Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

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Immunology and Infection

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Summary

Aquí, presentamos dos protocolos para estudiar las interacciones de la fagocito -abscessus de la micobacteria : la proyección de una biblioteca mutante de transposon de deficiencia intracelular bacteriana y la determinación de transcriptoma bacteriana intracelular de RNA secuencia. Ambos enfoques proporcionan información sobre las ventajas genómicos y transcriptómicos adaptaciones mejorar la aptitud de las bacterias intracelulares.

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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Abstract

Abscessus de la micobacteria de otras micobacterias saprofitas es la capacidad de resistir la fagocitosis por los macrófagos humanos y la capacidad de multiplicarse dentro de tales células. Estos rasgos de virulencia render M. abscessus patógenas, especialmente en huéspedes vulnerables con enfermedad pulmonar estructural subyacente, tales como fibrosis quística, bronquiectasias o tuberculosis. No está claro cómo los pacientes se infectan con M. abscessus . A diferencia de muchas micobacterias, M. abscessus no se encuentra en el medio ambiente pero podría residir dentro de las amebas, los fagocitos ambientales que representan un potencial reservorio de M. abscessus. De hecho, M. abscessus es resistente a fagocitosis amoebal y la vida intra-ameba parece aumentar la virulencia de M. abscessus en un modelo experimental de infección. Sin embargo, poco se sabe sobre la virulencia de M. abscessus en sí mismo. Para descifrar los genes que confieren una ventaja a la vida intracelular de M. abscessus , se realizó un screening de una biblioteca mutante de M. abscessus transposon. Paralelamente, se desarrolló un método de extracción de RNA de micobacterias intracelulares después de co-cultivo con amebas. Este método fue validado y permitido la secuenciación de todo M. abscessus transcriptomas dentro de las células; proporcionar, por primera vez, una visión global de M. abscessus adaptación a la vida intracelular. Ambos enfoques nos dan una visión de factores de virulencia de M. abscessus que M. abscessus colonizar las vías respiratorias en los seres humanos.

Introduction

El género Mycobacterium incluye especies que van desde organismos saprofitos inofensivos a los patógenos humanos más importantes. Bien conocidas especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum Mycobacterium ulcerans pertenecen al subgrupo de crecimiento lento micobacterias (SGM). En contraste, el subgrupo de crecimiento rápido micobacterias (RGM) se caracteriza por su capacidad para formar colonias visibles en menos de 7 días en medio de agar. El grupo RGM compone de más de 180 especies, principalmente micobacterias saprofitas no patógenos. Estudios sobre las interacciones de RGM con sus anfitriones han centrado principalmente en Mycobacterium smegmatis y demuestran que estas micobacterias son rápidamente eliminadas por la acción bactericida de los macrófagos.

Mycobacterium abscessus es una de la s raros que son patógenas para los seres humanos y es responsable de una amplia gama de infecciones que van desde la piel y tejidos blandos a las infecciones pulmonares y diseminadas. M. abscessus es considerado, junto con Mycobacterium avium, a ser el principal patógeno por micobacterias en pacientes de fibrosis quística1.

Varios estudios realizados en M. abscessus indican que esta micobacteria se comporta como un patógeno intracelular, capaz de sobrevivir la respuesta bactericida de los macrófagos y fibroblastos en los pulmones y la piel, que generalmente no se observa en RGM 2 , 3 , 4. análisis del genoma de M. abscessus ha identificado vías metabólicas suelen encontradas en microorganismos ambientales en contacto con el suelo, plantas y ambientes acuáticos, que suelen ser las amebas libres5. También han demostrado que M. abscessus está dotada de varios genes de virulencia que no se encuentran en la RGM no patógenas y saprofita, probablemente adquirida por la transferencia horizontal del gene en un nicho favorable al intercambio genético que podría reunir varias bacterias resistentes a la amebas.

Experimentalmente, uno de los primeros resultados llamativos fue la observación de crecimiento intracelular de M. abscessus en macrófagos, así como para M. tuberculosis6. M. abscessus resiste también la acidificación del fagosoma, apoptosis y autofagia, tres mecanismos esenciales de la resistencia celular a la infección2. Incluso se ha demostrado que M. abscessus es capaz de establecer una comunicación inmediata entre el fagosoma y el citosol, un ambiente más rico en nutrientes que puede favorecer la multiplicación bacteriana2. Muy poco se sabe acerca de las ventajas genómicas que M. abscessus posee o ha adquirido para permitir la supervivencia en un entorno intracelular. Cocultivo de la ameba es un método eficaz que permite el aislamiento de muchas nuevas bacterias resistentes a la amebas como Mycobacterium massiliense7,8. La capacidad de multiplicarse dentro de las amebas se observó, en un modelo de aerosolización de M. abscessus en ratones, que puede conferir una mayor virulencia de M. abscessus4. Una hipótesis es que M. abscessus había desarrollado rasgos genéticos encontrados dentro de este entorno para sobrevivir en las células fagocíticas, que son diferentes de otros no patógenos RGM. Estas adquisiciones podrían favorecer la capacidad de difusión y su virulencia en el anfitrión humano.

Este informe describe herramientas y métodos para resaltar las ventajas de genomic conferidas a M. abscessus para sobrevivir en el ambiente de las amebas. Para este propósito, la selección de mutantes de M. abscessus transposon se describe en primer lugar, en la cepa tipo de Acanthamoeba castellanii. , que permite la identificación de defectos del mutante para el crecimiento intracelular. También se divulga una segunda proyección en macrófagos, para confirmar si este defecto persiste en el anfitrión humano. En segundo lugar, para comprender qué mecanismos se aprovechen en M. abscessus para adaptarse a la vida en fagocitario células y aumento de su virulencia en el anfitrión animal, un método especialmente adaptado por M. abscessus fue desarrollaron, después de cocultivo en presencia de amebas que permitieron la extracción de ARN total de bacterias intra-amoebal. Como consecuencia, se desarrolló una visión integral de M. abscessus genes que se requieren para una vida intracelular.

