Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

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Immunology and Infection

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Summary

Aqui, apresentamos dois protocolos para estudar interações do fagócito -Mycobacterium abscessus : a triagem de uma biblioteca de transposon mutant para deficiência intracellular bacteriana e a determinação de bactérias intracelular transcriptoma do RNA sequenciamento. Ambas as abordagens fornecem insights sobre as vantagens genômicas e adaptações de transcriptomic melhorar a aptidão de bactérias intracelulares.

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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Abstract

O que diferencia outras micobactérias saprófitas Mycobacterium abscessus é a capacidade de resistir a fagocitose por macrófagos humanos e a capacidade de se multiplicar no interior dessas células. Essas características de virulência processam M. abscessus patogênicos, especialmente em hosts vulneráveis com doença pulmonar estrutural subjacente, como fibrose cística, Bronquiectasia ou tuberculose. Como a doentes infectados com M. abscessus permanece obscuro. Ao contrário de muitos micobactérias, M. abscessus não é encontrado no ambiente, mas pode residir dentro as amebas, fagócitos ambientais que representam um potencial reservatório para M. abscessus. Com efeito, M. abscessus é resistente à fagocitose amoebal e a vida intra-ameba parece aumentar a virulência do M. abscessus em um modelo experimental de infecção. No entanto, pouco é conhecido sobre a virulência do M. abscessus em si. Para decifrar os genes que conferem uma vantagem para M. abscessus vida intracelular, uma triagem de uma biblioteca de mutante de transposon M. abscessus foi desenvolvida. Em paralelo, foi desenvolvido um método de extração de RNA de micobactérias intracelulares após co-cultura com amebas. Este método foi validado e permitiu o sequenciamento de todo M. abscessus transcriptomes no interior das células; fornecimento, pela primeira vez, uma visão global para M. abscessus adaptação à vida intracelular. Ambas as abordagens dão-em uma visão M. abscessus fatores de virulência que permitem a M. abscessus colonizar as vias aéreas em seres humanos.

Introduction

O gênero Mycobacterium inclui espécies que variam de organismos saprófitas inofensivos a principais patógenos humanos. Espécies patogénicas well-known tais como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans pertencem ao subgrupo de crescimento lento micobactérias (SGM). Em contraste, o subgrupo de rápido crescimento micobactérias (RGM) caracteriza-se pela sua capacidade de formar colônias visíveis em menos de 7 dias em ágar-ágar. O grupo RGM abrange mais de 180 espécies, principalmente de não-patogênicas micobactérias saprófitas. Estudos sobre RGM as interações com seus hospedeiros principalmente focado na Mycobacterium smegmatis e demonstram que estas micobactérias são rapidamente eliminadas pela ação bactericida dos macrófagos.

Mycobacterium abscessus é um do RGM rara que são patogénicas para os seres humanos e é responsável por uma vasta gama de infecções, que variam de pele e infecções de tecidos moles para as infecções pulmonares e disseminadas. M. abscessus é considerado, juntamente com Mycobacterium avium, o principal patógeno micobacteriana em pacientes de fibrose cística1.

Vários estudos realizados na M. abscessus indicam que este mycobacterium se comporta como um patógeno intracelular, capaz de sobreviver a resposta bactericida de macrófagos e fibroblastos nos pulmões e pele, o que não é normalmente observada em RGM 2 , 3 , 4. análise do genoma de M. abscessus identificou vias metabólicas, tipicamente encontradas em microrganismos ambientais em contacto com o solo, plantas e ambientes aquáticos, onde livre amebas são frequentemente presentes5. Eles também têm demonstrado que M. abscessus é dotado de vários genes de virulência não encontrados no RGM não-patogênicas e Saprófita, provavelmente adquirida pela transferência horizontal de genes em um nicho favorável a troca genética que pode reunir várias bactérias resistentes a ameba.

Experimentalmente, um dos primeiros resultados marcantes foi a observação de crescimento intracelular de M. abscessus em macrófagos, bem como para M. tuberculosis6. M. abscessus também resiste a acidificação do fagossoma, apoptose e autofagia, três mecanismos essenciais da resistência à infecção2celular. Ainda mostrou que a M. abscessus é capaz de estabelecer uma comunicação imediata entre o fagossoma e o citoplasma, um ambiente mais rico em nutrientes que pode favorecer a multiplicação bacteriana2. Muito pouco é conhecido sobre as vantagens de genômicas que M. abscessus possui ou adquiriu para permitir a sobrevivência em um ambiente intracelular. Coculture ameba é um método eficiente que permitiu o isolamento de muitas novas bactérias resistentes a ameba como Mycobacterium massiliense7,8. A capacidade de se multiplicar dentro de amebas observou-se, em um modelo de clorofórmio de M. abscessus em ratos, que pode conferir uma maior virulência de M. abscessus4. Uma hipótese é que a M. abscessus desenvolveram características genéticas encontradas dentro deste ambiente para sobreviver nas células fagocíticas, que são diferentes das outra RGM não patogénicas. Essas aquisições podem favorecer a capacidade de se espalhar e sua virulência no hospedeiro humano.

