MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol

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Summary

Fixés au formol des spécimens de paraffine représentent une source précieuse de biomarqueurs moléculaires des maladies humaines. Nous présentons ici un protocole de préparation du bibliothèque de cDNA en laboratoire, initialement conçu avec de l’ARN congelée fraîche et optimisé pour l’analyse des microARN archivés des tissus conservés jusqu'à 35 ans.

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

– Archivés, classés cliniquement fixés au formol paraffine des tissus (FFIP) peuvent fournir des acides nucléiques pour des études rétrospectives et moléculaires du développement du cancer. En utilisant des lésions non invasives ou précancéreuses chez des patients qui développent plus tard une maladie invasive, analyses d’expression génique peuvent aider à identifier des altérations moléculaires précoces qui prédisposent au risque de cancer. Il a été bien décrit qu’acides nucléiques extraits des tissus FFPE ont subi de graves dommages physiques et des modifications chimiques, qui compliquent leur analyse et exige généralement des dosages adaptés. Cependant, microARN (miARN), qui représentent une petite classe de molécules d’ARN s’étendant sur plus de ~ 18 – 24 nucléotides, auraient dû être divulgués à résister au stockage à long terme et ont été analysés avec succès dans des échantillons FFPE. Nous présentons ici un 3' avec code à barres ADN (cDNA) Bibliothèque préparation au protocole complémentaire spécialement optimisé pour l’analyse de petits ARN extraites des tissus archivés, qui a été récemment démontrée pour être robuste et hautement reproductible lors de l’utilisation archivées échantillons cliniques stockées jusqu'à 35 ans. Cette préparation de bibliothèque est bien adaptée à l’analyse multiplex de matériel compromise/dégradé où les échantillons d’ARN (jusqu'à 18) sont ligaturés avec barcoded adaptateurs individuels de 3' et ensuite regroupées ensemble pour les préparations enzymatiques et biochimiques avant l’analyse. Toutes les purifications sont effectuées par sur gel de polyacrylamide (PAGE), qui permet des sélections de taille spécifique et enrichissements de petites espèces d’ARN avec code à barres. Cette préparation de bibliothèques d’ADNc est bien adaptée aux entrées de RNA minutes, comme une réaction en chaîne par polymérase pilote (PCR) permet la détermination d’un cycle d’amplification spécifique produire des quantités optimales de matériel pour l’ordonnancement de prochaine génération (NGS). Cette approche a été optimisée pour l’utilisation des dégradés FFIP ARN des spécimens archivés jusqu'à 35 ans et fournit des données hautement reproductibles de l’end.

Introduction

miARN est remarquablement bien conservés dans fixés au formol paraffine (FFIP) échantillons1,2,3. Travaux antérieur ont démontré que l’expression de ces courtes réglementaire non codantes unique échoués des molécules d’ARN peut être évalué avec succès à l’aide de l’ARN total des échantillons FFPE et fournir des données pertinentes d’expression par rapport à l’original frais tissus4,5,6,7,8. Par rapport aux ARN messagers de grande taille, qui se sont révélés d’être gravement affectés par FFIP traitement tissulaire (formaldéhyde, chaleur, dessiccation, etc.), des ribonucléases endogènes et l’âge des spécimens, la petite taille des miARN (~ 18 – 24 nucléotides) s’affiche pour les rendre résistants à la dégradation et résilient pour l’entreposage à long terme, a également démontré par des études d’expression de miRNA qui surpassent les études ADN messagère haut débit dans les spécimens archivés9. les études d’expression de miRNA archivés sur des échantillons cliniques, qui ont principalement été réalisées dans les analyses à petite échelle, ont démontré que seul ou multiplexé des analyses par PCR quantitatives, différents types de microarray technologies et plus récemment NGS peut servir à évaluer l’expression des miARN préservée après l’optimisation de ces dosages10,11,12,13,14.

Étant donné que le dérèglement de miRNA expression a été associé au développement d’une variété de cancers humains et qu’il y a potentiellement une offre énorme de cliniquement annoté spécimens archivés, il est devenu évident que ces petits ARN molécules représentent une source prometteuse de potentiels du cancer biomarqueurs15,16,17,18. L’utilisation d’une technologie d’expression de gène de haut-débit comme NGS a l’avantage de fournir une évaluation globale de toutes les transcriptions de miRNA par rapport aux technologies ciblées comme la PCR et/ou microarrays19. Pour cette raison, un protocole optimisé, abordable et facilement applicable pour la préparation de bibliothèque de cDNA de petits ARN de plus vieux spécimens archivés pour NGS a été optimisé pour permettre des études rétrospectives à grande échelle de20.

Nous avons déjà établi un protocole d’extraction d’ARN/ADN simultané pour restauration séparée de l’ARN et l’ADN de plus vieux spécimens archivés, que nous avons trouvées pour surpasser les kits commerciaux contemporains21. À l’aide de ce protocole d’extraction, d’obtenir l’ARN total de tissus FFPE archivées pendant une période prolongée de temps, nous avons optimisé la préparation de banques d’ADNc pour NGS des miARN préservés dans les échantillons cliniques jusqu'à 35 ans. En outre, dans une étude récemment publiée, où nous avons préparé des banques d’ADNc de cliniquement classés carcinome canalaire in situ des spécimens (CCIS), nous avons identifié des miARN différentiellement exprimés qui ont été validées par PCR quantitative, qui indiquait que modifications de l’expression miRNA spécifiques peuvent être détectables dans les lésions de la CCIS de patients qui développent un cancer du sein par rapport aux lésions de la CCIS de patients qui ne développent pas de cancer du sein.

Si l'on considère le coût des trousses commerciales pour la préparation de petites banques d’ADNc de RNA, le potentiel de leur arrêt, ainsi que l’utilisation de réactifs/brevet protégé qui ne peut pas être optimisée, nous avons décidé d’adapter un publiées antérieurement en laboratoire et sans kit de 3' Protocole bibliothèque préparation d’ADNc avec code à barres pour NGS de petits ARN archivées dans des échantillons FFPE, permettant l’analyse simultanée de 18 échantillons22. Ce protocole prévoit une procédure étape par étape idéale et robuste avec points de contrôle visuel et l’évaluation technique, qui critiquaient pour adaptation aux spécimens d’ARN FFIP, et a un fort potentiel d’application à d’autres sources de compromis ou difficile d’utiliser le matériel de RNA. Applicabilité du protocole original a été améliorée en remplaçant les marqueurs de taille marquée radioactivement avec fluorescentes (p. ex., SYBR Gold) détectables marqueurs de taille de RNA utilisés lors de la sélection des bibliothèques ligaturés sur grands gels de polyacrylamide. Ce protocole optimisé repose sur la ligature de barcoded adaptateurs de 3' à 18 échantillons FFPE RNA individuels, qui sont alors regroupées ensemble pour subir une ligature des adaptateur 5', transcription inverse, ainsi qu’une analyse PCR pilote pour adapté l’amplification de l’ADNc final Bibliothèque avant amplification PCR à grande échelle, purification et NGS sur un séquenceur haut débit.

