Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin

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Biochemistry

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Summary

La purification des canaux ioniques est souvent difficile, mais une fois atteint, il peut potentiellement permettre in vitro les enquêtes des fonctions et des structures des canaux. Nous décrivons ici les procédures pas à pas pour l’expression et purification des protéines de mammifères bestrophin, une famille de Ca2 +-activé les canaux Cl .

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Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

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Abstract

Le génome humain code pour quatre bestrophin paralogues, nommément BEST1, BEST2, BEST3 et BEST4. Best1, codée par le gène BEST1 , est un Ca2 +-activé Cl canal (CaCC) principalement exprimée dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE). La signification physiologique et pathologique de BEST1 est mis en évidence par le fait que plus de 200 mutations différentes du gène BEST1 ont été génétiquement liées à un éventail d’au moins cinq troubles dégénératifs rétiniens, comme meilleur Vitelliforme Dystrophie maculaire (meilleure maladie). Par conséquent, comprendre la biophysique des canaux de bestrophin à l’échelle de la molécule unique est titulaire d’importance considérable. Cependant, obtenir des canaux ioniques mammifères purifiée est souvent une tâche difficile. Nous rapportons ici un protocole pour l’expression des protéines de mammifères bestrophin avec le système de transfert de gène de baculovirus BacMam et leur purification par affinité et chromatographie d’exclusion stérique. Les protéines purifiées ont le potentiel d’être utilisé dans les analyses subséquentes fonctionnelles et structurelles, telles que l’enregistrement électrophysiologique dans les bicouches lipidiques et cristallographie. Ce qui est important, ce pipeline peut être adapté pour étudier les fonctions et les structures d’autres canaux ioniques.

Introduction

Bestrophins sont une famille de canaux ioniques conservés par espèces variant de bactéries à l’homme1. Chez l’homme, le gène BEST1 , situé sur le chromosome 11q12.3, code pour la protéine de la membrane Bestrophin-1 (BEST1) qui s’exprime principalement dans la membrane basolatérale des cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des yeux2,3 ,4. Composé de 585 acides aminés, la première ~ 350 qui sont hautement conservées entre les espèces et contenir sa région transmembranaire, BEST1 agit comme un CaCC dans les humains1,5,6. En outre, les homologues BEST1 chez les poulets et Klebsiella pneumoniae à la fois fonctionnent comme homopentamers7,8, ce qui suggère un niveau élevé de conservation tout au long de l’évolution.

Chez l’homme, plus de 200 mutations du gène BEST1 ont été cliniquement liées à un groupe de maladies de dégénérescence rétinienne appelé bestrophinopathies1,9. Cinq bestrophinopathies spécifiques ont été signalés, notamment maladie de Best, dystrophie Vitelliforme de l’adulte, autosomique dominante vitreoretinochoroidopathy, autosomique récessive bestrophinopathy et rétinite pigmentaire3,4 ,10,11,12,13,14. Ces maladies, qui conduisent à une diminution de la vue et même la cécité, sont actuellement incurables. Afin de développer des traitements thérapeutiques et médicaments potentiellement personnalisés, il est essentiel de comprendre comment ces mutations pathogènes de BEST1 influencent la fonction et la structure des BEST1 canal15. À ces fins, les chercheurs doivent obtenir des canaux bestrophin purifié (souche sauvage et/ou mutant) et conduite in vitro analyses5,8.

La première étape clée est l’expression des canaux bestrophin des espèces plus élevées dans les cellules de mammifères. Comme baculovirus transduction des cellules HEK293-F (système BacMam) est une méthode puissante pour exprimer façon hétérologue protéines de membrane16,17, ce protocole utilise un vecteur de BacMam (pEG BacMam) optimisé pour expression robuste de la cibler les protéines18, dans ce cas, qui est un homologue de bestrophin chez les mammifères. Ce vecteur a été utilisé pour l’expression de diverses protéines de membrane, y compris des récepteurs couplés aux protéines G, récepteurs nucléaires et autres de canaux d’ion18. Il semble également que les protéines produites sont adaptés pour la cristallographie18. Avec des niveaux élevés d’expression dans les cellules HEK293-F, les protéines peuvent alors être épurées chromatographie ; plus précisément, dans le cas de bestrophins, affinité et chromatographie liquide d’exclusion peuvent être utilisés.

Une fois que ce protocole est affiné pour une chaîne de bestrophin, la protéine purifiée puis peut être analysée que pour sa fonction et sa structure à travers la bicouche lipidique plane et cristallographie de rayon x, respectivement de5,8. Au total, ces techniques offrent un pipeline puissant pour les études fonctionnelles et structurelles des bestrophins et d’autres canaux ioniques.