Este relatório descreve ferramentas e métodos para destacar as vantagens de genômicas conferidas para M. abscessus para sobreviver no ambiente de amebas. Para este efeito, a seleção de mutantes de transposon M. abscessus é descrita pela primeira vez, na estirpe do tipo a Acanthamoeba castellanii , que permite a identificação de defeituoso do mutante para crescimento intracelular. Uma segunda triagem em macrófagos também é relatada, para confirmar se esse defeito persiste no hospedeiro humano. Em segundo lugar, para entender que mecanismos são aproveitados em M. abscessus se adaptar à vida em fagocíticas células e aumentar sua virulência no animal de acolhimento, um método especificamente adaptado para M. abscessus foi desenvolveram, depois da co-cultura na presença de amebas que permitiu a extração de RNA total de bactérias intra-amoebal. Como consequência, uma visão abrangente de M. abscessus genes que são necessários para uma vida intracelular foi desenvolvida.

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Protocol

1. Biblioteca triagem

  1. Construção da biblioteca mutante Tn
    1. Obter uma biblioteca de transposon.
      Nota: Para este experimento, uma biblioteca de transposon mutant foi obtida E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, EUA. A biblioteca foi construída de uma suave tensão clínica (43S) da M. abscessus complexo (M. abscessus subsp. massiliense) com um phagemid introduzido por M. abscessus , permitindo a inserção aleatória de um único Tn em um dinucleótido de TA (91.240 sequências de TA no genoma de M. abscessus ). Para mais detalhes, consulte referência de Rubin et al 9 e Laencina et al 10.
  2. Titulação da biblioteca e conservação dos mutantes em placas M. abscessusTn
    Nota: Isso leva uma semana.
    1. Descongele a biblioteca no gelo. Determine a concentração bacteriana através da realização de diluições em série em 1 mL de água (10-1 para 10-15). Placa de uma gota de cada diluição em uma placa de Petri contendo ágar 11 7H com canamicina 250mg/mL. Incube as placas a 37 ° C por 3 – 4 dias.
      Nota: Aqui, uma titulação de 10 bactérias/mL de11 foram recuperados.
    2. Depois de determinar a concentração da biblioteca, dilua a biblioteca para uma concentração final de 3.000 bactérias/mL, 10 ml de glicerol-água de 25%. Alíquota da biblioteca em 10 cryotubes com 1 mL de biblioteca em cada tubo. Armazenar as alíquotas a-80 ° C.
    3. Quando estiver pronto para usar, descongelar uma alíquota da biblioteca diluída no gelo e adicionar 100 µ l da biblioteca para 10 quadrados placas de ágar Mueller-Hinton (MH) (tamanho 12 cm) para recuperar colônias individuais de 200 a 300 após 3-4 dias de incubação a 37 ° C.
    4. Com palitos estéril, transferência das colônias individuais (cerca de 6.000 colônias em placas de 60 x 96 poços) em placas de 96 poços preenchido com 200 µ l de 7h 9 suplementado com 0,2% de glicerol, 1% de glicose, 250 mg/mL de canamicina. Incube a 37 ° C por 5 dias sem tremer.
    5. Transferir 100 µ l da cultura (etapa 1.2.4) para uma placa de 96 poços contendo 100 µ l de 7h 9 médio com 40% de glicerol. Loja da biblioteca ordenada a-80 ° C.
    6. Repita as etapas 1.2.3. a 1.2.5. com o resto da biblioteca até 10.000 clones individuais são recuperados (cerca de 100 x 96-placa e 30 MH chapas).
  3. Preparação de amebas
    1. Cultura ameba Acanthamoeba castellanii (AC) em frascos de cultura de tecidos de2 75 cm na temperatura de quarto (RT) em 30 mL de meio PYG (tabela 1) para a amplificação da célula linha11.
      Nota: Trofozoítos maduros de grandes células adesivas com numerosos vacúolos digestivos são claramente visíveis em um microscópio. A célula de tempo de duplicação é estimada ser 25 h. células foram ampliados cada 3 dias por espalhar um terço da cultura inicial em frascos de cultura de tecidos de 75 cm2 .
    2. Remova o meio PYG com uma pipeta de 25 mL. Lave as células com 10 mL de tampão de AC (tabela 2), que não contém quaisquer fontes de carbono ou nitrogênio12. Repeti a lavagem mais duas vezes.
      Nota: Reserva de AC que não contém nenhuma fonte de carbono ou nitrogênio evita o crescimento extracelular de micobactérias. Este mínimo médio leva para o encystment de amebas. Para limitar isso, inactivadas pelo calor Escherichia coli foram adicionados como um substrato (etapa 1.4) para amebas e tempos muito curtos de cultura foram promovidos (48 h para triagem de mutante) e 4 h ou 16 h cultura para experimentos de RNAseq. Como alternativa, use este meio mas enriquecido com meio PYG (normalmente 10%).
    3. Desanexe a ameba da parte inferior do frasco com um único shake vigoroso do recipiente de cultura de tecidos.