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Protocol

1. la préparation de tous les réactifs et les amorces

  1. Commandez toutes les amorces et les adaptateurs tel que décrit à la Figure 1.
  2. Préparer le calibrateur cocktail stock, ce qui va être dopé dans chaque ligature individuelle.
    1. Remettre en suspension l’oligonucléotide de transporteur (Figure 1) à 0,5 µM avec de l’eau exempte de RNase. Remettre en suspension les oligonucléotides de calibrateur (Figure 1) 10 à 100 µM en utilisant la solution d’oligonucléotide 0,5 µM transporteur.
    2. Combiner 10 µL de chacune des 10 calibrateurs dans une micro-centrifugeuse siliconée afin d’obtenir un stock de cocktail calibrateur 100 µM et préparer une solution de 0,026 nM à conserver à-20 ° C.
  3. Diluer les 20 unique, lyophilisé, adenylated 3' adaptateurs eau exempte de RNase à une concentration finale de 50 µM (Figure 1).
    Remarque : Il est recommandé de préparer 2,5 µL d’extraits de chaque carte dans des tubes de mastic individuels et les stocker à-80 ° C jusqu'à 2 ans.
  4. Resuspendre le morue dessalée nt-19 3' adaptateur et 24 nt-3' adaptateur taille marqueur oligonucléotides à 250 ng/mL (Figure 1).
  5. Remettre en suspension l’HPLC purifiée 5' adaptateur à 100 µM avec de l’eau exempte de RNAse. Remettre en suspension les amorces PCR de 5' et 3' à 100 µM en utilisant de l’eau exempte de RNase (Figure 1).
    NOTE : Partie aliquote tous les oligonucléotides en quantité nécessaire pour 1 – 2 expériences et conserver à-80 ° C.
  6. Préparer le polyacrylamide dénaturation (AAP) gel colorant de chargement en combinant 98,8 % formamide, 1 % (v/v) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 et 0,2 % bleu de bromophénol et définissez des aliquotes de 1 mL à-80 ° C.
    1. Préparer la solution d’EDTA 0,5 M Na2H2 en ajoutant les 18,6 g de poudre de EDTA Na2H2 à 50 mL d’eau exempte de nucléase. Ajouter les pastilles de NaOH pour atteindre le pH 8.0. Réglez le volume à 100 mL pour obtenir un 0,5 M Na2H2 EDTA, solution-mère pH 8.0.
    2. Peser 15 mg de bromophénol bleu dans un tube séparé 15 mL. Ajouter 600 µL d’eau exempte de nucléase. Ajouter 14,25 mL de formamide déminéralisée. Ajouter 150 µL de 0,5 M Na2H2 EDTA, solution pH 8.0.
    3. Partie aliquote de la solution finale de l’AAP de 15 mL en aliquotes de 1 mL à-80 ° C.
  7. Préparer le 5 x gel d’agarose, colorant de chargement en combinant bleu de bromophénol 0.2 %, 0,2 % de xylène cyanol FF, EDTA 50 mM Na2H2 , pH 8,0 et 20 % Ficoll Type-400.
    1. Resuspendre 1,86 g Na2H2-EDTA dans 50 mL d’eau exempte de nucléase dans un bécher de 400 mL sur un agitateur magnétique à température ambiante (RT). Ajouter les pastilles de NaOH pour atteindre un pH de 8,0. Ajouter l’eau exempte de nucléase pour atteindre 100 mL pour obtenir une solution d’EDTA Na2H2 de 50 mM.
    2. Peser 20 mg de poudre de bleu de bromophénol, 20 mg de poudre de xylène cyanol FF et 2 g de poudre de Ficoll Type-400 et remettre en suspension dans 5 mL de 50 mM Na2H2 EDTA.
    3. Vortex le tube contenant les trois colorants et ajouter 5 mL de 50 mM Na2H2 EDTA. Mélanger le colorant 5 chargement de gel x agarose, préparer des aliquotes de 1 mL et conserver à-80 ° C.

2. mettre en place les 3' Barcoded adaptateur trompes avec 18 échantillons d’ARN individuels

  1. Identifier 18 spécimens individuels d’ARN (pré-aliquotés à 100 ng dans 9,5 µL d’eau exempte de nucléase en tubes de microcentrifuge de 1,5 mL siliconé) et définissez les tubes sur la glace pour décongeler pendant 10 min.
  2. Préparer les 10 de frais ARN Ligase tampon (sans ATP).
    1. Dans un tube de microtubes de 1,5 mL siliconé, mélanger 343 µL d’eau exempte de RNase, 500 µL de Tris 1 M pH 7.5, 100 µL de 1 M du MgCl2, 50 µL de sérum albumine de 20 mg/mL et 7 µL de 14 M 2-mercaptoéthanol. Mélangez en effleurant le tube, centrifuger pendant 2 s 2 000 x g et RT et sur glace.
      Remarque : Toutes les étapes de ce protocole qui indiquent « Centrifuger pendant 2 s » sont effectuées dans un microcentrifuge de benchtop à RT et une vitesse maximale de 2 000 x g recueillir des solutions vers le bas des tubes.
  3. Préparer 50 % stock de DMSO aqueuse en ajoutant 1 mL de RNase-libre à 1 mL de DMSO dans un tube de microcentrifuge 2 mL siliconé, enrouler le tube en aluminium et stocker à température ambiante.
  4. Décongeler le cocktail de calibrateur 0,026 nM sur la glace pendant 10 min. préparer la ligature Master Mix en combinaison dans l’ordre suivant dans un tube de microtubes de 1,5 mL siliconé : 40 µL de 10 x ARN Ligase tampon et 120 µL de solution aqueuse de DMSO 50 % à l’aide d’une pipette de 200 mL , et ajouter 10 µL de 0,026 calibrateur nM cocktail à l’aide d’une pipette de 10 µL. Mettez le tube de 1,5 mL à mélanger, centrifuger pendant 2 s et le jeu sur la glace.
  5. Ajouter 8,5 µL du mélange réactionnel de ligature à chacun des 18 échantillons FFPE RNA aliquotés individuellement, doucement effleurer les tubes, centrifuger pendant 2 s et le magasin sur la glace.
  6. Dégivrer 2,5 µL d’extraits de chacun des 18, 3' barcoded cartes et placez-les sur la glace pour décongeler pendant 20 min.
    1. Utiliser une pipette 3 µL de transférer 1 µL de chaque adaptateur aux échantillons FFPE ARN correspondants contenant des ARN et la ligature Master Mix (c.-à-d., µL 9,5 + 8,5 µL).
    2. Ne pas pipeter de haut en bas, tout simplement diluer dans le liquide et tirez l’extrémité. Assurez-vous de changer des trucs entre échantillons FFPE RNA. Fermer chaque tube, balayez pour mélanger, centrifuger pendant 2 s et sur glace.
  7. Dénaturer les réactions en plaçant les 18 tubes sur un bloc chauffant à 90 ° C pendant 1 min et ensuite placer immédiatement sur la glace.
  8. Préparer la solution enzymatique de la ligature en diluant 10 µL de tronqué K227Q T4 ARN Ligase 2 avec 10 µL de RNase-libre de l’eau dans un tube de microcentrifuge fraîches 1,5 mL siliconé.
  9. Utiliser une pipette de 3 µL de transférer 1 µL de l’enzyme de ligature dilué dans chacun des 18 échantillons RNA (ne pas pipeter de haut en bas et changer des trucs entre chaque tube). Les ligature des 18 trompes sur la glace et y déposer dans une chambre froide de 4 ° C pour une incubation durant la nuit de 18 h.