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Protocol

1. librería proyección

  1. Construcción de la biblioteca del mutante de Tn
    1. Obtener una biblioteca de transposon.
      Nota: Para este experimento, una biblioteca mutante transposon se obtuvo de E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, Estados Unidos. La biblioteca fue construida de una cepa clínica lisa (43S) de la de M. abscessus complejo (M. abscessus subsp. massiliense) con un phagemid introducido en M. abscessus la inserción al azar de un solo Tn en un dinucleótido TA (91.240 TA las secuencias en el genoma de M. abscessus ). Para más detalles véase la referencia de Rubin et al. 9 y Laencina et al. 10.
  2. Valoración de la biblioteca y la conservación de los mutantes de M. abscessusTn en placas
    Nota: Esto toma una semana.
    1. Descongelar la biblioteca sobre el hielo. Determinar la concentración bacteriana mediante la realización de diluciones seriadas en 1 mL de agua (10-1 a 10-15). Placa una gota de cada dilución en una placa Petri conteniendo medio 7H 11 agar kanamicina 250 mg/mL. Incubar las placas a 37 ° C durante 3 – 4 días.
      Nota: Aquí, una valoración de 10 bacterias/mL de11 fueron recuperados.
    2. Después de determinar la concentración de la biblioteca, diluir la biblioteca a una concentración final de 3.000 bacterias/mL en 10 mL de agua 25% glicerol. Parte alícuota de la biblioteca en 10 criotubos con 1 mL de la biblioteca en cada tubo. Almacenar las alícuotas a-80 ° C.
    3. Cuando esté listo para utilizar, descongele una alícuota de la biblioteca diluida en hielo y añadir 100 μl de la biblioteca a 10 cuadrados Mueller-Hinton (MH) placas de agar (tamaño 12 cm) para recuperar colonias individuales de 200 a 300 después de 3 a 4 días de incubación a 37 ° C.
    4. Con mondadientes estériles, transfiera las colonias individuales (aproximadamente 6.000 colonias en placas de 60 x 96 pocillos) en placas de 96 pocillos llenan con 200 μL 7 h 9 suplementado con 0,2% de glicerol, glucosa 1% 250 mg/mL de kanamicina. Incubar a 37 ° C durante 5 días sin agitación.
    5. Transferir 100 μl de la cultura (paso 1.2.4) a una placa de 96 pocillos con 100 μl 7 h 9 medio con glicerol al 40%. Tienda de la biblioteca ordenada a-80 ° C.
    6. Repita los pasos 1.2.3. a 1.2.5. con el resto de la biblioteca hasta 10.000 clones individuales se recuperan (alrededor de la placa 100 x 96 pozos y 30 placas de MH).
  3. Preparación de amebas
    1. Ameba Acanthamoeba castellanii. (CA) en frascos de cultivo de tejidos2 de 75 cm a temperatura ambiente (RT) en 30 mL de medio PYG (tabla 1) para la amplificación de la célula de la cultura de la línea11.
      Nota: Los trofozoitos maduros de células adhesivas grandes con numerosas vacuolas digestivas son claramente visibles en un microscopio. El tiempo de duplicación de la célula se estima ser células de h. 25 fueron amplificados cada 3 días por que se separa una tercera parte de la cultura inicial en frascos de cultivo de tejidos2 75 cm.
    2. Retire el medio PYG con una pipeta de 25 mL. Lavar las células con 10 mL de tampón de AC (tabla 2), que no contiene ninguna de las fuentes de carbono o nitrógeno12. Repetir el lavado dos veces más.
      Nota: Tampón de AC que no contiene ninguna fuente de carbono o nitrógeno evita el crecimiento extracelular de micobacterias. Este medio mínimo conduce al enquistamiento de las amebas. Para limitar esto, inactivado con calor de e. coli fueron agregados como sustrato (paso 1.4) a amebas y tiempos muy cortos cultura fueron promovidos (48 h para el mutante de detección) y 4 h o 16 h cultura RNAseq experimentos. Alternativamente, utilice este medio pero enriquecido con medio de PYG (generalmente 10%).
    3. Separar la ameba de la parte inferior del matraz con un solo movimiento vigoroso del frasco de cultivo de tejidos.
    4. Contar celdas con un hemocitómetro para ajustar la concentración celular a 5 x 105 amebas/mL diluyen en tampón de AC.
  4. Preparación de inactivadas por calor Escherichia coli bacteria ameba la alimentación después de la infección
    1. Crecer la cepa clínica aislada de e. coli de un stock de glicerol en 100 mL de caldo Luria (LB) durante la noche a 37 ° C.
    2. Recoger las bacterias por centrifugación a 1.835 x g por 10 min en tubos de 50 mL. Deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 10 mL de agua glicerol al 10%. Repetir el lavado dos veces más.
