Meten van oefening niveaus bij Drosophila melanogaster met behulp van de roterende oefening kwantificering (systeemvereisten)

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De roterende oefenen kwantificering (systeemvereisten) kan leiden tot oefening in Drosophila melanogaster via rotatie terwijl gelijktijdig het meten van de hoeveelheid activiteit, uitgevoerd door de dieren. Hier presenteren we een punt-voor-punt protocol detailleren hoe meet je activiteitenniveaus van dieren ervaren rotatie oefening behandelingen met behulp van de REQS.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS). J. Vis. Exp. (135), e57751, doi:10.3791/57751 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Drosophila melanogaster is een nieuwe modelorganisme voor studies in de biologie van de oefening. Tot op heden twee belangrijkste oefening systemen, zijn de Power Tower en de tredmolen beschreven. Echter, een methode voor het meten van de hoeveelheid extra dierlijke activiteit geïnduceerd door de oefening behandeling heeft ontbroken. De roterende oefenen kwantificering (systeemvereisten) vult deze behoefte, bieden een zekere mate van dierlijke activiteit voor dieren rotatie oefening ervaren. Dit protocol gebruiken de REQS om te beoordelen van dierlijke activiteit tijdens de rotatie oefening gedetailleerd en illustreert het type gegevens die kunnen worden gegenereerd. We laten hier zien hoe de REQS wordt gebruikt voor het meten van seks - en stam-specifieke verschillen in oefening geïnduceerde activiteit. De REQS kan ook worden gebruikt om te evalueren van het effect van diverse andere experimentele parameters zoals de grootte van de leeftijd, dieet, of bevolking op oefening geïnduceerde activiteit. Daarnaast kan het worden gebruikt om te vergelijken van de werkzaamheid van andere oefening training protocollen. Belangrijker, biedt het de mogelijkheid om te standaardiseren oefening behandelingen tussen stammen, waardoor de onderzoeker om gelijke hoeveelheden van de activiteit tussen groepen indien nodig. Dus de REQS is een opmerkelijke nieuwe bron voor oefening biologen werken met het systeem van Drosophila model en vormt een aanvulling op de bestaande systemen van de oefening.

Introduction

Onderzoekers hebben onlangs begonnen met de fruitvlieg Drosophila melanogaster oefening biologie studeren. D. melanogaster is een genetische modelsysteem voor meer dan 100 jaar1,2. Echter, Drosophila onderzoek heeft bijgedragen aan niet alleen genetica, maar ook aan een verscheidenheid van andere disciplines waaronder neurobiologie, gedrags biologie en fysiologie3. In 2009, de Power Tower, was de eerste oefening machine voor Drosophila beschreven4. De Power Tower maakt gebruik van de dieren negatief geotaxis reactie. Wanneer verstoord, de Drosophila neiging te bewegen naar de top van hun behuizing. Deze reactie is een gevestigde en vormt de basis van de populaire "RING" (snelle iteratieve negatieve Geotaxis5) test die wordt gebruikt om te schatten klimmen vermogen en/of fysieke fitheid in Drosophila. De Power Tower maakt gebruik van een mechanische arm verbonden met een motor eenheid te herhaaldelijk heffen een aantal dieren binnen hun bijlagen door verscheidene duim en vallen ze terug op de grond voor het opwekken van de negatieve geotaxis-reactie (Tinkerhess et al. 20126 voorzien van een video ter illustratie van het gebruik van de Power Tower). Langdurige behandeling op de Power Tower dus verhoogt het bedrag van lichamelijke activiteit (actief of vliegend) de dieren voeren ten opzichte van onbehandelde dieren en over tijd leidt tot betere prestaties in de RING-assay voor fysieke fitheid4. Dus, dit werk toonde de haalbaarheid van het gebruik van Drosophila als een model voor oefening biologie.

