Correspondance de contraste de détergent dans les expériences de diffusion de neutrons de petits angles pour l’analyse structurale de protéines membranaires et la modélisation de Ab Initio

Biochemistry

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Summary

Ce protocole montre comment obtenir un modèle basse résolution ab initio et des détails de structure d’une protéine de membrane solubilisée détergent en solution par la diffusion des neutrons de petits angles avec filtrage de contraste du détergent.

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Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

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Abstract

L’instrument de diffusion de neutrons de petits angles biologique au haut Flux Isotope réacteur du Oak Ridge National Laboratory est dédié à l’étude des biomatériaux, biocarburants de traitement et les matériaux bio-inspirés couvrant nanomètre à échelles de micromètre de longueur. Les méthodes présentées ici pour étudier les propriétés physiques (p. ex., la taille et la forme) des protéines membranaires (ici, MmIAP, une protéase d’aspartyl intramembranaires de Methanoculleus marisnigri) dans les solutions micellaires formant des détergents sont bien adapté pour cet instrument de diffusion de neutrons de petits angles, entre autres. Autres techniques de caractérisation biophysique sont gênées par leur incapacité à régler les contributions de détergent dans une structure complexe de protéine-détergent. En outre, l’accès au laboratoire Bio-deutération fournit des capacités uniques pour la préparation des cultures à grande échelle et exprimant des protéines marquées du deutérium pour le signal de diffusion accrue de la protéine. Tandis que cette technique ne fournit pas de détails structuraux à haute résolution, ce manque de connaissances structurale des protéines membranaires contient plusieurs zones adressables de recherche sans nécessiter de résolution atomique près. Par exemple, ces domaines incluent la détermination des États oligomériques, formation d’un complexe, des changements conformationnels durant la perturbation et les événements de pliage/dépliage. Ces enquêtes peuvent être facilement exécutées via des applications de cette méthode.

Introduction

Les protéines membranaires sont codées par environ 30 % de tous les gènes1 et représentent une forte majorité des cibles pour des médicaments modernes. 2 ces protéines effectuent un large éventail de fonctions cellulaires vitales,3 mais en dépit de leur abondance et leur importance, ne représentent qu’environ 1 % du totales structures déposées dans le Research Collaboratory Structural Bioinformatics (RCSB) protéine Banque de données. 4 en raison de leur caractère hydrophobe partiellement, détermination structurale des protéines membranaires a été extrêmement difficile. 5 , 6 , 7

Comme beaucoup de techniques biophysiques nécessite monodispersés particules en solution pour la mesure, isoler des protéines de la membrane des membranes natives et la stabilisation de ces protéines dans un imitateur soluble des membranes natives a été un sujet de recherche active au cours des dernières décennies. 8 , 9 , 10 ces investigations ont conduit au développement de nombreuses nouvelles amphiphiles assemblées de solubiliser les protéines membranaires, comme nanodiscs, bicelles de11,12,13 ,14,15 et amphipols. 16 , 17 cependant, l’utilisation de détergents micelles reste une des approches plus courantes et les plus simples pour satisfaire aux exigences de la solubilité d’une protéine donnée. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 malheureusement, aucun détergent unique ou mélange magique de détergents n’existe actuellement qui satisfait à toutes les protéines de la membrane ; ainsi, ces conditions doivent être empiriquement dépistage pour les besoins uniques de chaque protéine. 26 , 27

Détergents s’auto-assembler en solution au-dessus de leur concentration micellaire critique pour former des structures agrégées appelées micelles. Les micelles sont composés de nombreux monomères détergents (qui vont généralement de 20 à 200) avec chaînes alkyl hydrophobe, formant un noyau de micelles et les groupes de tête hydrophiles en une couche de coquille de micelle face à solvant aqueux. Le comportement de détergents et de la formation des micelles a été classiquement décrite par Charles Tanford dans L’effet hydrophobe, de28 et de tailles et formes des micelles de détergents couramment utilisés dans les études de protéines membranaires ont été caractérisé à l’aide de petits angles diffusion. 29 , 30 organisme de détergent sur les protéines de la membrane a également été étudiée, et la formation des complexes protéine-détergent (PDC) est prévue avec les molécules de détergent entourant la protéine dans un arrangement qui ressemble à du détergent pur micelles. 31

On a ajouté avantage dans l’utilisation de détergents est que les propriétés de micelle qui en résulte peuvent être manipulées en incorporant d’autres détergents. De nombreux détergents pièce mélange idéal, et sélectionnez Propriétés de micelles mixtes peuvent même être prédites par les composants et le ratio de mélange. 22 Toutefois, la présence de détergent peut encore présentent des défis pour la caractérisation biophysique en contribuant au signal global. Par exemple, avec des rayons x et des techniques de diffusion de la lumière, signal de détergent dans le PDC est pratiquement impossible à distinguer de protéine. 32 enquêtes avec particule cryo microscopie électronique (cryo-EM) s’appuient généralement sur des particules (congelés) pris au piège ; des détails de structure de la protéine sont toujours cachés par certains détergents ou une forte concentration de détergent qui ajoute à l’arrière-plan. 33 autres approches vers l’interprétation de la structure complète de PDC (y compris le détergent) ont été faites par des méthodes de calcul qui cherchent à reconstruire le détergent autour d’une protéine de membrane donnée. 34

Dans le cas de la diffusion des neutrons, l’arrangement de noyau-enveloppe de détergent dans la micelle produit un facteur de forme qui contribue à la dispersion observée. Heureusement, les composants de la solution peuvent être modifiées telle qu’ils ne contribuent pas à la dispersion observée nette. Ce processus de « contraste correspondant » est réalisé en remplaçant le deutérium de l’hydrogène atteindre une densité de longueur de diffusion qui correspond à celle de l’arrière-plan (tampon). Un choix judicieux de détergent (avec des homologues deutérés disponibles) et de leur ratio de mélange doivent être considérés. Pour détergents micelles, cette substitution peut être effectuée à l’aide d’un détergent avec le même groupe de tête mais comportant une chaîne alkyle deutéré (d-queue au lieu de h-queue). Étant donné que les détergents sont bien mélangés,35 leurs agrégats aura une densité de longueur de diffusion qui est la fraction molaire pondérée moyen des deux composantes (h-queues et d-queues). Lorsque ce contraste moyen correspond à celle du groupe de tête, les structures globales uniformes peuvent être entièrement assorties pour supprimer toutes les contributions à la dispersion observée.

Nous présentons ici un protocole visant à manipuler le contraste de neutrons des micelles détergents en incorporant des molécules de détergent chimiquement identiques avec des chaînes alkyles marqués au deutérium. 19 , 36 , 37 cette façon contraste simultané complet correspondant de micelle principale et de la coquille, qui est une capacité unique de diffusion des neutrons. 35 , 38 avec ce niveau sensiblement raffiné de détail, contraste correspondant peut activer sinon irréalisables études des structures des protéines membranaires. En outre, cette approche contraste équivalente pourrait être étendue à d’autres systèmes impliquant détergent comme polymère échange réactions39 et huile-eau dispersants,40 ou même d’autres agents solubilisants, tels que bicelles,41 nanodiscs,42 ou bloc copolymères. 43 A approche similaire tel que décrit dans ce manuscrit, mais en employant une seule espèce de détergent avec des substitutions de deutérium partielle sur le groupe alkyle de chaîne et/ou de la tête, a été récemment publié. 37 alors que cela est susceptible d’améliorer la répartition aléatoire de l’hydrogène et de deutérium dans le détergent par rapport à l’approche présentée ici, le nombre limité de postes disponibles sur le détergent de substitution et en deux étapes synthèse de détergent nécessaire pose des défis supplémentaires aux fins d’examen.

Les étapes 1 et 2 du protocole détaillés ci-dessous souvent se chevauchent car la première expérience de planification doit être faite pour présenter une proposition de qualité. Cependant, la proposition est considérée ici comme la première étape à souligner que ce processus doit être démarré bien avant une expérience de neutrons. Il est à noter également qu’une étape préalable, ce qui devrait être démontrée par la proposition, est d’avoir la caractérisation biochimique et physique (y compris la pureté et la stabilité) de l’échantillon soutenant la nécessité d’études de neutrons. Une discussion générale de neutrons de petits angles de diffusion (San) est abordée dans cet article. Une introduction brève mais complète est disponible dans l’ouvrage de référence, Caractérisation des matériaux par Kaufmann,44 et une solution complète de manuels ciblée sur biologique petits angles de diffusion a été publié récemment. 45 autres lectures recommandées est donnée dans la section « Discussion ». Diffusion petits angles utilise le vecteur de diffusion que l'on appelle Q la quantité central qui décrit le processus de diffusion. Cet article reprend la définition généralement acceptée Q = 4π sin (θ) / λ, où θ est la moitié l’angle entre le faisceau entrant et épars et λ est la longueur d’onde du rayonnement neutronique en angströms. Autres définitions existent qu’utilisation différente symboles tels que les de ' pour le vecteur de diffusion et qui peuvent différer par un facteur 2π ou à l’aide de nanomètres au lieu de Angstrom (voir aussi la discussion de la Figure 10).