    3. Resuspender el precipitado con 5 mL de agua glicerol al 10%. Alícuota 0, 5 mL en tubos de 1,5 mL. Determinar la cantidad de bacterias/mL realizar diluciones seriadas y añadiendo las diluciones en placas de agar LB. Almacenar las alícuotas a-80 ° C.
    4. El día antes de la infección de la ameba, descongele una alícuota en el hielo y proceder a matar de calor por el tubo a 70 ° C durante 60 min de incubación.
      Nota: Comprobar la inactivación por la galjanoplastia 100 μl de bacterias inactivadas en placas de agar LB durante la noche a 37 ° C. No colonias deben ser visibles después de una noche de cultura.
    5. Diluir las bacterias muertas por calor a una concentración de 10 bacterias de7 en 50 μl de tampón de AC y almacenar las bacterias diluidas a 4 ° C durante no más de una semana.
  5. Co-cultivo de amebas mutantes deM. abscessus Tn : en primer lugar de la pantalla
    Nota: Esto toma 3-4 meses para la proyección de 6.000 mutantes.
    1. Extensión de 5 x 104 amebas/pozo de una placa de 96 pocillos en 100 μl de buffer de AC. Incubar durante 1 h a 32 ° C sin agitación. Deje el tiempo flotante de trofozoíto de Ameba a adherirse a los pozos.
      1. Mientras incuba, descongelar las bacterias en hielo durante 1 hora.
    2. Añadir 5 μl de los cultivos de bacterias descongeladas con una pipeta multicanal electrónica. Infectar de 1,5 h. pantalla alrededor de 6.000 clones individualizadas de la placa de 96 pocillos Tn existencias de mutantes.
      Nota: El Ministerio del interior es desconocido en este paso del Protocolo; sin embargo, todas las placas de 96 pocillos que contienen a Tn mutantes se cultivaron en la misma forma. Esta primera pantalla pretende identificar rápidamente intracelulares mutantes deficientes, sin considerar las variaciones en la densidad de inóculo.
    3. Después de 1,5 h de la infección, invertir la placa de 96 pocillos en gasas estériles colocados en una bandeja de metal esterilizada para eliminar el medio AC bajo una campana de humos. Rellenar con 200 μL de medio de AC. Repita este lavado dos veces más.
    4. Añadir 200 μL de medio fresco suplementado con 100 μg/mL amikacina para eliminar resto micobacterias extracelulares.
    5. Incubar por 2 h antes de proceder con 3 lavados adicionales (como se describe en el paso 1.5.3). Después del lavado, mantener las culturas con 50 μg/mL amikacina en 200 μL de tampón de AC.
    6. Añadir bacterias de Escherichia coli de 5 x 107 inactivado con calor (de paso 1.4) al final de la infección y cada 24 h para evitar el enquistamiento de las amebas.
    7. Después de 48 horas de cocultivo, lyse las células añadiendo 10 μl de 10% SDS (dodecil sulfato de sodio) en cada pocillo e incubar 30 minutos a 32 ° C. Proceder con la dilución seriada y añadir en placas de agar Columbia con 5% sangre de carnero (placas de COS) para evaluar el número de micobacterias intracelulares. Sellar la placa con el parafilm e incubar a 37 ° C.
    8. Cuando las colonias aparecen en las placas de agar después de 3-4 días, fotografía la placa e identificar a los mutantes con problemas para el crecimiento intracelular mediante la observación de los depósitos con el menor número de colonias bacterianas.
      Nota: No importa la forma, altura y densidad de la Colonia (figura 1A). se identificaron 136/6000 mutantes.
  6. Co-cultivo de amebas mutantes deM. abscessusTn : segunda pantalla de los mutantes identificados durante la primera pantalla
    Nota: Esto tarda 2 semanas. Una segunda pantalla se debe realizar con los mutantes atenuados 136 obtenidos después de la primera pantalla para cuantificar exactamente el número de bacterias inoculadas y el número de supervivencia intracelular bacterias 2 días post-infección.
    1. Crecido la 1 Colonia de cada mutante afectado en 50 mL tubos llenan con 20 mL de 7H 9 suplementado con glicerol 0.2%, 1% de glucosa y 250 mg/mL de kanamicina. Permite a la bacteria llegar a la fase exponencial (0.6 < OD < 0.8).
    2. La cultura de lavado por centrifugación (1.835 x g por 10 min) en medio de AC. Deseche el sobrenadante. Repita este lavado dos veces con 20 mL de 7H 9 suplementado con glicerol 0.2%, 1% de glucosa y 250 mg/mL de kanamicina.
    3. Resuspender las bacterias en 5 mL de tampón de AC.
    4. Determinar la concentración de la unidad (UFC) de los mutantes de formadoras. En placas de 24 pocillos, agregar 1 mL de agua a las dos primeras filas. Añada 100 μl de la suspensión bacteriana para el primer pozo. Con una micropipeta, mezcla de tres veces. A continuación, aspirar bien 100 μl y depósito para el segundo.