Uit te breiden het repertoire van tools beschikbaar voor Drosophila oefening onderzoek, in 2016, beschreven Mendez en collega's een tweede Drosophila oefening machine, de tredmolen7. Vergelijkbaar met de Power Tower, de tredmolen exploiteert de negatieve geotaxis reactie van Drosophila. Echter, dit antwoord wordt geïnduceerd door voortdurende rotatie van de dierlijke behuizingen, in plaats van opheffing en neer te zetten zoals de Power Tower. Deze methode van inductie is zachter en zorgt voor een meer uithoudingsvermogen georiënteerde oefening regime dat vermijdt eventuele fysieke trauma's die zich tijdens de oefening in de Power Tower voordoen kan (Zie Katzenberger, R. J. et al. 20138 voor de gevolgen van herhaald fysieke trauma's op de gezondheid van de Drosophila). Vergelijkbaar met de Power Tower4, oefening behandeling van dieren op de tredmolen leidt tot een verscheidenheid van fysiologische reacties, met inbegrip van wijzigingen in de fysieke fitheid, triglyceridenspiegels en lichaam gewicht7. Dus, twee complementaire methoden zijn beschikbaar voor Drosophila biologen bestuderen van oefening.

Een beperking van zowel de Power Tower en de tredmolen is het onvermogen om te meten van de hoeveelheid activiteit geïnduceerd door de behandeling van de oefening. Analyse van video-opnames ontleend aan de tredmolen aangetoond dat er aanzienlijke verschillen tussen de diverse stammen van Drosophila in hoe ze op de behandeling van oefening7 reageren. In het bijzonder de stammen studeerde verschilde in hoeveel extra activiteit die de dieren uitgevoerd wanneer7gestimuleerd. Deze observatie gevraagd ons een derde oefening systeem, de roterende oefenen kwantificering (systeemvereisten), dat ons toelaat om het meten van dierlijke activiteitsniveaus tijdens rotatie-geïnduceerde oefening9te ontwikkelen. De REQS maakt gebruik van een commercieel beschikbare activiteit controle eenheid die is geïnstalleerd op een roterende arm te stimuleren van oefening door middel van rotatie in de tredmolen. Eerste werk met de REQS bevestigt dat genetisch verschillende Drosophila stammen — en geslachten - aanzienlijk verschillende reacties op de roterende stimulatie kan hebben en dus de hoeveelheid oefening geïnduceerde niet identiek onder verschillende genotypen9 . Aldus, de REQS nu kan Drosophila biologen te meten van de hoeveelheid oefening geïnduceerde door de behandeling, openen van een scala aan nieuwe mogelijkheden van het onderzoek op het gebied van de oefening.

Hier beschrijven we in detail hoe te gebruiken de REQS voor de kwantificering van rotatie oefening. De REQS induceert rotatie oefening en gelijktijdig maatregelen de activiteitenniveaus van de dieren worden behandeld. De REQS is geschikt voor een scala aan oefenprogramma's, variërend van eenvoudige 2 h continu oefening regime aangetoond dat hier meer complexe interval trainingsmethoden zoals beschreven door Mendez en collega's7en stimulatie kan worden aangepast via Rotatiesnelheid (tussen ongeveer 1-13 rotaties per min). Deze methode is afhankelijk van de activiteit monitor-eenheid gebruikt voor de productie van de REQS, aan te passen aan de analyse van enkele vliegen of grote populaties van de dieren. Door deze veelzijdigheid biedt de REQS Drosophila onderzoekers met een scala aan mogelijkheden om te studeren, bijvoorbeeld, verschillende oefening regimes, dieet interventies, of de gevolgen van de bevolkingsdichtheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De REQS bestaat uit een Drosophila Activity Monitor-eenheid (, vindt u meer broninformatie Tabel of Materials) gemonteerd op een roterende arm die wordt beheerd door een motor unit (Figuur 1). De activiteitenmonitor bepaalt hoe vaak in een bepaalde periode de array van laserstralen ontrafeling van het midden van de test-buis wordt verstoord. Zie onze eerdere publicatie9voor gedetailleerde tekeningen en een diepgaande karakterisering. Terwijl onze systeem maakt gebruik van de LAM25H-eenheid, kan de REQS worden gewijzigd voor andere Drosophila Activity Monitor eenheden ook.

