Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

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Bioengineering

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Summary

Este protocolo ilustra un procedimiento seguro y eficaz para modificar CD133+ las células madre hematopoyéticas. El presentado no virales, magnético polyplex enfoque puede proporcionar una base para la optimización de los efectos terapéuticos de células madre, así en cuanto a la supervisión del producto celular administrada a través de la proyección de imagen de resonancia magnética.

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Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

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Abstract

Mientras CD133+ las células madre hematopoyéticas (SCs) se han demostrado para proporcionar alto potencial en el campo de la medicina regenerativa, sus tasas de retención baja después de la inyección en los tejidos lesionados, así como las tasas de muerte celular masiva observada conducen a muy efectos terapéuticos restringidos. Para superar estas limitaciones, intentamos establecer un protocolo basado no-virales para la ingeniería celular adecuado antes de su administración. La modificación de CD133 humano+ expresando SCs utilizando microARN (miR) cargada magnética polyplexes fue tratado con respecto a la eficiencia de absorción y seguridad así como el potencial de segmentación de las células. Confiando en nuestro protocolo, podemos lograr tasas de absorción miR alta de 80 – 90% mientras el CD133+ propiedades de células madre siguen siendo inafectadas. Además, estas células modificadas ofrecen la opción de orientación magnética. Aquí describimos un procedimiento seguro y altamente eficiente para la modificación de CD133+ SCs. Esperamos que este enfoque para proporcionar una tecnología estándar para la optimización de los efectos terapéuticos de células madre y para el seguimiento del producto celular administrada a través de la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI).

Introduction

CD133+ SCs representan una población heterogénea de células de vástago y del progenitor con prometedor potencial para la medicina regenerativa. Su diferenciación Hematopoyética, endoteliales y miógeno potencial1,2,3 permite la CD133+ de las células, por ejemplo, para contribuir a los procesos de neovascularización a través de la diferenciación en la formación de nuevos vasos y la activación de pro-angiogénica señalización paracrina mecanismos4,5,6,7.

A pesar de su alto potencial demostrado en más de 30 ensayos clínicos aprobados (ClinicalTrails.gov), su resultado terapéutico todavía está bajo discusión controversial4. De hecho, una aplicación clínica de SCs se ve obstaculizada por la baja retención en el órgano de interés y de la célula inicial masiva muerte5,8,9. Adicional de CD133+ SCs trasplante previo podría ayudar a superar estos desafíos.

Un requisito para una terapia celular eficiente sería la reducción de la muerte de la célula inicial masiva para mejorar el engraftment de células pertinentes terapéutica10. Los estudios actuales demuestran una pérdida inmensa de la célula del 90 – 99% en órganos altamente perfundidos como el cerebro y el corazón durante las primeras 1-2 h, independientemente del tipo de célula trasplantado o aplicación ruta11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC etiquetado utilizando nanopartículas magnéticas (MNPs) permite una estrategia invasiva innovadora a las células blanco para el sitio de interés22,23,24,25,26 y al mismo tiempo permite el celular control usando MRI27 y partículas magnéticas (MPI) la proyección de imagen. Más eficiente en vivo estudios aplicando células magnetizadas a retención celular usado después de la administración local preferentemente dirección de celda después de inyección intravenosa23,24,28 . Por lo tanto, nuestro grupo diseñó un sistema de entrega que consta de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas29. Con esta técnica, CD133+ SCs y las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) eficiente podrían ser objetivo, como lo demuestra en vitro trata de30,31.

Otro obstáculo para las terapias de la SC es el hostil entorno inflamatorio del tejido afectado después del trasplante, que contribuye a la muerte celular inicial del32. Además de varios estudios de acondicionamiento previo, la aplicación de terapéuticas relevantes miRs fue probado33; se ha demostrado con éxito que la anti-apoptotic miRs inhiben apoptosis en vitro y el engraftment de la célula en vivo33. Estas moléculas pequeñas, compuesto por 20-25 nucleótidos, desempeñan un papel crucial como moduladores postranscripcional de mensajero RNAs (mRNAs) y así afectan el destino y el comportamiento de la célula de vástago34. Por otra parte, la introducción exógena de miRs evitar la no deseada integración estable en el anfitrión genoma34.