    5. Con una punta nueva, repita el paso 1.6.4 desde el pozo de segunda a tercera, etc. hasta el duodécimo bien.
    6. Aspirar 30 μl de la dilución de 10-12 y añadir a un plato de lechuga romana. Repita para las otras diluciones.
    7. Envolver la placa COS con parafilm e incubar durante 3 – 4 días a 37 ° C. Determinar la concentración por recuento de las colonias.
    8. Realizar ensayos de co-cultivo descrita por triplicado en una placa de 24 pocillos con 5 x 104 ameba por pozo en 1 mL de medio de cultivo Co de AC. Inocular con una multiplicidad de infección (MOI) de 10.
    9. Después de 48 horas de cocultivo, proceder a la lisis celular como se describe en el paso 1.5.7. Realizar diluciones seriadas en agua (10-1 a 10-6) y añadir 30 μl a las placas de COS. Incubar las placas durante 4 días a 37 ° C antes de proceder con el conteo de UFC.
      Nota: Después de esta segunda pantalla, 60 de 136 mutantes fueron conservados.
    10. Almacenar los mutantes afectados para su supervivencia dentro de las células. Añadir una colonia a un criotubo con medio LB con glicerol (20% final) o en un criotubo que contiene solución comercial y microesferas a favor de una conservación a largo plazo y facilitar la futura inoculación y luego almacenar a-80 ° C.
    11. Evaluar el crecimiento de mutantes en vitro midiendo la densidad óptica (OD) a 600 nm cada 2 días.
      1. Crecer 1 Colonia de cada mutante afectado en tubos de 50 mL llena con 20 mL de 7H 9 suplementado con glicerol 0.2%, 1% de glucosa y 250 mg/mL de kanamicina. Permite a la bacteria llegar a la fase exponencial (0.6 < OD < 0.8) antes de ajustar el OD a 0,01 para comenzar la cinética.
      2. Excluir a mutantes con una en vitro crecimiento defecto en comparación con la cepa WT del conjunto de mutantes deficientes intracelulares.
  7. Co-cultivo de macrófagos -M. abscessus Tn mutante defectuoso para una vida de intra-ameba
    Nota: Esto tiene 1 mes.
    1. Extensión 5 x 104 J774.2 macrófagos murinos por pozo de una placa de 24 pocillos en 1 mL de medio rico, DMEM suplementado con 10% de suero Fetal de ternero (FCS). Incubar las placas durante 24 h a 37 ° C y 5% CO2 para permitir la adhesión de macrófagos. Proporcionar 3 repeticiones.
    2. Realizar la infección. Inocular el Tn mutantes, con MOI de 10, diluido en DMEM con 10% FCS en un volumen de 100 μl.
    3. Después de 3 horas de la infección, realizar tres lavados con 1 mL de DMEM (puede utilizarse una bomba de vacío). Luego tratar con 250 μg/mL amikacina (en DMEM con 10% FCS) por 1 h para eliminar resto micobacterias extracelulares.
      1. Después de 3 adicional se lava con 1 mL de DMEM, mantener las culturas de 250 μg/mL amikacina (en DMEM con 10% FCS) hasta un volumen final de 1 mL para evitar la multiplicación de micobacterias extracelular.
    4. 72 h después de co-cultivo, quitarlo del medio y lyse los macrófagos mediante la adición de 1 mL de agua fría. Incubar durante 30 min a 4 ° C.
    5. Realizar ensayos de UFC en las placas de COS para evaluar el número de bacterias intracelulares.
      1. En una placa de 24 pocillos, agregar 1 mL de agua a las dos primeras filas. Añada 100 μl de la célula Co lisada al primer pozo. Con una micropipeta, mezcla de tres veces. Aspire 100 μl y depositarlos en la segunda bien.
      2. Con una punta nueva, repetir la dilución del pozo de segunda a tercera, etc. hasta el duodécimo bien. Luego aspirar 30 μl de la dilución de 10-12 y añadir a un plato de lechuga romana.
      3. Repita para las otras diluciones. Envolver la placa COS con parafilm y esperar 3-4 días para observar y contar las colonias.
  8. Identificación y secuenciación del sitio de inserción de la Tn en mutantes de M. abscessus
    Nota: Esto tiene 1,5 meses para 60 mutantes.
    1. Extracción de genomic de los identificados mutantes de M. abscessus
      1. Crecen los mutantes en un tubo de 50 mL con 20 mL de 7H 9 medio suplementado con glicerol 0.2%, 1% de glucosa y kanamicina 250 mg/mL en fase exponencial (OD600= 0.8).
      2. 10 mL de las culturas (2.396 x g, 5 min) de la cosecha. Deseche el sobrenadante. Suspender las bacterias en 500 μl de solución I (25% sacarosa, 50 mM de Tris pH 8, lisozima de 10 mg/mL, tiourea de 40 mM). Transferir la solución a tubos de 2 mL con tapón de rosca e incubar por 2 h a 37 ° C.
      3. Añadir 500 μl de solución II (25% sacarosa, 50 mM Tris, pH 8, EDTA 50 mM). Después de su uso para arriba y abajo 5 - 10 veces, agregar granos de zirconio hasta un volumen de 500 μL en el tubo.