1. het testen van de installatie van de REQS

  1. Load test vliegt in glas specimen buizen door het anesthetizing van de dieren met CO2 of andere gekozen methode voor de behandeling, verhuizen ze naar de lege buizen en aftopping van de buizen.
  2. Afgetopte glazen specimen buizen in de sleuven van de eenheid van economische activiteit monitor invoegen. Veilig de buizen met behulp van rubberen O-ringen (17-18 meter) en/of elastiekjes aan beide zijden van de eenheid te controleren van de buizen niet tijdens rotatie bewegen zich:
    1. Een O-ring glijden over de buis specimen en plaats de O-ring dicht bij het midden van de buis. Plaats de specimen buis in een sleuf van de activiteitenmonitor van de voorzijde en centrum.
    2. Verplaats de O-ring desgewenst en zorgen dat zodra de specimen buis is gecentreerd, wordt de O-ring gleed zo dicht mogelijk bij de eenheid van economische activiteit monitor mogelijk. Corrigeer de specimen buis in plaats door uitglijden een tweede O-ring over de glazen buis vanaf de achterkant, opnieuw verplaatsen de O-ring zo dicht mogelijk bij de eenheid van economische activiteit monitor mogelijk.
  3. Inleiden van rotatie van de REQS van het wegknippen van de power-schakelaar aan de voorkant van het toestel. Pas de rotatiesnelheid met de draaiknop aan de voorzijde van de unit op de gewenste snelheid (4 rpm (rotaties per min) in dit voorbeeld).
    Opmerking: De rotatiesnelheid in dit voorbeeld werd gekozen op basis van een eerder gepubliceerde studie7. Aangezien verschillende toerentallen in verschillende dierlijke activiteitenniveaus, resulteren zal starten van een nieuwe studie, kan optimalisatie van toerental voor de specifieke experimentele opstelling (genotype, lengte van oefening bout, enz.) nodig zijn.
    Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de buizen goed zo zijn geplaatst dat ze niet langs de onderkant van de REQS-eenheid tijdens rotatie slepen doen.
  4. Test de verbinding met het systeem voor het verzamelen van gegevens voorzien de Drosophila Activity Monitor-eenheid door te openen van de DAMSystem308-software en ervoor te zorgen dat de verbinding licht groen voor verschillende rotaties blijft. De software zal beginnen opgenomen gegevens naar een tekstbestand "monitorX" (X wordt de unit number/logisch als meerdere monitoren in gebruik) onmiddellijk op inleiding. Opname van de frequentie kan aangepast worden in het tabblad "Voorkeuren"; Wij registreren typisch in 5 minuten intervallen.
  5. Onderzoeken van het tekstbestand dat is gegenereerd door de software van de DAMSystem308 om ervoor te zorgen dat de gegevensverbinding naar behoren functioneert. Problemen met de verbinding leiden tot knipsels, tijdstippen waar 0 activiteit is vastgelegd voor alle posities in de REQS (Zie Vertegenwoordiger resultaten en tabel 2). Als uitsparingen optreedt, aanpassen gegevensverbindingen leidt tot de roterende telefoonaansluiting, naarmate tijdens rotatie, deze verbinding kan los of verdraaide. Wij vinden dat de verbinding met tape te stabiliseren helpt om dit probleem te voorkomen.

2. voorbereiding van de dieren

Opmerking: Alle dieren waren aan de orde gesteld en getest onder normale omstandigheden in een incubator (25 ° C, luchtvochtigheid van 60-70%, 12 h licht/donker cyclus) op melasse/maïsmeel media10.