Intentos actuales para la introducción eficiente de los ácidos nucleicos (NAs) en SCs primarios en su mayoría se basan en virus recombinantes8,35. A pesar de la eficacia de transfección alta manipulación de virus recombinante presenta un gran obstáculo para una traducción de banco a cabecera, p. ej., expresión génica incontrolable, patogenicidad, inmunogenicidad y mutagénesis de insertional35 ,36. Por lo tanto, son críticos para desarrollar sistemas de vectores no virales como construcciones basados en polímeros. Entre los, polietilenimina (PEI) representa un vehículo de entrega válida que ofrece beneficios para la miRs como condensación de NA para proteger de la degradación, absorción celular, y liberación intracelular a través de endosomal escapar37,38. Además, complejos de miR-PEI demostraron una alta biocompatibilidad en ensayos clínicos39. Por lo tanto, nuestro sistema consiste en un biotinilado ramificado 25 kDa PEI enlazado a un cubierto de streptavidin MNP-core30,31,40.

En este manuscrito, presentamos un protocolo completo que describe (i) el aislamiento manual de CD133+ SC de donación de médula ósea humana (BM) con una caracterización detallada del producto de SC y (ii) una estrategia de transfección eficiente y suave de un sistema de entrega basados en polímeros magnéticamente no-virales para la ingeniería genética de CD133+ SCs utilizando miRs. CD133+ SCs son aislados y magnéticamente enriquecido de humano aspira BM esternal utilizando una superficie basados en anticuerpos activada por el magnético celular (MACS) sistema de clasificación. Luego, la viabilidad de las células, así como la pureza de la célula se analiza mediante citometría de flujo. Posteriormente, se preparan el miR/PEI/MNP complejos y CD133+ SCs son transfectadas. 18 h después de la transfección, la eficiencia de la absorción y el impacto de la transfección en SC marcador expresión celular la viabilidad y se analizan. Por otra parte, la evaluación de la distribución intracelular de los compuestos complejos de transfección se realiza utilizando etiquetado del cuatro-color y microscopía de iluminación estructurada (SIM).

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Protocol

Esternal BM humano para aislamiento de células se obtuvo de donantes informados, que dieron su consentimiento para utilizar sus muestras para la investigación de acuerdo con la declaración de Helsinki. El Comité de ética de la Universidad de Rostock ha aprobado el estudio presentado (REG. Nº A 2010 23, prolongada en 2015).

1. preparación de la célula

Nota: Utilice heparina sódica (BM de 250 UI/mL) para prevenir la coagulación para la examinación de BM.