      4. Proceder a la lisis celular con un homogenizador (3 x 6.000 rpm, 45 s) con una incubación de 1 min en hielo entre cada uno redondo.
      5. Añadir 5 μl de 20 mg/mL de proteinasa K (final de 100 μg/mL) e incubar las muestras durante la noche a 55 º C.
      6. Añadir 1 mL de frío de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol (25:24:1) bajo una campana de humos. Mezclar las muestras con un vórtex antes de proceder con centrifugación a RT y 16.500 x g durante 30 minutos.
      7. Después de la centrifugación, recuperar la fase acuosa y añadir un volumen igual de solución alcohol fenol/cloroformo/isoamílico frío bajo una campana. Centrifugar las muestras a 16.500 x g durante 30 min para recuperar la fase acuosa una vez más.
      8. Añadir 0,7 volumen de isopropanol de RT a la fase acuosa recuperada bajo una campana de humos. Poco a poco invertir los tubos para permitir la precipitación de ADN e incubar 5 min a TA. Luego centrifugar 10 min a 16.500 x g y RT.
      9. Quite el sobrenadante y lavar el pellet con 500 μl de etanol al 70% bajo una campana. Centrifugar los tubos durante 10 min a 16.500 x g a temperatura ambiente antes de retirar el etanol. Incubar por 10 min permitir la evaporación de alcohol restante.
      10. Por último, suspender el pellet de DNA en 100 μl de agua libre de DNasa/Rnasa. Determinar DNA rendimiento y pureza de la DNA con un espectrofotómetro.
      11. Quitar 1 μg de genomic DNA y digerir con 10 U de ClaI para una noche para el clonar el sitio de inserción de Tn . Utilizar el protocolo del fabricante.
        Nota: El Clala enzima es una de las enzimas de restricción más mentionadas en genoma M. abscessus (2.173 sitios de restricción). Un Clasitio de la restricción también se encuentra en la secuencia de Tn aguas arriba de la cinta de resistencia kanamicina del mutante de Tn. Así, el subcloning Cla-mediada permite identificar el sitio de inserción de Tn.
    2. El clonar en un plásmido de ADN genómico que contiene el Tn
      Nota: Antes de proceder con el Tn-subcloning en el 2.686 bp pUC19 ampicilina-resistente plásmido, añadir un Clasitio de la restricción en el sitio de clonación múltiple del plásmido. La secuencia del plásmido pUC19 puede encontrarse en este enlace https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Fabricante de seguimiento de protocolo de digerir el plásmido pUC19 con EcoRI y HindIII, que libera un fragmento de 51 bp y un fragmento de BP 2635 purifican el doble vector digerido con un kit de purificación PCR comercial para eliminar el 51 bp liberado el fragmento.
      2. Mezclar 1 μl (concentración 25 pmol/μL) de dos oligonucleótidos complementarios (5 'AGCT, TATA, AGATCT, TATA, ATCGAT, TATA3' y 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') de 28 bp que contiene ClaI sitio de la restricción y en los extremos la HindIII y EcoR I sitios de restricción. Calentar a 100 ° C durante 10 minutos y luego enfriar para enlazarlos.
      3. Digerir los cebadores apareados por EcoRI y HindIII según protocolo del fabricante.
      4. Ligar 150 ng de EcoRIHindIII restricción pUC19 plásmido con diferente concentración de cebadores apareados (50 pmol/μl, 25 pmol/μl, 2,5 pmol/μL) durante 1 h a temperatura ambiente con 1 U de T4 ADN ligasa en un volumen final de 20 μl. Compruebe la clonación por un diverso digestión enzimática.
      5. Digerir el plásmido modificado con Claque por 2 h a 37 ° C.
      6. Ligar 50 ng de Clarestricción de pUC19plásmido y 50 ng de ADN genómico digerido por Clapara 1 h a temperatura ambiente con 1 U de T4 ADN ligasa en 10 μl.
      7. Proceder a la transformación de bacterias de e. coli espectro con 5-10 μl de la ligadura (2500 V, 200 ohmios, 25 μF). Seleccionar los clones en placas de agar LB suplementados con 50 de μg/mL kanamicina y ampicilina 50 de μg/mL para seleccionar las bacterias con plásmidos con porciones de secuencias de Tn.
      8. Crecer clones resistentes durante la noche en medio líquido LB con la selección apropiada de antibióticos (50 μg/mL kanamicina y ampicilina 50 de μg/mL).
      9. Extraer ADN de plásmido. Verificar la presencia del inserto por restricción enzimática y la secuencia del extremo 3' de la Tn para identificar el gen interrumpido con un oligonucleótidos (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') que corresponde a los últimos 17 pares de bases de la kanamicina Tn cassettes de resistencia.
      10. Alinear la secuencia contra la cepa de M. abscessus 06 ir realizando una explosión (BLAST-N) del nucleótido.