  1. Twee weken vóór de geplande experiment, flesjes instellen gecontroleerde veedichtheid voor het verzamelen van de experimentele vliegt vanaf; We flesjes voor het doorgaans opgezet met 7 mannen en 10 vrouwen. Met een gezonde voorraad, van een enkele injectieflacon, kunnen ongeveer 15 Maagd mannen en 15 vrouwen worden verzameld via een 4-daagse periode. Het aantal flesjes instellen aanpassen op basis van het aantal dieren die nodig zijn voor de bepaling; een typische assay in ons laboratorium bevat 10 sets van 10 maagdelijke mannetjes en vrouwtjes per genotype (100 mannen en 100 vrouwen).
    Opmerking: Niet-virgin vliegt kunnen afhankelijk van de specifieke vraag van de experimentele worden gebruikt. Indien bij de langerlopende experimenten met dieren voor niet-virgin, storen kruipen larven nauwkeurige Activiteitencontrole.
  2. Verwijder de bovenliggende vliegen een week na het opzetten van de flesjes.
  3. Beginnen op dag 10 na oprichting van de flesjes, verzamelen van virgin vliegt van de flesjes en bewaar ze gescheiden door geslacht.
  4. Het verzamelen van voldoende dieren ten behoeve van het experiment en de leeftijd ze zo nodig, 3 dagen in dit voorbeeld.
    Opmerking: We meestal anesthetize met de dieren met CO2 voor behandeling. CO2 staat bekend om de impact van dierlijke activiteitenniveaus voor langere tijd na de behandeling (bijvoorbeeld Zie Bartholomew et al. 201511). Als het effect van CO2 met geplande downstream tests of analyses interfereert, gebruikt u de methode van een verschillende verdoving zoals ijs afstomping.

3. gegevensverzameling met de REQS

  1. Anesthetize van de dieren moet worden gebruikt voor de studie van de kwantificering oefening met CO2 of een andere methode van de verdoving. In groepen onderverdelen desgewenst en laden van de groepen van dieren in de lege glazen buizen van de activiteitenmonitor; in dit voorbeeld zijn 10 dieren van dezelfde leeftijd geladen per glazen buis, met 10 replicatieonderzoeken voor elk dier type (seks/genotype). Zorg ervoor op te merken welk dier type in elke buis wordt geladen.
    Opmerking: Voor langere experimenten, voedsel kan worden opgenomen in het specimen buizen. In dit geval, is het essentieel dat het voedsel veilig is en doet niet tijdens rotatie worden verdreven.
  2. Laden van de glazen assay buizen in de eenheid van de REQS en hen veilig met de rubberen O-ringen. Als u werkt met meer dan één geslacht/genotype, zal met behulp van een gerandomiseerd blokontwerp of randomisatie van de positie van de dieren in de REQS elimineren alle potentiële effecten van de positie. Randomisatie kan worden bereikt door het toewijzen van elke flacon een willekeurig nummer, bijvoorbeeld vanuit een web gebaseerde random number generator (bijvoorbeeld https://www.randomizer.org/) of in een spreadsheet, en vervolgens bestellen de flesjes op basis van de willekeurig getal.
  3. Plaats de REQS in de incubator om constante temperatuur, vochtigheid en licht omstandigheden. Ervoor zorgen dat zowel de gegevens als de macht kabels correct zijn aangesloten.
  4. Toestaan dat de dieren om te herstellen van anesthesie en om te acclimatiseren aan de nieuwe omgeving voor 1 h.
  5. Begint het experiment door rotatie van de REQS op de gewenste snelheid te starten.
    Opmerking: Een andere optie is eerste basislijn activiteit om gegevens te verzamelen van de dieren vóór de inleiding van rotatie, gevolgd door de opname van de activiteitenniveaus in reactie op roterende stimulatie.
  6. Verzamelen van gegevens starten door het openen van de software van de DAMsystem308 (gewoon de software ingewijden gegevensverzameling opening). Gegevens worden geschreven naar een tekstbestand met de ingestelde interval (hier, 5 min); indien nodig, wijzigen de instellingen van een interval op het tabblad "Voorkeuren" (zie stap 1.4).
  7. Om ervoor te zorgen dat de gegevens met succes naar de computer worden verzonden, opent u het tekstbestand dat is gegenereerd door de DAMsystem308-software nadat één of twee tijdsintervallen verstreken en bevestigen dat gegevens worden geschreven naar het bestand. Sluit en heropen dit bestand om te zien van de gegevens uit eventuele extra tijd punten. Verzamelen van gegevens voor de gewenste hoeveelheid tijd; in dit voorbeeld, 2 h.
    Opmerking: Niet openen de incubator deperiode assay, de dieren zijn zeer gevoelig voor verstoringen en zal waarschijnlijk reageren met verhoogde activiteit.
  8. Aan het eind van de oefening test, gegevensverzameling beëindigen door het sluiten van de DAMsystem308-software, dan de REQS. uitschakelen Verwijder van de dieren uit de glazen assay buizen en reinig de buizen. De dieren kunnen worden keerde terug naar voedsel flesjes als herhaald maatregelen op verschillende leeftijden zijn nodig.
    Opmerking: Als de sterfgevallen zich voordoen tijdens de oefening regime, moet worden opgenomen, zoals de aanwezigheid van dode vliegen invloed op de graven van de activiteit hebben kan. In onze ervaring met de DGRP2 vliegen lijnen12,13, oefening bij 4 rpm voor 2 h niet in een sterfgevallen resulteren, maar zwakkere stammen misschien anders reageren.