  1. CD133+ SC aislamiento
    1. Preparación de soluciones requiere
      1. Preparar el tampón fosfato salino (PBS) / ácido etilendiaminotetracético (EDTA) acción (2 mM) de solución mezclando 996 mL de PBS 1 x con 4 mL de EDTA (0.5 M). Vigorosamente, mezclar la solución y filtrar usando un filtro de 0.45 μm. Almacenar a temperatura ambiente (RT).
      2. Preparar el tampón MACS mezclando 995 mL de PBS/EDTA 2 mM con 5 g de albúmina de suero bovino (BSA). Vigorosamente, mezclar la solución y filtrar usando un filtro de 0.45 μm. Almacenar a 4 ° C.
      3. Preparar la solución stock de colagenasa B (40 mg/mL) diluyendo 500 mg de colagenasa B (de Clostridium histolyticum) en 12,5 mL de PBS. Mezcle la solución enérgicamente, hacer alícuotas de 350 μl y almacenar a-20 ° C.
      4. Preparación de desoxirribonucleasa (DNasa) acción solución (10 mg/mL) diluyendo 100 mg de la ADNsa I (páncreas bovino) en 10 mL de PBS. Mezcle la solución enérgicamente, hacer alícuotas de 350 μl y almacenar a-20 ° C.
    2. Digestión enzimática de la BM humana
      1. Caliente previamente el medio de linfocitos humanos a RT y descongelar las enzimas (1 parte alícuota cada de colagenasa B y DNasa por 20 mL BM).
      2. Recoger el BM de las jeringas en un tubo cónico de 50 mL y mezclar suavemente. Deseche cualquier coágulos existentes.
        Nota: Transfiera 200 μL de BM sin diluir en un tubo de 1,5 mL para análisis cytometric del flujo posterior. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
      3. Transferir 10 mL BM a un nuevo tubo cónico de 50 mL, añadir 6 mL de PBS/EDTA (2 mM), 20 mL de medio de linfocitos humanos, 175 μl de colagenasa B (40 mg/mL) y 175 μl de DNasa I (10 mg/mL). Suavemente mezcle la solución e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador. Repita para la muestra restante de BM.
    3. Centrifugación de gradiente de densidad
      1. Preparar un tubo de centrifugación del gradiente de densidad de 50 mL mediante la aplicación de 15 mL de linfocitos humanos, separar medio en un tubo de 50 mL. Centrifugar a 1.000 x g durante 30 s.
      2. Cuidadosamente la capa 35 mL de BM diluida en la parte superior del filtro de tubo de centrifugación del gradiente de densidad y centrifugue a 445 x g durante 35 min a TA.
        Nota: Configuración centrífuga es (3) de baja aceleración y sin freno (1).
      3. Retire con cuidado el tubo de la centrífuga sin agitación. Deseche cuidadosamente 20 mL de la solución clara superior sin tocar la capa turbia directamente encima del filtro.
      4. Cuidadosamente transfiera la capa turbia (que está directamente encima del filtro y contiene las células mononucleares (MNCs)) en un nuevo tubo cónico de 50 mL y llenar con PBS/EDTA hasta un volumen final de 50 mL.
        Nota: Combinar todas las multinacionales de una muestra de paciente BM en un tubo nuevo.
      5. Contar las multinacionales por transferir 10 μl de la suspensión de células de 50 mL a un tubo de 1,5 mL. Añadir 10 μl de ácido acético al 3% con azul de metileno. Suavemente mezcle y aplique 10 μL en una cámara de conteo. Calcular el número de empresas multinacionales.
      6. Centrifugar la suspensión MNC a 300 x g durante 10 minutos eliminar el sobrenadante.
        Nota: Durante la centrifugación, enfriar la centrifugadora de RT a 4 ° C.
    4. Selección magnética de CD133+ SCs usando partículas de dextrano de hierro superparamagnético anticuerpo ligado de CD133 humanas
      Nota: Durante este paso, funciona en el hielo. Almacene las soluciones hasta su uso a 4 ° C. Tienda Mac imán permanente, columnas de separación y filtro de separación previa a 4 ° C.
      1. Elija el tamaño de columna. Para < 1.2 x 108 multinacionales, uso MS columnas y para > 1.2 x 108 multinacionales, usar LS columnas (véase Tabla de materiales).
      2. Para preparar la selección magnética de 1 x 108 número de total de la célula, resuspender cuidadosamente las empresas multinacionales en 300 μL de tampón de MACS (4 ° C). Añadir 100 μl de reactivo de bloqueo de FcR (4 ° C) y 100 μl CD133 anticuerpo ligado superparamagnético hierro dextrano partículas (4 ° C).
      3. Suavemente mezcle la suspensión de células e incubar durante 30 min a 4 ° C. Suavemente agite la suspensión de células durante la incubación (2 – 3 x).
      4. Añadir 2 mL de tampón de MACS (4 ° C) por 1 x 108 total que MNCs. mezclar suavemente la suspensión y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
      5. Configurar el soporte magnético de MACS y coloque el imán permanente Mac. Instalar la columna de MACS y aplicar el filtro de separación previa en la parte superior.
      6. Equilibrar la primera columna de MACS MS/LS y el filtro de separación previa con 0.5 mL (MS) o (LS) de 3 mL de tampón de MACS (4 ° C).
        Nota: Nunca permita que las columnas de MACS para secarse después de equilibrar.
      7. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido en 500 μl de tampón de MACS (4 ° C) por 1 x 108 cantidad de total de la célula. Aplicar la suspensión de células en el filtro de separación previa.
      8. Lave el filtro de columna y separación previa de MACS usando tres veces, para cada colada, 0,5 mL (MS) o 3 mL (LS) de Mac del almacenador intermediario (4 ° C).
        Nota: Durante la tercera etapa de lavado, instale una segunda columna de MACS en el imán permanente de MACS y equilibre la segunda columna de MACS MS/LS (MS) de 0,5 mL o 3 mL (LS) de tampón de MACS (4 ° C).
      9. Deseche el filtro de separación previa.
      10. Eluir la fracción celular directamente en la segunda columna de MACS: Añadir 1 mL (MS) o 5 mL (LS) de tampón de MACS (4 ° C) en la primera columna de MACS y quitar la columna de MACS de imán permanente Mac. Inmediatamente transferir la primera columna Mac encima de la segunda columna Mac y empuje la suspensión de células a través de la columna de MACS usando el émbolo suministrado.
      11. Lavar la columna Mac tres veces, utilizando para cada colada (MS) de 0,5 mL o 3 mL (LS) MACS tampón (4 ° C).
      12. Eluir la fracción celular de la columna por adición de 1 mL (MS) o 5 mL (LS) de tampón de MACS (4 ° C) en la segunda columna de MACS y quitar la columna de MACS de imán permanente Mac. Inmediatamente transferir la segunda columna Mac encima de un tubo de 1,5 mL (MS) o un tubo cónico de 15 mL (LS) y la suspensión de células a través de la columna de MACS usando el émbolo provisto de empuje.
      13. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido en 100 μl de buffer de MACS (4 ° C).
      14. Cuenta la CD133+ células: transferencia 6 μl de la suspensión de células en un tubo de 1,5 mL. Añadir 6 μl solución de azul de tripán (0.4%). Suavemente mezcle y aplique 10 μL en una cámara de conteo. Calcular el número de CD133+ las células.
      15. Almacenar el CD133+ de las células en hielo hasta la siembra.
  2. Caracterización de CD133 recientemente aisladas+ SCs
    Nota: El siguiente trabajo debe llevarse a cabo en una habitación protegida de la luz (tenue de iluminación solamente). Mantener tubos, buffers y anticuerpos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
    1. Preparación de los CS para análisis cytometric del flujo
      1. Utilizar dos muestras (cada 10 μl) de alícuotas de BM y una muestra de CD133 recientemente aisladas+ SCs (mínimo, 1 x 104 células) para el análisis. Transferencia de las células en un tubo de 1,5 mL. Añadir 10 μl de reactivo de bloqueo de la FcR y llenar el buffer de MACS (4 ° C) hasta un volumen de 33 μl.
      2. Añadir los siguientes anticuerpos hacia el lado interno del respectivo tubo (ver tabla 1): isotiocianato de anti-CD34-fluoresceína (FITC) (clon: AC136), anti-CD133/2-ficoeritrina (PE) (clon: 293 3), control de isotipo IgG de ratón 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin APC ())-H7 (clon: 2D 1) y 7-aminoactinomycin (DAA). Después se han añadido todos los anticuerpos, sacudaren abajo del lado de los anticuerpos del tubo. Suavemente mezcle la solución (volumen final 50 μL) e incubar 10 min a 4 ° C.
      3. Añadir 1 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) x 1, suavemente la suspensión de la mezcla e incubar en hielo 10 minutos, centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
      4. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido en 100 μl PBS (4 ° C). Almacenar en hielo hasta el análisis cytometric del flujo.
    2. Flujo de análisis cytometric del CD133+ SCs
      1. Para examinar la viabilidad de las células y la pureza de CD133+ SC, use un adaptado internacional sociedad de Hematotherapy e Ingeniería (injerto de ISHAGE) flujo cytometry bloquea estrategia41 (véase la representación representativa en la figura 1). Utilice el siguiente orden:
        Paso 1: selección de la población de la célula (figura 1A)
        Paso 2: selección de CD45+ las células (figura 1B)
        Paso 3: selección de CD45 viable+ las células (figura 1)
        Paso 4: selección de CD45 viable+/CD34+ las células (figura 1)
        Paso 5: selección de CD45 viable+/CD34+/CD133+ las células (Figura 1E)
        Ejecutar el citómetro de flujo (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante.
      2. Calcular la viabilidad celular y la pureza con las siguientes ecuaciones:

Equation 1   Ecuación 1

Equation 2   Ecuación 2

  1. Cultura de CD133 recién aislado de células+ SCs
    1. 100 alícuota x cytokine humano recombinante suplemento en alícuotas μl 100 y almacenar a-20 ° C. Descongelar una alícuota de 100 x antes de la preparación media.
    2. Preparar el CD133+ SC medio de cultivo, libre de suero hematopoyético de la célula expansión suplementado con suplemento de cytokine humano recombinante (final 1 x) y 1% de penicilina/estreptomicina.
    3. Semilla 5 x 104 recién aislado CD133+ SCs para transfección en una placa de 24 pozos con 500 μl de medio de cultivo. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2 y 20% O2.
      Nota: Semilla 5 x 104 recién aislado CD133+ SCs como control para el análisis cytometric del flujo.

2. preparación de complejos de transfección

Nota: Durante este paso, mantenga la ribonucleasa de espacio de toda la obra (Rnasa)-libre uso solución de descontaminación de RNasa y utilizar material consumible sólo libre de Rnasa.

  1. Preparación del miR
    Nota: El siguiente trabajo debe llevarse a cabo en una habitación protegida de la luz (tenue de iluminación solamente).
    Nota: para la muestra de miR: tinte uso Cianina 3 etiquetado precursor miR y miR precursor sin etiqueta.
    1. Para preparar la solución madre de miR (50 μm), diluya la cantidad deseada de miR en el volumen adecuado de agua libre de nucleasas (p. ej., diluir 5 nmol de miR en 100 μl de agua). Suavemente mezcle la solución, alícuota la población miR (5 μl) y almacenar por debajo de-20 ° C.
  2. Preparación de PEI
    1. Preparar el PEI siguiendo protocolos estándar y nota el PEI concentración stock31,42 .
  3. Preparación de MNP
    1. Preparar el MNPs siguiendo protocolos estándar y observe el MNP concentración stock31,42.
  4. Preparación de complejos de miR/PEI
    1. Preparar solución glucosa al 5% diluir D-(+)-glucosa en agua libre de nucleasa. Suavemente mezcle la solución, alícuota del stock (1,5 mL) y almacenar a 4 ° C.
      Nota: El siguiente trabajo debe llevarse a cabo en una habitación protegida de la luz (tenue de iluminación solamente).
    2. Utilice 20 pmol miR por pozo de placa de 24 pozos30. Diluir el miR en la solución de glucosa 5% a una concentración final de 0.25 miR de pmol/μl.
    3. Calcular la cantidad de PEI requerido basado en la cantidad de miR (20 pmol, paso 2.3.1) y nitrógeno óptima (de PEI) fosfato (del miR) razón (N/P) basado en la concentración de acciones del PEI (paso 2.2.1; aquí, se utilizó una proporción de 7.5)30. Diluir el PEI en una cantidad igual de solución de glucosa 5% basada en la ecuación:
      Equation 3
      que acomoda a
      Equation 4    Ecuación 3
      donde volumen de PEI en μl y [PEI] es en m y N/P (optimizado para este protocolo) es 0.75. 0.12 es un factor de conversión específico de miR.
    4. Añadir el PEI previamente diluido en el miR previamente diluido y vortex durante 30 s.
    5. Incubar el miR/PEI complejo por 30 min a TA.
  5. Preparación de los complejos de miR/PEI/MNP
    Nota: El siguiente trabajo debe llevarse a cabo en una habitación protegida de la luz (tenue de iluminación solamente).
    1. Al incubar el complejo miR/PEI, preparar el MNPs sonicando MNPs por 20 min a 35 kHz en el sonicating baño de agua a temperatura ambiente para las partículas en suspensión y no agregando.
    2. Calcular el número de requerido MNPs (hierro de 3 μg/mL) basado en la solución stock de MNP (paso 2.3.1).
    3. Añadir las sonicación MNPs en la miR/PEI complejos y vortex para incubar s. 30 los complejos miR/PEI/MNP por 30 min a TA.
  6. Preparación de los complejos de transfección para etiquetado del cuatro-color con SIM
    Nota: Use miR precursor sin etiqueta.
    1. Etiqueta de la miR con tinte de Cianina 5 usando un tinte de Cianina 5 miR etiquetado kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante. Medir la concentración de final de la miR utilizando el espectrofotómetro lista (véase Tabla de materiales) de acuerdo a la configuración previa proporcionada por el fabricante (ácido nucleico RNA-40). Alícuota que del miR (5 μl) y conservar a-80 ° C protegidos de la luz.
    2. Etiqueta el PEI con una fluorescencia verde brillante tinte utilizando un etiquetado adecuada proteína kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante. Definir la concentración final del PEI mediante el ensayo de ninhidrina (paso 2.2.1). Alícuota del PEI (en el volumen calculado basado en la ecuación 3) y almacenar a 4 ° C protegido de la luz.
    3. Etiqueta de las MNPs con colorante rodamina conjugado con biotina utilizando una relación de 1:1,000 w/w, tinte a MNP. Mezclar el colorante rhodamine MNPs simultáneamente con la preparación de la formación del complejo miR/PEI e incubar la solución por 30 min en la oscuridad. Directamente utilice MNPs.