2. ARN extracción de micobacterias intracelulares Rnaseq p.a.

Nota: Esto tiene 4 meses para experimentos y 4 meses para análisis RNAseq.

  1. Co-cultivo de amebas-M. abscessus en lotes
    Nota: En el siguiente experimento, la cultura se realiza en tubos de 50 mL con agitación a favor de las bacterias al contacto.
    1. Crecimiento de M. abscessus en 7 H 9 suplementado con 0.2% de glicerol, glucosa 1% para la media exponencial fase a 120 rpm.
    2. Lave las bacterias dos veces con 10 mL de tampón de AC.
    3. Calcular la concentración de bacterias mediante la medición del OD600 nm (1 OD600= 4 x 108 micobacterias). Añadir 8.5 x 10 micobacterias de8 a 8.5 x 106 amebas en 10 mL de medio de AC.
    4. Incubar durante 1 h a 30 ° C con agitación suave (aproximadamente de 80 rpm).
    5. La cosecha de las células por centrifugación a 253 x g durante 12 minutos quite el sobrenadante y suspender las células en 10 mL de tampón de AC. Repita este lavado dos veces más.
    6. Resuspender las células en 10 mL de tampón de AC que contiene 50 μg/mL amikacina para eliminar bacterias extracelulares e incubar durante 4 h a 30 ° C con agitación suave (80 rpm). Lavan las células dos veces otra vez.
  2. Extracción de ARN total de M. abscessus de Mycobacterium intracelular
    Nota: Realice los pasos 2.2.1–2.2.3 en la capilla del humo debido al uso de reactivos tóxicos.
    1. Tras el final de lavado, suspender las amebas infectadas en 4 mL de solución fría III (tabla 3) con espontáneamente 280 μl de β-mercaptoetanol para interrumpir las amebas. Este es el paso de guanidinio tiocianato (GTC). Mantener la suspensión en hielo durante 10 minutos, centrifugar la célula lisado por 30 min a 2.396 x g y 4 ° C para las bacterias intracelulares liberadas de la pelotilla.
    2. Quite el sobrenadante y suspender el sedimento de bacteriano en 1 mL de solución fría III. Cosecha de las bacterias a 2396 x g durante 30 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 1 mL del tampón de extracción y transferencia en un tubo de tornillo de 2 mL que contiene granos de zirconio (hasta la gradación 500 μl del tubo). Almacenar los tubos durante al menos 24 h a 80 ° C.
      Nota: El almacenamiento en el reactivo de lisis permite la inactivación de la disolución de la célula y RNasas.
    3. Cuando esté listo para su uso, descongelar las muestras en hielo y les lyse con un homogeneizador realizando dos rondas a 6.000 rpm para 25 s, seguido por una ronda a 6.000 rpm durante 20 s con una incubación de 1 min en hielo entre cada uno redondo.
    4. Para enfriar la muestra, incubar en hielo durante 10 minutos. Luego añadir 200 μL de cloroformo diluido en alcohol isoamílico. Después de un vórtex las muestras durante 1 min, centrifugar 15 min a 16.500 x g a 4 ° C.
    5. Agregar 0,8 mL de isopropanol frío a la fase acuosa e incubar las muestras durante 2 – 3 horas a 20 ° C. Centrifugar las muestras durante 35 min a 16.500 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    6. Lavar el pellet de RNA mediante la adición de 500 μl de etanol 70% frío (no mezclar).
    7. Centrifugar las muestras a 16.500 x g por 10 min eliminar el etanol. Aspirar la solución y en un concentrador centrífugo en seco.
    8. Una vez seco, Resuspender el pellet en 100 μl de agua libre de DNasa/Rnasa.
      Nota: Las muestras deben ser tratadas dos veces con DNases para eliminar los contaminantes del ADN según las recomendaciones del fabricante.
    9. Evaluar la integridad del RNA en un gel de agarosa y confirmar midiendo el número de integridad del RNA (RIN) y el cociente ribosomal con un método basado en el chip de la electroforesis capilar.
      Nota: El RIN tiene el rastro electroforético todo en cuenta. El RIN algoritmo de software permite la clasificación de ARN total, basado en un sistema de numeración de 1 a 10, con 1 siendo el perfil más degradado y 10 siendo mas intacto. Para proceder a la preparación de la biblioteca de cDNA, los RINs deben ser en 8 y el cociente ribosomal [28S/18S] tan alto como sea posible, el valor ideal 2, dependiendo del organismo y sus especificidades.
    10. Almacenar las muestras de RNA a-80 ° C hasta que la preparación de la biblioteca de cDNA para la secuencia.
  3. Preparación de la biblioteca del cDNA
    1. Para continuar con la preparación de la biblioteca, utilizar un kit de síntesis de cDNA comercialmente disponibles (Tabla de materiales) utilizando el protocolo del fabricante.
    2. Compruebe la biblioteca para la concentración y calidad en un Chip de ADN.
      Nota: Puede realizarse una cuantificación más precisa y exacta con ensayos de cuantificación basado en fluorescente sensible.
  4. Secuencia de la biblioteca
    1. Normalizar las muestras a 2 nM y proceder a multiplexación según la organización de la célula de flujo.
    2. Desnaturalizar las muestras a una concentración de 1 nM utilizando 0,1 N NaOH durante 5 min a TA.
    3. Diluir las muestras en 22:00. Cada muestra en la celda de flujo de carga a 22:00.
    4. Continuar con la secuencia con un sistema de secuenciación de alto rendimiento que permite genómica a gran escala. Aquí el funcionamiento era un run SRM (SR: solo lectura, PE: Lee fin emparejados, M: multiplexado muestras) de 51 ciclos con 7 bases de índice leer.
    5. Evaluar la calidad de la secuencia con el FastQC externo programa13.
    6. Tras el recorte de las secuencias del adaptador, proceder con alineaciones leerlas contra un genoma de referencia. Alinear contra el genoma de la célula eucariota para evaluar la contaminación de las muestras y, si es necesario, proceder con el ajuste de la Lee no bacteriana.
  5. Análisis estadístico
    1. Utilizar varios programas de software disponibles en línea para definir conjuntos de genes diferencialmente expresados: software R, Bioconductor paquetes incluyendo DESeq2 y el paquete de PF2tools (versión 1.2.12) desarrollado en la plataforma "transcriptoma et Epigénome" (Pasteur Instituto, París).

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Representative Results

M. abscessus tiene la capacidad para resistir y escapar de la respuesta bactericida de los macrófagos y ambientales protozoos como las amebas. M. abscessus expresa factores de virulencia cuando se cultiva en contacto con las amebas, que hace más virulentas en ratones4. El primer objetivo de estos métodos fue identificar los genes presentes en M. abscessus permitiendo su supervivencia y multiplicación dentro de amebas.

Para ello, se proyectó una biblioteca mutante de M. abscessus subsp massiliense, obtenidos por Tn entrega9, después de co-cultivo en presencia de amebas, para identificar los mutantes con crecimiento atenuado en este intracelular medio ambiente (figura 1). También se evaluó el comportamiento de los mismos mutantes después de co-cultivo con los macrófagos para analizar si esta atenuación del crecimiento fue preservado en los macrófagos de ratones.

Esta biblioteca de ciegos transposon proyección enfoque, confirmó un fenotipo de replicación defectuosa para 47 de 6.000 mutantes que tuvieron una supervivencia del 50% o menos en las amebas o los macrófagos, en comparación con controles de10. Para descartar se evaluaron mutantes con atenuada supervivencia intracelular que puede ser debido a un defecto intrínseco de crecimiento de la micobacteria, el crecimiento de curvas de mutantes de Tn todo seleccionados una en vitro líquido medio de cultivo enriquecido (1% glucosa - 7 H 9). In vitro el crecimiento de los mutantes fue supervisado siguiendo OD600 culturas cada 2 días. Los distintos mutantes que muestra un defecto de crecimiento en vitro en comparación a la cepa de tipo salvaje correspondiente fueron excluidos del estudio.