4. de gegevensanalyse

  1. Open het txt-bestand met de naam "Monitor1", geproduceerd door de software van de DAMSystem308.
  2. Inspecteren van het gegevensbestand voor eventuele problemen die zich mogelijk hebben voorgedaan tijdens de data-acquisitie (gemiste tijd punten, enz.; Tabel 1). Indien nodig, censureren het bestand door het verwijderen van gegevenspunten aan het begin en einde van de opname.
  3. Met behulp van de statistische software van uw keuze (bijvoorbeeld, R), het analyseren van de verzamelde gegevens. Beschrijvende statistieken genereren en uitvoeren van variantieanalyse (ANOVA) te onderzoeken van de effecten zoals geslacht en genotype, als de gegevens zijn normaal verdeeld. Als de gegevens niet normaal worden gedistribueerd, gebruiken niet-parametrische methoden, zoals Kruskal-Wallis proeven, te vergelijken groepen. De voorgeschreven specifieke analyses zal afhangen van de specifieke vraag van de wetenschappelijke en de proefopzet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De uitvoer van een individuele run met de REQS is een gegevenstabel geproduceerd door de software van de DAMSystem308, die zal worden met het label "Monitor1.txt" (voor een voorbeeld Zie aanvullende bestand 1) standaard. Een uittreksel uit een dergelijke tabel wordt weergegeven in tabel 1. Elke kolom bevat de gegevens van een afzonderlijke kwantitatieve analyse buis, terwijl de rijen bevatten de activiteit gemeten in elk tijdsinterval vanaf het begin van het experiment (boven) tot het einde (onder). De eerste drie gegevenspunten moeten worden gecontroleerd, in het geval dat er knipsels van de gegevens (zoals deze gezien in tabel 2) zijn, in dat geval de kabel moet worden aangepast.

Figuur 2 toont de resultaten van een experiment vergelijken vier genetisch verschillende Drosophila lijnen (DGRP2 lijnen 371, 703, 810 en 89712,13). Voor elk van de vier lijnen, tien replicate metingen uit groepen van tien Maagd vliegen van beide geslachten werden verzameld als beschreven in de sectie Protocol. Van de output file van de DAMSystem308-software, werd "Gemiddelde activiteit per 5 min per 10 vliegen" berekend door de activiteit maatregelen gemiddeld over de hele tijdspanne van 2 uur. Dit gemiddelde van elke kolom produceert dus een enkele maatregel voor elke test kamer. De tabel Samenvatting die Figuur 2 is gebaseerd op wordt gegeven in tabel 3.