3. purification du petit RNAs ligaturé

  1. Désactiver les réactions de la ligature en plaçant les 18 tubes pendant 1 min sur un bloc chauffant à 90 ° C et ensuite revenir à la glace pendant au moins 2 min refroidir.
  2. Préparer le mélange maître de précipitations en ajoutant 1 µL de colorant bleu liée de façon covalente au glycogène à 26 µL de 5 exempte de RNase M NaCl dans un tube de microcentrifuge mastic frais.
    1. Transférer 1,2 µL du mélange maître de précipitations dans chacun des 18 tubes. Ajouter 63 µL d’éthanol à 100 % pour chacun des 18 tubes. Fermer chaque tube, feuilleter pour mélanger, centrifuger pendant 2 s et place les tubes sur la glace. Combiner le contenu de tous les 18 tubes dans un tube unique de 1,5 mL siliconé.
    2. Fermer le tube, inverser les trois fois pour mélanger, centrifuger pendant 2 s et la place sur la glace pendant 60 min à précipiter.
  3. Préparer un grand gel de polyacrylamide de 15 % (16 x 20 cm2) pour la PAGE.
    1. Deux coulées siliconé de plaques de verre (traités avec une alternative sûre aux revêtements de silane) avec des entretoises de 0,1 cm.
    2. Mélanger 9 mL de diluant de système, 18 mL de concentré de système 3 mL de tampon de système, 240 µL d’APS (9 %) et 12 µL de TEMED dans un tube de 50 mL.
    3. Transférer la solution de gel de PAGE entre les plaques de verre à l’aide d’une pipette de 30 mL, insérez un peigne 14 puits (0,1 cm d’épaisseur) et laisser le gel se solidifier à RT pendant 30 min.
  4. Centrifuger le tube de 1,5 mL avec les trompes regroupées à 16 000 x g et 4 ° C pendant 60 minutes.
  5. Retirer le peigne. Nettoyer les puits abondamment avec de l’eau exempte de RNase utilisant un vaporisateur avec une pointe 200 µL à son extrémité pour accéder à l’intérieur du puits et forcer l’acrylamide non polymérisée (un bien à un moment) au-dessus d’un évier. Jeu de la 15 % PAGE sur un appareil de gel, remplir les réservoirs avec 0,5 x solution Tris-Borate EDTA (TBE) et courir avant le gel pendant 30 min à 450 V.
  6. Récupérer le tube avec des trompes mise en commun de la centrifugeuse et sécher soigneusement le culot de RNA.
    1. Supprimer le surnageant avec une pointe de pipette 1 mL tout en conservant peu de liquide au fond. Incliner le tube et utiliser une pipette de 20 mL pour enlever le surnageant restant sans toucher le culot. Aspiration de vide le tube à l’aide d’une pipette Pasteur avec une pointe de 10 µL à son extrémité, sans toucher le culot.
    2. Resuspendre le culot de RNA dans 20 µL d’eau exempte de RNase en effleurant le tube. Ajouter 20 µL de gel AAP chargement solution pour remettre en suspension l’ARN, balayez pour mélanger, centrifuger pendant 2 assis RT et fixer le tube à 90 ° c pendant 1 min et ensuite place immédiatement sur la glace.
  7. Remplacer le 0.5 x TBE de l’engin de gel avec frais 0,5 x TBE et charge l’échelle, marqueurs de taille et ligaturé miARN dans le centre du gel, laissant vide 2 puits sur les deux côtés (Figure 2).
  8. Exécutez le gel à 450 V (35 mA) pendant 60 min, interrompre la course pendant 10 min à refroidir, puis réexécutez à 520 V (25 mA) pour un autre 60 min. Uncast 15 % PAGE en enlevant une des plaques de verre.
  9. Vaporiser légèrement le gel assis sur la plaque de verre avec une solution de colorant fluorescent (10 µL) dans 25 mL de 0,5 x TBE et laissez reposer plat pendant 5 min dans le noir.
  10. Poser le verre avec le gel sur un Transilluminateur de lumière bleu et aligner les deux 19 nt et 24 marqueurs de taille nt avec une règle pour diriger l’excision du petit RNAs ligaturé (Figure 2). Le gel de l’accise.
  11. Placer le gel excisé dans un tube de 0,5 mL, conçu pour fragmenter les tranches de gel, correctement placés dans un tube de 1,5 mL mastic microcentrifugeuse. Centrifuger à 16 000 x g pendant 3 min à RT. remettre en suspension le gel fragmenté avec 300 µL de 400 mM NaCl solution, fermer le tube et sceller avec le film de paraffine.
  12. Mettre le tube sur l’agitation sur un thermomixer à 1 100 tr/min dans une chambre froide de 4 ° C pour une nuit d’incubation (16-17 h).

4. la ligature de l’adaptateur de 5'

  1. Transférer la solution et fragmentée de gel pour un filtre de 5 µm assis dans un tube siliconé de 1,5 mL de tube, joint avec le film de paraffine et centrifuger pendant 5 min à 2 300 x g et RT.
  2. Ajouter 950 µL d’éthanol à 100 % à la solution filtrée, fermer le tube, inverser pour mélanger, centrifuger pendant 2 s, fermer le tube avec le film de paraffine et mettre sur la glace pendant 1 h.
  3. Préparer un 12 % PAGE gel comme indiqué au point 3.3, mais combiner 12,6 mL de diluant, 14,4 mL de concentré, 3 mL de tampon et 240 µL APS 12 µL de TEMED dans un tube de 50 mL. Avant de courir les 12 % gel de PAGE pendant 30 min à 450 V (~ 35 mA) à 0,5 x TBE.
  4. Centrifuger la solution purifiée de RNA petite à 16 000 x g pendant 60 min à 4 ° C.
  5. Pipetter soigneusement sur le surnageant à l’aide d’une pipette 1 mL d’enlever la majeure partie de la solution et utiliser une pipette de 200 mL pour enlever le reste de la solution, sans toucher le culot.
  6. À l’aide d’une pipette Pasteur avec une pointe de 10 mL à son extrémité connectée à une fiole à vide, sécher soigneusement la pastille sans le toucher.
  7. Resuspendre le culot dans 9 µL d’eau exempte de RNase sans pipetage de haut en bas, mais légèrement effleurement le tube Centrifuger pendant 2 s et l’ensemble du tube sur la glace.
  8. Préparer les 10 de frais ARN Ligase tampon (avec l’ATP) en combinant 500 µL de 1 M Tris pH 7,5, 100 µL de 1 M MgCl2, 50 µL de 20 mg/mL acétylé BSA, 200 µL d’ATP, 7 µL du 2-mercaptoéthanol 10 mM 14 M et 143 µL d’eau exempte de RNase.
  9. Mélanger le RNA Ligase mémoire tampon 10 x (avec l’ATP) en effleurant le tube et centrifuger pendant 2 s pour recueillir la solution au fond du tube.
  10. Mettre en place la ligature 5' adaptateur en ajoutant 2 µL de RNA Ligase mémoire tampon (avec l’ATP), 10 x 1 µL de 100 µM 5' adaptateur et 6 µL 50 % solution aqueuse de DMSO pour les 9 µL, 3' barcoded petite solution de RNA.
  11. Mettez le tube légèrement pour mélanger, centrifuger pendant 2 s pour recueillir la solution, placer le tube sur un bloc chauffant à 90 ° C pendant 1 min et retour sur la glace pendant au moins 2 min.
  12. Ajouter 2 µL de la solution de T4 ARN Ligase 1 (ne pas pipeter haut et en bas), mettez le tube, centrifuger pendant 2 s et de s’asseoir, le tube en flottant en rack dans un bain-marie à 37 ° C pendant 60 min.
  13. En même temps, mis en place deux trompes entre le nt-19 3' adaptateur et l’adaptateur de 5' et deux trompes entre les 24 nt-3' 5' adaptateur fourni.
    1. Combiner 2 µL de la 19nt-3' adaptateur (250 ng/µL) ou 24 nt-3' adaptateur (250 ng/µL) avec : 2 µL de la 5' adaptateur (100 µM), 2 µL de RNA Ligase mémoire tampon (avec l’ATP), 10 x 6 µL de solution aqueuse de 50 % DMSO, 6 µL d’eau exempte de RNase et 2 µL de T4 ARN Ligase 1 dans un tube de microtubes de 1,5 mL siliconé.
    2. Feuilleter les tubes à mélanger, centrifuger pendant 2 s et ensemble les tubes à 37 ° C pendant 60 min.
  14. Ajouter 20 µL de tampon de dénaturation AAP à tous des trompes (purifiée petits ARN, 2 trompes avec 19nt-3' adaptateur et 2 trompes avec 24nt-3' adaptateur).
    1. Mélangez en feuilletant les tubes, centrifuger pendant 2 s, incuber les tubes sur un bloc chauffant à 90 ° C pendant 1 min. transfert tous les tubes à la glace et préparer une échelle (3 mL d’échelle avec 20 µL de l’AAP).
  15. Vider le réservoir supérieur de l’engin de gel avec la course avant 12 % gel de la PAGE et ajouter 0,5 solution fraîche de x TBE au-dessous du niveau des puits (puits sont vidés avec une pipette de pointe longue et mince).
    1. Charger les échantillons avec un embout de la pipette mince, comme décrit à la Figure 3.
    2. Utilisation frais 0,5 x TBE pour remplir les puits individuels vers le haut du gel.
    3. Ajouter 0,5 frais x TBE pour le réservoir au-dessus du puits et démarrer l’électrophorèse des 12 % PAGE pendant 60 min à 450 V (~ 35 mA).
    4. Arrêter la course en arrêtant le groupe électrogène pendant 10 min refroidir le gel. Redémarrer le générateur et exécutez le gel pendant 60 min à 520 V (~ 25 mA).
  16. Arrêter le générateur, vider les réservoirs en retournant l’appareil au-dessus d’un évier et uncast les 12 % PAGE en enlevant une des plaques de verre.
  17. S’asseoir le verre avec le gel plat, vaporiser le gel avec 10 µL du colorant fluorescent dans 25 mL 0,5 x TBE, incuber dans l’obscurité pendant 5 min. Posez le verre avec le gel sur un Transilluminateur de lumière bleu et aligner les deux le 19 nt et les deux les 24 nt marqueurs de taille avec une règle pour diriger l’excision du petit RNAs ligaturé (Figure 3).
    1. Le gel de l’accise et de transférer le morceau excisés gel dans un tube de disjoncteur 0,5 mL gel. Refermer le bouchon du tube gel de disjoncteur, jeu dans un tube de microtubes de 1,5 mL siliconé et sécurisé avec film de paraffine. Enlever le tube de briseur de gel, ajouter 300 µL de 300 mM NaCl et 1 µL d’amorces PCR de 100 µM 3' pour les morceaux broyés gel dans un tube de 1,5 mL.
    2. Fermer le tube avec le film de paraffine sur agitation sur un thermomixer à 1 100 tr/min à 4 ° C, pendant la nuit (17 – 18 h) dans une chambre froide.