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Protocol

1. préparer et soumettre un Neutron installation faisceau temps Instrument et proposition

  1. Consulter les ressources en ligne pour l’identification des installations de diffusion de neutrons qui fournissent l’utilisateur générale neutrons faisceau temps accès, tels que l’Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Une carte des installations de neutrons et d’informations sur la recherche de neutrons dans le monde entier est disponible en ligne. 46 , sachez que ces installations ont généralement des appels à propositions ; Ceci permet de déterminer quand la prochaine fois de faisceau sera disponible. Neutrons sont utilisés pour une variété d’applications ; Rechercher des instruments de diffusion (San) petit angle neutrons, particulièrement ceux avec des capacités d’échantillons biologiques.
  2. Ressources fournies par les installations de neutrons permet d’aider à diriger le processus de soumission de proposition neutrons faisceau fois. Consulter avec un Neutron Scattering scientifique (NSS) qui est associée à l’instrument pour lequel vous allez appliquer. Examiner l’information actuelle de la facilité de neutrons au sujet des appels de propositions, des délais et des conseils pour la présentation ; pour Oak Ridge c’est disponible en ligne. 47 soumettre la proposition de temps de faisceau suite à toutes les directives pour une présentation réussie.
  3. Si deutéré de protéine est nécessaire (voir 2.2), installations de diffusion de neutrons sont souvent prise en charge par les laboratoires et l’expertise dédiée à la production de matériaux deutérées. Pour demander l’accès à la deutération Bio Lab (BDL) à ORNL, sélectionnez la BDL comme deuxième instrument dans le système de la proposition. Tandis que la proposition SANS se poursuite une étude de faisabilité et par un Comité d’examen scientifique, BDL requêtes sont seulement projetés une étude de faisabilité. Pour faciliter l’étude de faisabilité BDL, soumettre une information rempli demande formulaire48 qui décrit le protocole d’expression de protéine et le rendement estimé (disponible en ligne).
  4. Après avoir réussi-examen par les pairs de la proposition de temps de faisceau, confirmer la date attribuée de temps de faisceau avant l’expérience. Assurez-vous que tous les détails d’échantillon et de la mémoire tampon et les formules sont correctement inscrit dans la proposition de révision. Toute modification apportée au plan expérimental proposé, y compris les changements dans la composition de l’échantillon et le tampon, une notification de l’installation.
    Remarque : Modifications devraient être envisagées dès que possible avec le SNRS assigné.

2. déterminer les neutrons contraste Points de Match et le contraste nécessaire pour la mesure de la protéine

  1. Recueillir de l’information (de l’information du fournisseur des produits, des bases de données en ligne, les valeurs publiées, etc.) relatives aux compositions atomiques et de volumes pour les composants de système de détergent soit égalé par le contraste. Cette information est utilisée pour déterminer les densités de la longueur de diffusion neutronique (SLD) et contraste ainsi points de match (CMPs) en solution, ce qui est essentielle à l’obtention de qualité SANS informations structurelles et les données pour la protéine de la membrane d’intérêt dans le cadre d’une PDC. Un tableau résumant les points de match propriétés et contraste physiques pour détergents utilisés couramment dans les études biophysiques des protéines membranaires est inclus (tableau 1).
  2. Déterminer les neutrons SLD à l’aide de l’application web de paillis : ModULes pour l’analyse de contraste Variation données49 (disponible en ligne50 de gratuit). Un lien vers le manuel de l’utilisateur se trouve sur la page d’accueil. Accéder au site Web et lisez la documentation qui l’accompagne. Figure 1 et Figure 2 donnent un aperçu de contraste module d’entrée et de sortie pour deux exemples connexes.
    Remarque : Autres sites Web pour le calcul des SLD est disponibles, tels que celui maintenu par le centre de la technologie (NIST) et le National Institute of Standards pour la recherche de neutrons. 51
    1. Ouvrez le module de contraste en cliquant sur « Contraste » situé dans le volet de navigation de gauche. Prévoir un titre du projet de texte et entrez les détails ci-dessous pour les deux composants (p. ex., détergent groupe de tête et queue) comme "sous-unité 1' et ' sous-unité 2'.
    2. Entrez la formule moléculaire pour chaque composant dans la boîte de texte « Formule ».
      Remarque: le bouton radio am' doit être activée sous « Type de Substance » pour entrer une formule moléculaire. En outre, utiliser la lettre « X » dans la formule pour indiquer des atomes d’hydrogène facilement échangeables. Les séquences de protéines, ARN ou ADN peuvent être saisis si le correspondant « P », « R », ou a ' cases d’option sont sélectionnés. Si plusieurs copies d’un composant existent au sein de la sous-unité, la valeur de « Nmolecules » peut être modifiée en conséquence. Un exemple concret ici se rapporte aux détergents de type lipidique contenant deux queues identiques, permettant ainsi la formule pour une queue devant figurer avec Nmolecules égal à 2.
    3. Entrez le volume en angströms cubes pour chaque composant dans la boîte ci-dessous « Volume (Å3) ». Utilisation formule28 de Tanford pour chaînes alkyles de longueur n, Vqueue = 27,4 + n * 26,9, de calculer le volume approximatif de queue, ou d’obtenir des volumes moléculaires d’informations produit fourni ou publié des valeurs en la littérature.
    4. Entrer dans les détails pour les composants de la mémoire tampon. Changer le « nombre dissous dans le solvant, les espèces » à l’aide du menu déroulant pour ajouter ou supprimer des lignes pour chaque composant de la mémoire tampon. Dans le cas de formation de micelles détergents, inclure les monomères de détergent gratuits comme composants de tampons distincts à la concentration micellaire critique de la lessive (CMC).
    5. Cliquez sur « Soumettre » pour effectuer les calculs de contraste de neutrons et de générer une page de résultats qui fournit un tableau de longueur de diffusion densité et contraste points gagnés ainsi que des formules permettant de déterminer ces paramètres à n’importe quel pourcentage donné D2O en la mémoire tampon. Revoir les paramètres de diffusion avec une attention particulière aux composante CMPs. Si les points de match sont semblables (à moins de 10 % D2O) et la concentration micellaire libre est faible, alors la moyenne CMP peut être utilisé pour faire correspondre le contraste les contributions de détergent. Dans la plupart des cas, la COP/MOP du détergent groupe de tête et le croupion sera différente de plus de 10 à 15 %, produisant un facteur de forme de coeur-écorce dans les données SANS qui obscurcit la collecte directe du signal de diffusion de la protéine seule.
  3. Évaluer le contraste entre détergent groupe de tête et la queue. Lorsque le détergent tête groupe alkyle chaîne arrière et SCPM ne sont pas bien assortis, la disponibilité et l’incorporation d’un détergent substitués en deutérium peuvent permettre à diffusion des densités de longueur de choisir les composants à être manipulés. Dans la plupart des cas, il faudra former une micelle mixte grâce à l’incorporation d’un détergent identique avec des chaînes alkyles deutérium-substitués. L’ajout de deutérium déclenche la densité de longueur de diffusion du noyau formé par les queues de chaîne alkyle. Le point de terminaison souhaité, dans ce cas, est telle que le groupe de tête shell CMP et le noyau de chaîne alkyle CMP ont approximativement les valeurs égales.
    1. Soulever la COP/MOP du noyau détergent micelle est approximativement égale à la COP/MOP de la coque du groupe de tête en déterminant le rapport approprié de mélange entre h-queues et d-queues qui réalise le parfait contraste avec les groupes de tête. Une condition préalable à cette détermination est la connaissance de la COP/MOP pour une queue de chaîne alkyle substitués en deutérium. Un équivalent disponible dans le commerce de n-dodécyl β-D-maltoside (DDM) est disponible à l’hydrogène de chaîne alkyle toutes remplacée par deutérium (d25-DDM). Répéter les calculs de contraste décrits à l’étape 2.1 pour un empennage avait ' à la place de l’h « queue ».
    2. Calculer le rapport molaire de h-queue à queue d requis pour filtrage de contraste avec le groupe de tête CMP. Cette détermination peut aider la formule suivante :
      CMPtête = CMPh-queue * χh-queue + CMPqueue d * χd-queue
      où CMP est la densité de longueur de diffusion et χ est la fraction de volume pour le composant de détergent tête, h-queue, ou d-queue. Pour des solutions tampons de DDM, incorporation de 44 % en poids (43 % en mole) du détergent total comme d25-DDM avec chaînes alkyles substitués en deutérium produit un seul CMP à 48,5 % D2O pour tête et de queue.
  4. Examiner le degré de substitution de deutérium pour la protéine de la membrane. Pour mesurer un signal suffisant de diffusion de la protéine, la COP/MOP pour la protéine doit être au moins 15 % D2O en solution loin le détergent CMP et les conditions de mesure. Le signal augmente avec le carré de cette différence de %. Étant donné que la COP/MOP d’une protéine sans étiquette se produit généralement avec ~ 42 % D2O en solution (un CMP semblable à de nombreux groupes de tête détergents), étiquetage de deutérium de la protéine est presque toujours une nécessité. 52

3. exprimer et purifier la protéine membranaire d’intérêt

  1. Préparer le milieu LB (bouillon de lysogénie) et cultiver des Escherichia coli (e. coli) cellules contenant un vecteur d’expression inductible de l’ordre de protéine cible.
    1. Préparer le milieu minimal. Dans H2O ou D2O, dissoudre 7,0 g/L (NH4)2SO4, 5,25 g/L de Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, citrate de 0,50 g/L diammonique hydrogène, glycérol 5,0 g/L, 1,0 mL/L de 20 % p/v MgSO 4·7H2O et 1,0 mL/L de métaux-traces Holme (0,50 g/L CaCl2·2H2O, CoCl de 0,098 g/L2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O et 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Préparer les solutions antibiotiques appropriées à l’aide de H2O ou D2O.
    3. Préparer une solution isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside H2O ou D2O.
    4. Stérile-filtre toutes les solutions en sec, containers de stérilisation utilisant le flacon vide et filtres avec une porosité de 0,22 micron de seringues.
  2. Adapter les cellules d’Escherichia coli au moyen avant marqués au deutérium mesurent-vers le haut pour la surexpression d’une protéine deutériée.
    1. Inoculer 3 mL de milieu LB avec une colonie isolée d’une gélose de lysogénie bouillon (LB) ou de cellules provenant d’un stock de glycérol congelés. La croissance de cellules à 37 ° C dans un incubateur à agitation à 250 tr/min ou réduire la température à 30 ° C ou en dessous pour éviter la prolifération de la culture lors de l’incubation du jour au lendemain.
      Remarque : La procédure d’adaptation peut varier. 55 , 56 , 57
    2. Une fois que la culture de la LB est passé à une densité optique à 600 nm (OD600) de ~ 1, diluez-la 01:20 dans 3 mL de milieu minimal de H2O et poussent à une OD600 de ~ 1. Répéter le 01:20 dilutions à l’aide d’un milieu minimal contenant 50, 75 et 100 % D2O (ou à concurrence du pourcentage désiré de2O D).
      Remarque: comme la D2O contenu est augmenté, les taux de croissance vont diminuer. La relation entre le pourcentage de2O D dans la substitution de médias et de deutérium de croissance dans la protéine a été rapportée dans la littérature. 58 , 59 , 60
    3. Continuer à croître de la culture dans un bioréacteur pour augmenter le rendement d’une masse cellulaire deutéré (Figure 3).
      Remarque : Procédures pas à pas pour l’opération de bioréacteur ont été examinés ailleurs. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Récolter et lyser les cellules d’Escherichia coli pour la purification d’extraction et de protéine de membrane
    1. Les cellules de granule par centrifugation à ~ 6 000 x g pendant environ 30-45 min à 4 ° C.
    2. Adoucir le culot cellulaire par trempage dans un tampon sur la glace pendant environ 30 min. Puis, doucement Resuspendre le culot de cellules dans un tampon de pipetage doucement avec une pipette sérologique, ou doux balancement sur un rocker 2D, à une concentration finale de 1 ~ g hydro-électriques masse/10 mL du tampon.
      NOTE: un tampon exemple est 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide), pH 7.5, 200 mM NaCl complétée avec une tablette d’inhibiteur de protéase.
    3. Lyser les cellules resuspendues avec trois passe par un homogénéisateur haute pression à 10 000 lb/po2 tout en refroidissant les sorties de fonds.
      Remarque : Selon l’échelle requise, autres méthodes lyse peuvent être utilisé (par exemple, par la presse Français ou la sonication).
    4. Débris cellulaires Pellet par centrifugation à ~ 4 000-5 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Répétez cette étape jusqu'à ce que le liquide surnageant est clarifié.
    5. Ultracentrifugeuse (~ 150 000 x g pendant 30-45 min) le surnageant de l’étape précédente, qui contient le soluble et fractions membranaires. Le diabolo après ultracentrifugation contient la fraction membranaire.
    6. Resuspendre le culot de membrane dans un homogénéisateur Dounce grand et d’isoler la fraction de membrane à nouveau par ultracentrifugation (étape 3.3.5). Répétez cette opération au moins une fois pour éliminer les protéines faiblement liés.
    7. Solubiliser les membranes en balançant doucement pour ~ 30 min à 4 ° C dans un tampon contenant le détergent approprié pour la purification. La solubilisation est visible lorsque la suspension se détourne de nuageux transparent. Enlever les matières insolubles par ultracentrifugation (~ 150 000 x g pendant 30-45 min).
      Remarque : Un tampon exemple est 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazole de 20 mM et 4 % (p/v) : DDM de purification par chromatographie d’affinité Ni2 + .
  4. Purifier la protéine selon un protocole précédemment développé pour des formes protonées.
    Remarque : Voir Naing et coll. pour un protocole de purification d’exemple pour une protéine contenant le tag marisnigri M. JR1 intramembranaires aspartyl protéase (d-MmIAP). Le rendement final était de 65 ~ 1 mg de deutéré de croissance de culture cellulaire 5 L deutéré, qui a été utilisé dans l’expérience SANS (Figure 4).
  5. Échanger la protéine purifiée dans le « dernier échange tampon » contraste correspondant.
    1. Préparez 200 mL de « Dernier échange tampon » contenant le mélange correct pour le contraste correspondant, par exemple,20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl et 0,05 % total DDM (0,028 % DDM et 0,022 % d25-DDM) dans 49 % D2O.
    2. Equilibrer une colonne d’exclusion de taille avec > 2 volumes de colonne (CV) du « Dernier échange tampon » en 3.5.1 en utilisant un système Fast protéine Liquid Chromatography (FPLC).
    3. Après l’injection de l’échantillon, exécutez la colonne et isoler les fractions correspondant à la protéine d’intérêt.
    4. Concentrer les protéines à la concentration finale souhaitée (2-5 mg/mL).
      Remarque : Un volume de ~ 300 μL est tenu de remplir une cuvette de quartz cylindrique de 1 mm utilisée pour les San.
    5. Réserver une partie aliquote de tampon correspondant pour SANS soustraction du fond.
      Remarque : L’aliquote peut être pris directement à partir de la mémoire tampon de prête, ou idéalement d’une fraction d’élution propre à la fin de la course des FPLC.

4. faire les derniers préparatifs pour le temps de faisceau et de percevoir SANS données

  1. Après que la proposition a été acceptée et l’accès au site a été approuvé, complète tous les Instr heure assignée de faisceau. Il s’agit d’été, ainsi que le laboratoire radiologique, sur place et de la formation spécifique à l’instrument de formation basée sur le web.
    Remarque : Exigences de formation peuvent dicter l’arrivée avancée pour la première fois que des utilisateurs. Plus d’informations sont disponibles en ligne. 66
  2. Charger des échantillons et tampons pour la collecte de données.
    Remarque : Une vue d’ensemble de la diffusion des neutrons de petits angles biologique (Bio-SANS) instrument échantillon environnement area est montré dans la Figure 5.
    1. Charger les échantillons et les tampons dans les cellules de quartz. Il existe des cellules de quartz le scientifique de l’instrument ou les installations. Gel-chargement conseils permet d’accéder à l’ouverture étroite de la plupart des échantillons de cellules.
    2. Assurez-vous que l’obturateur du faisceau est fermé, puis aborder le domaine de l’environnement échantillon et placer les cellules de quartz dans le changeur de l’échantillon. Enregistrer la position de changeur d’échantillon pour chaque cellule de l’échantillon.
    3. Vérifiez la zone et s’assurer que la marche des rayons est exempt de l’obstruction, alors quitter la zone de prélèvement environnement et ouvrir l’obturateur de faisceau.
      Remarque : Soigneusement suivre toutes les règles d’installation et de réglementations, obéir à toutes les annonces et tenir compte des conseils de la scientifique de l’instrument. Échantillons pas de retirer de la poutre et manipulés après l’exposition à la poutre sans précautions spéciales suivantes. Consulter avec un technicien de contrôle radiologique (RCT) avant ces procédures.
  3. Exécuter l’analyse de table pour la collecte de données automatisée
    1. Faire fonctionner l’instrument grâce au contrôle personnalisé un logiciel basé sur LabVIEW, environnement de contrôle Instrument spectromètre (épice). Suivez les instructions pour le fonctionnement de l’appareil fourni par le scientifique de diffusion de neutrons. Un aperçu des fenêtres d’exploitation table scan est fourni à la Figure 6.
    2. Après avoir entré les informations requises dans les zones appropriées, exécutez l’analyse de la table et un processus de collecte automatisée des données commencera. Surveiller la progression via l’onglet « Statut de Scan de Table ».

5. réduire SANS données d’Image 2D à 1D emplacement

  1. Identifier chaque fichier de données exemple et tampon de la scan enregistré les numéros. Chaque mesure on attribuera un numéro d’analyse unique. Cette information est utile au cours de la réduction des données pour identifier chaque échantillon correspondant et la paire de tampon.
  2. Utiliser un logiciel MantidPlot et script Python pour la réduction
    1. Neutron Scattering utilisateurs sont fournis avec des informations de compte pour accéder à leurs données sur le Cluster distant d’analyse. 67 , connectez-vous au Cluster Analysis distant et exécuter « MantidPlot » de la ligne de commande. Figure 7 et Figure 8 sont fournies pour aider ces étapes.
    2. Obtenir un Script de réduction de l’utilisateur du Neutron Scattering scientifique (cela arrivera généralement au cours de l’expérience) ; Ce script est basé sur Python et contiendra tous les nécessaire étalonnage et mise à l’échelle des ajustements afin de réduire l’image 2D diffusion dans une intrigue 1D des intensités éparses en fonction de l’angle de diffusion, i.
    3. Ouvrez le Script de réduction de l’utilisateur fourni dans MantidPlot et placez les numéros correspondants de scan ou l’identification pour les paires d’échantillon et de la mémoire tampon dans la liste appropriée.
    4. Exécutez le script pour générer des données réduites sous forme de fichier texte de quatre colonnes (ordre des colonnes est Q, i, i erreur, erreur Q) à l’emplacement spécifié. Cliquez avec le bouton droit sur l’espace de travail approprié dans MantidPlot et sélectionnez « Tracé avec erreurs... » pour un premier examen des profils diffusion.

6. analyser les données pour les paramètres structuraux de la particule de diffusion

  1. Transférez le fichier de données réduites à partir du serveur d’analyse sur un ordinateur local à l’aide de transfert de fichier FTP sécurisé. Cela peut être effectuée à l’aide d’un logiciel comme FileZilla ou CyberDuck. Des instructions supplémentaires et des détails de connexion pour le système de fichiers du serveur analyse sont fournis sur la page de connexion analysis.sns.gov.
  2. Télécharger le ATSAS logiciel suite65,68 (suite ATSAS entière). 69 programmes individuels70 sont également disponibles en ligne pour analyser les données SANS, à savoir déterminer les paramètres structuraux et ab initio de modèles.
    Remarque : Plusieurs options sont disponibles pour SANS analyse des données des biomacromolécules. 45
  3. Utiliser PRIMUS71 pour le traçage des données, mettre en mémoire tampon mise à l’échelle et soustraction et l’analyse de Guinier.
    1. Lancer le ATSAS « Analyse de données SAS » application et charge les données réduites des fichiers correspondant à la paire / échantillon de tampon.
      1. Pour mesurer correctement la mémoire tampon, sélectionnez une plage de données à haute Q (Q > 0.5 Å-1) où les deux profils sont similaires et plates et cliquez sur le bouton de « L’échelle », situé sous les « opérations » onglet. Un facteur d’échelle s’appliquera au tampon telle que ces deux régions plates doivent se chevaucher. Soyez prudent : il devrait y avoir une raison plausible de physique qui justifie la mise à l’échelle de l’intensité de la mémoire tampon pour correspondre à l’échantillon. Si l’écart est grand, consulter un scientifique de l’instrument aux approches valides pour soustraction de fond. 44 , 45 , 72
      2. Augmenter la plage de données pour afficher tous les points. Cliquez sur « Soustraire » pour effectuer cette opération. Cliquez avec le bouton droit sur le fichier de données soustraites à la mémoire tampon dans la légende et enregistrez ce fichier pour une analyse ultérieure. La figure 9 décrit l’utilisation de l’onglet « Opérations ».
    2. Effectuer une analyse de Guinier de l’exemple soustraite à la mémoire tampon de données à l’aide de l’onglet « Analyse » de la demande de « Analyse de données SAS ».
      1. N’oubliez pas que le bon fichier est sélectionné dans la liste, puis cliquez sur « Rayon de giration ». Une tentative automatisée pour effectuer un Guinier ajustement est fournie en cliquant sur le bouton « Autorg ».
      2. Élargir l’éventail des données utilisées pour inclure toutes les données de la basse-Q et commencer à réduire la plage de données en enlevant des points de Q-haut jusqu'à la Qmax * Rg limite est inférieure à 1,3. L’intrigue des résidus permet de vérifier que les données soient linéaires dans la gamme d’ajustement. La Guinier fit donne un approximatif Rg et j’ai0 pour les particules de diffusion.
      3. Faire de petits ajustements à la région fit et surveiller la sensibilité de ces valeurs à l’éventail des données utilisées pour l’ajustement. Figure 10 a illustre l’utilisation de l’outil « Rayon de giration ».
  4. Obtenir la fonction de distribution de probabilité (P(r)) en GNOM. 73 le fichier de sortie généré ici servira comme entrée pour l' ab initio processus de modélisation.
    1. Démarrer l’Assistant Distribution de Distance dans l’onglet « Analyse » obtenir un bon ajustement aux données est essentielle à l’obtention d’un modèle de qualité. Pour plus d’informations sur l’obtention des ajustements précis, veuillez consulter la revue74 par Putnam, et al.
      NOTE: GNOM le programme fournit des informations supplémentaires sur l’ajustement au-delà de l’Assistant Distribution de Distance. Figure 10 b illustre l’utilisation correcte de l’outil « Distance Distribution », et la Figure 11 illustre certaines erreurs communes rencontrées.
    2. Dmax, de déterminer la distance interatomique maximale au sein de la molécule.
      1. Estimer une valeur pour Dmax en décochant la case pour forcer Rmax = 0 et en entrant une valeur élevée pour Dmax (150 Å, par exemple). Le premier x-intercept dans la parcelle de p (r) donne cette estimation.
      2. Faire les modifications incrémentielles apportées à cette valeur Dmax et la plage des données utilisées ou le nombre de points utilisés dans l’ajustement pour optimiser le GNOM correspondent à des données et la courbe p (r).
    3. Continuer à affiner l’ajustement GNOM et enregistrer les fichiers de sortie GNOM avec bons paramètres ajustement pour les ab initio étapes de modélisation.
  5. Simuler SANS profils de modèles d’APB haute résolution en utilisant le programme CRYSON. 75
    1. Ouvrez le programme et choisissez l’option "0". Sélectionnez le nom de fichier PDB dans le navigateur de fichiers de popup. Appuyez sur entrée pour accepter les paramètres par défaut, sauf en spécifiant la chaîne deutération fractions et la fraction de D2O dans le solvant pour obtenir les paramètres de contraste adéquat.
    2. Ajuster le modèle à un ensemble de données expérimental en entrant « Y » et sélectionner le fichier de données dans l’Explorateur de fichiers de popup. Acceptez les valeurs par défaut restants, et les fichiers de sortie seront écrite dans l’emplacement du fichier PDB. Le fichier « .fit » contient des informations pour le profil de dispersion estimée du modèle 3D haute résolution.

7. créer des modèles de calculs Ab Initio de la SANS données.

Remarque: DAMMIF76 et77 au sein de la suite logicielle ATSAS de DAMMIN est utilisé pour reconstruire des modèles de l’atome factice (barrages) en utilisant un procédé de recuit simulé de la GNOM sortie, qui contient des données de p (r) ou des informations sur la probabilité ou fréquence des distances interatomiques dans la particule de diffusion. Ces programmes peuvent être exécutés en mode batch ou sur le serveur web ATSAS-Online.

  1. Lancez l’Assistant de forme PRIMUS depuis le bouton « Dammif » dans l’onglet « Analyse » « SAS d’analyse des données » et utiliser une sélection manuelle des paramètres. L’entrée de l’Assistant est illustrée à la Figure 12.
    1. Définir la plage de Guinier de la fit (étape 6.3.2) et passer à l’étape suivante en utilisant les boutons de navigation. Définir les valeurs fit de l’intrigue de p (r) (étape 6,4) et passez à l’étape suivante.
    2. Fournir des paramètres pour les ab initio processus de modélisation. Entrez un préfixe pour les noms de sortie de modèle (par exemple, SANSEnvelope), choisissez soit modélisation mode « rapide » ou « lent », entrez une valeur pour le nombre de modèles (17 suggérés de signification statistique), sélectionnez une des options offertes pour la symétrie de la particule, anisométrie et échelle angulaire (s’il est connu). Assurez-vous que les cases sont vérifiées au moyen de modèles avec DAMAVER et affiner le modèle final avec DAMMIN.
    3. Lancez le processus en utilisant le bouton « valider ». Une fois le processus terminé, afficher et enregistrer le répertoire de travail.
      Remarque: le processus de modélisation typique pour un single, petite protéine peut prendre jusqu'à quelques heures avec un micro-ordinateur typique. Les fichiers sont stockés dans des répertoires temporaires avant l’enregistrement.
  2. Superposition et superposer la finale SANS enveloppe avec un modèle haute résolution associé à l’aide de SUPCOMB dans ATSAS. Placez une copie du modèle APB haute résolution pour être en forme à l’enveloppe SANS dans le répertoire de travail. Exécutez SUPCOMB à partir de la ligne de commande en utilisant les noms de fichiers PDB comme deux arguments avec la structure du modèle citées en premier : $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Remarque : Le deuxième nom de fichier répertorié est réécrits dans un nouveau fichier avec un « r » ajouté aux fin et avoir de nouvelles coordonnées pour superposition sur la structure du modèle.
  3. Visualiser les résultats du modèle ab initio utilisant PyMOL (pymol.org), un programme 3D graphiques moléculaires. Figure 13 donne un aperçu des opérations PyMOL.
    Remarque : Il y a des directives de publication pour la modélisation structurelle des données de petits angles de diffusion de molécules en solution. 78
    1. Lancez l’application PyMOL et ouvrir les fichiers .pdb correspondant à la 3D SANS enveloppe et la structure de haute résolution aligné à SUPCOMB pour être lus.
    2. Visualiser l’enveloppe SANS en représentant ce modèle comme une surface. Cliquez sur les "à côté de la modèle et sélectionnez le bouton ' Show : comme : Surface'.
    3. Visualiser la structure d’épine dorsale de protéine à haute résolution en représentant ce modèle comme une bande dessinée. Sélectionnez les ' situé à côté de ce modèle et sélectionnez ' afficher : comme : dessin animé '. Afficher la chaîne comme un arc-en-ciel de N - à extrémité C-terminale en cliquant sur le bouton « C » et "de la chaîne : 'Chainbows.
    4. Modifier la transparence de la représentation de surface pour plus de clarté. Dans la barre de menu « Réglage », sélectionnez "transparence » Surface » 40 %".
    5. Rendre le fond blanc et non opaques. Dans la barre de menu « Affichage », sélectionnez « arrière-plan »' et sélectionnez « Opaque » de décocher cette option et « Blancs » à l’occasion de cette couleur pour le fond.
      NOTE: opérations supplémentaires et les usages pour PyMOL peuvent être trouvés à PyMolWiki.org.

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Representative Results

Une proposition d’instrument et de temps de faisceau doit exprimer clairement toutes les informations nécessaires au Comité de surveillance ainsi qu’une évaluation valable de l’expérience proposée peut être faite. Communication avec un NSS est fortement recommandée pour les utilisateurs inexpérimentés. Le SNRS peut évaluer la faisabilité initiale et soumission de proposition de guide pour souligner la faisabilité, la sécurité et le potentiel de fort impact science. Les informations fournies dans la proposition doivent inclure des renseignements généraux et le contexte de l’importance de la recherche ; connaissance qui devrait être acquise et comment cela influe sur les connaissances actuelles dans le domaine de la science ; une description de le œuvre, échantillons, méthodes et procédures qui seront utilisées ; et, le cas échéant, productivité précédente de l’équipe à l’installation, y compris les publications pertinentes et les résultats. Ressources utiles, telles que les modèles de proposition et de conseils pour la préparation de la proposition, sont accessibles aux utilisateurs via le portail Science neutronique d’utilisateur (neutrons.ornl.gov/users).

Expérience de planification est un processus dynamique qui souvent commence pendant les étapes initiales de la soumission de la proposition, mais ne peut pas être entièrement conçu jusqu'à ce que juste avant l’expérience. Cependant, gardez à l’esprit que les modifications qui s’écartent sensiblement de la description dans la proposition (y compris les modifications apportées aux conditions de tampon ou de la composition de l’échantillon) doivent être approuvées par l’installation avant le début de l’expérience.

Ce protocole suppose qu’une méthode pour exprimer et la purification de la protéine de membrane d’intérêt dans les micelles détergents en solution a été démontrée avec succès. Dans ce cas, la protéine de membrane d’intérêt est une protéase d’aspartyl intramembranaires (IAP), qui a un protocole de purification établie et a été préalablement déterminée à être actifs dans un tampon contenant les micelles DDM et soluble.

Nous démontrons ici, calculs de contraste de neutrons utilisant le paillis : module de contraste pour une solution de protéines IAP en contraste même mélangé DDM / micelles d25-DDM. La stratégie décrite ci-après a été d’abord déterminer le degré de mélange entre deux détergents nécessaires pour réaliser un match parfait contraste de la micelle. Le résultat final était de déterminer le contraste relatif de chaque composante et l’arrière-plan (rapport de2O H2o/d) nécessaire de contraste-match la diffusion par un détergent afin de n'observer que la diffusion de la protéine.

Figure 1 illustre une entrée correcte pour le module de paillis contraste et le résultat pour les calculs de contraste du groupe de tête détergent DDM et le croupion comme sous-unités 1 et 2, respectivement. La formule utilisée pour le groupe de tête est C12H14X7O11 avec un volume de 348 Å3et la formule de queue de chaîne alkyle est donné comme C12H25 avec un volume de 350 Å3.

Il ressort de la sortie du module contraste que le groupe de tête de DDM et la queue ont des densités de longueur de diffusion différents, et donc on remarquera le contraste entre les deux composantes. Pour la DDM, les groupes de tête ont une CMP dans 49 % D2O tandis que les queues de chaîne alkyle ont un COP/MOP 2 % D2O, avec leur CPM moyen qui se produisent dans 22 % D2O. Par conséquent, le but de la prochaine étape sera de concevoir une micelle mixte qui incorpore les chaînes alkyle substitués par deutérium pour augmenter la COP/MOP moyenne des queues détergents pour correspondre à la COP/MOP des groupes de tête. Le calcul du contraste a été répété pour un détergent substitué, DDM avec une queue entièrement deutéré (d25-DDM), qui se traduit de même en revanche entre le groupe de tête et la queue. Cependant, comparer les valeurs des h-queues et d-queues sont significativement différentes. Rappelons que le détergent mélanges sont connus pour produire des micelles bien mélangés en solution,22 donc un mélange de ces h - et d-queues dans le noyau de la micelle devrait produire une moyen SLD, égale à celle de la tête du groupe shell, ce qui donne une micelle avec CMP unique. Le groupe de tête étant commun à la DDM et d25-DDM, la stratégie consiste à trouver un mélange de ces détergents qui produit une valeur de contraste moyen de queues mixtes qui correspond le contraste entre les groupes de tête.

La moyenne de la cible CMP pour les queues de détergent est celle des groupes de tête maltoside, ou 49 % D2O. Pour estimer le ratio de mélange de la COP/MOP moyenne de chaque composant h-queue et d-queue doit être connue. Ces valeurs pour certains détergents communs et disponibles sur le marché deutérium étiquetés homologues sont fournis dans le tableau 1. En utilisant ces valeurs CMP DDM et d25-DDM, la fraction molaire de h-queues et d-queues qui satisfait l’équation fournie à l’étape 2.2 est χd-queues = 0,43.

La figure 2 illustre une entrée plus avancée du module de paillis contraste qui peut être utilisé pour confirmer les conditions de match final-micelle mixte contraste et déterminer le degré de deutération nécessaire sur la protéine. Ici, la sous-unité 1 se réfère à la micelle mixte assortie contraste avec 2 composants, DDM et d25-DDM, tandis que la sous-unité 2 se réfère à la marisnigri de M. JR1 intramembranaires aspartyl protéase (MmIAP) donnée par sa séquence d’acides aminés. Le SLD de la protéine a été élevé par l’expression dans les milieux de croissance deutéré de céder un CMP pour la protéine dans un tampon contenant environ 92 % D2O. Le degré de séparation entre match point la protéine 92 % D2O et l’état de mesure (48,5 % D2O) laisse entendre que ce signal de diffusion suffisamment proviendra de la protéine.

Production de d-MmIAP a été réalisée avec Rosetta 2 e. coli cellules contenant le vecteur pET22b-MmIAP. Un milieu minimal avec le glycérol non étiqueté dans 90 % D2O a été choisi comme le milieu de croissance. Après adaptation à un milieu minimal 90 % D2O, le volume de la culture a été mise à l’échelle jusqu'à 400 mL et utilisé pour inoculer 3,6 L de milieu minimale 90 % D2O frais dans un récipient de bioréacteur 5,5 L.

La figure 3 fournit une trace des valeurs processus pendant la culture fed-batch. Au moment de l’inoculation, la consigne était de 30 ° C, le point de consigne d’oxygène dissous (OD) était de 100 %, le point de consigne d’agitation était 200 tr/min et le débit d’air comprimé a été de 4 L/min. Le pH a été jugé ci-dessus une consigne de 6,9 à l’aide d’une solution à 10 % p/v d’hydroxyde de sodium dans 90 % D2O. Une fois la pointe signalée l’appauvrissement de la glycérol initiale 5 g/L, alimentation (glycérol p/v de 30 %, 0,2 % MgSO4 dans 90 % D2O) a été lancé, qui s’est poursuivie tout au long de la culture. Après environ 7 heures de l’alimentation, la température de la culture a été réduite à 18 ° C et isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside a été ajouté à une concentration finale de 1 mM. À la récolte de la culture, environ 145 g poids net de pâte de cellules ont été recueillis par centrifugation (6 000 x g pendant 45 min)

Purification de d-MmIAP a procédé en ce qui concerne l’enzyme protoné sauf que le rendement enzyme était significativement plus faible et pureté finale était un peu inférieure à celle typique. De 5 L, ~ 20 g des membranes humides a été isolé, ce qui a été solubilisées dans DDM pour la purification et chargées sur la première Ni2 + colonne d’affinité. Pour maximiser le rendement de la purification, la fraction intermédiaire a été diluée et re-relancer sur colonne d’affinité Ni2 + . La procédure se répétait une troisième fois avant de polir l’échantillon concentré d-MmIAP par chromatographie d’exclusion (Figure 4).

Figure 5 représente une cellule d’échantillon de quartz et de sa configuration de changeur échantillon connexes. Environnements de l’échantillon sont gérés par le Bio-SANS équipe opérations et NSS. Une variété d’environnements différents peut être organisée pour effectuer des mesures avec contrôle de température, contrôle de l’humidité, culbutage mécanique, haute température et une pression soutenue, entre autres.

La figure 6 illustre Bio-SANS opérations et l’exécution de la table automatique scanne. L’analyse de la table est configurée pour être intuitive et conviviale. Sur le premier onglet (échantillons de charge), les informations sont fournies sur le changeur de l’échantillon et le programme d’installation, telles que l’identification des échantillons dans chaque position de l’échantillon changeur, épaisseurs de cellules et du type d’échantillon (faisceau ouvert, échantillon, arrière-plan, etc.). Balises de métadonnées supplémentaires peuvent s’appliquer ici aussi. Sur l’onglet suivant (Plan d’expérience), la configuration de l’instrument et des paramètres associés (tels que le contrôle de la température) sont définis. Cette étape est organisée par le SNRS au début de l’expérience. L’utilisateur doit simplement entrer les temps (en secondes) pour chaque échantillon. L’onglet final (exécuter des Scans) fournit un résumé des données d’analyse de la table et permet l’analyse automatisée à exécuter.

Après que les images 2D de diffusion sont enregistrés, ces données doivent être réduites à une parcelle de 1D de l’intensité par rapport à Q - fonction de l’angle de diffusion. Au cours de la réduction des données, corrections d’image comme pixels sensibilité masques et soustractions de fond foncé sont également appliquées. Logiciel MantidPlot a été conçu pour interpréter le crus Bio-SANS données instrumentales. Le SNRS aidera généralement en réduisant et en récupérant les données finales à la fin de l’expérience.

Figure 7 donne un aperçu de l’accès de cluster distant analyse MantidPlot et la fenêtre de Script utilisé pour la réduction des données. Les données brutes sont accessibles à la grappe de l’analyse à distance (analysis.sns.gov) via l’authentification utilisateur UCAMS/XCAMS. Après la notation dans le Bureau à distance, le logiciel MantidPlot peut être lancé depuis une fenêtre de terminal en exécutant simplement « MantidPlot » sous n’importe quel chemin d’accès. Ouvrez la fenêtre de Script dans MantidPlot et modifiez le Script de réduction de l’utilisateur tel qu’ordonné par le SNRS. L’exécution de ce script va générer les fichiers de données réduites, qui peuvent ensuite être transférées à un ordinateur local pour l’analyse à l’aide de FTP sécurisé.

Figure 8 montre le traçage et affichage des données après que l’exécution des données utilisateur réduction script apparaît dans la fenêtre d’espaces de travail. Par défaut, m├⌐lange final aura le suffixe _f annexée. Faites un clic droit permettra de tracer le spectre avec erreurs sélectionnables et données à tracer. Préférences d’affichage sont accessibles en sélectionnant Préférences dans la barre de menu « Affichage ». Mise en forme des axes et fourchette de traçage sont facilement accessible en double-cliquant sur les axes. Les profils de diffusion de tampons, qui ne contenant aucune diffusion des particules de taille importante doivent apparaître une ligne relativement plate (intensité constante). Pour les échantillons, intensité doit être observée en angles de diffusion inférieurs (Q) avec une décroissance exponentielle à un fond plat incohérent.

Figure 9 donne un aperçu de la soustraction de tampon appropriée à l’aide du progiciel SAS Data Analysis (ou primusqt), suite à la réduction de données. Assez souvent le fond incohérent (intensité à haute-Q) est légèrement incompatible entre l’échantillon et de la mémoire tampon. Pour la soustraction correcte, les données dans cette région doivent se chevaucher. La correction d’échelle applique un facteur d’échelle intensité aux données qui se traduit par des données qui se chevauchent, et la soustraction peut être effectuée. Si le facteur d’échelle entraîne points de données de mémoire tampon avec une intensité plus grande que les points correspondants dans l’échantillon, alors ces points sera négatif et pas rendu dans un complot de journal. Si les valeurs négatives dans le fichier tampon-soustrait sont abondantes, faire une réduction mineure dans le facteur d’échelle de tampon et effectuer la soustraction à nouveau.

Figure 10 fournit des utilisations de l’exemple du Primus Guinier et assistants de Distribution de Distance. Une analyse de Guinier fournit une estimation préliminaire du rayon de giration d’après les données de bas-angle de diffusion des particules. Comme données approchent de zéro, une région linéaire doit être présente dans les données. Montage d’une ligne dans cette région permet la Rg à être déterminée à partir de la pente et un j’ai0 à être extrapolée à partir de l’intersection de l’intensité à Q = 0. Une tendance à la hausse dans les données Q approche de zéro indique l’agrégation dans l’échantillon, tandis que les tendances à la baisse sont généralement révélateurs de répulsions interparticulaires. Ces tendances sont surtout visibles lorsque la distribution des résidus est non stochastiques. La limite supérieure de la Guinier digne des particules globulaires est limitée par la pièce de < 1,3g Q * R' est utilisé à la place de Q dans le logiciel ATSAS).

Le Rg déterminé pour d-MmIAP de cette forme de Guinier était 15,4 ± 1,1 Å, avec une estimation j’ai0 donnée comme 0,580 ± 0,001.

L’Assistant distribution de distance permet des modifications systématiques doivent être apportées aux paramètres de la forme p (r). La courbe p (r) est une transformation de Fourier indirecte de l’ajustement aux données expérimentales de la courbe. Par conséquent, il est essentiel de vérifier que l’ajustement dans le panneau de gauche reflète fidèlement les données expérimentales. Pour l’ajustement illustré dans cet exemple, un Dmax de 46 Å a été obtenue.

Figure 11 illustre les erreurs courantes en sélection Dmax. Un Dmax qui est artificiellement grand souvent est p (r) valeurs deviennent négatives, comme la fonction p (r) oscille sur l’axe des abscisses. Un Dmax est artificiellement faible conduit à une courbe p (r) tronquée avec une transition abrupte à Rmax = 0.

Les premières étapes de l’Assistant de forme de Primus sont identiques pour les assistants de Distribution de Distance et de Guinier. Une fois que cette information a été fournie pour obtenir le bon ajustement aux données expérimentales, la configuration de modèle ab initio est configurée.

Figure 12 illustre une entrée correcte pour l’Assistant de forme de Primus. Ici, expérimental SANS données pour l’IAP était doté d’une échelle en angströms, et le préfixe de fichier attendue de « SANSEnvelope » a été donné. Un ensemble de 17 modèles de l’atome factice initiale demandait aux obtenues en mode « rapide » modèle avec aucune symétrie (P1) appliqué et aucun anisométrie sélectionné. L’ensemble des 17 modèles sera aligné, en moyenne et filtrée avec DAMAVER et le modèle moyen raffiné à l’aide de DAMMIN. Inspection du préfixe-damsel.log texte document résume le critère de sélection et de tous les modèles mis au rebut de l’ensemble. Le dernier modèle raffiné a été écrit comme SANSEnvelope-1.pdb.

Le programme SUPCOMB permet de réaliser une superposition de l’enveloppe SANS modèle avec le modèle haute résolution, avec seulement les deux structure fichiers PDB comme entrée. Par défaut, « r » est ajouté au nom du fichier réorientée et superposées.

Une fois le SANS enveloppe et structure à haute résolution ont été superposées, ces modèles peuvent être visualisées à l’aide de n’importe quel graphique moléculaire Regarde un programme. Les résultats de PyMOL conviennent pour des images de qualité publication et peuvent être utilisés pour mettre l’accent sur les résultats biophysiques concernant l’enquête structurelle. Nous démontrons ici, quelques opérations de PyMOL base utilisées pour fournir des représentations 3D et vues des structures superposées qui en résulte.

Figure 13 donne un aperçu du processus de visualisation PyMOL. Une fois que les fichiers de structure PDB ont été ouverts à PyMOL, les modèles doivent être visibles dans la fenêtre du visualiseur PyMOL. Changer les représentations de chaque modèle, en utilisant les "bouton à côté de chaque nom de fichier. Utiliser une représentation de la surface de l’enveloppe SANS et une représentation sous forme de bande dessinée de l’épine dorsale de protéine du modèle haute résolution. Sélectionnez un jeu de couleurs approprié parmi les options disponibles sous le bouton « C ». Pour les chaînes de protéines, une coloration « chainbow » offre un dégradé de couleur à C-aminée pour faciliter l’interprétation. Transparence est appliquée à la représentation de surface pour permettre la meilleure visualisation de la structure de la protéine dans l’enveloppe. Pour les images de publication, un fond blanc est recommandé. Une fois ces files d’attente de visualisation ont été appliquées, les structures 3D peuvent être examinés. Manipulations de la perspective et la molécule rotation/translation peuvent être effectuées en cliquant et glissant de la structure.

Figure 1
Figure 1. Utilisation du module contraste de paillis pour déterminer les paramètres de contraste pour les composants de dodécyl maltoside (DDM). Valeurs d’entrée sont indiquées à l’écran sur la gauche avec la sortie ultérieure vers la droite. La page d’entrée du module contraste est accessible en cliquant sur « Contraste » (cercle vert) dans le menu de navigation du côté gauche de chaque écran. Les zones d’entrée pour le titre du projet, composants de tampons et sous-unités 1 et 2 sont étiquetés comme tels. Pages de sortie contiennent des particules importantes informations et contraste propriétés pour le système décrit. Tableaux pertinents et calculé des balles de match ont été enfermées orange pour plus de clarté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Utilisation du module contraste de paillis pour déterminer les paramètres de contraste pour les composantes du complexe protéine-détergent membrane. Dans ce cas, entrée a été donnée pour décrire l’ensemble du système PDC dans la solution tampon. Sous-unité 1 décrit le contraste même mélangées micelle composé de DDM avec 43 % de taupe comme d25-DDM. Sous-unité 2 décrit la protéine de la membrane, avec la séquence d’acides aminés pour l’entrée de MmIAP que la formule. Le niveau de deutération (cercle vert) décrit le degré de la protéine de la substitution de deutérium et a un impact direct sur la SLD et match-point calculé qui sera estimé pour la protéine. Résultats (boîte orange) indiquent ce match-point pour le détergent mixte aura lieu à 48,5 % D2O, alors que se produit match-point la protéine à ~ 90 % D2O. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Préparation de l’échantillon – trace de bioréacteur. Les valeurs de processus affichées sont la température de consigne (ligne orange), point de consigne d’oxygène dissous (OD) (ligne bleue), point de consigne d’agitation (ligne rouge) et débit d’air comprimé (ligne rose). Pompe 1 (ligne verte) a été utilisée pour le contrôle du pH. Le crampon à 18:40 signalé l’appauvrissement de la glycérol intial et utilisé pour lancer l’alimentation de la solution de glycérol par l’intermédiaire de pompe 2 (ligne noire). Axe x indique les heures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Préparation – d’échantillons SDS-PAGE et FPLC caractérisation de l’échantillon. Chromatogramme exclusion taille finale pour d- MmIAP équilibrée avec 20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl, 48,5 % D2O et 0,05 % total DDM, dont 44 % (p/v) est deutéré queue d25-DDM. En médaillon : SDS-PAGE analyse avec coloration de Coomassie. Mise en commun des fractions sont marquées A, B et C. région « B » a été utilisée dans l’expérience SANS. Annoté de poids moléculaire marqueur est en kDa. Image reproduite avec la permission de Naing et al. 65 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 5
Figure 5. Collecte de données – banjo Quartz échantillon cellulaire et échantillonneur automatique, le programme d’installation. (A) une cellule de banjo quartz vide apparaît au repos contre le bloc de l’échantillonneur automatique. Les cellules sont remplis d’échantillon et insérées dans l’un des 15 postes disponibles. (B) le bloc de l’échantillon est monté derrière un sélecteur d’ouverture (non illustré) entre la poutre Tube prolongateur et fenêtre de silicium à l’entrée de la cuve du détecteur. Tuyaux de raccordement à un bain d’eau à température contrôlée et canaux dans tout le bloc de l’échantillon fournit la régulation de la température à la position de l’échantillon. La flèche indique la direction du faisceau neutronique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Collecte de données – vue d’ensemble des opérations d’épices et d’analyse de table. Les opérations d’analyse de table sont accessibles depuis le bouton « Scan de Table » dans le menu à gauche du logiciel instrument de contrôle aux épices. Flèches vertes indiquent l’onglet actif en haut de l’écran et boîtes orange mettre en surbrillance les zones dans le tableau pour les entrées de l’utilisateur actif. (A) le premier onglet de l’analyse du tableau est utilisé pour fournir des informations sur le changeur de l’échantillon et les échantillon cellulaire positions. Fournissent des étiquettes, épaisseur de l’échantillon et types d’échantillons pour chaque position utilisée dans le changeur de l’échantillon. Cochant la case « Faire l’analyse » ajoutera la ligne correspondante à la file d’attente du scan de table. (B) sur le deuxième onglet, détails sur le temps instrument de configuration et la mesure pour chaque échantillon (en secondes) sont enregistrés. Configurations de l’instrument sont préconfigurées par le scientifique de diffusion de neutrons et fournies aux utilisateurs en fonction des détails fournis dans la proposition d’instrument et de temps de faisceau. Des paramètres supplémentaires peuvent être ajoutés au contrôle de l’instrument, comme la possibilité de définir des seuils de température et maintenez fois, tout au long de la file d’attente de la mesure. (C) l’onglet final donne un aperçu des mesures à prendre pour chaque ligne de la table. Si aucun des changements ne sont nécessaires, le scan automatique est lancé en cliquant sur le bouton « Exécuter scanne ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Réduction des données – vue d’ensemble du scénario de réduction et des opérations de MantidPlot. MantidPlot logiciel est accessible sur le cluster d’analyse en tapant « mantidplot » dans une invite de commande terminale à n’importe quel répertoire actif (le cercle jaune et la flèche sont ajoutés). Une fois le logiciel ouvert, accéder à la fenêtre de script (activé/désactivée par la touche marquée en vert) et ouvrez le script fourni par le scientifique de diffusion de neutrons. Suivez les instructions fournies dans le script, qui nécessite seulement les nombres de scan pour chaque échantillon et le tampon à être inscrites sur une liste pour la réduction automatique, mais aussi de numéros pour la cellule vide pour la soustraction et faisceau vide pour transmission et faisceau de balayage détermination du centre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Analyse des données – table à tracer des données à l’aide de MantidPlot. Données sont référencées comme « Espaces de travail » en MantidPlot. La zone de l’espace de travail sera remplie avec les noms de fichiers sont produits par le script de réduction de l’utilisateur. Données d’espace de travail pour les ensembles de données 1D peuvent être tracées par un clic droit sur l’espace de travail et en sélectionnant « Plot du spectre avec erreurs... ». Des données supplémentaires peuvent être ajoutées à l’intrigue actuelle par simple glisser / déposer des espaces de travail. Mise en forme de la fenêtre de tracé (par exemple, en ce qui concerne les parcelles logarithmique) peut être effectuée en sélectionnant « Préférences » dans la barre de menu « Affichage », ou un double-clic sur les étiquettes d’axe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9. Analyse des données – logiciel ATSAS : opérations de base et de la soustraction de tampon. L’application primusqt (analyse de données SAS) fournit la visualisation pour la soustraction de fond appropriée (tampon). Le fichier tampon devrait être dimensionnée pour la soustraction telle que les données se chevauchent à haute-Q (où diffusion est déchargée à la suite de signal restant de fond incohérent). Lorsque cette gamme haute-Q de données est sélectionnée, l’opération d’envergure s’appliquera un facteur d’échelle pour le fichier de données plus bas dans le tableau qui produit le chevauchement dans la région définie. Après la mise à l’échelle, le fichier de la mémoire tampon peut être soustraite pour obtenir le profil de diffusion nette de la particule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10. Analyse des données – Guinier et p (r) détermination (distribution des distances). (A) l’Assistant de Guinier Primus est utilisé pour effectuer une analyse de Guinier, fournissant une estimation initiale d’I0 et Rg. Le type de particule et la plage de données pour s’adapter sont utilisés pour définir l’ajustement. Une parcelle de l’ajustement et les résidus correspondants sont indiqués à gauche, tout en termes de Guinier (j’ai0 et R,g), limites deg Q * R et la qualité de l’ajustement linéaire sont fournis comme sortie dans la zone délimitée par la boîte orange. (B) l’Assistant Distribution de Distance Primus est utilisé pour effectuer l’analyse de distribution distance, fournissant la courbe p (r) qui définit la probabilité des distances interatomiques dans la particule de diffusion et comprend la Dmax ou maximale distance interatomique. Paramètres indiqués par la boîte orange peuvent être systématiquement analysés pour déterminer une fonction de distribution de bonne distance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11. Mauvais résultats de l’analyse de distribution distance. Un Dmax correctement sélectionné devrait produire une courbe p (r) qui culmine avec une décroissance progressive à zéro. Dmax valeurs trop grandes produira probablement des valeurs négatives de p (r) ou oscillations près de l’axe des abscisses à des valeurs élevées des valeurs de Dmax r qui sont artificiellement faible souvent entraînent courbes p (r), où la limite supérieure apparaît tronquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12
La figure 12. Modélisation – Ab initio les paramètres de modèle à l’aide de l’Assistant de forme Primus. Ab initio des paramètres de modélisation sont fournis dans un guichet d’entrée unique. Un préfixe est spécifié pour les noms de fichier de sortie avec d’autres options de traitement disponibles. Recuit de procédure peut être rapide (plus grandes perles avec un refroidissement plus rapide) ou lentes (petites perles avec un refroidissement plus lent). Nombre de répétitions doit être de dimensions suffisantes pour examiner la reproductibilité des caractéristiques du modèle. Anisométrie et symétrie de particules peuvent être fournis, si elle est connue. Échelle angulaire doit correspondre à des unités des données mesurées. DAMAVER en moyenne va aligner tous les modèles de l’atome factice en moyenne et puis appliquer un critère de sélection qui exclut tous les modèles atypiques. Un noyau des atomes fixes du modèle moyenne sera davantage affinées à l’aide de DAMMIN si cette option est sélectionnée. Ce modèle raffiné devrait représenter l’enveloppe basse résolution 3D de l’expérimental SANS profil. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 13
Figure 13. Visualisation – expérimentale SANS enveloppe et superposition avec modèle haute résolution avec PyMOL. Après avoir ouvert les fichiers de structure PDB à PyMOL, modèles apparaissent dans la visionneuse de PyMOL. Modèles actifs sont répertoriées dans le tableau à droite, ainsi que des boutons d’action qui peuvent être utilisées pour manipuler le modèle et sa représentation. Opérations de base sont fournies pour la visualisation de ces modèles qui permettent des régions de structure accord (ou décalage) entre l’enveloppe SANS et à haute résolution d’être identifié. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1. Propriétés physiques des détergents utilisés couramment dans les enquêtes de protéines membranaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Chercheurs de biologie structurale tirer parti des techniques structurelles complémentaires comme solution de diffusion pour obtenir des détails biochimiques et structurales (tels que la taille globale et la forme) de molécules en solution. SANS est une technique particulièrement attractive pour la détermination des structures de faible résolution des protéines membranaires, un objectif de base de biochimie et de biologie structurale moderne. SANS nécessite des quantités de protéines purifiées comparables à ceux des essais cristallographiques (1 mg/échantillon). La disponibilité commerciale récemment en expansion de haute pureté deutérées détergents aux études de protéine de membrane rend accessible un moyen de manipuler cet hydrogène/deutérium contenu pour SANS expériences des complexes protéine-détergent membranaires, permettant ainsi au signal de protéine à enregistrer directement. Lorsque réussie, une enveloppe moléculaire ab initio modèle peut être calculée à partir de données recueillies au cours de quelques heures. Ainsi, biochimistes de protéines membranaires, biophysiciens et biologistes structures peuvent facilement profiter de SANS obtenir convoités premiers modèles 3D de protéines membranaires, solution, structures en complexe avec liant les partenaires ou les substrats et les modèles obtenus par SANS peut être utilisé pour l’élimination des données de diffraction. L’utilisation systématique de San pour caractériser les protéines membranaires serait transformatrices pour le domaine de biochimie de protéines membranaires et ont des effets d’entraînement de la fonction de la structure de base pour la découverte et le développement. L’avantage supplémentaire de contraste de neutrons assortissant avec substitution de deutérium fait SANS une technique précieuse pour l’étude de protéine-protéine, protéine-ADN ou autres biomoléculaire complexes, qui peuvent être facilement manipulés dans leur teneur en hydrogène/deutérium.