De gegevens in tabel 3 zijn geanalyseerd met ANOVA, tests voor effecten van genotype, seks, en de interactie tussen seks en genotype. Als alleen het effect van genotype significant was (p < 2 x 10-16), de twee geslachten werden samengevoegd in de grafiek die is afgebeeld in Figuur 2. De ANOVA ontdekt een sterk effect van genotype, die blijkt uit de grafiek. De gemiddelde uitoefening activiteitenniveaus tussen alle vier genotypen verschillen aanzienlijk van elkaar (p < 0.05; Tukey de HSD), en dus, Figuur 2 illustreert hoe het REQS kan worden gebruikt voor het detecteren van een effect van genotype op oefening activiteitenniveaus.

Figure 1
Figuur 1: de REQS. Komt te staan in deze foto is de REQS in deze procedure gebruikt. De eenheid van economische activiteit monitor (A) draait rond de horizontale as gedreven door een roterende arm (B). De rotatiesnelheid is verstelbaar via een inbelverbinding (C), en de werking van de machine wordt bestuurd door een aan/uitschakelaar (D). De inzet (E) toont een close-up van de gegevensverbinding tussen de eenheid van economische activiteit monitor en op de roterende telefoonaansluiting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Afbeelding 2: vergelijking van uitoefening activiteit zoals gemeten door de REQS in vier verschillende DGRP stammen. X-as: dierlijke genotype. Y-as: dierlijke activiteit gemeten als lichtbundel kruisingen per 10 dieren per 5 min. A: DGRP2 lijn 897; B: DGRP2 lijn 810; C: DGRP2 lijn 703; D: DGRP2 regel 371. De hier weergegeven grafiek combineert gegevens van mannetjes en vrouwtjes, aangezien er geen significante seks effect voor deze specifieke lijnen (ANOVA; p = 0.557). Er is echter een sterke genotype effect (ANOVA; p < 2 x 10-16), en alle individuele vergelijkingen tussen de vier genotypen zijn veelbetekenend (Tukey de HSD; p < 0,05). Black diamond: genotype betekenen; zwarte lijn: +/-een SD (standaarddeviatie). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tijd Activity(1) Activity(2) Activity(3) Activity(4) Activity(5)
12:25:00 21 86 48 32 76
12:30:00 31 55 58 74 119
12:35:00 27 45 47 80 125
12:40:00 28 55 34 83 91
12:45:00 36 56 45 67 103

Tabel 1: voorbeeld van de uitvoer van nauwkeurige gegevens uit de software DAMSystem308. Elke "Activity(#)"-kolom vertegenwoordigt één flacon van 10 vliegen, met activiteit opgenomen intervallen van 5 min.

Tijd Activity(1) Activity(2) Activity(3) Activity(4) Activity(5) Schuld?
12:00:00 0 0 0 0 0 Ja
12:05:00 98 1 36 0 8 geen
12:10:00 0 0 0 0 0 Ja
12:15:00 88 24 44 1 9 geen
12:20:00 0 0 0 0 0 Ja
12:25:00 106 51 41 0 15 geen

Tabel 2: Voorbeeld van de uitvoer van defecte gegevens met pakketverlies vanuit de software DamSystem308. Elke kolom vertegenwoordigt een flacon van 10 vliegen, met activiteit opgenomen intervallen van 5 min. Rijen van 12:00:00, 12:10:00 en 12:20:00 "0" activiteit opnamen weergeven in alle kolommen, waarin een probleem met de gegevensverbinding (schuld? "ja" in de laatste kolom).