5. reverse Transcription de la ligature 5' et 3' petits ARN purifié avec code à barres

  1. Récupérer le tube du filtre et thermomixer purifier la solution avec un tube de filtre 5 µM.
    1. Utiliser une pipette de 1 mL pour transvaser la solution sur un tube de filtre 5 µM insérée dans un 1,5 mL siliconé tube de prélèvement de RNase-libre. Centrifuger le tube pendant 3 min à 2 300 x g et RT.
    2. Jeter le tube filtre et ajouter 950 µL d’éthanol à 100 % dans le tube de prélèvement de microtubes de 1,5 mL contenant la solution filtrée. Il faut inverser le tube à mélanger, centrifuger pendant 2 s et le lieu sur la glace pour 60 min. précipité l’ARN à pellets par centrifugation du tube à 16 000 x g et 4 ° C pendant 1 h.
  2. Sécher le culot de RNA.
    1. Ouvrir le couvercle et retirer délicatement le surnageant avec une pipette de 1 mL, laissant peu de liquide au fond.
    2. Utiliser une pipette de 20 µL pour enlever tout le surnageant restant sans toucher le culot. Incliner le tube afin de permettre à n’importe quelle solution de s’asseoir sur le côté opposé de la pastille.
    3. Utiliser une pipette Pasteur avec une pointe de pipette non filtrée de 10 mL pour aspirer le surnageant et le culot à l’aide d’un aspirateur à sec.
  3. Resuspendre le culot de RNA dans 5,6 µL d’eau exempte de RNase.
    1. Décongeler les réactifs de la transcription inverse sur la glace pendant 15 min. Set up une réaction de transcription inverse en ajoutant 3 µL de 5 x 1,5 µL de dithiothréitol (DTT) tampon et 4,2 µL de 10 x deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) (chaque 2 mM) pour les 5,6 µL de RNase-libre extrait concentré.
    2. Effleurez doucement le tube pour mélanger la réaction et centrifuger pendant 2 s pour recueillir la solution. Mettre en place la réaction sur un bloc chauffant à 90 ° C pendant exactement 30 s et puis transfert directement sur un thermomixer à 50 ° C.
    3. Laissez le tube sur le thermomixer pendant 2 min afin que la température égalise. Ajouter 0.75 µL de l’enzyme transcriptase inverse directement dans la solution et flick doucement pour mélanger ensemble le tube de retour sur le thermomixer à 50 ° C pendant 30 min immédiatement.
  4. Après 30 min, transférer le tube sur un bloc chauffant à 95 ° C pendant 1 min arrêter la transcription inverse. Ajouter 95 µL d’eau exempte de RNase directement à la transcriptase inverse, balayer le tube pour mélanger et placez-le directement sur la glace pendant 2 min.
  5. Etiqueter le tube avec l’ADNc Stock Bibliothèque et bibliothèque ID.

6. pilotes PCR et l’Amplification par PCR à grande échelle

  1. Préparer les frais 10 x PCR buffer, en ajoutant : 304 l d’eau exempte de RNase, 125 µL de KCl, 50 µL de 1 M Tris pH 8,0, 2 M 10 µL de 1 M du MgCl2, 5 µL de 1 % Triton X-100 et 6 µL de 1 M 2-mercaptoéthanol dans un tube de mastic microcentrifugeuse et garder à température ambiante.
  2. Assembler la réaction PCR pilote en combinant 2 µL de 50 67 µL d’eau exempte de RNase et 10 µL de 10 x tampon PCR, 10 µL de 10 x dNTPs, 0,5 µL d’amorces PCR de 100 µM 5', 0,5 µL d’amorces PCR de 100 µM 3', 10 µL de cDNA Library Stock x Taq polymérase.
    1. Mis en place deux PCR cycles sur un thermocycleur comme suit : déposer 1 : 94 ° C pendant 45 s, 50 ° C pendant 85 s et 72 ° C pendant 60 s pendant 10 cycles, tenir à 4 ° C ; Fichier 2 : 94 ° C pendant 45 s, 50 ° C pendant 85 s et 72 ° C pendant 60 s pour 2 cycles, tenir à 4 ° C. Mis en place la réaction PCR pilote dans le thermocycleur et démarrer le fichier 1.
    2. À la fin du fichier 1, ouvrez le tube PCR, et à l’aide d’une pipette 20 µL, transfert 12 µL de la réaction PCR pilote dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 3 µL de 5 x gel colorant de chargement, de la composition de pipetage de haut en bas, fermer le tube et l’étiquette « 10 cycles ».
    3. Fermer le tube pilote PCR et démarrez File 2 sur un thermocycleur. À la fin du fichier 2, ouvrir le tube PCR et une pipette de 20 mL permet de transférer 12 µL de solution dans tube microtubes de 1,5 mL avec 3 µL de 5 x gel colorant de chargement et l’étiquette « 12 cycles ».
    4. Répétez les étapes décrites dans les étapes 6.2.2 et 6.2.3 pour recueillir 12 produits PCR µL de la réaction PCR pilote à cycles de PCR, 14, 16, 18 et 20. Ajouter 3 µL de 5 x chargement gel colorant à chacun des 12 µL d’extraits PCR et à l’échelle de nt 20 contenant 3 µL d’échelle et 9 µL d’eau exempte de RNase.
  3. Préparer un gel d’agarose 2.5 % avec 0,5 x TBE.
    1. Pèsent 2,5 g d’agarose dans un récipient propre et ajouter 100 mL de 0,5 x TBE. Chauffer la solution dans un four à micro-ondes jusqu'à ébullition. Retirer la solution du micro-ondes, agiter le flacon pour mélanger l’agarose, ajouter 4 μL de bromure d’éthidium (10 mg/mL) et transvaser la solution dans un plateau d’électrophorèse de2 de 7 x 10 cm, fermé aux deux extrémités avec du ruban adhésif.
    2. Un peigne de 8 puits et laisser le gel d’agarose à se solidifier à RT. transfert l’agarose solidifiée gel dans un appareil d’électrophorèse rempli de 0,5 x TBE.
  4. Charger l’échelle et les échantillons PCR sur gel d’agarose, puis exécutez-le pour 30 min à 120 V.
  5. Évaluer le gel sur une boîte d’UV pour identifier le cycle PCR optimal (Figure 4 a).
    NOTE : La taille des bandes PCR attendus est montrée dans la Figure 4 b.
    1. Observer les deux bandes PCR dans chacun des puits différents (bande supérieure : bibliothèque d’ADN, de la bande du bas : dimères d’amorce).
    2. Identifier le cycle PCR adéquat pour l’amplification de cDNA en sélectionnant le cycle où la Banque d’ADNc est visible, mais les dimères d’amorce sont à peine observables.
      Remarque : En général, le cycle PCR adéquat est sélectionné entre 12 et 16 cycles. Sur la Figure 4 a, le cycle PCR adéquat pour cette bibliothèque est 14.
  6. Mettre en place les réactions de PCR à grande échelle (6 x 100 µL) pour la purification de bibliothèque pour le gel d’agarose.
    1. Préparer un nouveau tube de 10 x PCR tampon suite étape 6.1.
    2. Préparer le mélange maître PCR à grande échelle dans un tube de 1,5 mL en combinant 435,5 µL d’eau exempte de RNase, 65 µL de tampon de x PCR 10, 65 µL de 10 x dNTPs, 3.25 µL de 5' amorce PCR, 3.25 µL de 3' amorce PCR et pipetage de haut en bas pour mélanger.
    3. Transférer 88 µL de la PCR Master Mix dans six tubes PCR de 0,5 mL. Transférer 10 µL de cDNA Library de Stock (stockés sur glace), ajouter 2 µL de 50 x Taq polymérase dans chacun des 6 tubes PCR et pipette pour mélanger.
    4. Préparer un tube de réaction PCR négatif en combinant 77 µL de RNase-libre eau, 10 µL de tampon de x PCR 10, 10 µL de 10 x dNTPs, 0,5 µL de 5' amorce PCR, 0,5 µL de 3' amorce PCR et 2 µL de 50 x Taq polymérase et pipette pour mélanger.
    5. Placer les tubes PCR dans le thermocycleur utilisant le cycle PCR indiqué au point 6.2.1 et définissez le nombre optimal de cycles d’amplification. Préparer un gel d’agarose de 2,5 % à l’aide de 0,5 x TBE, comme indiqué au point 6.3.
  7. Après amplification par PCR, transférer 9 µL de chaque tube PCR dans six tubes de microcentrifuge de 1,5 mL contenant 3 µL de 5 x gel colorant de chargement.
    1. Préparer 20 échelle nt en combinant 3 mL d’échelle en 9 µL d’eau exempte de RNase et ajouter 3 µL gel, colorant de chargement dans un tube de 1,5 mL.
    2. Chargez l’échelle contrôle PCR négatif et 6 produits PCR sur gel d’agarose et exécutez le gel pendant 30 min à 120 V.
    3. Vérifier l’uniformité de l’amplification PCR entre voies sur une boîte d’UV (prendre une image).
    4. Combinez 3 réactions de PCR dans deux tube de microtubes de 1,5 mL siliconé (3 x 91 µL), ajouter 27 µL de 5 M de NaCl et 950 µL d’éthanol à 100 %. Il faut inverser les tubes pour mélanger et mettez-les à-20 ° C durant la nuit à précipiter les produits PCR.

7. cDNA Library Purification et évaluation

  1. Centrifuger les deux tubes avec les réactions de PCR à 16 000 x g pendant 60 min à 4 ° C.
  2. Supprimez le surnageant avec une pipette de 1 mL, puis incliner le tube avec le culot sur le dessus et le liquide sur le côté inférieur et utilisez une pipette Pasteur reliée à une bouteille isotherme avec une baignoire et aspirer le liquide avec une pointe de 10 mL à l’extrémité de la pipette Pasteur.
  3. Mettre en place le digest PmeI.
    1. Remettre en suspension l’un des boulettes PCR avec 17,5 µL d’eau exempte de nucléase et transférer l’extrait concentré à la deuxième pastille PCR. Ajoutez 2 µL de mémoire tampon 10 x et 0,5 µL d’enzyme PmeI, puis définissez le condensé dans un bain-marie pendant 2 h à 37 ° C.
    2. Préparer un gel d’agarose de 2,5 % à l’aide de 0,5 x TBE (étape 6.3). Ajouter 6 µL de 5 x chargement gel colorant à la digérer. Transférer 13 µL de chaque digest dans deux puits adjacents du gel d’agarose, l’échelle de taille 20 nt à des puits de fin de charge et exécutez le gel pendant 90 min à 150 V (Figure 4).
    3. Les bandes PCR supérieures du gel sur la zone UV de l’accise, transférer les morceaux de gel dans un tube de microcentrifuge fraîchement pesait 1,5 mL et peser les pièces de gel sur une échelle.
  4. Purifier l’excisées PCR amplifiés d’ADNc utilisant un gel extraction kit suivant les instructions du fabricant. Quantifier l’ADNc en utilisant un test de quantification d’ADN et l’instrument, suivant les instructions du fabricant.
  5. Évaluer la taille et la pureté de la Banque d’ADNc avec une puce à ADN haute sensibilité sur un Bioanalyzer (Figure 5). Séquence de la Banque d’ADNc en utilisant un système de haut-débit. Transférez le fichier de données FASTQ dans le pipeline WashableMarker pour règlage de l’adaptateur et l’alignement sur le génome humain pour identifier les séquences de miRNA.