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Protocol

1. production BacMam Expression baculovirus

  1. Insérez la séquence codante d’une protéine bestrophin mammifères désiré dans la cheville BacMam vector18 avec une séquence de reconnaissance de protéase tabac Etch Virus (TEV), suivie d’un GFP-10 x son étiquette à l’extrémité C-terminale de la protéine.
  2. Transfecter transitoirement le plasmide expression adhésif HEK293 cellules19,20,21,22,23. Contrôler l’expression de la protéine GFP-fusion sous un microscope à fluorescence avec 10 X ou 20 X grossissement, une source d’excitation 488 nm et un filtre d’émission de 510 nm (Figure 1 a).
    Remarque : Transfection à base de polymères est assurée de 1 μg d’ADN plasmidique pour un plat de 35 mm de cellules HEK293.
  3. Produire les baculovirus dans des cellules d’insecte Sf9 comme précédemment décrit16,17.
    Remarque : Le passage 3 (P3) virus, qui sera utilisé pour infecter les cellules HEK293-F pour la production de protéines, peuvent être stocké à 4 ° C pendant 1 mois.
  4. Déterminer le titre (unités infectieuses) du virus P3 par la plaque formation test16,17.
    Remarque : Comme la protéine d’intérêt est le tag GFP, une méthode plus rapide pour le contrôle des unités infectieuses est d’infecter les cellules Sf9 avec des dilutions successives du virus et de compter le nombre de cellules fluorescentes après 48 h.

2. Expression de la protéine

  1. Maintenir les cellules HEK293-F dans une culture en suspension avec le médium d’expression HEK293-F dans un incubateur à 37 ° C humidifié avec 8 % de CO2. Utiliser des flacons de culture jetable qui sont 2 à 2,5 fois plus grand que le volume de la culture et de faire pivoter la culture sur une plate-forme orbitale à 135 tr/min.
    Remarque : Il est recommandé d’infecter les cellules lorsqu’elles sont entre 5 et 30 passages et pour effectuer ces actions sous un capot de culture cellulaire.
  2. 24h avant l’infection virale, ajouter 15 μL de bleu Trypan dans une aliquote de 15 μL de culture cellulaire et vérifier la densité cellulaire et la viabilité à l’aide d’un hémocytomètre sous un microscope. Diluer les cellules à 0,6 x 106 cellules/mL dans des fioles de 2 x 2 L chacun, 500 ml de milieu préchauffée à 37 ° C.
    Remarque : Les cellules mortes sont colorées bleu de Trypan Blues. La viabilité de la cellule souhaitée est > 95 %.
  3. Le jour de l’infection, vérifiez la densité cellulaire et la viabilité (étape 2.2).
    Remarque : Une grande viabilité cellulaire de > 95 % est essentiel pour l’expression efficace de l’infection et de protéines. La densité cellulaire attendue est ~1.0 x 106 cellules/mL (cultivée pendant la nuit de 2 x 500 mL le 0,6 x culture de cellules de 106 cellules/mL). Le nombre total de cellules est ~1.0 x 109.
  4. Les baculovirus P3 s’ajoute des cellules à une multiplicité d’infection (MOI) de 5. Pour déterminer la quantité de virus pour ensemencer, utilisez l’équation suivante :
    Equation
  5. Secouer les cellules sur la plate-forme orbitale à 135 tr/min dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 8 % CO2 pendant 24 h.
  6. Ajouter 10 mM du butyrate de sodium à la culture de cellules et continuer en incubation pendant 48 h.
    Remarque : Pour certaines protéines, réduisant la température de culture cellulaire à 30 ° C après que addition de butyrate de sodium peut améliorer expression et la stabilité.
  7. Sous un microscope à fluorescence avec 10 X ou 20 X grossissement, une source d’excitation 488 nm et un filtre de d’émission 510 nm, vérifiez le pourcentage et la luminosité des cellules vertes, qui représentent directement le rendement de protéine (bestrophin-GFP-10xHis) (Figure 1 b).
    Remarque : Le pourcentage de cellules vertes est calculé en : 100 x (cellules cellules vertes/Total). Niveau d’expression de protéine bon est indiqué par la forte fluorescence verte sous le microscope.
  8. Récolter les cellules par centrifugation à 1 000 x g à 4 ° C pendant 20 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les pellets de la cellule avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour un volume final de ~ 80 mL. Split, la suspension cellulaire dans les tubes coniques de 2 x 50 mL et centrifuger à 1 000 x g à 4 ° C pendant 20 min. stocker les pellets de cellule à-80 ° C.

3. Purification de protéine

  1. Incuber les tubes coniques contenant des granulés de cellule dans un bain d’eau à température ambiante pendant 10-15 min en remuant pour qu’ils dégèlent. Remettre en suspension les cellules à 2 x volume (p/v) de tampon A (tableau 1) (p. ex., 10 g de pastilles de cellule dans 20 mL de tampon) complétée avec des inhibiteurs de protéinase (aprotinine, leupeptine, pepstatine A et phénylméthylsulfonyle fluorure) à 0,1 à 1,0 mM. Pipette de haut en bas longuement pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
  2. Lyse des cellules à l’aide d’un homogénéisateur haute pression. Exécutez la suspension cellulaire par le biais de l’homogénéisateur à 7-10 MPa pour un total de 3 - 4 fois pour obtenir une homogénéisation complète. Garder la cellule lysat sur glace pendant 2-3 minutes entre les rounds.
  3. Ajouter du détergent [par exemple, 2 % w/v sol-grade n-dodécyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] pour le lysat cellulaire. Incuber en agitant pendant 1 h à 20 ° C pour extraire les protéines de la membrane.
    Remarque : Le type de détergent doit être optimisé pour chaque protéine cible18,24.
  4. Centrifuger à 150 000 x g dans une ultracentrifugeuse à 4 ° C pendant 1 h.
    Remarque : Toutes les étapes suivantes sont effectuées à 4 ° C.
  5. Ramassez les lysats de cellules claires et les flux à travers une 5 mL son piège Ni2 +LTN - colonne d’affinité préalablement équilibrés avec tampon A (tableau 1).
    Remarque : Après centrifugation, le lysat de cellules claires sera intercalé entre un culot au fond et une couche nuageuse sur le dessus. Utiliser une pipette de transfert de 10 mL pour recueillir soigneusement le lysat clair et ensuite passer à une pipette 1 mL pour le dernier quelques millilitres de lysat. Éviter le culot, qui peut boucher la colonne de Ni2 + ; Cependant, une petite quantité de la couche supérieure est très bien ou peut être filtrée avec un filtre 1,5 μm.
  6. Laver la colonne avec 25 mL de tampon B, puis 40 mL de tampon C (tableaux 2 et 3, respectivement).
    Remarque : C’est un bon endroit pour prendre une pause, comme purification totale peut prendre jusqu'à 12 h et de la protéine peut demeurer stable bien qu’attachée à la colonne du jour au lendemain.
  7. Fixer la colonne sur un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide et éluer avec fractionnement, la protéine de la colonne avec 13 mL de tampon D (tableau 3). Recueillir les fractions enrichies en protéines selon la lecture d’absorbance UV.
    Remarque: conditions de la FPLC sont les suivantes : une taille de fraction de 1,0 mL, une alarme de pression de la précolonne égale à 0,3 MPa et un débit de 0,5 mL/min.
  8. Mesurer la concentration de produit protéine éluée sur un spectrophotomètre microvolume. Lire l’absorbance à 280 nm.
  9. (Facultatif) Pour supprimer la balise de GFP-10xHis, ajouter la protéase TEV dans un rapport de masse de 1:1 et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    Note : La balise peut ou peut ne pas affecter la fonction ou la structure du canal purifié. Calculer le montant TEV de la volume et de la concentration de la protéine recueillie des étapes 3,7 à 3,8. Par exemple, si 10 mL de produit d’élution est recueilli et mesurée à 0,1 mg/mL, la protéine totale masse est 10 x 0,1 = 1 mg et 1 mg de TEV sera utilisée pour la digestion.
  10. Concentrer la protéine avec un 15 mL centrifuge (50 ou 100 kDa) unité de filtration de la filature à 4 000 x g à 4 ° C pour un volume final de 400-500 μL (pour une boucle de chargement d’échantillon de 2 mL sur FPLC).
    Remarque : Le temps de centrifugation pour concentration varie en fonction de la concentration et la taille de la protéine. Pour éviter de trop se concentrer, qui peut provoquer la précipitation de protéines, tourner pendant 10 min dans un premier temps, puis observer le volume restant et estimer le temps pour une rotation ultérieure (par exemple, 2-5 min), et ainsi de suite, pour obtenir le volume final. Pipette entre les spins pour disperser la protéine, qui est tirée vers le bas du filtre.
  11. Transférer le concentré de protéine pour une nouvelle 1,5 mL de tube et de retirer le produit concentré de n’importe quel précipité ou bulles. Tournent à > 12 000 x g pendant 5-10 min à 4 ° C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  12. Charger le produit final avec une seringue de 1 mL et une aiguille ronde-pointe sur un système FPLC pour chromatographie liquide d’exclusion avec une colonne de taille-exclusion préalable équilibrée avec tampon E (tableau 5).
    Remarque: conditions de la FPLC sont les suivantes : une taille de fraction 0,5 mL, une alarme de pression de la colonne avant la valeur 2,50 MPa, un volume de flux définie dans 30 mL de tampon E (tableau 5), et un débit préréglé à 0,5 mL/min.
  13. Notez que les protéines sages exécutent en tant qu’un seul pic (Figure 2 a) et recueillent le procède de la protéine correspondant à ce pic (Figure 2 a).
  14. Concentrer la protéine avec une unité de filtration centrifuge de 4 mL ou 0,5 mL (de la même coupure de poids moléculaire comme à l’étape 3.10) et un essorage à 4 000 x g à 4 ° C à une concentration finale de 5 à 10 μg/μL. Le spectrophotomètre permet de vérifier la concentration du produit final (étape 3,8).
    Note : Temps de Centrifugation varie, comme le volume du produit final peut différer entre les essais de purification. Habituellement, la centrifugation prend 10-20 min. Il est recommandé de pipette entre les spins pour disperser la protéine, qui est tirée vers le bas du filtre.
  15. Le concentré de protéine de transfert dans un nouveau tube de 1,5 mL. Supprimer n’importe quel précipité par centrifugation à > 12 000 x g pendant 5-10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Apportez 10 μL parties aliquotes pour stockage à-80 ° C et enregistrez une aliquote petits de 2-5 μL d’exécuter sur un gel SDS-PAGE dégradé de 4 à 15 % à 9 V/cm (Figure 2 b).
  16. Confirmer l’identité de la protéine purifiée par spectrométrie de masse8.
    Note : In vitro d’analyse de la fonction et la structure de la protéine purifiée peuvent être effectuées par le biais de bicouches lipidiques planes et cristallographie de rayon x, respectivement de5,8.