Tabel 3: voorbeeldgegevens gebruikt voor het genereren van Figuur 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 1: Onverwerkte uitvoerbestand zoals geproduceerd door de software van de DAMSystem308. Kolom 1 registreert de tijd puntaantal. Kolom 2 records de datum van het experiment, en kolom 3 records de tijd die elk punt van de tijd wordt geregistreerd. 4-10 kolommen worden niet gebruikt, en kolommen 11-42 vertegenwoordigen de opnames van de 32 sleuven van de activiteitenmonitor. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Als de representatieve resultaten illustreren, is de REQS geschikt voor het nauwkeurig meten van de activiteit uit te oefenen van Drosophila. De REQS is flexibel en staat van onderzoekers om aan te pakken een aantal onderzoeksvragen die betrekking heeft op oefening biologie of oefening interventies. Er zijn twee belangrijke stappen in het protocol om te markeren. Eerste plaats is het essentieel om te testen van de installatie van de REQS om ervoor te zorgen dat de overdracht van de gegevens van de REQS naar de DAMSystem308 naar behoren functioneert. Als dit niet goed opgezet, kan de datakabel tijdens de rotatie worden verward, en soms de verbinding tussen de REQS en de DAMSystem308 wordt onderbroken bij de roterende verbinding wegens slijtage en scheur (hoewel, met bijna dagelijks gebruik van de REQS, wij moesten de connector vervangen door eens in de twee jaar). Het is verstandig om altijd vervangende onderdelen bij de hand. Ten tweede, de consistentie van omgevings parameters is essentieel voor het succes van de experimenten. Drosophila zijn zeer gevoelig voor lawaai of trillingen, en het is dus belangrijk dat het experiment niet verstoord wordt tijdens het verzamelen van gegevens. Dus, in het ideale geval experimenten worden uitgevoerd in een toegewijde incubator die is niet geopend tijdens een experimentele run. Aandacht voor deze twee kritische stappen zal ervoor zorgen dat hoogwaardige gegevens worden verzameld uit de REQS.

Terwijl we laten hier hoe de REQS kan worden gebruikt zien voor het meten van dierlijke activiteit tijdens een 2-uur continu oefening behandeling van groepen dieren, is de REQS flexibel in die zin dat de tijd en de intensiteit van de oefening kunnen worden aangepast voor een verscheidenheid van oefening behandelingen. Bovendien, afhankelijk van de activiteit monitor-eenheid gebruikt, kan het worden gewijzigd voor het meten van de activiteit van één vliegen of zeer grote populaties van de dieren. Bovendien kan de REQS worden gebruikt voor het testen van het ontwerp en de optimalisatie van oefening regimes. Het kan ook worden gebruikt voor het meten van de effecten van aanvullende variabelen zoals tijd van dag, dierlijke leeftijd, dieet, grootte van de populatie of medicamenteuze behandeling op geïnduceerde activiteit en oefening reacties. Afhankelijk van de exacte experimentele opzet, dat wil zeggen, de duur van de oefening regime en timing, kan de REQS ook worden gebruikt om zich te mengen met de natuurlijke slaappatronen van Drosophila. Deze voorbeelden vormen een illustratie van het veelzijdige karakter van de REQS en enkele mogelijke toepassingen in Drosophila onderzoek. Andere kleine dierlijke onderzoeksgemeenschappen misschien ook wel interesse bij de aanpassing van de REQS voor hun doeleinden, dus het verbreden van het nut van dit nieuwe instrument.

Op dit moment is een beperking van de REQS het beperkt aantal monsters dat kan worden verwerkt op een bepaald moment, die is ingegeven door de activiteit monitoren gebruikt, die een maximum van 32 monsters assay. Hoewel het gebruik van meerdere REQS eenheden mogelijk is, dat de REQS moet worden gebruikt voor grootschalige genetische schermen of soortgelijke toepassingen, zou de ontwikkeling van een hogere doorvoersnelheid versie van de REQS ideaal.