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Representative Results

Comme décrit dans la méthode ici, un total de 18 échantillons FFPE RNA individuels (100 ng de chacun) sont mis en place dans des tubes distincts pour subir 3' adenylated avec code à barres oligonucléotide T4 ligature du jour au lendemain. Le lendemain, les réactions enzymatiques sont chaleur-désactivée, combinées et précipitées dans un seul tube. Le culot de RNA est remis en suspension et les molécules d’ARN ligaturés sont séparés sur gel de polyacrylamide (PAGE), où les marqueurs de taille d’oligonucléotide RNA qui ont migré dans les puits adjacents du gel PAGE, sont utilisés pour choisir la taille appropriée de 3' barcoded la dénaturation de 15 % petits ARN (Figure 2). Le morceau de gel excisées est incubé dans une solution de NaCl, du jour au lendemain pour éluer les molécules d’ARN ligaturés. Le lendemain, l’ARN éluée est précipitée, et une ligature 5' adaptateur est effectuée. Puis, les 5' adaptateur ligaturé petites molécules d’ARN sont migrés et séparés sur un gel de 12 % d’acrylamide, où encore une fois migré RNA taille marqueur oligonucléotides permettent excision de la taille du petit RNAs contenant les oligonucléotides 3' avec code à barres et l’adaptateur de 5' ( Figure 3). Le gel excisé est incubé pendant la nuit dans une solution de NaCl pour permettre l’élution de l’ARN. Le lendemain, les petites molécules d’ARN ligaturés sont précipités, et le culot est remis en suspension dans l’eau exempte de RNase, suivie par transcription inverse ; une partie aliquote des molécules de cDNA subit une réaction de PCR pilote (Figure 4 a). Les réactions de PCR à grande échelle utilisant la même entrée de banques d’ADNc sont mises en place et évaluées sur un gel d’agarose 2.5 % pour vérifier que toutes les réactions ont été adéquatement PCR amplifié (Figure 4 b), avant la mise en commun et une nuit précipitation à l’éthanol. Le lendemain, la Banque d’ADNc amplifié contenant tous les 18 bibliothèques individuelles pour les 18 échantillons FFPE RNA uniques, est migré sur un gel d’agarose de 2,5 % et la bande supérieure PCR, cadencé à 100 nt est excisé et purifié (Figure 4). La purification de bibliothèques d’ADNc est ensuite évaluée sur une puce à ADN pour déterminer que le produit PCR purifié ne contient pas un excès de dimères d’amorce ou d’autres sous-produits de la réaction PCR ultrasensible (Figure 5). Le produit de la PCR est ensuite analysé sur un système de séquençage haut-débit. Le règlage de l’adaptateur et la génération de 18 dossiers individuels pour chacun des 18 échantillons sont effectuées à l’aide du pipeline de WashableMarker (accès est fourni par le Dr Thomas Tuschl pour nous). Des analyses biostatistiques sont ensuite réalisées afin d’évaluer le contenu de miRNA des échantillons FFPE RNA.

Pour valider ce optimisé procédure, assortie de frais congelés et échantillons de tumeur du sein FFPE ont été utilisés pour les analyses (Figure 6). Deux analogues des tumeurs du sein canalaire invasif carcinome (IDC) ont été choisis pour évaluer la sensibilité de la procédure et de déterminer si des différences d’expression miRNA constatées entre les deux tissus congelés frais pourraient également être détectés dans l’appariés archivées FFIP Spécimens d’ARN. Pour cette expérience, la qualité du total obtenu à partir de la 2 frais congelés et appariées deux échantillons FFPE ARN l’ARN a été évaluée (Figure 6 a). Comme prévu, la taille de RNA et de la qualité des échantillons FFPE a été sévèrement ont diminué par rapport à RNAs congelé frais assorti (comparer les voies 1 et 3 et les pistes 2 et 4). L’un de l’ARN FFIP avait été archivé à RT pendant 4 ans (Invasive Breast Cancer 1, (IBC1)) et l’autre avait été archivée à la droite depuis 8 ans (IBC2), tandis que les homologues frais congelés avaient été stockés à-80 ° C. Les quatre spécimens individuels d’ARN ont été analysés dans une bibliothèque unique, à l’aide de 4 codes à barres individuelles et le miRNA lire distribution parcelles sont affichés dans la Figure 6 b. Les deux panneaux supérieurs affichent miRNA expression de corrélation entre la tumeur congelée frais deux ARN et leurs homologues de spécimen FFIP ARN spécifiques. Les parcelles correspondant entre frais congelés et FFIP miARN indique que la préparation de bibliothèques d’ADNc fournit une bonne reproductibilité, comme observe une forte corrélation entre les miARN détecté dans des échantillons traités différemment (Frozen vs FFIP). Les deux panneaux inférieurs affichent la corrélation entre les données d’expression de miRNA depuis les deux différentes tumeurs congelés et entre les deux différentes tumeurs FFIP. Comme indiqué dans la Figure 6, les différences d’expression de miRNA constatées entre les deux tumeurs congelées fraîches étaient corrélés avec les différences détectées entre les deux spécimens de tumeur FFIP appariés. Différences de signification miRNA expression sont décelables tant en frais congelés et tumeurs FFIP.

Pour continuer à évaluer la sensibilité de cette approche, miRNA expression données de 12 spécimens archivés du FFIP et 4 échantillons congelés frais de RNA ont été utilisées (Figure 6). Les 16 différents spécimens d’ARN ont été individuellement 3' avec code à barres et tous utilisés pour la préparation d’une seule banque d’ADNc. Les échantillons d’ARN utilisés dans cette lignées de cellules de la poitrine deux Bibliothèque incluse, le MCF10A (lignée cellulaire de type normal) et le MCF7 (lignée cellulaire de cancer de sein) l’ARN des cellules fraîches et du leur archivés FFIP homologues23, appariés frais surgelés et échantillons d’ARN FFIP du cancer du deux sein échantillons analysés indépendamment (IBC1 et IBC2 dans la Figure 6 a et 6 b) et assorti de frais surgelés et FFIP RNA échantillons provenant d’échantillons cervicales normales (Cx). En outre, les spécimens archivés de FFIP de normal (normal Br1, Br2 normal et Br3 normal) et tissus cancéreux du sein (IBC 5, IBC 6 et 7 de l’IBC), sans leurs homologues fraîches congelées ont été analysés. Tel qu’observé sur le heatmap, indépendamment des frais congelés ou origine FFIP RNA, miRNA profils d’expression des mêmes cellules (MCF10 ou MCF7), ou les mêmes tissus (IBC1, IBC2 ou Cx) regroupés. En outre, comme indiqué sur le cluster sans surveillance, de gauche à droite, cellules normales du sein et des tissus regroupés tandis que les tumeurs du sein et des cellules tumorales regroupent sur la droite. Le tissu du col, qui affiche un profil d’expression différents miRNA, regroupés sur la droite de la heatmap.

Étant donné que la plupart des échantillons FFPE cliniquement archivés n’ont pas homologues congelés frais mais qu’ils peuvent être récupérés après la durée de stockage différent, on a tenté de déterminer si le protocole de préparation de Bibliothèque optimisée ARNC était applicable et reproductible avec plus en plus anciens spécimens de FFIP. Comme illustré à la Figure 7, miRNA profils d’expression des tissus FFPE archivés pour 18, 20, 22, 27, 30 et 35 ans ont été obtenus. L’ARN a été extrait à l’aide de la procédure ARN/ADN optimisée simultanée21et quadruplet RNA aliquotes de chaque échantillon FFPE individuel ont été préparés le jour même et stockées à-80 ° C avant la préparation de la bibliothèque. Un total de 9 différentes FFIP échantillons ont été analysés en double, où chaque aliquote de RNA individuel a été ligaturé avec code-barres différents oligonucléotides (totales 18 codes-barres), au sein de la même bibliothèque. Cette expérience a été répétée au cours de deux semaines consécutives (semaine 1 et semaine 2). Ceci a permis l’évaluation de la reproductibilité de préparation de bibliothèque de cDNA avec les mêmes spécimens d’ARN à l’aide de deux codes à barres différentes dans une seule bibliothèque, ainsi qu’entre deux différentes bibliothèques avec un intervalle d’une semaine. Comme sur la Figure 7, le coefficient de corrélation est resté au-dessus de 0,96 indépendamment de l’âge de l’échantillon ou de la semaine de préparation de bibliothèque ; par conséquent, le protocole de préparation de bibliothèque de cDNA optimisé fournit un outil robuste reproductible analyse d’échantillons FFPE quelle que soit leur durée d’archivage, par exemple, l’ARN FFIP archivées de 35 ans (voir le #9) affiche des mesures reproductibles hautes équivalent à ceux mentionnés avec les échantillons d’ARN FFIP de 20 ans (voir seins #3).