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Representative Results

L’intensité de la fluorescence dans les cellules transfectées de manière transitoire de HEK293 adhésifs (Figure 1 a) est un bon indicateur pour le niveau d’expression de protéine projetées dans les cellules HEK293-F suspension (Figure 1 b). Si la protéine cible n’est pas bien exprimée ou est mal localisée dans les cellules HEK293 après transfection transitoire, il est recommandé d’envisager de modifier la construction de l’expression (e.g., changer la position de la balise GFP ou en faisant des mutations/troncations sur la protéine cible). Petites cultures en suspension HEK293-F (par exemple, les cultures de 25 mL) sont utilisés pour optimiser les conditions d’expression de la protéine, parmi lesquels l’infection MOI et température de culture ont été les plus importantes dans les expériences précédentes.

Une purification efficace est indiquée par un seul pic principal au volume d’élution attendus en chromatographie d’exclusion stérique (Figure 2 a) et une seule bande dominante sur un gel de SDS-PAGE dénaturé (Figure 2 b). Si plusieurs pics apparaissent en chromatographie d’exclusion stérique, il est important de recueillir chaque pic et exécutez un gel natif pour déterminer quel pic contient le canal fonctionnel pentamères. Il convient de signaler qu’entre deux constructions de protéine, le niveau d’expression, par l’intensité de la fluorescence au moment de la récolte, n’est pas nesessarily en corrélation avec le rendement final, comme chaque construction de protéine se comporte différemment au cours de la purification. Pour une protéine bestrophin sage, 200 à 500 µg du produit purifié final peut généralement provenir de 1 L de cellules HEK293-F en suspension.

Figure 1
Figure 1 : Expression d’une protéine chez les mammifères bestrophin. Des images microscopiques d’une bestrophin chez les mammifères GFP-étiquetée exprimée dans les cellules (A) adhésif HEK293 par transfection de plasmide et (B) la suspension HEK293F cellules par baculovirus infection. Gauche = fluorescence verte ; droite = lumineux-zone. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Purification d’une protéine chez les mammifères bestrophin. (A) purifiés par affinité des protéines GFP-étiquetée a couru sur une colonne de filtration sur gel taille exclusion comme un pic principal. Fractions entre lignes tiretées ont été recueillies. B protéine final a couru sur un gel SDS-PAGE avec des échelles (colonne de gauche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Réactif MW Montant par 1 L Finale
HEPES 238,3 11,9 g 50 mM
NaCl 58.44 g 17,529 300 mM
Glycérol 92.09 50 mL 5 % (v/v)
Imidazole 68.1 1,3616 g 20 mM
MgCl2 203 g 0,20331 1 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 2,5 mL de bouillon de 200 mM 0,5 mM