Fue vital para esta prueba ciega se reproduzca cada día utilizando exactamente el mismo protocolo. La limitación de esta técnica fue en la primera proyección visual, se tomaron fotografías de cada UFC para proporcionar una imagen precisa para referencia. En este grupo de mutantes, se identificaron 12 mutantes de M. abscessus (incluidos duplicados) en la cual el transposón fue insertado en genes pertenecientes al ESX-4 lugar geométrico del tipo sistema de secreción de VII que subraya su importancia en el intracelular crecimiento de M. abscessus10.

Hasta ahora, el análisis de la virulencia de M. abscessus se ha basado esencialmente en el análisis comparativo del genoma de M. abscessus con la de M. chelonae, una micobacteria que pertenecen al mismo grupo pero que causan infecciones sólo de la piel en los seres humanos. El objetivo fue obtener un catálogo de los genes expresados durante condiciones de co-cultivo diferentes con el fin de comprender mejor la adaptación y mecanismos de virulencia involucrados en co-cultivo en presencia profesional ambiental fagocitos. Análisis de esta virulencia creciente a través de un enfoque integral de la secuencia total mensajero RNAs de M. abscessus, fue realizado con el fin de detectar los RNAs inducidos o represión en co-cultivos de Ameba en comparación con los RNAs transcritos bajo condiciones en vitro . La expresión diferencial de estos RNAs puede conferir a M. abscessus un mayor "virulencia" explicar la colonización de las vías aéreas superiores en los seres humanos.

Estas culturas Co otra vez se realizaron en un medio mínimo (sin fuente de carbono o nitrógeno) como se describe anteriormente, con el fin de prevenir el crecimiento extracelular de M. abscessus y representativa de las condiciones ambientales que enfrentan estos micobacterias y bajo la presión de la selección de un antibiótico durante toda la duración de la cultura para seleccionar micobacterias intracelulares.

Por lo tanto, se desarrolló una técnica para aislar el RNA de micobacterias intracelulares. La principal dificultad de esta extracción de RNA micobacteriano era evitar la contaminación con ARN amoebal (tipo de eucariotas). Para evitar esto, se realizó lisis de Ameba en diferentes tiempos post co-cultivo, usando tiocianato de guanidinio (GTC); desde intracelulares micobacterias son resistentes. Después de este paso, una extracción mecánica de los RNAs micobacterias se llevó a cabo utilizando un homogeneizador de la célula en presencia de perlas de circonio. Esta técnica nos permitió obtener RNA micobacteriano de buena calidad, con un número RIN de alta calidad, esencial para mejorar la capacidad de llevar a cabo un análisis completo del transcriptoma de M. abscessus , utilizando la secuencia de ARN mensajero (ARNm) técnica (figura 2). Esto nunca antes de que se ha hecho y nos dio una visión fundamental de las familias de genes inducidos o reprimidos, agrupándolas según su función: la respuesta de M. abscessus a un entorno limitado en su fuente de nutrientes y minerales, a una hipoxia o ambiente ácido y la resistencia de M. abscessus a oxidativo y estrés nitrosativo y finalmente la expresión de la virulencia de M. abscessus en Ameba ambiental.

Figure 1
Figura 1 : A. primera pantalla visual de M. abscessus Tn mutantes en ameba. Pantalla a gran escala (A) de Tn mutantes en las amebas se realiza en placas de 96 pocillos con una aleatorizada multiplicidad de infección rápidamente identificar mutantes atenuadas. (B) identificación de los mutantes atenuados de Tn había alterado genes. ADN genómico TN mutantes está fragmentado con Claque clonar el sitio de inserción de Tn . M. abscessus genomas alberga 2500 ClaI sitios de restricción que favorece la obtención de ADN corto fragmentos pero baja la probabilidad de clonar el sitio de inserción de Tn (1/2500). Los clones se seleccionan con kanamicina, oso de resistencia por el transposon. El gen interrumpido es identificado por la secuencia con un primer interior del cassette de resistencia kanamicina Tn (flecha negra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análisis de la extracción de RNA micobacteriana. (A) RNA extracción de intracelular de M. abscessus en amebas co-cultivoM. abscessus . Las amebas co-cultivos con M. abscessus se realizan a una alta multiplicidad de infección (es decir, 100), en grandes volúmenes, con agitación suave, a favor de la célula a los contactos de las bacterias. Después de co-cultivos, las células son cosechadas y lisis con una combinación de GTC y ß-mercaptoetanol. Las bacterias que contiene el lisado celular se trata con GTC para debilitar la pared celular de las bacterias para facilitar la lisis mecánica de bacterias antes de la extracción de RNA. (B) RNA evaluación de la calidad e integridad con un bioanalyzer. Un gel de electroforesis se da en la que se observa rRNA (16S, 23S y 5S). RIN debe estar por encima de 8 para proceder con la preparación de la biblioteca para secuenciación y rRNA los cocientes (23S/16S) tan altos como sea posible según el organismo, siendo 2 el valor ideal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El comportamiento de M. abscessus es mucho más similar al comportamiento de SGM patógeno como M. tuberculosis que cualquier otras micobacterias pertenecientes a RGM2. El elemento clave en la patogenicidad del SGM es su capacidad para sobrevivir o multiplicarse aún dentro de las células presentadoras de antígeno tales como macrófagos y células dendríticas.