Vanwege zijn vermogen om te meten van de activiteitenniveaus geïnduceerde op identieke wijze op de tredmolen, de REQS kan worden gebruikt in combinatie met de tredmolen, die het mogelijk voor een iets hogere doorvoer maakt (48 monsters kunnen worden verwerkt op een moment). Oefening protocollen kunnen worden geoptimaliseerd met behulp van de REQS en vervolgens toegepast op de tredmolen voor verdere studies. Dus, de tredmolen en REQS kunnen worden gebruikt aanvullende desgewenst voor specifieke studie ontwerpen.

De REQS is een belangrijke stap voorwaarts in Drosophila oefening onderzoek, omdat het zorgt voor de kwantificering van de geïnduceerde activiteit. Met een machine die gelijktijdig induceren kan oefening en maatregel die deze oefening dat een duidelijke nodig in de Drosophila oefenen veld, was zoals een Duitse groep van wetenschappers een zeer vergelijkbaar toestel, genoemd "swing boot," onafhankelijk ontwikkeld die ook gebruik maakt van een activiteit monitor voor het meten van de activiteit tijdens de oefening geïnduceerde door rotatie14. De "swing boot" gebruikt geen volledige rotaties, maar in plaats daarvan schommels van de eenheid van economische activiteit monitor terug en weer ongeveer 30 graden rond een roterende as. Dus, het "swing boot," zoals de REQS, gebruikt de rotatie om voortdurend een negatieve geotaxis reactie veroorzaken en dierlijke activiteit te verhogen. De REQS en een "swing boot" aanvulling op bestaande video-tracking methoden gebruikt voor de gehaltebepaling van Drosophila na stimulatie, zoals de Drosophila opwinding Tracking Systeem (DART)15. Zowel de REQS als de "swing boot" verbetering van systemen zoals de DART, die activiteiten alleen na de stopzetting van de stimulus bijhouden. Dus, de REQS en een "swing boot" zijn belangrijke nieuwe hulpmiddelen voor onderzoekers op het gebied van Drosophila oefening, die kan worden gebruikt in combinatie met de bestaande tredmolen en Power Tower apparaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het werk werd gesteund door Award nummer P30DK056336 van het nationale Instituut van Diabetes en spijsvertering en nierziekten door middel van een pilot subsidie uit de voeding en obesitas Research Center van de Universiteit van Alabama in Birmingham te NCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Activity Monitor  Trikinetics LAM25H REQS component
Telephone Cord Detangler Uvital uv20170719 REQS component
Vial closures (flugs) Genesee Scientific 49-102 Drosophila culture supplies
Vials  Genesee Scientific 32-120 Drosophila culture supplies
Drosophila culture netting Carolina Biological Supply 173090 Drosophila culture supplies
Cornmeal Pepsico 43375 Drosophila media
Molasses Golden Barrel BLA-GAL Drosophila media
Agar Apex Bioresearch 66-103 Drosophila media
Inactive Dry Yeast Genesee Scientific 62-106 Drosophila media
Tegosept Apex Bioresearch 20-258 Drosophila media
Propionic acid Genesee Scientific 20-271 Drosophila media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30, (11), 479-481 (2014).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9, (3), 235-244 (2016).
  3. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201, (3), 815-842 (2015).
  4. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance. PLoS One. 4, (6), e5886 (2009).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, (5), 386-395 (2005).
  6. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (61), (2012).
  7. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila. PLoS One. 11, (10), e0164706 (2016).
  8. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (44), E4152-E4159 (2013).
  9. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS One. 12, (10), e0185090 (2017).
  10. Reed, L. K., et al. Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185, (3), 1009-1019 (2010).
  11. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298 (2015).
  12. Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Res. 24, (7), 1193-1208 (2014).
  13. Mackay, T. F., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, (7384), 173-178 (2012).
  14. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease. Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).
  15. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Sci Rep. 5, 8454 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics