Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

Biochemistry

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Summary

Questo protocollo viene illustrato come ottenere un modello a bassa risoluzione ab-initio e dettagli strutturali di una proteina di membrana detergente-solubilizzato in soluzione mediante scattering di neutroni piccolo angolo con contrasto-corrispondenza del detergente.

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Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

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Abstract

Lo strumento di dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone al High-Flux isotopo reattore di Oak Ridge National Laboratory è dedicato allo studio di materiali biologici, biocarburanti lavorazione e materiali bio-ispirato che coprono nanometro a scale di lunghezza di micrometro. I metodi presentati qui per indagare le proprietà fisiche (cioè, dimensioni e forma) delle proteine di membrana (qui, MmIAP, del intramembrane aspartil proteasi da Methanoculleus marisnigri) in soluzioni di formazione di micelle sono detergenti particolarmente adatto per questo strumento di scattering ad angolo piccolo neutrone, tra gli altri. Altre tecniche di caratterizzazione biofisica sono ostacolati dalla loro incapacità di affrontare i contributi detersivi in una struttura di complesso proteina-detergente. Accesso al laboratorio di Bio-Deuteration fornisce inoltre funzionalità uniche per la preparazione di coltivazioni su larga scala e che esprimono le proteine deuterio-etichettati per una maggiore dispersione del segnale dalla proteina. Mentre questa tecnica non fornisce dettagli strutturali in alta risoluzione, il divario di conoscenza strutturale per le proteine di membrana contiene molte zone indirizzabile di ricerca senza risoluzione vicino-atomica. Ad esempio, queste aree includono la determinazione degli Stati oligomerici, formazione complessa, cambiamenti conformazionali durante perturbazione ed eventi di chiusura/apertura. Queste indagini possono essere facilmente realizzate attraverso applicazioni di questo metodo.

Introduction

Proteine di membrana sono codificati di circa il 30% di tutti i geni1 e rappresentano una forte maggioranza di bersagli per farmaci medicinali moderni. 2 queste proteine svolgono una vasta gamma di funzioni cellulari vitali,3 ma nonostante la loro abbondanza e importanza — rappresentano solo circa l'1% del totale strutture depositato nel Research Collaboratory per bioinformatica strutturale (RCSB) proteina Banca dati. 4 a causa della loro natura parzialmente idrofobo, determinazione strutturale delle proteine di membrana-limita è stato estremamente impegnativo. 5 , 6 , 7

Come molte tecniche biofisiche richiedono particelle monodisperse in soluzione per la misurazione, isolando le proteine di membrana dalle membrane native e queste proteine in un mimic solubile delle membrane native di stabilizzazione è stato un'area attiva di ricerca negli ultimi decenni. 8 , 9 , 10 queste indagini hanno portato allo sviluppo di molti romanzo anfifilici assembly per solubilizzare le proteine di membrana, come nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 tuttavia, l'uso di detergenti micelle rimane uno degli approcci più comuni e semplici per soddisfare le esigenze di solubilità di una data proteina. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 purtroppo, nessun singolo detersivo o la magica miscela di detergenti attualmente esiste che soddisfa tutte le proteine di membrana; così, queste condizioni devono essere schermate empiricamente per le esigenze specifiche di ogni proteina. 26 , 27

Detergenti, auto-assemblarsi in soluzione sopra loro concentrazione micellare critica per formare le strutture aggregati chiamate micelle. Micelle sono composte di molti monomeri detergente (in genere che vanno da 20-200) con catene idrofobiche alchiliche formando un nucleo di micelle e gruppi testa idrofiliche disposti in uno strato di guscio micella affrontando il solvente acquoso. Il comportamento di detergenti e formazione di micelle è stato classicamente descritto da Charles Tanford in The effetto idrofobico,28 e dimensioni e forme delle micelle dai detergenti comunemente utilizzati negli studi di proteine di membrana sono stati caratterizzata mediante scattering ad angolo piccolo. 29 , 30 organizzazione detersivo sulle proteine di membrana è stato anche studiato, e la formazione di complessi proteina-detergente (PDC) è previsto con detergente molecole circostanti la proteina in un arrangiamento che ricorda il detergente pulito micelle. 31

Uno ha aggiunto vantaggio nell'utilizzo di detergenti è che le proprietà di micella risultante possono essere manipolate incorporando altri detergenti. Molti detergenti per mostre di miscelazione ideale, e selezionare proprietà delle micelle miste possono anche essere prevedute dal componenti e rapporto di miscelazione. 22 tuttavia, la presenza di detersivo può ancora presentare sfide per caratterizzazioni biofisiche contribuendo al segnale complessivo. Ad esempio, con tecniche di dispersione della luce e raggi x, segnale da detersivo in PDC è praticamente indistinguibile dalla proteina. 32 le indagini con singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) in genere si basano su particelle intrappolate (congelate); dettagli strutturali della proteina sono ancora oscurati da taluni detersivi o un'alta concentrazione di detersivo che aggiunge allo sfondo. 33 approcci alternativi verso interpretando la completa struttura PDC (compreso il detersivo) sono state fatte attraverso metodi computazionali che cercano di ricostruire il detersivo intorno una proteina di membrana determinato. 34

Per il caso di scattering di neutroni, la disposizione di nucleo-guscio di detersivo nella micella produce un fattore di forma che contribuisce alla dispersione osservata. Fortunatamente, i componenti della soluzione possono essere alterati tale che non contribuiscono alla dispersione osservata netta. Questo processo di "contrasto di corrispondenza" si ottiene sostituendo deuterio per l'idrogeno ottenere una densità di lunghezza di dispersione che corrisponde a quello dello sfondo (buffer). Deve essere considerate una scelta giudiziosa di detergente (con controparti deuterati disponibile) e il loro rapporto di miscelazione. Per detergente micelle, questa sostituzione può essere eseguita usando un detersivo con lo stesso gruppo di testa ma avendo una catena alchilica deuterato (d-coda invece di h-coda). Dato che i detergenti sono ben miscelati,35 loro aggregati avrà una densità di lunghezza di dispersione è la frazione molare ponderata medio dei due componenti (h-code e d-code). Quando questo contrasto medio è coerenza con quella del gruppo di testa, le strutture di aggregazione uniforme possono essere abbinate completamente per rimuovere tutti i contributi alla dispersione osservata.

Presentiamo qui un protocollo per manipolare il contrasto di neutroni di micelle detergente incorporando molecole chimicamente identici detersivi con catene alchiliche deuterio-etichettati. 19 , 36 , 37 ciò consente il completo contrasto simultaneo di corrispondenza della micella core e shell, che è una capacità unica di scattering di neutroni. 35 , 38 con questo significativamente raffinato livello di dettaglio, contrasto di corrispondenza può attivare studi altrimenti irrealizzabile di strutture di proteine di membrana. Inoltre, questo approccio di contrasto di corrispondenza potrebbe essere esteso ad altri sistemi che coinvolgono detergente, come polimero cambio reazioni39 e olio-acqua disperdenti,40 o anche altri agenti solubilizzanti, quali bicelles,41 nanodiscs,42 o blocco di copolimeri. 43 A approccio simile come delineato in questo manoscritto, ma impiegando una singola specie di detersivo con sostituzioni di deuterio parziale sul gruppo alchilico catena e/o di testa, è stato recentemente pubblicato. 37 mentre questo può essere previsto per migliorare la distribuzione casuale di idrogeno e deuterio in tutto il detersivo rispetto all'approccio qui presentato, il numero limitato di posti disponibili sul detersivo per sostituzione e in due fasi detergente sintesi necessari pone ulteriori sfide per l'esame.

I passaggi 1 e 2 del protocollo descritto di seguito spesso si sovrappongono poiché esperimento iniziale pianificazione deve essere fatto per presentare una proposta di qualità. Tuttavia, la presentazione delle proposte è considerato qui come il primo passo per sottolineare che questo processo deve essere iniziato in anticipo un esperimento di neutroni. Si noti inoltre che un passaggio dei prerequisiti, che dovrebbe essere dimostrato dalla proposta, è di avere la caratterizzazione biochimica e fisica (tra cui purezza e stabilità) del campione sostiene la necessità per gli studi di neutroni. Una discussione generale di small-angle neutron scattering (SANS) è oltre la portata di questo articolo. Un'introduzione breve ma completa è disponibile nella Caratterizzazione di materiali da Kaufmann,44 e una soluzione completa di libro concentrata sul biologica small-angle scattering è stata recentemente pubblicata l'opera di riferimento. 45 ulteriori letture consigliate sono riportate nella sezione discussione. Scattering di piccolo angolo utilizza il così chiamato vettore di dispersione Q come la quantità centrale che descrive il processo di dispersione. In questo articolo utilizza la definizione ampiamente accettata Q = 4 π sin (θ) / λ, dove θ è la metà dell'angolo tra fascio in ingresso e sparso e λ è la lunghezza d'onda della radiazione neutronica in Angstrom. Esistono altre definizioni che uso diverso simboli come di ' per il vettore di dispersione e che possono variare di un fattore 2 π o utilizzando nanometri al posto di Angstrom (Vedi anche la discussione di Figura 10).

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Protocol

1. preparare e presentare una proposta di strumento e tempo fascio di neutroni Facility

  1. Consultare le risorse online per l'identificazione di strutture di scattering di neutroni che forniscono l'accesso di utente generale neutroni fascio tempo, come ad esempio Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mappa di neutroni strutture e informazioni sulla ricerca di neutroni in tutto il mondo è disponibile online. 46 essere consapevoli del fatto che queste strutture sono in genere regolari inviti a presentare proposte; Questo determina quando sarà disponibile la prossima volta di larghezza. Neutroni sono utilizzati per una varietà di applicazioni; ricerca di strumenti per lo scattering (SANS) small-angle neutroni, particolarmente quelli con capacità per campioni biologici.
  2. Utilizzare risorse fornite dalle strutture neutroni per navigare il processo di invio proposta di neutroni fascio tempo. Consultare con un Neutron Scattering scienziato (NSS) che è associato con lo strumento per il quale si applica. Scrivi una recensione su informazioni aggiornate della struttura neutroni per quanto riguarda la proposta chiamate, scadenze e consigli per la presentazione; Oak Ridge è disponibile online. 47 inviare la proposta di tempo trave seguendo tutte le linee guida per una presentazione di successo.
  3. Se deuterata proteina è richiesto (Vedi 2.2), strutture di scattering di neutroni sono spesso supportati da laboratori e competenze dedicate alla produzione di materiali deuterati. Per richiedere l'accesso per il laboratorio di Bio-Deuteration (BDL) a ORNL, selezionare il BDL come il secondo strumento nel sistema proposta. Mentre la proposta di SANS è esaminata per fattibilità e da un comitato di revisione scientifica, BDL richieste vengono proiettate solo per fattibilità. Per aiutare con la recensione di fattibilità BDL, presentare una di modulo di richiesta di informazioni completate48 che descrive il protocollo di espressione della proteina e la resa calcolata (disponibile online).
  4. Dopo successo inter pares della proposta di tempo della trave, confermare la data premiata del tempo di fascio in anticipo l'esperimento. Assicurarsi che tutti i dettagli del campione e buffer e le formule sono elencate correttamente nella proposta di revisione corretta. Eventuali modifiche per il piano sperimentale proposto, compreso i cambiamenti nella composizione del campione e buffer, richiedono la notifica dell'impianto.
    Nota: Modifiche dovrebbero essere discusso più presto con il NSS assegnato.

2. determinare il neutrone contrasto Match Point e il contrasto necessario per la misurazione della proteina

  1. Raccogliere informazioni (da informazioni di prodotto del fornitore, database online, valori pubblicati, ecc.) relative alle composizioni atomici e volumi per i componenti di sistema detergente da abbinare a contrasto. Queste informazioni vengono utilizzate per determinare la densità di lunghezza lo scattering di neutroni (SLD) e così contrasto match point (CMPs) in soluzione, che è importante per ottenere qualità SANS informazioni dati e strutturali per la proteina di membrana di interesse nel contesto di un PDC. Una tabella che riassume i punti di corrispondenza proprietà e contrasto fisici per detergenti comunemente utilizzati negli studi di biofisici delle proteine di membrana è incluso (tabella 1).
  2. Determinare il neutrone domini utilizzando l'applicazione web pacciame: moduli di analisi di contrasto variazione dati49 (disponibile online50 free-of-charge). Un link al manuale dell'utente si trova nella home page. Accedere al sito Web e leggere la documentazione di accompagnamento. Figura 1 e Figura 2 forniscono una panoramica di contrasto modulo input e output per due esempi correlati.
    Nota: Altri siti Web per il calcolo di domini sono disponibili, come quello effettuato dal National Institute of Standards and Technology (NIST) Center per la ricerca di neutroni. 51
    1. Aprire il modulo di contrasto cliccando 'Contrasto' si trova nel riquadro di navigazione a sinistra. Fornire il testo per un titolo del progetto e inserire i dati qui sotto per due componenti (ad es., detergente gruppo testa e coda) come ' subunità 1' e ' subunità 2'.
    2. Immettere la formula molecolare per ogni componente nella casella di testo 'Formula'.
      Nota: il pulsante di opzione sto ' deve essere selezionata sotto 'Sostanza tipo' per immettere una formula molecolare. Inoltre, è possibile utilizzare la lettera 'X' nella formula per indicare gli atomi di idrogeno facilmente intercambiabili. Sequenze di DNA, RNA o proteine possono essere inseriti se la corrispondente 'P', 'R', o aveva ' pulsanti di opzione sono selezionati. In presenza di più copie di un componente nella subunità, il valore per 'Nmolecules' può essere modificato di conseguenza. Qui un esempio pratico riguarda lipido-come detersivi contenenti due code identiche, consentendo la formula per una coda essere inseriti con Nmolecules uguale a 2.
    3. Immettere il volume in cubi Angstrom per ogni componente nella casella sotto 'Volume (Å3)'. Utilizzare la formula di Tanford28 per catene alchiliche di lunghezza n, Vcoda = 27,4 + n * 26,9, per calcolare il volume approssimativo della coda, o ottenere volumi molecolari da informazioni sul prodotto fornito o pubblicati i valori in la letteratura.
    4. Immettere dettagli per componenti di buffer. Cambiare il 'numero dissolto specie nel solvente' utilizzando il menu a discesa per aggiungere o rimuovere righe per ogni componente del buffer. Nel caso di formazione di micelle detergenti, includere i monomeri di detersivo gratuiti come componenti del buffer separato a concentrazione di detergente micellare critica (CMC).
    5. Fare clic su 'Submit' per eseguire i calcoli di contrasto del neutrone e generare una pagina di risultati che fornisce una tabella di dispersione lunghezza densità e contrasto match point, nonché formule per determinare questi parametri in qualsiasi percentuale determinata di D2O in il buffer. Rivedere i parametri di scattering con particolare attenzione per la componente CMPs. Se i punti di incontro sono simili (nel raggio di 10% D2O) e la concentrazione libera micella è bassa, quindi la media CMP può essere utilizzato per la corrispondenza di contrasto i contributi di detersivo. Nella maggior parte dei casi, la CMP del detergente gruppo testa e della coda sarà diverso da più di 10-15%, producendo un fattore di forma di core-shell nei dati SANS che offusca la raccolta diretta del segnale dispersione dalla proteina da solo.
  3. Valutare il contrasto tra detergente gruppo testa e coda. Quando il detergente testa gruppo alchilico catena coda e CMPs non sono ben assortiti, la disponibilità e l'incorporazione di un detergente deuterio-sostituiti può consentire di scattering la densità di lunghezza di selezionare i componenti per essere manipolato. Nella maggior parte dei casi, ciò richiederà formando una micella mista attraverso l'incorporazione di un detergente identico con le catene alchiliche deuterio-sostituiti. L'aggiunta di deuterio genera la densità di lunghezza di dispersione del nucleo formato dalle code di catena alchilica. L'endpoint desiderato, in questo caso, è tale che la testa del gruppo shell CMP e alchil catena core CMP hanno valori approssimativamente uguali.
    1. Sollevare il CMP del core micellare detergente per essere approssimativamente uguali ai CMP del guscio testa gruppo determinando il rapporto di miscelazione tra h-code e d-code che raggiunge completo contrasto di corrispondenza con i gruppi di testa appropriato. Un prerequisito per questa determinazione è conoscenza della CMP per una coda di catena alchilica deuterio-sostituiti. Una controparte reperibile a n-dodecil β-D-maltoside (DDM) è disponibile con tutti i idrogeno di catena alchilica sostituito dal deuterio (d25-DDM). Ripetere i calcoli di contrasto indicati nel passaggio 2.1 per una coda aveva ' al posto di 'h-coda'.
    2. Calcolare il rapporto di mole di h-coda a d-coda necessaria per l'abbinamento a contrasto con il gruppo di testa CMP. La seguente formula può aiutare con questa determinazione:
      CMPtesta = CMPh-coda * χh-tail + CMPd-coda * χd-coda
      dove CMP è la densità di lunghezza di dispersione e χ è la frazione di volume per il componente di testina detergente, h-coda, o d-coda. Per le soluzioni tampone di DDM, incorporazione del 44% in peso (43% da talpa) del totale detergente come d25-DDM con catene alchiliche deuterio-sostituiti produce un singolo CMP a 48,5% D2O per i componenti sia di testa e di coda.
  4. Considerare il grado di sostituzione deuterio per la proteina di membrana. Per misurare il segnale sufficiente scattering dalla proteina, la CMP per la proteina deve essere almeno 15% D2O in soluzione lontano il detersivo CMP e condizioni di misura. Il segnale aumenta con il quadrato di questa differenza di %. Dal momento che il CMP di una proteina senza etichetta, in genere, si verifica con ~ 42% D2O in soluzione (un CMP simile a molti gruppi testa detergente), deuterio etichettatura della proteina è quasi sempre una necessità. 52

3. esprimere e purificare la proteina di membrana di interesse

  1. Preparare il supporto di LB (brodo di Lisogenesi) e crescere Escherichia coli (e. coli) le cellule che harboring un vettore di espressione inducibile di sequenza della proteina bersaglio.
    1. Preparare il supporto minimo. In H2O o D2O fare sciogliere così 7,0 g/L (NH4)24, 5,25 g/L Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L diammonio idrogeno citrato, glicerolo 5,0 g/L, 1,0 mL/L del 20% w/v MgSO 4·7H2O e 1,0 mL/L di Holme oligometalli (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 Co.GE MnSO4· H2O e 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Preparare soluzioni di riserva antibiotici appropriati utilizzando H2O o D2O.
    3. Preparare una soluzione stock di isopropile-β-D-1-thiogalactopyranoside con H2O o D2O.
    4. Sterile-filtro tutte le soluzioni in secca, contenitori sterili, utilizzando la parte superiore della bottiglia vuoto e siringa filtri con un diametro dei pori 0,22 micron.
  2. Adattare le cellule di e. coli su deuterio-etichettato medio prima di scalabilità per la sovraespressione di una proteina deuterata.
    1. Inoculare 3 mL di terreno LB con una colonia isolata da una piastra di agar Lisogenesi brodo (LB) o cellule da uno stock di glicerolo congelati. Crescere le cellule a 37 ° C in un incubatore d'agitazione a 250 giri/min o ridurre la temperatura a 30 ° C o inferiore per evitare la crescita eccessiva della cultura quando incubando durante la notte.
      Nota: La procedura di adattamento può essere variata. 55 , 56 , 57
    2. Una volta che la cultura LB è cresciuta fino a densità ottica a 600 nm (OD600) di ~ 1, diluirlo 01:20 in 3 mL di terreno minimo di H2O e crescere per un OD600 ~ 1. Ripetere il 01:20 diluizioni mediante medium minimo contenente 50, 75 e 100% D2O (o fino alla percentuale desiderata di2O D).
      Nota: come la D2O contenuto è aumentato, tassi di crescita diminuirà. Il rapporto tra la percentuale di2O D nella sostituzione crescita media e deuterio nella proteina è stato segnalato nella letteratura. 58 , 59 , 60
    3. Continuare a crescere la cultura in un bioreattore per aumentare il rendimento della massa cellulare deuterato (Figura 3).
      Nota: Procedure dettagliate per il funzionamento di bioreattori sono state esaminate altrove. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Raccolto e lisare cellule di Escherichia coli per la purificazione di estrazione e proteine di membrana
    1. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a ~ 6.000 x g per ~ 30-45 min a 4 ° C.
    2. Ammorbidire il pellet cellulare immergendo nel buffer sul ghiaccio per ~ 30 min. Poi, delicatamente e risospendere il pellet cellulare nel buffer pipettando delicatamente con una pipetta sierologica, o dolce dondolo su un agitatore meccanico 2D, a una concentrazione finale di g ~ 1 cella umida massa/10 mL di tampone.
      Nota: un buffer di esempio è di 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido), pH 7.5, 200 mM NaCl completati con una tavoletta di inibitore della proteasi.
    3. Lisare cellule sedimento con tre passa attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione a 10.000 psi mentre il raffreddamento il deflusso.
      Nota: A seconda della scala necessaria, altri metodi di Lisi possono essere usato (per esempio, dalla stampa francese o sonicazione).
    4. Detriti cellulari pellet mediante centrifugazione a ~ 4.000-5.000 x g per 15 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio fino a quando il surnatante è chiarito.
    5. Ultracentrifuga (~ 150.000 x g per 30-45 min) il surnatante dal passaggio precedente, che contiene la sostanza solubile e frazioni della membrana. Il pellet dopo ultracentrifugazione contiene la frazione di membrana.
    6. Risospendere il pellet di membrana in un omogeneizzatore lisata grande e isolare la frazione di membrana nuovamente dall'ultracentrifugazione (passo 3.3.5). Ripetere questa operazione almeno una volta per rimuovere proteine vagamente associati.
    7. Solubilizzare le membrane di dondolio per ~ 30 min a 4 ° C in un tampone contenente detergente adatto per purificazione. Solubilizzazione è evidente quando la sospensione si trasforma da nuvoloso a trasparente. Rimuovere il materiale insolubile di ultracentrifugazione (~ 150.000 x g per 30-45 min).
      Nota: Un buffer di esempio è 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazolo di 20 mM e 4% (p/v) DDM per purificazione di cromatografia di affinità di Ni2 + .
  4. Purificare la proteina seguendo un protocollo precedentemente sviluppato per forme protonata.
    Nota: Vedi Naing et per un protocollo di purificazione di esempio per un hexahistidine etichetta M. marisnigri JR1 intramembrana aspartil proteasi (d-MmIAP). 65 la resa finale era ~ 1 mg di deuterated dalla crescita della coltura cellulare 5L deuterated, ognuno dei quali è stato utilizzato nell'esperimento SANS (Figura 4).
  5. Scambiare la proteina purificata nel "Buffer di scambio finale" per la corrispondenza di contrasto.
    1. Preparare 200 mL di "Buffer di scambio finale" contenente la miscela corretta per contrasto corrispondenti, ad esempio,20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl e lo 0,05% totale DDM (0,028% DDM e 0,022% d25-DDM) in 49% D2O.
    2. Equilibrare una colonna di esclusione di dimensione con > 2 volumi di colonna (CV) di "Buffer di scambio finale" in 3.5.1 utilizzando un sistema veloce proteina liquida cromatografia (FPLC).
    3. Dopo l'iniezione del campione, è necessario eseguire la colonna e isolare frazioni corrispondenti alla proteina di interesse.
    4. Concentrare la proteina fino alla concentrazione finale desiderata (2-5 mg/mL).
      Nota: Un volume di ~ 300 μL è necessaria per riempire una cuvette in quarzo cilindrica 1 mm utilizzata per SANS.
    5. Riservare un'aliquota di tampone abbinati per SANS sottrazione di sfondo.
      Nota: L'aliquota può essere assunto direttamente dal buffer preparati, o idealmente da una frazione di eluizione pulito alla fine della corsa FPLC.

4. fare preparativi finali per il fascio tempo e raccolgono SANS dati

  1. Dopo la proposta è stata accettata e accesso al sito è stato approvato, completare tutte le necessarie formazione in anticipo fascio assegnato. Questo include prearrival, formazione e laboratorio radiologico, in loco e la formazione di specifici dello strumento basato sul web.
    Nota: Requisiti di formazione possono dettare arrivo anticipato per i nuovi utenti. Ulteriori informazioni sono disponibili online. 66
  2. Caricare i campioni e buffer per la raccolta dati.
    Nota: Una panoramica della dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone (Bio-SANS) area ambiente di strumento campione è illustrato nella Figura 5.
    1. Caricare i campioni e i buffer in celle in quarzo. Celle in quarzo sono disponibili dal scienziato strumento o struttura. Utilizzare gel-caricamento suggerimenti per accedere la stretta apertura della maggior parte delle cellule del campione.
    2. Assicurarsi che il pulsante di scatto del fascio è chiuso, quindi avvicinarsi alla zona di ambiente campione e posizionare le celle di quarzo nell'autocampionatore. Registrare la posizione del selettore di campione per ogni cella del campione.
    3. Controllare l'area e verificare che il percorso del fascio sia privo di ostacoli, quindi lasciare l'area di ambiente campione e aprire l'otturatore di fascio.
      Nota: Attentamente seguire tutte le norme e regolamenti, obbedire a tutte le registrazioni e ascoltare i consigli dello scienziato dello strumento. Campioni non possono essere rimosso dal fascio e manipolati dopo l'esposizione al fascio senza precauzioni speciali seguenti. Consultare con un tecnico di controllo radiologico (RCT) prima di queste procedure.
  3. Eseguire la scansione di tabella per la raccolta automatizzata dei dati
    1. Usare lo strumento attraverso il controllo personalizzato software basato su LabVIEW, spettrometro strumento controllo ambiente (SpICE). Seguire le istruzioni per il funzionamento di uno strumento fornito dallo scienziato di Scattering di neutroni. Una panoramica di tabella scansione operazione windows è fornita nella Figura 6.
    2. Dopo aver inserito le informazioni richieste nelle aree appropriate, eseguire la scansione della tabella e inizierà un processo di raccolta dati automatizzata. Monitorare i progressi attraverso la scheda 'Table Scan Status'.

5. ridurre SANS dati da immagini 2D a trama 1D

  1. Identificare ogni file di dati di esempio e buffer dai numeri registrati scansione. Ogni misurazione verrà assegnato un numero di scansione unica. Questa informazione è utile durante la riduzione di dati per identificare ciascun campione corrispondente e la coppia di buffer.
  2. Utilizzare MantidPlot software e script Python per la riduzione
    1. Gli utenti di Scattering di neutroni sono forniti con dettagli dell'account per accedere ai propri dati su analisi Cluster remoto. 67 il login per il Cluster di analisi remoto ed eseguire "MantidPlot" dalla riga di comando. Figura 7 e Figura 8 vengono fornite come supporto alla seguente procedura.
    2. Ottenere uno Script di riduzione utente dallo scienziato di Scattering di neutroni (solitamente questo accadrà durante l'esperimento); Questo script è basato su Python e conterrà tutti i valori di calibrazione e regolazioni di scala per ridurre l'immagine di dispersione 2D in un terreno di 1D di intensità sparse in funzione dell'angolo di scattering, I(Q).
    3. Aprire lo Script di riduzione utente fornito in MantidPlot e inserire i corrispondenti numeri di scansione o identificazione per le coppie del campione e buffer nell'elenco appropriato.
    4. Eseguire lo script per generare dati ridotto come un file di testo di quattro colonne (ordine delle colonne è Q, I(Q), I(Q) errore, errore di Q) nel percorso specificato. L'area di lavoro appropriata in MantidPlot fare clic destro e selezionare "Grafico con errori..." per un primo esame dei profili di scattering.

6. analizzare i dati per i parametri strutturali della particella Scattering

  1. Trasferire il file di dati ridotto da analysis server in un computer locale utilizzando il trasferimento di file FTP sicuro. Questa operazione può essere eseguita con l'uso di software come FileZilla o CyberDuck. Ulteriori istruzioni e dettagli per il collegamento al file system del server di analisi sono disponibili sulla pagina di login analysis.sns.gov.
  2. Scarica il ATSAS software suite65,68 (tutta la suite ATSAS). 69 programmi individuali70 sono disponibili anche online per analizzare i dati SANS, vale a dire determinare parametri strutturali e modelli di ab-initio .
    Nota: Molte opzioni sono disponibili per SANS analisi dei dati di biomacromolecole. 45
  3. Utilizzare PRIMUS71 per la traccia dati, ridimensionamento e sottrazione e Guinier analisi di buffer.
    1. Lanciare il ATSAS 'Analisi dei dati SAS' applicazione e carico dati ridotto file corrispondente alla coppia campione e buffer.
      1. Per ridimensionare correttamente il buffer, selezionare un intervallo di dati in alto Q (Q > 0,5 Å-1) dove entrambi i profili sono simili e piatto e fare clic sul pulsante 'Scala' situato sotto le 'operazioni' tab. Un fattore di scala si applicherà al buffer tale che queste due regioni piane devono sovrapporsi. Usare cautela: ci dovrebbe essere un motivo plausibile fisico che giustifica l'intensità di buffer per abbinare il campione di scaling. Se la discrepanza è grande, è possibile consultare un instrument scientist per approcci validi per sottrazione di sfondo. 44 , 45 , 72
      2. Aumentare l'intervallo di dati per visualizzare tutti i punti. Fare clic su 'Subtract' per eseguire questa operazione. Il file di dati buffer-sottratto nella Legenda fare clic destro e salvare questo file per la successiva analisi. Figura 9 illustra l'utilizzo della scheda «Operazioni».
    2. Eseguire un'analisi Guinier i sottratto da buffer di dati di esempio utilizzando la scheda 'Analisi' dell'applicazione 'Analisi dei dati SAS'.
      1. Verificare che il file corretto sia selezionato nell'elenco e fare clic su 'Raggio di girazione'. Un tentativo di eseguire un Guinier in forma automatizzato sarà fornito da facendo clic sul pulsante 'Autorg'.
      2. Espandere l'intervallo di dati utilizzati per includere tutti i dati di low-Q e iniziare a restringere l'intervallo di dati togliendo punti ad alto Q fino il Qmax * Rg limite è inferiore a 1.3. Utilizzare la trama di residui per verificare che i dati siano lineari nell'intervallo fit. Guinier fit produce un approssimativo Rg e I0 per le particelle di scattering.
      3. Apportare piccole modifiche alla regione adatta e monitorare la sensibilità di questi valori per l'intervallo di dati utilizzati nel fit. Figura 10A viene illustrato l'utilizzo dello strumento 'Raggio di girazione'.
  4. Ottenere la funzione di distribuzione di probabilità (P(r)) in GNOM. 73 il file di output generato qui sarà utilizzato come input per l' ab-initio processo di modellazione.
    1. Avvia la procedura guidata distribuzione di distanza all'interno della scheda di 'Analisi' ottenimento di un buon adattamento ai dati è essenziale per ottenere un modello di qualità. Per ulteriori informazioni su come ottenere misure precise, si veda la recensione74 da Putnam, et al.
      Nota: The GNOM programma fornisce ulteriori informazioni sulla vestibilità oltre la creazione guidata di distribuzione di distanza. Figura 10B viene illustrato il corretto utilizzo dello strumento «Distanza distribuzione», e Figura 11 illustra alcuni degli errori comuni incontrati.
    2. Determinare Dmax, la distanza massima interatomico all'interno della molecola.
      1. Stimare un valore per Dmax deselezionando la casella per forzare Rmax = 0 e immettendo un valore elevato per Dmax (150 Å, ad esempio). Il primo x-intercettazione nella trama del p (r) produce questa stima.
      2. Apportare le modifiche incrementali a questo valore Dmax e l'intervallo di dati utilizzati o numero di punti utilizzati nel fit per ottimizzare la GNOM adattarsi ai dati e la curva risultante p (r).
    3. Continuare a perfezionare la vestibilità GNOM e salvare i file di output GNOM con buoni parametri fit per successivi ab-initio passaggi di modellazione.
  5. Simulare SANS profili da modelli PDB ad alta risoluzione utilizzando il programma di Paolo. 75
    1. Aprire il programma e selezionare l'opzione '0'. Selezionare il nome del file PDB nel browser dei file popup. Premere INVIO per accettare le impostazioni predefinite, tranne che specifica le frazioni di deuteration di catena e la frazione di D2O nel solvente per ottenere i parametri di contrasto adeguato.
    2. 'Y' e selezionando il file di dati nel browser dei file popup si adattano al modello per un set di dati sperimentale. Accettare i valori predefiniti rimanenti e i file di output verranno scritto nel percorso del file PDB. Il file '. Fit' contiene informazioni per il profilo di scattering predetto dal modello 3D ad alta risoluzione.

7. creare modelli Ab Initio dal SANS dati.

Nota: DAMMIF76 e77 all'interno della suite di software ATSAS di DAMMIN viene utilizzato per ricostruire i modelli dell'atomo fittizio (DAMs) utilizzando un processo di ricottura simulato da GNOM, che contiene i dati di p (r), o informazioni sulla probabilità di uscita o frequenza delle distanze interatomiche all'interno della particella di scattering. Questi programmi possono essere eseguiti in modalità batch o sul server web ATSAS-Online.

  1. Avviare la procedura guidata forma PRIMUS dal pulsante 'Dammif' nella scheda 'Analisi' di 'Analisi dei dati SAS' e utilizzare una selezione manuale dei parametri. L'input per la procedura guidata è illustrata nella Figura 12.
    1. Definire l'intervallo di Guinier dal fit (punto 6.3.2) e procedere al passaggio successivo, utilizzando i pulsanti di navigazione. Definire i valori di misura dalla trama p (r) (punto 6.4) e procedere al passaggio successivo.
    2. Fornire i parametri per l' ab-initio processo di modellazione. Immettere un prefisso per i nomi di uscita di modello (ad esempio, SANSEnvelope), scegliere o modellazione di modalità 'veloce' o 'lento', immettere un valore per il numero di modelli (17 consigliato per significatività statistica), selezionare le opzioni disponibili per la simmetria delle particelle, anisometry e scala angolare (se noto). Assicurarsi che le caselle vengono controllate per modelli medio con DAMAVER e perfezionare il modello finale con DAMMIN.
    3. Avviare il processo utilizzando il pulsante 'conferma'. Una volta completato il processo, visualizzare e salvare la cartella di lavoro.
      Nota: il processo di modellazione tipica per una camera singola, piccola proteina può richiedere fino a un paio d'ore con un tipico personal computer. I file vengono memorizzati nella directory temporanee fino a quando salvato.
  2. Sovrapposizione e sovrapporre la finale SANS busta con un modello ad alta risoluzione correlata utilizzando SUPCOMB all'interno ATSAS. Inserire una copia del modello ad alta risoluzione PDB per essere in forma per la busta SANS nella directory di lavoro. Eseguire SUPCOMB dalla riga di comando utilizzando i nomi dei file PDB come due argomenti con la struttura del modello elencato per primo: supcomb $ HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Nota: Il secondo nome del file elencato sarà riscritto come un nuovo file con una "r" aggiunta alla fine e avere nuove coordinate per la sovrapposizione sulla struttura del modello.
  3. Visualizzare i risultati del modello ab-initio utilizzando PyMOL (pymol.org), un programma di visualizzazione di grafica molecolare 3D. Figura 13 viene fornita una panoramica delle operazioni PyMOL.
    Nota: Ci sono linee guida di pubblicazione per la modellazione strutturale di dati di scattering ad angolo piccolo dalle biomolecole in soluzione. 78
    1. Avviare l'applicazione di PyMOL e aprire i file PDB corrispondente al 3D SANS busta e la struttura ad alta risoluzione SUPCOMB-allineato per essere visualizzato.
    2. Visualizzare la busta SANS rappresentando questo modello come una superficie. Fare clic su del ' pulsante accanto al modello e selezionare ' Visualizza: come: superficie '.
    3. Visualizzare la struttura della spina dorsale proteina ad alta risoluzione che rappresenta questo modello come un cartone animato. Selezionare gli ' accanto a questo modello e seleziona ' Visualizza: come: Cartoon'. Visualizzare la catena come un arcobaleno da N - al C-terminale selezionando il pulsante 'C' e ' di catena: 'Chainbows.
    4. Modificare la trasparenza della rappresentazione superficiale per chiarezza. Dalla barra dei menu 'Impostazioni', selezionare ' trasparenza» superficie» 40% '.
    5. Fare il bianco e il non-opaco. Dalla barra dei menu 'Visualizza', selezionare ' sfondo»' e selezionare 'Opaque' di deselezionare questa opzione e 'Bianco' per contrassegnare questo colore per lo sfondo.
      Nota: ulteriori operazioni e usi per PyMOL possono essere trovati alla PyMolWiki.org.

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Representative Results

Una proposta di tempo e strumento di fascio chiaramente dovrebbe trasmettere tutte le informazioni necessarie per il Comitato di revisione in modo che può essere fatta una valutazione valida dell'esperimento proposto. Comunicazione con un NSS è altamente consigliata per gli utenti inesperti. il NSS può valutare fattibilità iniziale e presentazione delle proposte Guida per enfatizzare la fattibilità, la sicurezza e il potenziale per la scienza ad alto impatto. Le informazioni fornite nella proposta dovrebbero includere informazioni di sfondo e il contesto per l'importanza della ricerca; conoscenza che deve essere acquisita e come ciò influisce la comprensione corrente nel campo correlato della scienza; una descrizione del lavoro, campioni, metodi e procedure che saranno impiegate; e, se applicabile, precedente produttività del team presso l'impianto, tra cui pubblicazioni pertinenti e risultati. Risorse utili, come i modelli di proposta e suggerimenti per preparare la proposta, sono disponibili per gli utenti tramite il portale di utente di scienza di neutroni (neutrons.ornl.gov/users).

Esperimento di pianificazione è un processo dinamico che spesso inizia durante le fasi iniziali di presentazione delle proposte, ma non può essere completamente concepito fino ad appena prima dell'esperimento. Tuttavia, tenere presente che eventuali modifiche che si discostano notevolmente dalla descrizione della proposta (comprese le modifiche condizioni di buffer o composizione del campione) devono essere approvate da parte dell'impianto prima dell'inizio dell'esperimento.

Questo protocollo si presuppone che un metodo per esprimere e purificare la proteina di membrana di interesse in micelle detersivi in soluzione è stato dimostrato con successo. In questo caso, la proteina di membrana di interesse è un intramembrana aspartil proteasi (IAP), che ha un protocollo di purificazione stabilito ed sono stato determinato in precedenza per essere solubile e attivo in tampone contenente micelle DDM.

Qui, dimostriamo che i calcoli di contrasto di neutroni utilizzando il pacciame: modulo di contrasto per una soluzione di proteine IAP in contrasto-abbinati misti DDM / micelle d25-DDM. La strategia delineata nel presente documento è stato innanzitutto determinare il grado di miscelazione tra i due detergenti necessari per raggiungere una completo contrasto partita della micella. Il risultato finale era di determinare il relativo contrasto di ogni componente e il background (rapporto2O di H2o/d) necessario contrasto-partita lo scattering da detergente al fine di osservare solo la dispersione di proteine.

Nella figura 1 viene illustrato un ingresso corretto per il modulo di pacciame contrasto e l'output risultante per i calcoli di contrasto del DDM detergente gruppo testa e coda come subunità 1 e 2, rispettivamente. La formula utilizzata per il gruppo di testa è C12H14X7O11 con un volume di 348 Å3e la formula di coda catena alchilica è dato come C12H25 con un volume di 350 Å3.

È evidente dall'output del modulo di contrasto che il gruppo testa DDM e la coda hanno densità di lunghezza diversa dispersione, e così sarà osservato contrasto tra i due componenti. Per DDM, i gruppi di testa hanno un CMP in 49% D2O mentre le code di catena alchilica hanno un CMP in 2% D2O, con loro CMP media che si verificano nel 22% D2O. Pertanto, l'obiettivo del prossimo passo sarà di progettare una micella mista che incorpora catene alchiliche deuterio-sostituiti per aumentare il CMP media delle code detergente per abbinare il CMP dei gruppi di testa. Il calcolo di contrasto è stato ripetuto per un detergente sostituito, DDM con una coda completamente deuterated (d25-DDM), che analogamente risultati in contrasto tra il gruppo di testa e coda. Tuttavia, i valori di h-code di contrasto e d-code sono significativamente differenti. Ricordiamo che detersivo miscele sono noti per produrre micelle omogeneizzati in soluzione,22 così una miscela di questi h-d-code e nel nucleo della micella dovrebbe produrre un medio SLD pari a quello della testa del gruppo shell, producendo una micella con singolo CMP. Poiché il gruppo di testa è comune a DDM e d25-DDM, la strategia è di trovare una miscela di questi detergenti che produce un valore di contrasto medio dalle code miste che corrisponde il contrasto tra i gruppi di testa.

Media di destinazione CMP per le code di detersivo è quella dei gruppi testa maltoside, o 49% D2O. Per stimare il rapporto di miscelazione il CMP media di ciascun componente h-coda e d-coda deve essere noto. Questi valori per alcuni comuni detersivi e reperibile deuterio etichettati controparti sono forniti nella tabella 1. Utilizzando questi valori CMP per DDM e d25-DDM, la frazione molare di h-code e d-code che soddisfano l'equazione fornito nel passaggio 2.2 è χd-code = 0,43.

Nella figura 2 viene illustrato un ingresso più avanzato per il modulo di pacciame contrasto che può essere utilizzato per confermare le condizioni di corrispondenza finale micelle miste contrasto e determinare il grado di deuteration necessarie sulla proteina. Qui, subunità 1 si riferisce alla micella mista abbinati a contrasto con 2 componenti, DDM e d25-DDM, mentre subunità 2 si riferisce a M. marisnigri JR1 intramembrana aspartil proteasi (MmIAP) dato dalla sua sequenza aminoacidica. La SLD della proteina sono stati elevati di espressione nei mezzi di crescita deuterati a cedere un CMP per la proteina in tampone contenente ~ 92% D2O. Il grado di separazione tra match point della proteina nel 92% D2O e la condizione di misurazione (48,5% D2O) suggerisce che quel segnale sufficiente scattering si otterranno dalla proteina.

Produzione di d-MmIAP è stato effettuato con Rosetta 2 Escherichia coli cellule che harboring il vettore di pET22b-MmIAP. Terreno minimo con glicerolo senza etichetta in 90% D2O è stata selezionata come il mezzo di crescita. Dopo l'adattamento al terreno minimo 90% D2O, il volume di cultura è stato ridimensionato fino a 400 mL e utilizzati per inoculare 3,6 L di fresco 90% D media di minimo di2O in un vaso di bioreattore 5,5 litri.

Figura 3 fornisce un'analisi dei valori di processo durante la coltivazione fed-batch. Al momento dell'inoculazione, la temperatura era di 30 ° C, il set point di ossigeno disciolto (DO) era al 100%, il set point di agitazione era 200 giri/min e la portata di aria compressa è stato 4 L/min. Il pH è stato tenuto sopra un set point di 6,9 usando una soluzione di p/v di 10% di idrossido di sodio in 90% D2O. Una volta il picco segnalato lo svuotamento del glicerolo iniziale 5 g/L, alimentazione (30% glicerolo w/v, 0,2% MgSO4 in 90% D2O) è stato avviato, che ha continuato per tutta la coltivazione. Dopo circa 7 ore di alimentazione, la temperatura di cultura è stata ridotta a 18 ° C e isopropilico-β-D-1-thiogalactopyranoside è stato aggiunto a una concentrazione finale di 1 mM. Al momento di raccolta la cultura, sono stati raccolti circa 145 g peso umido della cella incolla tramite centrifugazione (6.000 x g per 45 min)

Purificazione di d-MmIAP proceduto per quanto riguarda l'enzima protonata tranne che enzima resa era significativamente più basso e purezza finale era leggermente inferiore alla tipica. Da 5 L, ~ 20 g delle membrane bagnate è stato isolato, che è stato solubilizzato in DDM per purificazione e caricati sulla prima colonna Ni2 + affinità. Per massimizzare il rendimento di depurazione, la frazione di flusso continuo è stata diluita e ri-eseguire nuovamente sulla colonna di affinità2 + di Ni. La procedura è stata ripetuta una terza volta prima della lucidatura del campione concentrato d-MmIAP di cromatografia di esclusione di formato (Figura 4).

Figura 5 raffigura una cella campione di quarzo e sua installazione changer esempio correlato. Ambienti di esempio sono gestiti da Bio-SANS team operativo e NSS. Una varietà di ambienti diversi possa essere organizzata per eseguire misurazioni con controllo della temperatura, controllo dell'umidità, tumbling meccanico, ad alta temperatura e pressione sostenuta, tra gli altri.

Figura 6 dimostra Bio-SANS le operazioni e l'esecuzione della tabella automatica esegue la scansione. La scansione della tabella è configurata per essere intuitivo e facile da usare. Nella prima scheda (campioni di carico), vengono fornite informazioni sull'impostazione, come l'identificazione di campioni in ogni posizione nell'autocampionatore, cella spessori e tipo di campione (travi, campione, sfondo, ecc.) e autocampionatore. Tag di metadati aggiuntivi può essere applicato anche qui. Nella scheda successiva (esperimento di piano), sono definiti la configurazione dello strumento e tutti i parametri associati (ad esempio, controllo della temperatura). Questo passaggio è organizzato dal NSS all'inizio dell'esperimento. L'utente deve semplicemente inserire i tempi di misurazione per ogni campione (in secondi). La scheda finale (eseguire scansioni) viene fornito un riepilogo dei dati di scansione della tabella e permette la scansione automatizzata da eseguire.

Dopo le immagini di dispersione 2D sono state registrate, questi dati devono essere ridotto a una trama 1D dell'intensità contro Q - una funzione dell'angolo di dispersione. Durante la riduzione di dati, vengono applicate anche le correzioni di immagine quali maschere pixel sensibilità e sottrazioni di sfondo scuro. MantidPlot software è stato progettato per interpretare il Bio crudo-SANS dati dello strumento. il NSS generalmente vi assisterà nella riduzione e recupero i dati finali alla fine dell'esperimento.

Figura 7 fornisce una panoramica dell'accesso al cluster analisi remota di MantidPlot e la finestra di Script utilizzato per la riduzione dei dati. Dati grezzi sono accessibili presso il cluster analisi remota (analysis.sns.gov) tramite l'autenticazione dell'utente: UCAMS/XCAMS. Dopo l'accesso al desktop remoto, il software di MantidPlot può essere lanciato da una finestra terminale eseguendo semplicemente 'MantidPlot' in qualsiasi percorso. Aprire la finestra di Script in MantidPlot e modificare lo Script di riduzione di utente, come indicato dal NSS. L'esecuzione di questo script genera i file di dati ridotta, che possono quindi essere trasferiti a un computer locale per l'analisi tramite FTP sicuro.

Nella figura 8 viene illustrato stampa e la visualizzazione dei dati dopo l'esecuzione i dati utente riduzione script. ridotto apparirà nella finestra di aree di lavoro. Per impostazione predefinita, i dati Uniti finali avrà il suffisso _f aggiunto. Tasto destro del mouse vi permetterà di tracciare lo spettro con errori per essere selezionati e i dati per la tracciatura. Preferenze di visualizzazione sono accessibili selezionando Preferenze dalla barra dei menu 'Visualizza'. Formattazione degli assi e la gamma di stampa è facilmente accessibile facendo doppio clic su assi. Profili di scattering di buffer, che non contengono particelle di scattering di rilevanti dimensioni dovrebbero essere visualizzato come una linea relativamente piatta (intensità costante). Per i campioni, intensità dovrebbe essere osservato a inferiori angoli di scattering (Q) con decadimento esponenziale ad uno sfondo piatto incoerente.

Figura 9 fornisce una panoramica delle sottrazioni di buffer corrette utilizzando il pacchetto di software di analisi dati SAS (o primusqt) seguendo la riduzione dei dati. Molto spesso lo sfondo incoerente (intensità alle ad alto Q) è leggermente non corrispondente tra il campione e il buffer. Per sottrazione corretta, i dati in questa regione devono sovrapporsi. La correzione di scala si applica un fattore di scala di intensità per i dati che si traduce in dati sovrapposti, e può essere eseguita la sottrazione. Se il fattore di scala risultati in buffer dati punti con maggiore intensità rispetto a punti corrispondenti nel campione, allora questi punti sarà negativo e non sottoposte a rendering in una trama di registro. Se i valori negativi nel file buffer-sottratto sono abbondanti, fare una riduzione minore il fattore di scala del buffer ed eseguire la sottrazione di nuovo.

Figura 10 fornisce gli utilizzi di esempio del Primus Guinier e procedure guidate di distribuzione di distanza. Un'analisi di Guinier fornisce una stima preliminare del raggio di girazione dai dati di scattering ad angolo basso particelle. Come dati avvicinano a zero, una regione lineare dovrebbe essere presente nei dati. Montaggio di una linea in questa regione permette la Rg deve essere determinato dalla pista e un io0 a essere estrapolati dall'intercetta di intensità Q = 0. Una tendenza al rialzo nei dati come Q si avvicina a zero indica l'aggregazione nel campione, mentre le tendenze al ribasso sono solitamente indicative di repulsioni interparticella. Queste tendenze sono più evidenti quando la distribuzione dei residui è non stocastici. Il limite superiore di Guinier misura per particelle globulari è vincolato da Q * Rg < 1.3 attrezzature ' viene utilizzato al posto di Q nel software ATSAS).

Rg determinato per d-MmIAP da questo fit Guinier era 15,4 ± 1.1 Å con una stima ho0 dato come 0,580 ± 0.001.

La procedura guidata di distribuzione di distanza consente di essere apportate ai parametri del p (r) in forma sistematiche modifiche. La curva di p (r) è una trasformata di Fourier indiretta della curva corrispondono ai dati sperimentali. Pertanto, è indispensabile verificare che la misura nel pannello di sinistra rifletta accuratamente i dati sperimentali. Per il fit illustrato in questo esempio, un Dmax di 46 Å è stata ottenuta.

Figura 11 illustra gli errori comuni nella selezione di Dmax. Un Dmax che è artificialmente grande spesso causa valori di p (r) diventare negativo come la funzione p (r) oscilla intorno all'asse x. Un Dmax che è artificialmente piccolo conduce ad una curva di p (r) troncata con una transizione brusca a Rmax = 0.

I primi passi della procedura guidata forma di Primus sono identici al Guinier e procedure guidate di distribuzione di distanza. Una volta che queste informazioni sono state fornite per ottenere buona si adatta ai dati sperimentali, l'installazione di modello ab-initio è configurato.

Figura 12 illustra un ingresso corretto per la procedura guidata forma di Primus. Qui, sperimentale SANS dati per la IAP è stato fornito con una scala in Angstrom e il prefisso del file previsto di "SANSEnvelope" è stato dato. Una serie di 17 modelli dell'atomo fittizio iniziale sono stati richiesti per essere generato utilizzando applicata la modalità modello "veloce" con nessuna simmetria (P1) e nessun anisometry selezionata. Il set di 17 modelli verrà essere allineato, in media e filtrato con DAMAVER e il modello medio raffinato utilizzando DAMMIN. Ispezione del prefisso-damsel.log testo documento contiene una sintesi di eventuali modelli scartati dal set e il criterio di selezione. Il modello finale raffinato fu scritto come SANSEnvelope-1.pdb.

Il programma SUPCOMB è utilizzato per eseguire una sovrapposizione della busta SANS modello con il modello ad alta risoluzione, con solo le due struttura file PDB come input. Per impostazione predefinita, "r" viene aggiunto al nome del file di sovrimpressione e riorientata.

Una volta il SANS inviluppo e struttura ad alta risoluzione sono state sovrapposte, questi modelli possono essere visualizzati utilizzando qualsiasi grafica molecolare visualizzazione programma. I risultati da PyMOL sono adatti per immagini di qualità di pubblicazione e possono essere utilizzati per enfatizzare la biofisiche risultati relativi all'indagine strutturale. Qui, noi dimostrare alcune operazioni di PyMOL base utilizzate per fornire rappresentazioni 3D e visualizzazioni delle strutture sovrapposte risultante.

Figura 13 viene fornita una panoramica del processo di visualizzazione di PyMOL. Una volta che la struttura di file PDB è state aperte in PyMOL, i modelli dovrebbero essere visibili nella finestra del Visualizzatore di PyMOL. Modificare le rappresentazioni di ogni modello utilizzando gli ' pulsante accanto a ogni nome di file. Utilizzare una rappresentazione della superficie per la busta SANS e una rappresentazione del fumetto della spina dorsale della proteina dal modello ad alta risoluzione. Selezionare una combinazione di colore adatto da opzioni disponibili sotto il pulsante "C". Per catene proteiche, una colorazione "chainbow" fornisce una sfumatura di colore da N - al C-terminale di aiuto interpretazione. Trasparenza è applicata per la rappresentazione della superficie per permettere la migliore visualizzazione della struttura della proteina all'interno della busta. Per le immagini di pubblicazione, è consigliabile una priorità bassa bianca. Una volta che queste code di visualizzazione sono state applicate, le strutture 3D possono essere esaminate. Manipolazioni della prospettiva e molecola rotazione/traduzione possono essere eseguite facendo clic e trascinando la struttura.

Figure 1
Figura 1. L'utilizzo del modulo di pacciame contrasto per determinare i parametri di contrasto per componenti di dodecil maltoside (DDM). I valori di input sono mostrati nella schermata a sinistra con l'uscita successiva a destra. La pagina di ingresso del modulo contrasto è accessibile facendo clic 'Contrasto' (cerchio verde) dal menu di navigazione sul lato sinistro di ogni schermata. Aree di input per il titolo del progetto, i componenti del tampone e subunità 1 e 2 sono etichettati come tali. Uscita pagine contengono proprietà di informazioni e di contrasto delle particelle importanti per il sistema descritto. Tabelle rilevanti e calcolato match point hanno stato inscatolato in arancione per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. L'utilizzo del modulo di pacciame contrasto per determinare i parametri di contrasto per i componenti del complesso proteina-detergente membrana. In questo caso, l'input è stato dato per descrivere l'intero sistema PDC in soluzione tamponata. Subunità 1 descrive il contrasto-abbinato misto composto da DDM con 43% di mole come d25-DDM micella. Subunità 2 descrive la proteina di membrana, con la sequenza di aminoacidi per l'input di MmIAP come la formula. Il livello di deuteration (cerchio verde) descrive il grado di proteina di sostituzione di deuterio e ha un impatto diretto sul SLD e partita-punto calcolato che sarà valutato per la proteina. Risultati (scatola arancione) indicano che match-point per il detersivo misto si verificherà nel 48,5% D2O, mentre partita-punto della proteina si trova a ~ 90% D2O. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Preparazione del campione – traccia di bioreattore. i valori di processo visualizzati sono set point di temperatura (linea arancione), ossigeno disciolto (DO) set-point (linea blu), agitazione set point (linea rossa) e la portata dell'aria compressa (linea rosa). Pompa 1 (linea verde) è stato utilizzato per il controllo del pH. Il picco alle 18:40 segnalato lo svuotamento del glicerolo intial e utilizzato per avviare l'alimentazione della soluzione di glicerolo tramite pompa 2 (linea nera). Asse x indica ore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Preparazione – caratterizzazione FPLC e SDS-PAGE del campione. Cromatogramma di esclusione di formato finale per d- MmIAP equilibrate con 20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl, 48,5% D2O e 0.05% totale DDM, di cui 44% (p/v) è coda-deuterated d25-DDM. Inserto: Analisi di SDS-PAGE con la macchiatura di Coomassie. Frazioni raccolte sono etichettati come A, B, e C. regione "B" è stato usato nell'esperimento SANS. Marcatore di peso molecolare con annotazioni è in kDa. Immagine riprodotta con permesso da Naing et al. 65 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 5
Figura 5. Raccolta dei dati – banjo quarzo esempio di impostazione delle cellule e autocampionatore. (A) una cella di banjo quarzo vuota viene mostrata che riposa contro il blocco di autocampionatore. Le cellule sono pieni di campione e inserite in uno dei 15 posizioni disponibili. (B) il blocco campione è montato dietro un selettore di diaframma (non mostrato) tra il fascio Ampliatore e silicio finestra all'ingresso al serbatoio rivelatore. Tubi di collegamento per un bagno di acqua a temperatura controllata e canali in tutto il blocco campione forniscono la regolazione della temperatura alle posizioni del campione. La freccia indica la direzione del fascio di neutroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Raccolta dei dati – panoramica delle operazioni di SPICE e scansione di tabella. Le operazioni di scansione di tabella sono accessibili dal pulsante 'Table Scan' estrema sinistra dal menu del software di controllo dello strumento delle spezie. Le frecce verdi indicano la scheda attiva nella parte superiore dello schermo e scatole arancioni evidenziano aree nella tabella per gli input dell'utente attivo. (A) la scheda prima della scansione della tabella viene utilizzata per fornire informazioni sul campionatore e posizioni cella campione. Fornire etichette, campione spessori e tipi di campione per ogni posizione utilizzata nell'autocampionatore. Selezionando la casella 'Fare Scan' aggiungerà la riga corrispondente alla coda di scansione di tabella. (B) sulla seconda scheda, i dettagli circa i tempi di configurazione e misura strumento per ogni campione (in secondi) sono registrati. Configurazioni di strumento sono preconfigurate dallo scienziato di Scattering di neutroni e fornite agli utenti in base ai dati forniti nella proposta di tempo e strumento della trave. Il controllo dello strumento, ad esempio la possibilità di definire soglie di temperatura e tenere volte, durante la coda misura possono essere aggiunti ulteriori parametri. (C) la scheda finale viene fornita una panoramica delle misurazioni da effettuare per ogni riga nella tabella. Se non sono necessarie modifiche, viene avviata la scansione automatica facendo clic sul pulsante 'Esegui scansione'. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Riduzione dei dati – panoramica degli script di riduzione e le operazioni di MantidPlot. MantidPlot software è accessibile sul cluster analisi digitando "mantidplot" nel prompt dei comandi terminal a qualsiasi directory attiva (il cerchio giallo e freccia vengono aggiunti per dare enfasi). Una volta aperto il software, accedere alla finestra di script (attivata/disattivata tramite pulsante contrassegnato in verde) e aprire lo script fornito dallo scienziato di Scattering di neutroni. Seguire le istruzioni fornite nello script, che devono essere solo i numeri di scansione per ogni campione e buffer per essere iscritti in un elenco per riduzione automatizzata, come pure i numeri per la cella vuota per sottrazione e trave vuota per la trasmissione e fascio di scansione determinazione di centro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8. Analisi dei dati – Plotting di dati utilizzando MantidPlot. Dati si fa riferimento come 'Aree di lavoro' in MantidPlot. L'area di lavoro verrà popolata con i nomi di file come prodotto dallo script di riduzione di utente. Possono essere tracciati i dati dell'area di lavoro per set di dati 1D facendo doppio clic nell'area di lavoro e selezionando "Plot Spectrum con errori...". Dati supplementari possono essere aggiunti alla trama corrente semplicemente trascinando e rilasciando le aree di lavoro. Formattazione della finestra del grafico (ad esempio per trame log-log) può essere eseguita selezionando 'Preferenze' dalla barra dei menu 'View', o facendo doppio clic sulle etichette dell'asse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Nella figura 9. Analisi dei dati – software di ATSAS: operazioni di base e sottrazione di buffer. L'applicazione primusqt (analisi dei dati SAS) fornisce la visualizzazione per la sottrazione di sfondo corretto (buffer). Il file di buffer deve essere scalato per sottrazione tale che dati si sovrappongono alle ad alto Q (dove lo scattering è piatto a seguito di segnale rimanente da sfondo incoerente). Quando è selezionata questa gamma ad alto Q di dati, l'operazione di scala si applica un fattore di scala per il file di dati inferiore della tabella che produce sovrapposizione nella regione definita. Dopo la scalatura, il file di buffer può essere dedotta per produrre il profilo netto scattering della particella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10. Analisi dei dati – Guinier e p (r) determinazione (distribuzione di distanza). (A) il Primus Guinier guidata viene utilizzata per eseguire un'analisi Guinier, fornendo una stima iniziale di I,0 e Rg. Il tipo di particelle e l'intervallo di dati per adattarsi vengono utilizzati per definire la misura. Una trama della vestibilità e i corrispondenti residui vengono visualizzati a sinistra, mentre termini Guinier (ho0 e Rg), Q * Rg limiti e qualità di fit lineare sono forniti come output nell'area contrassegnata dal riquadro arancione. (B) la creazione guidata di distribuzione di distanza Primus viene utilizzato per eseguire l'analisi di distribuzione di distanza, fornendo la curva p (r) che definisce la probabilità di distanze interatomiche all'interno della particella di scattering e include il Dmax o massimo distanza interatomico. Parametri indicati dal riquadro arancione possono essere studiati sistematicamente per determinare una funzione di distribuzione della giusta distanza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11. Impropri risultati dell'analisi di distribuzione distanza. Un Dmax correttamente selezionato dovrebbe produrre una curva di p (r) che i picchi con un graduale decadimento a zero. DMAX valori troppo grandi probabilmente produrrà valori negativi di p (r) o provocare oscillazioni vicino l'asse x a valori elevati dei valori di Dmax di r. che sono artificialmente piccole spesso curve p (r), dove il limite superiore appare troncato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Nella figura 12. Modellazione – Ab-initio l'installazione del modello utilizzando la procedura guidata forma di Primus. Ab-initio modellazione parametri sono forniti in un'unica finestra di input. Un prefisso è fornito per i nomi dei file di output con altre opzioni per l'elaborazione disponibile. Procedura di ricottura può essere veloce (più grandi perle con raffreddamento più rapido) o lenti (più piccoli grani con raffreddamento più lento). Numero di ripetizioni deve essere di dimensioni sufficienti per esaminare la riproducibilità delle caratteristiche del modello. Anisometry e la simmetria delle particelle possono essere forniti, se noto. Scala angolare deve corrispondere alle unità di dati misurati. Con una media di DAMAVER allineare e media di tutti i modelli dell'atomo fittizio e quindi applicare un criterio di selezione che esclude qualsiasi modelli di valore erratico. Un nucleo fissi di atomi di dal modello sulla media sarà ulteriormente raffinato utilizzando DAMMIN se questa opzione è selezionata. Questo modello raffinato dovrebbe rappresentare la busta a bassa risoluzione 3D di SANS profilo sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 13
Figura 13. Visualizzazione – sperimentale SANS busta e overlay con modello ad alta risoluzione utilizzando PyMOL. Dopo aver aperto i file di struttura PDB in PyMOL, modelli vengono visualizzati nel Visualizzatore di PyMOL. Modelli attivi sono elencati nella tabella a destra, insieme con i pulsanti di azione che possono essere utilizzati per manipolare il modello e la sua rappresentazione. Operazioni di base sono fornite per la visualizzazione di questi modelli che consentono alle regioni di struttura accordo (o mancata corrispondenza) tra la busta SANS e ad alta risoluzione per essere identificati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Proprietà fisiche dei detersivi comunemente utilizzati nelle indagini di proteine di membrana. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

I ricercatori di biologia strutturale sfruttano tecniche strutturali complementari come soluzione dispersione per ottenere dettagli biochimici e strutturali (ad esempio, forma e dimensioni complessive) da biomolecole in soluzione. SANS è una tecnica particolarmente attraente per la determinazione di strutture di bassa risoluzione delle proteine di membrana, un focus di nucleo della moderna biologia strutturale e biochimica. SANS richiede quantità di proteine purificate paragonabili a quelli degli studi cristallografici (1 mg/campione). La recente espansione disponibilità commerciale di elevata purezza deuterati detergenti rilevanti per gli studi della proteina di membrana rende accessibile un mezzo per manipolare questo idrogeno/deuterio contenuto per SANS esperimenti di complessi proteina-detergente di membrana, permettendo il segnale di proteina essere registrato direttamente. Quando è successo, una busta ab-initio modello molecolare può essere calcolata dai dati raccolti nel corso di solo alcune ore. Così, biochimici di proteine di membrana, dei biophysicists e i biologi strutturali possono facilmente sfruttare SANS per ottenere modelli 3D iniziale ambite di proteine di membrana in soluzione, strutture in complesso con associazione partner o substrati e modelli ottenuti da SANS può essere utilizzato per l'eliminazione dei dati di diffrazione. L'utilizzo sistematico di SANS per caratterizzare le proteine di membrana sarebbe trasformativo per il campo di biochimica della proteina di membrana e avere effetti a catena dalla funzione di struttura di base per drogare scoperta e sviluppo. Il vantaggio aggiunto di contrasto di neutroni di corrispondenza con la sostituzione di deuterio rende SANS una tecnica importante per lo studio della proteina-proteina, proteina-DNA o altri complessi biomolecolari, che possono essere facilmente manipolati nel loro contenuto di idrogeno/deuterio.

Per ulteriori informazioni su design di scattering ad angolo piccolo strumento e teoria, sono consigliate le seguenti recensioni: il Bio-SANS strumento presso l'High Flux isotopo reattore di Oak Ridge National Laboratory,79 Small-angle scattering per biologia strutturale – espandendo la frontiera, evitando le insidie,72 e gli studi di dispersione Small-angle delle macromolecole biologiche in soluzione. 80 the Scientist di Scattering di neutroni può anche discutere attuale strumento configurazioni e i parametri ottimali per un dato sistema. Per esempio, dati a Q inferiore (che è una funzione della lunghezza d'onda di angolo e neutron scattering) sono generalmente desiderati per sistemi più grandi. La configurazione più comune strumento presso Bio-SANS fornisce un Qmin di 0,003 Å-1 ed è adatto per i più grandi complessi di proteine fino a centinaia di kDa. Una soluzione contenente ~ 3 mg mL-1 di proteina di membrana di dimensione approssimativa di 30 kDa (monomero) in micelle abbinati a contrasto con 48,5% D2O in soluzione richiede un tempo di misurazione tipico circa 8 ore per esempio, buffer e cella vuota (24 ore = 1 giorno totale). Tempi di misura dello strumento a una condizione di contrasto dato possono essere scalati circa secondo il prodotto di massa molecolare e la concentrazione della particella di scattering. Tuttavia, le particelle di dispersione devono essere misurate in condizioni non interagenti, compresa qualsiasi aggregazione di proteine aspecifiche, che pone un limite superiore pratico sulla concentrazione del campione. Un'ora misure porre dei limiti sulla stabilità di determinate proteine. Fortunatamente, SANS misurazioni può essere fatto ordinariamente a temperature refrigerate per migliorare il tempo di vita di proteina, e il lavoratore fascio di neutroni di bassa energia non causa alcun danno da radiazione durante la misurazione.

Una panoramica di questo processo e la determinazione di molti fattori chiave verso la riuscita registrazione di scattering di neutroni da un campione misurato presso il punto d'incontro contrasto del detersivo sono presentati in questo manoscritto. Questo include il passaggio fondamentale verso ottenere una corrispondenza completa del detergente aggregata progettando una miscela detergente con un contrasto di neutroni uniforme tra il gruppo di testa detergente e componenti della catena alchilica. Le misure in questo unico punto match detergente forniscono un profilo di scattering attribuito solo alla proteina di membrana di interesse e ha permesso una busta ab-initio che rappresenta la proteina di membrana ad essere ricostruiti dai dati. L'analisi dei dati e ab-initio modellazione protocolli anche dimostrare il potenziale informazioni ottenute da tali indagini, che potrebbero mirare a indirizzo struttura complessiva, cambiamenti conformazionali, oligomerici Stati, tra gli altri. Una limitazione è che fino ad oggi soltanto molto pochi detergenti sono commercialmente disponibili con sostituzioni di deuterio. 19

Mentre perdeuteration può non essere necessario, in questo caso l'obiettivo dovrebbe essere di ottenere una proteina con > 65% deuterio etichettatura nella proteina. In alternativa, detergente con selettivamente deuterated code e gruppi testa è disponibile e il CMP del detergente micellare si verifica vicino 100% D2O, se sufficiente contrasto dalla proteina possa essere raggiunti senza la necessità per l'etichettatura di deuterio. Determinare il livello appropriato di deuteration della proteina per ottenere sufficiente scattering quando misurato nel punto di contrasto-partita del detergente. Ci sono numerose sfide connesse con l'espressione della proteina di membrana e purificazione,81 che rimangono oltre la portata di questo articolo. Purtroppo, alti livelli di deuteration attualmente non sono (ancora) possibili per sistemi eucariotici. Mentre ci rendiamo conto che si tratta di una limitazione per alcune proteine eucariotiche, la maggior parte delle proteine di membrana sono orthologs batterica, per cui questo metodo è adatto.

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Disclosures

Gli autori Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver sono contratte attraverso UT-Battelle con noi DOE per sostenere il programma utente di neutroni scienza e Bio-SANS strumento all'Oak Ridge National Laboratory, utilizzato in questo articolo.

Questo manoscritto è stato co-autore di UT-Battelle, LLC, sotto contratto DE-AC05-00OR22725 con l'US Department of Energy (DOE). Mantiene il governo degli Stati Uniti e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, in tutto il mondo per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di questo manoscritto o consentire gli altri a farlo, fini governo US. DOE fornirà accesso del pubblico a questi risultati di ricerca sponsorizzato dal governo federale conformemente al piano di accesso pubblico DOE. 82

Acknowledgments

L'ufficio di biologico e la ricerca ambientale sostenuto la ricerca di ORNL centro per biologia molecolare strutturale (CSMB) e Bio-SANS utilizzando strutture supportati dalla divisione scientifica di strutture utente, Office di base energia scienze, dipartimento di di energia. Opere strutturali su proteine di membrana nel laboratorio di Lieberman sono stata sostenuta da NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

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