M. abscessus ha adquirido ciertas ventajas genomic como se muestra en la secuencia de su genoma14 total para sobrevivir dentro de una célula fagocítica eucariota. El genoma de M. abscessus se ha demostrado que estar evolucionando rápidamente y muy plástico, con muchos recientemente introducido secuencias de inserción como prophages y nuevos genes15. Aunque hay menos datos sobre virulencia factores de M. abscessus en comparación con M. tuberculosis, M. abscessus parece ser capaz de evolucionar rápidamente y activamente hacia mayor virulencia. Hasta ahora, el análisis de la virulencia de M. abscessus se basó esencialmente en el análisis comparativo del genoma de M. abscessus con la de M. chelonae, una micobacteria que pertenecen al mismo grupo pero que causan infecciones limitadas a la piel en los seres humanos. Algunos genes no presentes en M. chelonae pero presentes en M. abscessus, tales como fosfolipasa C, se explican en parte la resistencia de M. abscessus después de fagocitosis por amebas ambiental4.

El desarrollo de una técnica de co-cultivo de Ameba complementado con muestras ambientales ha demostrado inequívocamente ameba micobacterias interacciones16,17. Así, micobacterias se podía aisladas de lisados Co cultivadas en presencia de amebas en un tratamiento de agua planta18, y M. massiliense fue aislado del esputo de un paciente después de co-cultivo con amebas, considerando que la cultura solo no permite el aislamiento de esta micobacteria8. Las amebas se consideran cada vez más como una incubadora para micobacterias4 y Acanthamoebasp. como un huésped natural ambiental para muchas micobacterias no tuberculosas. Cultura la ameba más micobacterias sistemas cada vez más se proponen como modelos de simples y rápidos para caracterizar factores implicados en el crecimiento intracelular de las micobacterias19,20,21, 22,23,24.

En el entorno, la interacción entre micobacterias y amebas se documenta mal. El primer artículo que describe la evidencia de una asociación entre micobacterias y amebas en el campo salió en 2014, y este estudio se centró en el análisis de una red de agua potable25.

A nuestro conocimiento, éste es la primera proyección durante un cocultivo con amebas. Este estudio permitió demostrar el papel desempeñado por los fagocitos ambientales en la adquisición de virulencia de un patógeno oportunista que afecta a los seres humanos. Para poner de relieve aquellos genes necesarios para la supervivencia intracelular de M. abscessus, una pantalla de una biblioteca mutante por transposición se llevó a cabo en una subespecie de M. abscessus complejo y en una cepa clínica. Esta biblioteca mutante fue defendida con amebas, este último que se ha demostrado como "campo de entrenamiento" para aumentar la virulencia de M. abscessus en ratones4, similar a la observada con M. avium26. El resultado principal fue el descubrimiento por primera vez en micobacterias del papel esencial de lo locus de ESX-4 codificación de un sistema de secreción tipo VII y antepasado del ESX-1 lugar geométrico considerado esencial para la virulencia y la supervivencia intracelular de M. tuberculosis Mycobacterium microti y M. marinum27,28,29,30,31.

El segundo objetivo era obtener un catálogo de los genes expresados durante condiciones de co-cultivo diferentes con el fin de comprender mejor la adaptación y posibles mecanismos de virulencia involucrados en co-cultivo en presencia de medio ambiente fagocitos profesionales. Análisis de esta virulencia creciente a través de un enfoque integral de la secuencia total del ARN mensajero de M. abscessus, fue realizado con el fin de detectar los RNAs inducidos o represión en co-cultivos de Ameba en comparación con los RNAs transcritos bajo condiciones en vitro . La expresión diferencial de estos RNAs puede conferir a M. abscessus un mayor "virulencia" explicar la colonización de las vías aéreas superiores en los seres humanos. Entre las especies RGM, M. abscessus es una excepción al fenotipo no patógenos junto a M. chelonae. La capacidad de causar patologías similares a las micobacterias tuberculosas de M. abscessus hace aún más único. Muchos estudios han informado las adaptaciones intracelulares de M. tuberculosis a la vida interior de los macrófagos32,33 pero ninguno se han centrado en adaptaciones de M. abscessus en vivo. Respuesta transcripcional de M. abscessus a la hipoxia ha sido descrito34 , destacando el papel de mycobactins y el regulón dosR como se describe en M. tuberculosis. Análisis del transcriptoma de M. abscessus dentro de amebas y de los macrófagos da una penetración en las bacterianas adaptaciones a la vida intracelular propiamente. Una comparación de los transcriptomas permite la evaluación del papel de amebas en accionar virulencia de s M. abscessuen los seres humanos y a descifrar de adaptaciones específicas a las células fagocíticas mamíferas. Una suposición hizo que el ambiente amoebal podría constituir un 'campo de entrenamiento' de M. abscessus antes de transferencia a las células humanas, para describir la virulencia de M. abscessus en términos de adaptaciones evolutivas, hace que este enfoque original .

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Acknowledgments

Reconocemos mucho PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) para el precioso don del mutante de biblioteca y el Dr. Ben Marshall (Facultad de medicina, Universidad de Southampton, Reino Unido) para la corrección del manuscrito. Mucho reconocemos la asociación francesa de paciente de la Fibrosis Quística "Vaincre la Mucoviscidose" y "L'Association Gregory Lemarchal" por su apoyo financiero (RF20150501377). También agradecemos a la Agencia Nacional de investigación (programa de ANR (ANR-13-BSV3-0007-01) de DIMIVYR) y la Région Ile (Domaine d'Intérêt mayor Maladies Infectieuses et Emergentes) para la financiación de la beca postdoctoral para VL-m.. L. L. es Becaria doctoral de la "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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