    4. Contagem de células com um hemocytometer para ajustar a concentração de células de 5 x 105 amebas/mL diluído em tampão de AC.
  4. Preparação de calor-inativado Escherichia coli bactérias para alimentar ameba após infecção
    1. Crescer a tensão isolada de Escherichia coli clínica de um estoque de glicerol em 100 mL de caldo de Luria (LB) durante a noite a 37 ° C.
    2. Recolher as bactérias por centrifugação a 1.835 x g durante 10 minutos em tubos de 50 mL. Desprezar o sobrenadante. Resuspenda o pellet com 10 mL de glicerol 10% água. Repeti a lavagem mais duas vezes.
    3. Resuspenda o pellet com 5 mL de glicerol 10% água. Alíquota 0,5 mL em tubos de 1,5 mL. Determine a quantidade de bactérias/mL realizar diluições em série e adicionando diluições em placas de ágar LB. Armazenar as alíquotas a-80 ° C.
    4. No dia anterior a infecção de ameba, descongelar uma alíquota no gelo e proceder ao calor-matança de incubar o tubo a 70 ° C por 60 min.
      Nota: Verifique a inactivação pelo chapeamento 100 µ l de bactéria inativada em placas de ágar LB durante a noite a 37 ° C. Não há colónias devem ser visíveis depois de uma noite de cultura.
    5. Diluir a bactéria matou o calor a uma concentração de 107 bactérias em 50 µ l de tampão de AC e armazenar as bactérias diluídas em 4 ° C para não mais de uma semana.
  5. Co-cultura de amebas -M. abscessus Tn mutante: primeira tela
    Nota: Isto leva 3-4 meses para o rastreio de 6.000 mutantes.
    1. Espalhe 5 x 104 amebas/bem de uma placa de 96 poços em 100 µ l de tampão de AC. Incube durante 1 h a 32 ° C sem tremer. Permitir que o tempo de trophozoïtes de ameba flutuante aderir aos poços.
      1. Durante a incubação, descongele as bactérias no gelo por 1h.
    2. Adicione 5 µ l das culturas de bactérias descongeladas com uma pipeta multicanal eletrônica. Infectar-se por 1,5 h. tela em torno de 6.000 clones individualizadas da placa de 96 poços Tn estoque de mutantes.
      Nota: O MOI é desconhecido neste passo do protocolo; no entanto, todas as placas de 96 poços contendo Tn mutantes foram cultivadas exatamente da mesma forma. Esta primeira tela visa identificar rapidamente mutantes deficientes intracelulares, sem considerar as variações na densidade de inóculo.
    3. Após a 1,5 h de infecção, inverta a placa de 96 poços em gazes estéreis, colocados em uma bandeja de metal esterilizada para remover o meio de AC sob uma coifa. Reabasteça com 200 µ l de meio AC. Repeti esta lavagem mais duas vezes.
    4. Adicione 200 µ l de meio fresco, suplementado com 100 µ g/mL amicacina para eliminar micobactérias extracelulares restantes.
    5. Incube durante 2 h antes de prosseguir com 3 lavagens adicionais (conforme descrito na etapa 1.5.3). Após a lavagem, manter as culturas com 50 µ g/mL amicacina em 200 µ l de tampão de AC.
    6. Adicione 5 x 107 inactivadas pelo calor Escherichia coli bactérias (da etapa 1.4) no final da infecção e a cada 24 h para evitar encystment de amebas.
    7. Após 48 h de co-cultura, lisar as células, adicionando 10 µ l de SDS 10% (Dodecil sulfato de sódio) para cada poço e incube por 30 min a 32 ° C. Prosseguir com a diluição serial e adicionar em placas de ágar Columbia contendo 5% sangue de cordeiro (placas de COS) para avaliar o número de micobactérias intracelulares. Selar a placa com o parafilm e incubar a 37 ° C.
    8. Quando colônias aparecem sobre as placas de ágar, após 3-4 dias, foto da placa e identificam os mutantes deficientes auditivos para crescimento intracelular, observando os depósitos com o menor número de colônias bacterianas.
      Nota: Não me importo sobre a forma, a altura ou a densidade da colônia (Figura 1A). 136/6000 mutantes foram identificados.
  6. Co-cultura de amebas -M. abscessusTn mutante: segunda tela dos mutantes identificados durante a primeira tela
    Nota: Isto leva 2 semanas. Uma segunda tela deve ser realizada com os 136 mutantes atenuados obtidos depois da primeira tela para quantificar precisamente o número de bactérias inoculadas e o número de sobrevivência intracelular bactérias 2 dias pós infecção.
    1. Crescido 1 colônia de cada mutante impactado em 50 mL tubos enchidos com 20 mL de 7h 9 suplementado com 0,2% de glicerol, 1% de glicose e 250 mg/mL de canamicina. Permitir que as bactérias para chegar à fase exponencial (0.6 < OD < 0.8).
    2. Lave a cultura por centrifugação (1.835 x g durante 10 minutos) no meio de AC. Desprezar o sobrenadante. Repita isso lavar duas vezes mais com 20 mL de 7h 9 suplementado com 0,2% de glicerol, 1% de glicose e 250 mg/mL de canamicina.