Pour obtenir des détails supplémentaires sur la conception d’instruments de petits angles de diffusion et de la théorie, les examens suivants sont recommandés : le Bio-SANS instrument au haute Flux Isotope réacteur d’Oak Ridge National Laboratory,79 petits angles de diffusion pour biologie structurale – expansion de la frontière tout en évitant les pièges, les72 et les études de diffusion petits angles de macromolécules biologiques en solution. 80 the Scientist de diffusion de neutrons peut également discuter actuel instrument configurations et les paramètres optimaux pour un système donné. Par exemple, les données en Q inférieur (qui est fonction de la longueur d’onde diffusion angle et neutrons) sont généralement souhaitées pour les grands systèmes. La configuration la plus courante instrument à Bio-SANS fournit un Qmin de 0,003 Å-1 et est adapté aux plus grands complexes de protéine jusqu'à des centaines de kDa. Une solution contenant environ 3 mg mL-1 de protéine de la membrane d’une taille approximative de 30 kDa (monomère) dans des micelles assortie contraste avec 48,5 % D2O en solution exige un temps de mesure typique environ 8 heures chaque échantillon, tampon et cellule vide (24 heures = 1 jour de total). Fois de mesure instrument à une condition donnée contraste peuvent être redimensionnées environ selon le produit de la masse moléculaire de la particule de diffusion et de la concentration. Cependant, les particules de diffusion doivent être mesurées dans des conditions sans interaction, y compris toute agrégation de protéines non spécifiques, qui impose une limite supérieure pratique pour la concentration de l’échantillon. Une heure mesures imposent des limites à la stabilité de certaines protéines. Heureusement, SANS mesures peut être fait systématiquement à température réfrigérée pour améliorer la durée de vie de protéine, et le travailleur faisceau de neutrons de faible énergie ne provoque pas de dommages de rayonnement pendant la mesure.

Une vue d’ensemble de ce processus et de la détermination des nombreux facteurs clés vers l’enregistrement avec succès de la diffusion des neutrons dans un échantillon mesuré au point de correspondance contraste du détergent sont présentés dans ce manuscrit. Cela inclut l’étape critique pour obtenir une correspondance complète du détergent agrégée en concevant un mélange détergent avec un contraste de neutrons uniforme entre le groupe de tête détergent et éléments de la chaîne alkyle. Les mesures à ce point unique de match détergent fournissent un profil de diffusion attribuée à seulement la protéine membranaire d’intérêt et a permis une enveloppe ab initio , ce qui représente la protéine de la membrane pour être reconstruit à partir des données. L’analyse des données et ab initio modélisation des protocoles aussi illustrent les potentielles informations tirées de ces enquêtes, qui pourraient viser d’aborder la structure générale, les changements conformationnels, oligomères États, entre autres. Une seule limitation est que, à ce ne jour que très peu détergents sont commercialement disponibles avec des substitutions de deutérium. 19

Alors que l’irradiation ne sera ne peut-être pas nécessaire, dans ce cas devrait viser à atteindre une protéine avec > étiquetage de 65 % de deutérium dans la protéine. Alternativement, si détergent avec sélectivement deutéré queues et les groupes de tête est disponible et le CMP de la micelle de détergent se produit près de 100 % D2O, alors un contraste suffisant de la protéine peut être réalisé sans la nécessité pour l’étiquetage de deutérium. Déterminer le niveau de deutération appropriés de la protéine pour atteindre une diffusion suffisante lorsqu’elle est mesurée au point contraste-match du détergent. Il y a des nombreux défis associés à l’expression des protéines membranaires et de purification,81 qui restent au-delà de la portée de cet article. Malheureusement, des niveaux élevés de deutération ne sont actuellement pas (encore) possibles pour les systèmes eucaryotes. Alors que nous nous rendons compte qu'il s’agit d’une limitation pour certaines protéines eucaryotes, la plupart des protéines de membrane ont orthologues bactérienne pour laquelle cette méthode est appropriée.

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Disclosures

Les auteurs Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss et Ryan C. Oliver sont transigés par l’entremise de UT-Battelle avec US DOE pour soutenir le programme d’utilisateur Science neutronique et Bio-SANS instrument à Oak Ridge National Laboratory utilisés dans cet Article.

Ce manuscrit a été co-écrit par UT-Battelle, LLC, sous contrat DE-AC05-00OR22725 avec le nous Department of Energy (DOE). Le gouvernement américain maintient et le serveur de publication, par l’acceptation de l’article pour publication, reconnaît que le gouvernement américain conserve une licence non exclusive, versée, irrévocable, mondiale, pour publier ou reproduire le formulaire publié de ce manuscrit ou d’autoriser d’autres de le faire, aux fins de le gouvernement américain. DOE fournira l’accès du public à ces résultats de recherche parrainé par le gouvernement fédéral conformément au Plan de l’accès Public DOE. 82

Acknowledgments

L’Office of Biological and Environmental Research appuyé la recherche au centre de ORNL pour biologie moléculaire structurale (CSMB) et Bio-SANS en utilisant les équipements pris en charge par le scientifique à la Division des installations, le Bureau des Sciences fondamentales de l’énergie, le département américain de l’énergie. Travaux structurels sur les protéines de la membrane dans le laboratoire de Lieberman a été soutenu par les NIH (DK091357, GM095638) et NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

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