Tableau 1 : Purification de protéine tampon (un tampon de Resuspension)

Réactif MW Montant par 1 L Finale
HEPES 238,3 11,9 g 50 mM
NaCl 58.44 g 17,529 300 mM
Glycérol 92.09 50 mL 5 % (v/v)
Imidazole 68.1 g 2,7232 40 mM
MgCl2 203 g 1,01655 5 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL de bouillon de 200 mM 0,1 mM
DDM (anagrade) 510,6 0,5 g 0,05 % (p/v)

Tableau 2 : Protein Purification tampon B (tout d’abord laver le tampon)

Réactif MW Montant par 1 L Finale
HEPES 238,3 5,95 g 25 mM
NaCl 58.44 29,2 g 500 mM
Glycérol 92.09 50 mL 5 % (v/v)
Imidazole 68.1 5,1 g 75 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL de bouillon de 200 mM 0,1 mM
DDM (anagrade) 510,6 0,5 g 0,05 % (p/v)

Tableau 3 : Protein Purification tampon C (deuxième tampon de lavage)

Réactif MW Montant par 1 L Finale
HEPES 238,3 7,74 g 32,5 mM
NaCl 58.44 g 11,686 200 mM
Glycérol 92.09 25 mL 2,5 % (v/v)
Imidazole 68.1 17,02 g 250 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL de bouillon de 200 mM 0,1 mM
DDM (anagrade) 510,6 0,5 g 0,05 % (p/v)

Tableau 4 : Protein Purification tampon D (tampon d’élution)

Réactif MW Montant par 1 L Finale
HEPES 238,3 9,53 g 40 mM
NaCl 58.44 g 11,686 200 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0,5 mL de bouillon de 200 mM 0,1 mM
DDM (anagrade) 510,6 0,5 g 0,05 % (p/v)

Tableau 5 : Protein Purification tampon E (tampon de Gel Filtration)

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Discussion

Ce protocole décrit un pipeline utile pour l’expression et purification des canaux ioniques bestrophin mammifère à être utilisé pour des analyses futures in vitro . Alors que l’appareil FPLC est nécessaire pour la chromatographie d’exclusion stérique, un pousse-seringue est suffisante pour toutes les étapes de la chromatographie d’affinité y compris contraignantes, lavage et d’élution. Lorsque vous utilisez une pompe à seringue pour pousser des solutions (dans une seringue) à travers une colonne, il est essentiel de sous-couche le côté ressort pour éviter de pousser les bulles d’air dans la colonne. Si la pureté de la protéine après chromatographie d’affinité est déjà suffisante pour les expériences ultérieures, chromatographie d’exclusion stérique peut être omise afin qu’un dispositif FPLC peut-être pas nécessaire du tout.

Car il faut environ 2 semaines pour faire les baculovirus de plasmides pBacMam, afin d’accroître l’efficacité, un écran initial des homologues de protéines bien sage est réalisable en récoltant les cellules HEK293 transfectées transitoirement (e.g., d’un plat de 60 mm) et test comment l’exprimé la protéine d’intérêt (GFP-étiquetée) se comporte dans les détergents (p. ex., DDM) avec détection par fluorescence chromatographie d’exclusion (FSEC)18,24. Il est plus productif de se concentrer sur des constructions de protéine qui forte fluorescence s’affichent dans les cellules HEK293 transfectées et bonne monodispersion et la stabilité au FSEC.

Il existe plusieurs recommandations pour augmenter le rendement de la purification de la protéine. Tout d’abord, les conditions pour la digestion de la TEV devrez peut-être être optimisé pour chaque protéine. Cela peut être fait en testant une série de rapports de masse de protéine-à-TEV (p. ex. 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 et 01:10) et en incubant fois (par exemple, 0,5 h, 1 h, 2 h, 5 h et durant la nuit). Alors, il est proposé d’exécuter que les échantillons traités dans un SDS-PAGE de gel pour vérifier l’efficacité de clivage. En outre, il est important de ne pas laisser toute fuite de surnageant ou comme éluant centrifuge sur les connexions sur le FPLC ou des seringues. De même, il est important d’éviter les bulles lors du pipetage le concentré de protéine.

Divers subséquent en vitro analyse les procédures qui utilisent des protéines de ce protocole comprennent bicouche lipidique, diffraction, cryo-microscopie électronique, la spectroscopie et criblage à haute8,25 , 26.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce projet a été financé par le NIH subventions EY025290, GM127652 et University of Rochester fonds de démarrage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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