    3. Ressuspender as bactérias em 5 mL de tampão de AC.
    4. Determine a concentração de unidade (CFU) dos mutantes formadoras. Em placas de 24 poços, adicione 1 mL de água para as duas primeiras linhas. Adicione 100 µ l da suspensão bacteriana para o primeiro poço. Com uma micropipeta, misture três vezes. Em seguida, Aspire 100 µ l e depósito para o segundo, bem.
    5. Com uma dica nova, repita a etapa 1.6.4 do poço segundo a um terceiro, etc. até o décimo segundo bem.
    6. Aspire 30 µ l da diluição 10-12 e adicioná-lo para um prato de COS. Repita para as outras diluições.
    7. Embrulhe a placa COS com parafilm e incubar durante 3-4 dias a 37 ° C. Determine a concentração através da contagem das colónias.
    8. Realize ensaios de cultura co como descrito acima em triplicado em uma placa de 24 com 5 x 104 ameba por alvéolo em 1 mL de meio de cultura co de AC. Inocule com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10.
    9. Após 48 h de co-cultura, prossiga com a lise celular conforme descrito no passo 1.5.7. Realizar diluições em série na água (10-1 a 10-6) e adicione 30 µ l para as placas de COS. Incube as placas durante 4 dias a 37 ° C antes de prosseguir com a contagem de UFC.
      Nota: Após esta segunda tela, 60 de 136 mutantes foram conservados.
    10. Armazene os mutantes afetados para a sua sobrevivência no interior das células. Adicionar uma colônia para um criotubo contendo meio LB com glicerol (20% final) ou em um criotubo contendo solução comercial e microbeads a favorecer uma conservação a longo prazo e facilitar futura inoculação e em seguida, armazenar a-80 ° C.
    11. Avaliar o crescimento mutante em vitro medindo a densidade óptica (OD) em 600 nm cada 2 dias.
      1. Crescer 1 colônia de cada mutante impactado em tubos de 50 mL enchido com 20 mL de 7h 9 suplementado com 0,2% de glicerol, 1% de glicose e 250 mg/mL de canamicina. Permitir que as bactérias para chegar à fase exponencial (0.6 < OD < 0.8) antes de ajustar o OD para 0,01 para começar a cinética.
      2. Exclua os mutantes com um em vitro crescimento defeito quando comparada com a cepa WT do conjunto de mutantes deficientes intracelulares.
  7. Co-cultura de macrófagos -M. abscessus Tn mutante defeituoso para uma vida intra-ameba
    Nota: Isto leva 1 mês.
    1. Espalhe 5 x 104 J774.2 murino macrófagos por alvéolo de uma placa de 24 em 1 mL de meio rico, DMEM suplementado com 10% de soro Fetal de bezerro (FCS). Incube as placas por 24 h a 37 ° C e 5% CO2 para permitir a adesão de macrófagos. Fornece 3 repetições.
    2. Realize a infecção. Inocule os mutantes de Tn , com um MOI de 10, diluído em DMEM com 10% de FCS em um volume de 100 µ l.
    3. Após 3 h de infecção, realize três lavagens com 1 mL de DMEM (uma bomba de vácuo pode ser usada). Então trate com 250 µ g/mL amicacina (em DMEM com 10% de FCS) por 1h eliminar micobactérias extracelulares restantes.
      1. Depois lava-se com 1 mL de DMEM 3 adicionais, manter as culturas em 250 µ g/mL amicacina (em DMEM com 10% de FCS) até um volume final de 1 mL, para evitar a multiplicação de micobactérias extracelular.
    4. 72 h após a co-cultura, remover o meio e lyse os macrófagos, adicionando 1 mL de água fria. Incubar durante 30 min a 4 ° C.
    5. Realize ensaios de UFC em placas COS para avaliar o número de bactérias intracelulares.
      1. Em uma placa de 24, adicione 1 mL de água para as duas primeiras linhas. Adicione 100 µ l do lisado celular total co para o primeiro poço. Com uma micropipeta, misture três vezes. Aspirar a 100 µ l e depositá-los no segundo bem.
      2. Com uma dica nova, repita a diluição do poço segundo a um terceiro, etc. , até o décimo segundo bem. Em seguida, Aspire 30 µ l da diluição 10-12 e adicioná-lo para um prato de COS.
      3. Repita para as outras diluições. Embrulhe a placa COS com parafilm e esperar 3-4 dias para observar e contar as colônias.
  8. Identificação e sequenciamento do local de inserção do Tn em mutantes de M. abscessus
    Nota: Isto leva 1,5 meses para 60 mutantes.
    1. Extração de genômica de identificados M. abscessus mutantes
      1. Crescem os mutantes em um tubo de 50 mL com 20 mL de 7h 9 meio suplementado com 0,2% de glicerol, 1% de glicose e canamicina 250mg/mL de fase exponencial (OD600= 0,8).
      2. Colha 10 mL das culturas (2.396 x g, 5 min). Desprezar o sobrenadante. Suspender as bactérias em 500 µ l de solução eu (25% de sacarose, 50 mM Tris pH 8, lisozima de 10 mg/mL, tioureia 40 milímetros). Transferir a solução para tubos de 2 mL com tampa de rosca e incubar durante 2 h a 37 ° C.