3. transfección de CD133+ SCs

Nota: Durante este paso, mantenga la ribonucleasa de espacio de toda la obra (Rnasa)-libre con solución de descontaminación de RNasa y utilizar material consumible sólo libre de ARNasa
Nota: El siguiente trabajo debe llevarse a cabo en una habitación protegida de la luz (tenue de iluminación solamente).

  1. Añadir gota a gota el complejo miRNA/PEI/MNP preparado directamente en el pozo correspondiente que contiene el recién aislados CD133+ SCs en medio de cultivo.
  2. Mezclar suavemente, meciendo la placa hacia adelante y hacia atrás. Incube las células durante 18 h a 37 ° C, 5% CO2 y 20% O2.

4. Análisis de la miR de la transfección

  1. Examen de la eficacia de la absorción de miR y la citotoxicidad de los complejos de transfección
    Nota: para la muestra de miR: usar tinte de Cianina 3 etiquetado miR de precursor para la evaluación de la absorción y CD133 no transfectadas SCs+ para las puertas de control de citometría de flujo.
    Nota: El siguiente trabajo debe llevarse a cabo en una habitación protegida de la luz (tenue de iluminación solamente).
    Nota: Mantenga los tubos, buffers y anticuerpos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
    1. Preparar la solución madre de paraformaldehido (PFA, 4%) diluir 4 g PFA en 100 mL de PBS y calentando la solución a 80 ° C. Vigorosamente la solución de la mezcla y ajustar el pH a 7.3. Alícuota del PFA (1,5 mL) de stock y almacenar a-20 ° C.
    2. 18 h después de la transfección, recoge cada pozo en un separado 1,5 mL tubo. Lavar cada pozo una vez con 500 μl de PBS y transferir esta suspensión de células al mismo tubo.
    3. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido en 100 μl de buffer de MACS de 4 ° C.
    4. Añadir 0,5 μl de un colorante reactivo de Amina a distinguir entre células vivas y muertas, suavemente la suspensión de la mezcla e incubar 10 min a 4 ° C. Añadir 1 mL PBS (4 ° C) y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
    5. Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado obtenido en 100 μl PBS, agregar 33 μl PFA (4%) y almacenar en hielo o a 4 ° C hasta el análisis cytometric del flujo.
    6. Organizar la estrategia bloquea según la representación representativa en la figura 2. Ejecutar las muestras en el citómetro de flujo (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante.
  2. Caracterización de la miR-transfected CD133+ SCs
    Nota: Utilizar miR precursor sin etiqueta como CD133 no transfectadas SCs+ para las puertas de control de citometría de flujo.
    1. Recoger cada uno bien en un tubo separado 1.5 mL y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
    2. Utilice la estrategia bloquea como se describe en el paso 1.2.
  3. Examen de la distribución intracelular de complejos de transfección por SIM
    1. Preparar los complejos y transfectar las células como se describe en la sección 2 y sección 3.
    2. 18 h después de la transfección, recoge cada pozo en un separado 1,5 mL tubo. Lavar cada pozo una vez con 500 μl de PBS y transferir el lavado respectivo tubo del pozo. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
    3. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido en 1 mL de suero bovino fetal (FBS) de 2% en PBS, suavemente mezclar la suspensión y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
    4. Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado obtenido en 100 μl de PBS y agregar 33 μl PFA (4%) por 20 min.
    5. Transferir la suspensión de células en una nueva placa 24-cultura con cubreobjetos de vidrio estéril y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
    6. Deseche el sobrenadante y agregar 500 μl de PBS. Homogeneizar la placa y descartar el PBS.
    7. Coloque el cubreobjetos preparado en las diapositivas microscópicas usando medio de montaje acuoso para preservar de la fluorescencia y secar a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
    8. Adquisición de imágenes con un objetivo de inmersión 100 X aceite. Configuración de SIM: 405, 488, 561 y líneas de láser de 633 nm para la excitación y z-pilas con una profundidad de 16 bits a 3 ángulos, 3 fases, con un promedio de 4, redes por la línea de láser: 23 μm – 405, 34 μm – 488, 42 μm – 561, 51 μm – 633.

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Representative Results

El protocolo presentado describe un aislamiento manual y enriquecimiento magnético de CD133 humano derivados de BM+ CS con una célula independiente del virus posterior ingeniería de estrategia, como una tecnología no invasiva para la manipulación de la célula en vitro y en vivo herramienta de monitorización.

Esta tecnología de aislamiento de tres pasos permite una separación de las empresas multinacionales del BM esternal previamente digerido a través de centrifugación de gradiente de densidad. Luego, un CD133+ fracción de la célula puede enriquecerse magnéticamente usando la tecnología de aislamiento apropiado. Esto permite un enriquecimiento de CD133+ SCs con viabilidad y pureza superior al 80%, que puede ser determinado por citometría de flujo (figura 1). En adelante, sólo los productos de SC que coinciden con los requisitos fueron utilizados para experimentos adicionales.

El método de la transfección se describe aquí permite una introducción muy eficaz de miR en estos recién aislado humano CD133+ CS con una absorción de aproximadamente el 80% de viable de las células (figura 2)30. Además, no hay ningún efecto citotóxico significativo evidente 18 h después en comparación con el control de la transfección de las células (figura 2)30. Por otra parte, un suministro suficiente y distribución normal de los compuestos complejos de transfección (miR, PEI y MNPs) se observa dentro del citoplasma de las células con SIM (figura 3).

Figure 1
Figura 1: Representante Boolean gating estrategia para CD133+ SC caracterización. (A-E) Representación de una estrategia de selección de 5 pasos para una estricta evaluación de la viabilidad celular y la pureza de aislado CD133+ SC así como control de isotipo de CD133 (F) con la muestra sin tratamiento apropiada de BM. (A) excepto residuos de la población de célula intacta en una parcela de punto adelante/side scatter (FSC/SSC), seguido por la selección sucesiva de CD45 (B)+ celular población, CD45 viable (C)+ población, (D) de la célula viable CD45 positivo doble+/CD34+ población de la célula y (E) viable triple CD45 positivo+/CD34+/CD133+ población de la célula. Naranja: CD45+/CD34+/CD133+ células destacadas dentro de cada etapa de selección. Leyenda: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: Forward Scatter canal, PE: anti-CD133, SSC: canal de dispersión lateral, 7-AAD: 7-aminoactinomycin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representante bloquean la estrategia para la evaluación de la eficiencia de absorción de la miR y la citotoxicidad de la transfección compleja. Bloquea las estrategias de (A, B) transfected CD133+ SCs así como (C, D) no-transfected CD133+ SCs para el análisis de (A, C) Cyanine3 tinte etiquetado miRNA precursor uptake () eficiencia rojo: Cy3 viable+ las células) y (B, D) los efectos citotóxicos de lo procedimiento de transfección marcaron por un tinte reactivo de la amina para distinguir entre células vivas y muertas (azul: las células muertas). Leyenda: SSC: canal de dispersión lateral, las células solamente: no transfectadas CD133+ SCs, miRNA/PEI/MNP: CD133+ SCs transfected con marcado con Cy3 miR haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: visualización intracelular de la transfección complejo. CD133+ SCs fueron transfectadas con tricolor etiquetado complejo miR/PEI/MNP (miR: 20 pmol, PEI: relación N/P 7.5, MNP: 3 μg/mL). Representante de visualización se realizó 18 h después de transfección mediante microscopía de iluminación estructurada. La miR fue etiquetada con tinte Cyanine5 (rojo), PEI con un colorante de fluorescencia verde brillante (verde), MNPs con colorante rodamina conjugan con biotina (amarilla) y el núcleo fue contratinción con DAPI (azul). Barra de escala = 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

muestra Reactivo de bloqueo de FCR [μl] Mac del almacenador intermediario [μl] anticuerpos [μl] total [μl]
número muestra células [μl] Isotipo de CD133-PE CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 AÑADIR
1 BM 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 BM 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 104) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

Tabla 1: distribución de pipeteo para caracterización de CD133 + SCs.

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Discussion

En los últimos años, CD133+ SCs han surgido como una población prometedora de células para terapias basadas en la SC según lo evidenciado por varias fase I, II y III ensayos clínicos43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. aquí, presentamos un protocolo detallado para el estándar manual purificación y flujo cytometric caracterización de estas células de humano BM esternal. El procedimiento de aislamiento basados en MACS descrito representa una estrategia suave, rápida y eficiente para obtener una fracción de SC hematopoyética altamente pura y viable. La buena compatibilidad combinada con la rápida degradación de co-inyección MicroBeads MACS utilizados para la clasificación de la célula ha sido demostrada previamente por nuestro grupo55,56.

Este procedimiento de aislamiento fue desarrollado usando BM esternal humana como materia prima, y por lo tanto, el protocolo actualmente permite la purificación de hematopoyéticas SCs para uso en investigación no clínica. Si CD133+ SCs están aislados de otros tejidos (por ejemplo, BM Obtenido de cresta iliaca) varios pasos del protocolo tales como centrifugación de digestión y densidad de tejido enzimática pueden requerir adaptación. Para la aplicación clínica de la célula, nuestro grupo más estableció un procedimiento de fabricación in situ compatibles con GMP con el necesita de un sistema automático con el fin de satisfacer las demandas adicionales en nombre de clínica57.

Ingeniería de SCs antes de su aplicación es una nueva estrategia para superar ciertos obstáculos en el tratamiento del SC, incluyendo retención de baja celular y muerte celular masiva. El protocolo actual comprende instrucciones para la producción de un sistema de transfección viral libre multifuncional basado en PEI ramificado a MNPs y su introducción eficiente en el CD133+ SCs30. Aplicación de este sistema permite la modificación genética de la célula, célula magnéticamente controlados orientación y seguimiento no invasivo de la célula mediante MRI o MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.

Lo importante, las condiciones descritas de la transfección se han optimizado para la modificación genética transitoria de CD133+ SCs derivados de BM30. En trabajos anteriores, este sistema de transfección ha aplicado también con éxito para la entrega del plásmido ADN y miR a otros tipos de célula31,40,60. Estos experimentos han demostrado que la eficiencia de transfección y citotoxicidad es depende del tipo de la célula. Por lo tanto, las composiciones óptimas de NAs, PEI y MNPs deben definirse para cada tipo de célula.

Debido a su alta eficiencia, el PEI es uno de los polímeros más utilizados para no virales célula genética ingeniería61. Sin embargo, la aplicación clínica61,62 de PEI es muy limitada hasta la fecha debido a su toxicidad general61,63. Curiosamente, nuestro grupo demostró recientemente que MNPs reducen la toxicidad de la PEI cuando esté incluido en el sistema de transfección31,60. Al mismo tiempo, la posible toxicidad de las nanopartículas de óxido de hierro base causadas por la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) es dependiente de la dosis y varios tipos de nanopartículas superparamagnéticas están aprobados para MRI64,65 . Sin embargo, debe prestarse atención a la toxicidad del sistema en vitro y en vivo.

En general, el protocolo es bastante complejo, que contiene muchos pasos críticos que deben ser abordados con mucho cuidado. Para ello, hemos destacado estos puntos en la sección de protocolo con las notas. En particular, nos gustaría señalar la importancia de un ambiente totalmente libre de ARNasas y evitando cualquier exposición a la luz durante el manejo los tintes fluorescentes aplicados.

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Disclosures

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el Ministerio Federal de educación, investigación de Alemania (FKZ 0312138A y 316159 FKZ), la estado Mecklenburg-Western Pomerania con fondos estructurales (FSE/IVWM-B34-0030/10 y FSE/IVBM-B35-0010/12) y DFG (DA1296/2-1), el Fundación de corazón alemán (01/12/F), el BMBF (VIP + 00240) y la Fundación húmeda. Además, F.H. y P.M. son apoyados por el Cajamarca programa de Rostock University Centro médico (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

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