Figure 1
Figure 1 : oligonucléotides. Toutes les séquences oligonucléotidiques, leurs correspondants des modifications chimiques et concentrations utilisées dans le présent protocole sont décrites. Les types de modifications chimiques sont décrites dans la boîte de modification et les modifications abrégées affichées dans les séquences oligonucléotidiques. Le calibrateur cocktail affiche la liste des 10 individuels RNA oligonucléotide calibrateurs, qui ont été remis en suspension dans une solution contenant de l’oligonucléotide transporteur (0,5 µM). Les adaptateurs oligonucléotidiques dix-huit 3' avec code à barres sont détaillées avec un ombrage gris au cours de la séquence de code à barres. La séquence d’ARN de l’adaptateur de 5' et les séquences d’ADN des 3' 5' et PCR PCR amorces sont détaillées. Les séquences d’ARN des oligonucléotides deux taille marqueurs, nommément cités dans le protocole nt-3 19' adaptateur et 24 nt-3 "marqueurs de carte de taille, sont fournis. Tous les oligonucléotides d’ADN et l’ARN ont été achetées dans le commerce. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : purification de la PAGE des échantillons barcoded RNA 3'. Après la mise en commun et précipitant les 18 échantillons barcoded RNA, l’extrait concentré de RNA est migré et séparés par électrophorèse sur un 15 % d’acrylamide gel (voir 8 puits). Le carré rouge met en évidence la zone contenant les 3' microARN avec code à barres, qui a été excisé avec une lame de bistouri Swann-Morton et transférée dans un tube de microcentrifuge mastic exempte de nucléase. Un total de quatre puits, avec deux contenant la nt-19 3' adaptateur et deux contenant les 24 nt-3' adaptateur a été défini un bien loin, de chaque côté de la bibliothèque (voir puits 5, 6 et 10, 11, respectivement). Comme un test pour la ligase d’ARN T4 1 et pour la purification de la taille ligaturée marqueurs pour être terminée le lendemain, les réactions de ligature contenant la nt-19 3' marqueur de taille adaptateur avec l’adaptateur 5' et le nt-24 3 "marqueur de taille adaptateur avec l’adaptateur 5' ont été exécutés dans les puits 2 une d 3, respectivement. Les carrés jaunes affichent les bandes excisés représentant les oligonucléotides de RNA taille ligaturé marqueur avec l’adaptateur 5'. Ces bandes sont purifiés, précipités et exécuter au cours sur les 12 % purification de PAGE (voir Figure 3 ci-dessous). Puits 1 et 13 contiennent l’échelle de taille 20 nt, qui a contribué à confirmer la taille prévue des produits ligaturés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : purification de la PAGE de la bibliothèque purifiée après ligature de l’adaptateur de 5'. La bibliothèque de RNA purifiée a été ligaturée avec l’adaptateur de 5' et la taille du produit attendu a été excisée par rapport aux 12 % PAGE utilisant les marqueurs de taille ligaturé (voir carré rouge). Les produits des ligature des trompes T4 ARN entre les 19 nt-3' 5' adaptateur (puits 4 et 9) fourni, ainsi qu’entre le nt-24 3' adaptateur et l’adaptateur de 5' (puits 5 et 10) ont été exécutés en parallèle, de chaque côté de la cupule contenant la bibliothèque de RNA. Les bandes plus hautes (voir astérisques blancs) sont les produits de la ligature 5' adaptateur et utilisé comme guide pour l’excision de bande de gel contenant la 5' adaptateur ligaturé bibliothèque RNA. Les produits de ligature de marqueur taille de ligature purifiées à la PAGE précédente sont exécutés dans les 3 puits. Comme observé dans les puits 1 et 12, l’échelle de taille 20 nt a été également exécuté pour valider la taille attendue de la bibliothèque de RNA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : pilote PCR et l’amplification à grande échelle de la Banque d’ADNc. La taille et le ratio des produits PCR ont été évaluées sur un gel d’agarose de 2,5 % en présence de bromure d’éthidium. (A) après que la transcription inverse de la bibliothèque de barcoded RNA, une partie aliquote de la Banque d’ADNc a été amplifiée à l’aide des amorces PCR 5' et 3' en une seule réaction de PCR pilote. Aliquotes des réactions PCR pilotes ont été obtenus à 10, 12, 14, 16, 18 et 20 cycles et migrés sur un gel d’agarose 2.5 %. Tel qu’observé entre les puits 1 et 7, la présence des dimères cDNA library et l’adaptateur a été exponentielle observable (voir les rectangles verts). Pour cette bibliothèque, le cycle PCR sélectionné pour l’amplification de l’ADNc a 15. (B), ce schéma affiche la position et la longueur les oligonucléotides différents et les produits qui en résultent d’ARN et ADN, qui sont reconnaissables sur les gels d’agarose et de PAGE. (C) aliquotes des 6 réactions PCR à grande échelle (identifiées à A) ont été analysés séparément sur un gel d’agarose 2.5 % gel (voir puits 3 à 8). Les deux types de produits PCR, à savoir la bibliothèque (bande supérieure) et les dimères d’amorces (bande inférieure) sont visibles sur ce gel (voir vert rectangles). La réaction de PCR vide sans ADNc n’affiche aucune amplification par PCR (voir 2 puits). L’échelle de taille 20 nt permet la vérification de la taille du produit (voir bien 1). (D) Gel image sur un Transilluminateur lumière bleu de l’agarose 2.5 % gel contenant les réactions de PCR regroupées a couru dans deux puits adjacents. Tel qu’observé, la tranche la plus élevée dans les deux puits se trouve la taille attendue de bibliothèque et la bande de dimère adaptateur se trouve en dessous. Les bandes supérieures de PCR ont été excisées et purifiés avec un kit d’extraction de gel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : évaluation de la PCR purifiée amplifié bibliothèque ADN. Une petite aliquote (1 µL) de l’ADNc amplifié de PCR est analysée à l’aide d’une puce à ADN haute sensibilité sur une plate-forme microfluidique. (A), ce panneau affiche la migration des marqueurs de la taille pour l’étalonnage de l’instrument. (B), ce panneau affiche la migration de la bibliothèque d’ADNc amplifié PCR purifiée. Le point culminant est mesuré à une taille de 100 bp (voir astérisque) et représente la Banque d’ADNc. Le petit pic, évalué à 72 bp par l’instrument représente les dimères d’adaptateur de l’apprêt. Le pic de bp 100 détectées par microfluidique basée plate-forme révèle la taille estimée de la Banque d’ADNc amplifié, qui contient 18 spécimens d’ARN avec code à barres individuel pour NGS ultérieures sur un système de séquençage haut-débit. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : préparation de bibliothèque de cDNA et séquençage de nouvelle génération utilisant appariés spécimens frais congelés ou fixés au formol paraffine incorporé. (A) l’ARN Total extrait de mise en correspondance frais surgelés et tumeurs du carcinome canalaire infiltrant (IDC) FFPE a été analysée sur une puce de RNA totale sur une plate-forme microfluidique basée. (B) l’ARN Total de frais correspondant congelés et échantillons FFPE (bac 1 et IBC2) ont subi le protocole de préparation de bibliothèque ADNc et les données de séquençage miARN ont été tracées. (C) DifferentialmiRNA expression entre IBC1/IBC2 spécimens et corrélation entre congelés et FFIP échantillons appariés. miRNA expression s’affiche dans le journal nombre par million (CPM), de haut en bas se lit comme suit (rouge pour la couleur bleue). L’importance de la différence d’expression entre les paires de deux tissus, par miRNA, est affiché par les cercles gris, avec haute et basse expression miARN identifiés dans les frais et les échantillons FFPE. (D) l’ARN Total extrait des frais correspondants et spécimens d’ARN de FFIP de cellule lignes (MCF10A et MCF7), maternel invasif du cancer (bac 1 et IBC2), cervical tissu mammaire (Cx), archivé des tissus du sein normal (normal Br1, Br2 normal et normal 3 Br), et Archivé l’envahissantes d’un cancer du sein (5 bac, bac 6 et IBC7) a subi la préparation cDNA de bibliothèque au sein d’une même série. Les données des end des miARN détectés dans les bibliothèques sont affichées dans une configuration de carte thermique. Ce chiffre a été modifié par Loudig et al. 20 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : ADNc bibliothèque préparation et miRNA expression corrélation entre les répétitions à l’aide d’anciens archivés échantillons FFPE. ARN total de 18, 20, 22, 27, 30 et 35 ans archivés FFIP du sein des échantillons de tissus ont subi notre protocole de préparation de bibliothèque de cDNA optimisée. Échantillons de 9 différents spécimens FFIP RNA ont été ligaturés avec différents 3' barcoded oligonucléotides et analysées au sein de la même bibliothèque sur semaine 1 (w1). La même expérience a été répétée dans un intervalle d’une semaine (semaine 2 ou w2). Mesures de la reproductibilité des données d’expression de miRNA dupliqué entre les mêmes spécimens archivés de RNA sont affichés dans les heatmaps et avec les coefficients de corrélation évaluées entre 0,93 et 0,99. Ce chiffre a été modifié par Loudig et al. 20 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Un protocole de préparation de bibliothèque cDNA hautement reproductible et robustes pour NGS de petits ARN archivées dans des échantillons FFPE ARN est présenté dans ce protocole, qui est une version modifiée et optimisée de la procédure décrite par Hafner et al. 22