      3. Adicione 500 µ l de solução II (25% de sacarose, 50 mM Tris pH 8, 50mm EDTA). Após pipetagem para cima e para baixo 5 - 10 vezes, adicionar grânulos de zircónio até um volume de 500 µ l do tubo.
      4. Prosseguir com a lise celular com um homogeneizador (3 x 6.000 rpm, 45 s) com uma incubação de 1 min no gelo entre cada rodada.
      5. Adicione 5 µ l de 20 mg/mL de Proteinase K (final de 100 µ g/mL) e incubar as amostras durante a noite a 55 ° C.
      6. Adicione 1 mL de frio do álcool isoamílico/fenol/clorofórmio (25:24:1) sob uma coifa. Misture as amostras vortexing antes de prosseguir com a centrifugação a RT e 16.500 x g durante 30 min.
      7. Após a centrifugação, recuperar a fase aquosa e adicionar um volume igual de solução de álcool de fenol/clorofórmio/isoamílico frio debaixo de um carro. Centrifugar as amostras a 16.500 x g durante 30 min recuperar novamente a fase aquosa.
      8. Adicione 0,7 volume de isopropanol RT para a fase aquosa recuperada sob uma coifa. Inverter lentamente os tubos para permitir a precipitação do DNA e incubar 5 min à RT Em seguida centrifugar durante 10 min a 16.500 x g e RT
      9. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 500 µ l de etanol a 70% sob um capuz. Centrifuga os tubos por 10 min a 16.500 x g em RT antes de remover o etanol. Incube durante 10 minutos permitir que o restante da evaporação do álcool.
      10. Finalmente, suspenda o sedimento de DNA em 100 µ l de água livre de RNase/DNase. Determine o DNA de rendimento e pureza do DNA com um espectrofotômetro.
      11. Remova 1 µ g de genoma de DNA e digest com 10 U do ClaI para uma noite de sub clonagem o local de inserção do Tn . Use o protocolo do fabricante.
        Nota: A CIAenzima é dentre as enzimas de restrição mais altamente representadas no genoma M. abscessus (2.173 sítios de restrição). Uma CIArestrição site também é encontrado na sequência Tn, a montante da fita do mutante Tn resistência canamicina. Assim, a CIAmediada por subcloning permite identificar o local de inserção do Tn.
    2. Sub clonagem em um plasmídeo de DNA genômico contendo o Tn
      Nota: Antes de prosseguir com o Tn-subcloning na 2.686 bp pUC19 ampicilina-resistentes do plasmídeo, adicionar um CIAeu local de restrição no site clonagem múltiplos do plasmídeo. A sequência do plasmídeo pUC19 pode ser encontrada em https://www.addgene.org/50005/sequences/ este link.
      1. Fabricante de acompanhamento do protocolo de digerir o plasmídeo pUC19 com EcoRI e HindIII, que libera um fragmento de 51 bp e um fragmento de Dom 2635 purificam o duplo vetor digerido com um kit de purificação de PCR comercial para eliminar o 51 bp lançado o fragmento.
      2. Misturar 1 µ l (concentração 25 pmol / µ l) de dois oligonucleotídeos complementares (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' e 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') de 28 bp cada um contendo a CIAeu local de restrição e nas extremidades o HindIII e EcoR Eu locais da limitação. Aqueça a 100 ° C por 10 min e depois refrescar para ligá-los.
      3. Digerir os primers emparelhados por EcoRI e HindIII, de acordo com o protocolo do fabricante.
      4. Ligate 150 ng de EcoReuHindIII-restrito pUC19 plasmídeo com concentração diferente de iniciadores emparelhados (50 pmol / µ l, 25 pmol / µ l, 2.5 pmol / µ l) por 1h no RT com 1 U de T4 DNA ligase em um volume final de 20 µ l. Verifique que a clonagem de um diferente digestão enzimática.
      5. Digerir o plasmídeo modificado com CIAeu por 2 h a 37 ° C.
      6. Ligate 50 ng do CIA-limitei pUC19plasmídeo e 50 ng de DNA genômico digerido pela CIAeu por 1h no RT com 1 U de T4 DNA ligase em 10 µ l.
      7. Proceda à transformação de bactérias electrocompetent Escherichia coli com 5-10 µ l da ligadura (2500 V, 200 Ohms, 25 µF). Selecione os clones em placas de ágar LB suplementados com 50 canamicina µ g/mL e 50 µ g/mL ampicilina, para selecionar as bactérias plasmídeos com porções de Tn sequências de rolamento.
      8. Cresce clones resistentes durante a noite em meio líquido LB com a seleção apropriada de antibióticos (50 canamicina µ g/mL e 50 µ g/mL ampicilina).
      9. Extrair o DNA do plasmídeo. Para verificar a presença da inserção da restrição enzimática e sequenciar a extremidade 3' da Tn , para identificar o gene interrompido com um correspondente do oligonucleotide (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') para os última 17 pares de base da canamicina Tn gaveta de resistência.
      10. Alinhe a sequência contra a estirpe de ir 06 de M. abscessus , realizando uma explosão de nucleotídeo (explosão-N).

2. o RNA extração de micobactérias intracelulares para análise de Rnaseq

Nota: Isto demora 4 meses para experimentos e 4 meses para análise de RNAseq.

  1. Co-cultura de amebas-M. abscessus em lotes
    Nota: O seguinte experimento, co-cultura é executada em tubos de 50 mL com agitação para favorecer as bactérias aos contatos do celular.
    1. Crescer M. abscessus em 7h 9 suplementado com 0,2% de glicerol, glicose 1% para a fase de meados-exponencial a 120 rpm.
    2. Lave as bactérias duas vezes com 10 mL de tampão de AC.
    3. Estimar a concentração de bactérias através da medição do OD600nm (1 OD600= 4 x 108 micobactérias). Adicione 8,5 x 108 micobactérias 8,5 x 106 amebas em 10 mL de meio de AC.
    4. Incube durante 1 h a 30 ° C, com agitação suave (cerca de 80 rpm).
    5. Recolher as células por centrifugação a 253 x g durante 12 min. remover o sobrenadante e suspender as células em 10 mL de tampão de AC. Repeti esta lavagem mais duas vezes.
    6. Ressuspender as células em 10 mL de tampão de AC contendo 50 µ g/mL amicacina para eliminar bactérias extracelulares e incubar durante 4 horas a 30 ° C, com agitação suave (80 rpm). Lave as células duas vezes novamente.
  2. Extração de RNA total de intracelular M. abscessus
    Nota: Execute etapas 2.2.1–2.2.3 sob a capa das emanações resultantes da utilização de reagentes tóxicos.
    1. Após a lavagem final, resuspenda as amebas infectadas em 4 mL de solução fria III (tabela 3) com extemporaneamente 280 µ l de β-Mercaptoetanol para perturbar as amebas. Este é o passo de tiocianato (GTC) de guanidínio. Manter a suspensão no gelo durante 10 min. centrifugar a célula lisado por 30 min a 2.396 x g e 4 ° C para a bactéria intracelular liberada de Pelotas.
    2. Remover o sobrenadante e suspender o sedimento bacteriano em 1 mL de solução fria III. Colher as bactérias no 2396 x g durante 30 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet em 1 mL da solução tampão e transferir para um tubo de parafuso de 2 mL contendo grânulos de zircónio (até a graduação de 500 µ l do tubo). Armazenar os tubos pelo menos 24 h a-80 ° C.
      Nota: Armazenamento no reagente de Lise permite a inativação de RNases e célula de dissolução.
    3. Quando estiver pronto para uso, descongelar as amostras no gelo e lyse-los com um homogenizador através da realização de duas rodadas a 6.000 rpm para 25 s, seguido de uma rodada em 6.000 rpm por 20 s, com uma incubação de 1 min no gelo entre cada rodada.
    4. Para arrefecer a amostra, os incube no gelo por 10 min. Em seguida, adicione 200 µ l de clorofórmio diluído em álcool isoamílico. Após a utilização do Vortex as amostras por 1 min, centrifugar por 15 min em 16.500 x g e 4 ° C.
    5. Adicionar 0,8 mL de isopropanol frio para a fase aquosa e incubar as amostras para 2-3 h a 20 ° C. Centrifugar as amostras por 35 min em 16.500 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    6. Lave a pelota do RNA adicionando 500 µ l de etanol a 70% frio (não misturar).
    7. Centrifugar as amostras a 16.500 x g por 10 min remover o etanol. Aspirar a solução e seque em um concentrador centrífugo.
    8. Uma vez seco, resuspenda as pelotas em 100 µ l de água livre de RNase/DNase.
      Nota: As amostras devem ser tratadas duas vezes com DNases para remover contaminantes de DNA de acordo com as recomendações do fabricante.
    9. Avaliar a integridade do RNA em um gel de agarose e confirmar medindo-se o número de integridade do RNA (RIN) e o rácio ribosomal com um método baseado no chip de eletroforese capilar.
      Nota: O RIN tem o traço inteiro eletroforético em conta. A RIN algoritmo de software permite a classificação do RNA total, baseado em um sistema de numeração de 1 a 10, com 1 sendo o perfil mais degradado e 10 sendo a mais intacta. Para prosseguir com a preparação de biblioteca de cDNA, os RINs devem ser mais de 8 e o rácio ribosomal [28S/18S] mais alto possível, o valor ideal, sendo 2, dependendo do organismo e suas especificidades.
    10. Armazenar as amostras de RNA a-80 ° C até a preparação da biblioteca de cDNA para sequenciamento.
  3. Preparação da biblioteca de cDNA
    1. Para prosseguir com a preparação da biblioteca, use um kit de síntese do cDNA comercialmente disponíveis (Tabela de materiais) usando o protocolo do fabricante.
    2. Verifique se a biblioteca para a concentração e qualidade em um Chip de DNA.
      Nota: Mais precisa e exata quantificação pode ser realizada com ensaios de quantificação de base fluorescente sensível.
  4. Sequenciamento de biblioteca
    1. Normalizar as amostras de 2 nM e proceder a multiplexação de acordo com a organização de célula de fluxo.
    2. Desnaturar as amostras em uma concentração de 1 nM, utilizando 0,1 N NaOH para 5 min à RT
    3. Dilua as amostras às 22:00. Carrega cada amostra na célula de fluxo às 22:00.
    4. Proceda com sequenciamento com um sistema de sequenciamento de alto rendimento que permite genômica em grande escala. Aqui o run foi uma corrida SRM (SR: única leitura, PE: emparelhado-final lê, m: multiplexado amostras) de 51 ciclos com 7 índice bases ler.
    5. Avalie a qualidade da sequência com o externo FastQC programa13.
    6. Após a aparagem de sequências de adaptador, prosseguir com a leitura alinhamentos contra um genoma de referência. Alinhe-se contra o genoma de célula eucariótica para avaliar a contaminação da amostra e, se necessário, proceder com o aparamento das leituras não-bacteriana.
  5. Análise estatística
    1. Usar vários programas de software disponíveis on-line para definir conjuntos de genes diferencialmente expressos: R software, Bioconductor pacotes, incluindo DESeq2 e o pacote de PF2tools (versão 1.2.12) desenvolvido na plataforma "Transcriptome et Epigénome" (Pasteur Instituto, Paris).

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Representative Results

M. abscessus tem a capacidade de resistir e fugir das respostas bactericidas de macrófagos e ambientais protozoários como as amebas. M. abscessus expressa fatores de virulência quando cultivada em contacto com as amebas, que o torna mais virulento em ratos4. O primeiro objetivo desses métodos era identificar os genes presentes no M. abscessus , permitindo sua sobrevivência e multiplicação dentro de amebas.

Por isso, uma biblioteca mutante de M. abscessus subsp. massiliense, obtidos por Tn entrega9, foi exibida na sequência co-cultura na presença de amebas, para identificar os mutantes com crescimento atenuado neste intracelular ambiente (Figura 1). O comportamento dos mutantes mesmos também foi avaliado seguindo co-cultura com macrófagos para analisar se esta atenuação do crescimento foi preservada em macrófagos de ratos.

Esta biblioteca de transposon cego triagem abordagem, confirmou um fenótipo de replicação defeituosa para 47 de 6.000 mutantes que teve uma sobrevida de 50% ou menos em amebas e/ou de macrófagos, em comparação com controles10. Para descartar os mutantes com atenuada sobrevivência intracelular, que pode ser devido a um defeito de crescimento intrínseco do mycobacterium, o crescimento, as curvas de mutantes de Tn tudo selecionados foram avaliados em um em vitro líquido enriquecido meio de cultura (1% glicose - 7h 9). In vitro o crescimento de todos os mutantes foi monitorado, seguindo OD600 das culturas a cada 2 dias. Os mutantes diferentes exibida um defeito crescimento em vitro comparado da estirpe selvagem-tipo correspondente foram excluídos do estudo.