Toutes les étapes de ce protocole ont été optimisés pour une utilisation avec ancien archivé et compromis l’ARN total extraite des échantillons FFPE. L’étape clé du présent protocole, pour le traitement des petites quantités d’ARN FFIP, réside dans la mise en commun de tous les échantillons d’ARN (c.-à-d., les échantillons FFPE ARN 18 individuels 100 ng) après des trompes individuels avec les adaptateurs d’avec code à barres unique de 3' 18. Cette étape essentielle permet les 18 échantillons FFPE RNA uniformément subir toutes ultérieures étapes biochimiques et enzymatiques nécessaires à la préparation de la petite bibliothèque de cDNA de RNA. En outre, cette étape maximise la quantité d’ARN subissant des précipitations et des purifications de gel en renforçant l’effet porteur de petites molécules d’ARN et en facilitant l’observation de granule et gel sélections. Une autre caractéristique essentielle de ce protocole, qui outre met en évidence sa polyvalence lorsque vous travaillez avec de petites quantités d’ARN FFIP, est qu’une réaction de PCR pilote sert à identifier le cycle d’amplification optimale de l’ADNc. Cette étape aussi permet de mieux comprendre la dynamique de l’amplification de la bibliothèque par rapport à une amplification amorce dimère, qui est critique lorsque le gel de préparation de la réaction PCR à grande échelle et la purification de la petite bibliothèque de RNA sur l’agarose. Les données ajoutées au présent protocole démontrent la reproductibilité de cette démarche entre appariés congelés et échantillons FFPE et également mettre en évidence son applicabilité à l’ancienne FFIP ARN des échantillons de spécimens archivés jusqu'à 35 ans.

Ce protocole a été modifié depuis sa version initiale, donc il est optimisé pour la préparation de petites bibliothèques de RNA issus de basse qualité et la quantité d’ARN FFIP chimiquement modifiés et compromis. Un des aspects de cette procédure qui a été modifiée pour ligaturer et amplifier les petits ARN à partir d’échantillons FFPE se rapporte à la quantité de calibrateur cocktail dopé au cours de l’initial de 3' ligature barcoded adaptateur, pour lesquels les entrées a été réduite à 0,026 nM pour empêcher concurrence avec la ligature de faible abondance petits ARN présentes dans les échantillons d’ARN FFIP. Une autre modification importante de la procédure d’origine est la suppression de tous les marqués radioactivement taille-marqueurs utilisés lors de la sélection du petit RNAs ligaturé sur les gels de la PAGE. Utilisation de ces marqueurs de taille radioactifs limité non seulement l’applicabilité de cette approche aux laboratoires certifiés pour l’utilisation de radio-isotopes mais aussi empêché d’observation des produits RNA sur les gels. Au contraire, dans ce protocole optimisé, marqueurs de taille sont exécuter en puits adjacents à la bibliothèque, sur le gel de la PAGE et visualisés directement avec un colorant fluorescent pour diriger l’excision du petit RNAs ligaturé. Ce qui est important, le colorant fluorescent est légèrement vaporisé sur le gel pour éviter la diffusion des produits RNA et puis visualisé sur une boite à lumière bleue. Par la suite, comme une mesure de précaution et d’améliorer la diffusion de la ligaturé petits ARN contenu dans les fragments de gel PAGE excisées, tubes de gel séparateur sont utilisés pour écraser uniformément le gel avant l’incubation dans une solution de NaCl à passer la nuit à 4 ° C sous agitation. Toutes ces étapes ont été soigneusement évalués pour travailler avec petites quantités de matériel.

Ce protocole a été appliqué aux échantillons FFPE ARN provenant de différentes sources (organes et institutions) qui avaient été entreposés pendant des quantités différentes de temps. Les analyses ont révélé la grande reproductibilité de séquencer des petits ARN de spécimens frais et surgelés, lorsque l’utilisation de ce optimisé la procédure. Des analyses supplémentaires à l’aide des plus anciens spécimens archivés FFIP, stockés jusqu'à 35 ans, démontré plus vaste applicabilité du protocole des échantillons cliniques. Le minimum requis d’entrée FFIP ARN pour les échantillons FFPE s’est avéré être 100 ng. Cette exigence faible permet d’application du présent protocole à une variété de lésions de différentes tailles et de disponibilité, mais elle ne permettrait pas l’analyse des unicellulaires FFIP RNA. Il est important de noter, cependant, que cela optimisé protocole a également été utilisé avec l’ARN total extrait de circulation exosomes avec entrées de moins de 1 ng et illustrées afin de fournir des profils d’expression des RNA petits hautement reproductibles (données non présentées). Cet apport réduit suggère que les petits ARN dans les échantillons FFPE, bien représentatif du tissu frais original, est présents dans des proportions beaucoup plus faibles que dans l’ARN total de circulation exosomes.

Dans des travaux récents, où ce protocole optimisé a été appliquée aux spécimens de DCIS FFPE cliniquement classifiés, il a été constaté que les différences d’expression miRNA identifiés par NGS de la Banque d’ADNc pourraient être validés par PCR quantitative. Ce travail a démontré la faisabilité d’utiliser des lésions de la CCIS de tissus archivés de différentes institutions d’études rétrospectives à grande échelle [20]. Cette étude a également mis en évidence la robustesse de cette préparation de bibliothèque de cDNA lorsque effectuées à des moments différents (à intervalles de plusieurs semaines), sans pour autant compromettre la reproductibilité et la sensibilité du test.

Compte tenu de l’énorme quantité de cliniquement classifiés spécimens archivés du FFIP, ce protocole optimisé fournit un outil robuste pour préparation de banques d’ADNc dans des analyses rétrospectives à grande échelle et l’éventuelle identification de biomarqueurs de miRNA associé de développement de cancer du21.

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Disclosures

Les auteurs tiennent à divulguer qu’une publication contenant certaines données présentées dans ce manuscrit a été publiée dans la revue internationale des Sciences moléculaires par Loudig et al. 21.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Thomas Tuschl, chef du laboratoire de biologie moléculaire des ARN, ainsi que des membres de son laboratoire pour leur soutien et pour le partage de la technologie mise au point dans son laboratoire et de la fourniture d’accès à l’oléoduc WashableMarker. Nous remercions également le Dr Markus Hafner partage son protocole et de fournir des descriptions détaillées sur toutes les étapes biochimiques et enzymatiques utilisées dans sa procédure initiale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

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References

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