Foi extremamente importante para este teste cego ser reproduzido a cada dia usando exatamente o mesmo protocolo. A limitação desta técnica foi a primeira análise visual, fotografias foram tiradas de cada UFC para fornecer uma imagem exata para referência. Neste grupo de mutantes, 12 M. abscessus mutantes (incluídos duplicatas) foram identificados em que o transposon foi inserido em genes pertencentes para o ESX-4 locus do tipo sistema de secreção do VII que sublinha a sua importância no intracelular crescimento de M. abscessus10.

Até agora, a análise da virulência do M. abscessus essencialmente baseou-se na análise comparativa do genoma de M. abscessus com o de M. chelonae, um mycobacterium pertencentes ao mesmo grupo mas causando apenas infecções da pele em humanos. O objetivo era obter um catálogo de genes expressado durante condições de cultura co diferentes a fim de melhor compreender a adaptação e, potencialmente, mecanismos de virulência envolvidos durante co-cultura na presença de ambiente profissional fagócitos. Análise deste virulência aumentada através de uma abordagem abrangente de RNAs Mensageiro de sequenciamento total de M. abscessus, foi realizada a fim de detectar os RNAs induzida ou reprimida durante ameba co culturas em comparação com os RNAs transcritos sob em vitro condições. A expressão diferencial destes RNAs pode conferir para M. abscessus uma reforçada "virulência" explicando a colonização das vias aéreas superiores em seres humanos.

Essas culturas co foram novamente realizadas em meio mínimo (nenhuma fonte de carbono ou nitrogênio) como descrito acima, a fim de impedir o crescimento extracelular de M. abscessus e representativas das condições ambientais enfrentados por estas micobactérias e sob a pressão de seleção de um antibiótico durante toda a duração da co-cultura para selecionar micobactérias intracelulares.

Portanto, uma técnica foi desenvolvida para isolar o RNA das micobactérias intracelulares. A principal dificuldade com esta extração de RNA micobacteriana estava evitando contaminação com RNA amoebal (tipo Eukaryote). Para evitar isso, lise de ameba realizou-se em diferentes momentos post co-cultura, usando de guanidinium (GTC); desde intracelulares micobactérias são resistentes. Após esta etapa, uma extração mecânica dos RNAs micobacterianas foi realizada usando um celular-homogenizador na presença de grânulos de zircônio. Esta técnica permitiu-nos obter micobacteriana RNA de boa qualidade, com um número RIN de alta qualidade, essencial para melhorar a capacidade de realizar uma análise completa do transcriptoma da M. abscessus , usando a sequência de RNA mensageiro (mRNA) técnica (Figura 2). Isto nunca foi feito antes e nos deu uma visão fundamental das famílias gene induzida ou reprimida, agrupando-os de acordo com o seu papel: a resposta de M. abscessus em um ambiente limitado em sua fonte de nutrientes e minerais, para uma hipoxia ou ambiente ácido e resistência de M. abscessus oxidativo e estresse nitrosative e, finalmente, expressão da virulência do M. abscessus em ameba ambiental.

Figure 1
Figura 1 : A. primeira tela visual de M. abscessus Tn mutantes na ameba. (A) tela em grande escala dos mutantes Tn em amebas é realizada em placas de 96 poços, com uma multiplicidade aleatória de infecção para identificar rapidamente mutantes atenuados. (B) identificação dos mutantes atenuados Tn interrompeu os genes. DNA genômico dos mutantes TN é fragmentado com CIAeu clonar o local de inserção do Tn . M. abscessus genomas abriga 2500 CIAeu restrição sites que favores a obtenção do DNA curto fragmentos, mas reduziu a probabilidade para clonar o local de inserção do Tn (1/2500). Os clones são selecionados com canamicina, urso de resistência pelo transposon. O gene interrompido é identificado pelo sequenciamento com um primer dentro da gaveta de resistência Tn canamicina (seta preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análise de extração de RNA micobacteriana. (A) RNA extração de intracelular M. abscessus durante as amebas -M. abscessus co-cultura. Amebas co culturas com M. abscessus são executadas em uma multiplicidade de alta de infecção (ou seja, 100), em grandes volumes, com leve agitação, para favorecer o celular para contatos de bactérias. Depois de culturas co, as células são colhidas e lysed com uma combinação de GTC e ß-Mercaptoetanol. As bactérias de lisado contendo células é tratada com GTC novamente para enfraquecer a parede celular de bactérias para facilitar mecânico lise de bactérias antes da extração do RNA. Avaliação de qualidade e integridade (B) RNA com um bioanalyzer. Um gel de eletroforese é dado no qual rRNA é observada (23S, 16S e 5S). RIN deve estar acima de 8 para prosseguir com a preparação de biblioteca para sequenciamento e rRNA rácios (23S/16S) mais altos possível, dependendo do organismo, sendo 2 o valor ideal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O comportamento de M. abscessus é muito mais semelhante ao comportamento da SGM patogénico, tais como M. tuberculosis do que qualquer outras micobactérias pertencentes a RGM2. O elemento chave na patogenicidade de SGM é sua capacidade de sobreviver ou até mesmo se multiplicam dentro de células apresentadoras de antígeno, tais como macrófagos e células dendríticas.

M. abscessus adquiriu certas vantagens genômicas como mostrado pela sequência total de seu genoma14 para sobreviver dentro de uma célula eucariótica fagocítica. O genoma de M. abscessus foi mostrado para ser rapidamente evoluindo e muito plástico, com muitos recentemente introduzidas sequências de inserção como prophages e novos genes15. Embora haja menos dados na virulência fatores em M. abscessus em relação ao M. tuberculosis, M. abscessus parece ser capaz de evoluir rapidamente e ativamente no sentido de maior virulência. Até agora, a análise da virulência do M. abscessus essencialmente baseou-se na análise comparativa do genoma de M. abscessus com o de M. chelonae, um mycobacterium pertencentes ao mesmo grupo mas causando infecções limitadas a a pele em humanos. Alguns genes não presentes no M. chelonae , mas presente em M. abscessus, tais como fosfolipase C, parcialmente explicaram a resistência de M. abscessus após a fagocitose por amebas ambiental4.

O desenvolvimento de uma técnica de co-cultura ameba suplementado com amostras ambientais demonstrou inequivocamente ameba-micobacteriana interações16,17. Assim, micobactérias podem ser isoladas de lysates co cultivados na presença de amebas em um de planta de tratamento de água18e M. massiliense foi isolado da saliva de um paciente após co-cultura com as amebas, Considerando que a cultura sozinha não fez permita o isolamento deste de micobactérias8. Amebas são cada vez mais consideradas como uma incubadora para micobactérias4 e Acanthamoebasp. como um host ambiental natural para muitos micobactérias não-tuberculosa. Ameba além de micobactérias co-cultura sistemas cada vez mais estão sendo propostos como modelos simples e rápidos para caracterizar fatores envolvidos no crescimento intracelular das micobactérias19,20,21, 22,23,24.

No ambiente, a interação entre micobactérias e amebas é mal documentada. O primeiro artigo descrevendo a evidência de uma associação entre micobactérias e amebas no campo saiu em 2014, e este estudo focado na análise de uma rede de água potável25.

A nosso conhecimento, isso é primeira análise descrito durante uma co-cultura com amebas. Este estudo nos permitiu demonstrar o papel desempenhado pelos fagócitos ambientais na aquisição de virulência de um patógeno oportunista que afetam os seres humanos. Para destacar os genes necessários para a sobrevivência intracelular de M. abscessus, uma tela de uma biblioteca de mutantes por transposição foi realizada em uma subespécie de M. abscessus complexas e em uma cepa clínica. Esta biblioteca mutante foi exibida com as amebas, esta última tendo sido demonstrado como um "campo de treinamento" para aumentar a virulência do M. abscessus em ratos4, semelhante ao observado com o M. avium26. O principal resultado foi a descoberta pela primeira vez em micobactérias do papel essencial do locus de ESX-4 codificação de um sistema de secreção do tipo VII e ancestral do locus de ESX-1 considerado essencial para a virulência e sobrevivência intracelular de M. tuberculosis Mycobacterium microti e M. marinum27,28,29,30,31.

O segundo objetivo era obter um catálogo de genes expressado durante condições de cultura co diferentes a fim de compreender melhor a adaptação e potenciais mecanismos de virulência envolvidos durante co-cultura na presença de ambiental Fagócitos profissionais. Análise deste virulência aumentada através de uma abordagem abrangente de sequenciamento total do RNA mensageiro da M. abscessus, foi realizada a fim de detectar os RNAs induzida ou reprimida durante ameba co culturas em comparação com os RNAs transcritos sob em vitro condições. A expressão diferencial destes RNAs pode conferir para M. abscessus uma reforçada "virulência" explicando a colonização das vias aéreas superiores em seres humanos. Entre as espécies RGM, M. abscessus é uma exceção para o fenótipo não-patogênicas juntamente com M. chelonae. A capacidade de M. abscessus para causar patologias semelhantes para micobactérias tuberculosas torna ainda mais único. Muitos estudos têm relatado as adaptações intracelulares de M. tuberculosis a vida dentro de macrófagos32,33 , mas nenhum se concentraram em M. abscessus adaptações na vivo. Resposta transcricional de M. abscessus à hipoxia tem sido descrito34 , destacando o papel de mycobactins e o regulon dosR, conforme descrito em M. tuberculosis. Análise da transcriptoma de M. abscessus dentro amibas e macrófagos dá uma visão para as bacterianas adaptações à vida intracelular por si. Uma comparação entre essas transcriptomes permite a avaliação do papel das amebas no desencadeamento de virulência de s M. abscessuem seres humanos e para o deciframento de adaptações específicas para mamíferos células fagocíticas. Foi feita uma suposição de que o amoebal ambiente possa constituir um 'training ground' para M. abscessus antes de transferência para células humanas, a fim de descrever a virulência de M. abscessus em termos de adaptações evolutivas, processa essa abordagem original .

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Acknowledgments

Reconhecemos grandemente PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, EUA) para o dom precioso do mutante biblioteca e o Dr. Ben Marshall (Faculdade de medicina, Universidade de Southampton, Reino Unido) para as correções do manuscrito. Muito reconhecemos associação francesa do paciente para fibrose cística "Vaincre la Mucoviscidose" e "L'Association Gregory Lemarchal" pelo apoio financeiro (RF20150501377). Agradecemos também a Agência Nacional para a investigação (programa ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) e a modernização de Région (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) para o financiamento a postdoctoral fellowship para V.I.C.T.I.M.S.W.V.-M. L. L. é um colega de doutorado do "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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