वर्दी समुच्चय का उत्पादन करने के लिए ओ के आकार का जहाजों में स्तनधारी कोशिकाओं की एक परिक्रमा मिलाते संस्कृति

Bioengineering
 

Summary

यहां हम ओ के आकार का जहाजों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, सेलुलर समुच्चय के निलंबन संस्कृतियों के लिए विशेष, कक्षीय मिलाते के साथ । HEK293 इस बैग में उगाई कोशिकाओं पारंपरिक संस्कृति वाहिकाओं में बड़े लोगों की तुलना में अधिक सजातीय समुच्चय फार्म ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Horiguchi, I., Suzuki, I., Morimura, T., Sakai, Y. An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates. J. Vis. Exp. (143), e57922, doi:10.3791/57922 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

स्तनधारी सेल समुच्चय के निलंबन संस्कृतियों चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकी क्षेत्रों में विभिंन अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं । डिस्पोजेबल बैग आधारित विधि सेलुलर समुच्चय के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए सरलतम तकनीकों में से एक है, लेकिन यह अधिक एकत्रीकरण के खिलाफ संस्कृतियों की रक्षा नहीं करता है, जो तब होता है जब वे संस्कृति पोत के नीचे केंद्र में इकट्ठा । इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक ओ के आकार का पकवान और एक ओ के आकार का बैग विकसित की है, जो न तो एक केंद्रीय क्षेत्र शामिल हैं । या तो ओ के आकार का संस्कृति पोत में उगाया समुच्चय पारंपरिक जहाजों में बड़े समुच्चय से आकार में अधिक समान रूप से थे । ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण से पता चला है कि पारंपरिक संस्कृति व्यंजन में समुच्चय निहित सबसे एक गरीब ऑक्सीजन की आपूर्ति के कारण होने की संभावना कोर समाहित । इसके विपरीत, समुच्चय है कि ओ के आकार का बैग में बड़े हो रहे थे, यहां तक कि पारंपरिक संस्कृति व्यंजन में समुच्चय के समान व्यास के साथ उन, गल कोर नहीं दिखा था । इन परिणामों का सुझाव है कि ओ के आकार का बैग बैग सामग्री की ऑक्सीजन पारगम्यता के कारण समुच्चय को पर्याप्त ऑक्सीजन प्रदान करता है । हम, इसलिए, प्रस्ताव है कि इस उपंयास गैस पारगंय ओ के आकार का संस्कृति बैग समान समुच्चय है कि विभिंन क्षेत्रों में प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में आवश्यक है की बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उपयुक्त है ।

Introduction

निलंबन सेल संस्कृति regenerativeी दवा1 और रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन2 के लिए सेल उत्पादन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि यह पैमाने अप करने के लिए आसान है और उच्च कोशिका घनत्व को प्राप्त करने, कभी 10 से अधिक7 कोशिकाओं तक/ एमएल5. चीनी हंसटर अंडाशय (चो)3 कोशिकाओं और मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं २९३ (HEK293)4 निलंबन संस्कृति में उगाया गया है, और मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) हाल ही में अपक्षय के लिए निलंबन संस्कृति प्रणालियों में उगाया गया है चिकित्सा1,6,7। निलंबन संस्कृतियों के प्रयोग से भविष्य में वृद्धि होने की उम्मीद है ।

निलंबन संस्कृति में, कुछ कक्ष रेखाएं एकल कक्षों के रूप में विकसित नहीं हो सकतीं और इसलिए, प्रपत्र समुच्चय । उदाहरण के लिए, hPSCs समुच्चय के गठन के बिना निलंबन की स्थिति में जीवित नहीं रह सकते । हालांकि, समग्र विकास के लिए इस आवश्यकता वर्दी निलंबन संस्कृतियों के लिए कठिनाइयों प्रस्तुत करता है । एक कठिनाई संस्कृति है, जो निलंबन संस्कृति8की दक्षता निर्धारित करता है की प्रारंभिक अवधि में वर्दी समुच्चय का गठन है । एक अंय कठिनाई समुच्चय में पोषक तत्वों की सामूहिक हस्तांतरण है । विशेष रूप से, ऑक्सीजन की आपूर्ति समुच्चय के अधिकतम आकार को सीमित करता है, और एक गरीब ऑक्सीजन की आपूर्ति के केंद्र में परिगलन का कारण बनता है9. नतीजतन, सेल समुच्चय के निलंबन संस्कृतियों और अधिक पारंपरिक निलंबन संस्कृतियों से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हैं । फिर भी, निलंबन संस्कृतियों बायोमेडिकल और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

कक्षीय मिलाते जहाजों सरल निलंबन संस्कृति प्रणालियों में से एक है कि उत्तेजित देनेवाला आंदोलन के बिना संस्कृति मध्यम मिश्रण प्राप्त कर रहे हैं । उत्तेजित करनेवाला और गतिशील मध्यम प्रवाह से कतरनी तनाव निलंबन संस्कृति की प्रमुख समस्या है क्योंकि यह कोशिका क्षति और भेदभाव का कारण बनता है । एक कम कतरनी तनाव के साथ आंदोलन को प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं और उद्योगों कक्षीय मिलाते पोत प्रणाली2,10की एक किस्म विकसित की है ।

हालांकि, पारंपरिक संस्कृति वाहिकाओं कक्षीय मिलाते संस्कृतियों के लिए तैयार नहीं हैं । कक्षीय मिलाते जहाजों में, कोशिकाओं के मध्य-जहाजों के नीचे की ओर झुकना मध्यम प्रवाह के एक प्रकार के "आइंस्टीन चाय पत्ती विरोधाभास"11के रूप में जाना जाता है, जो कोशिकाओं के सजातीय एकत्रीकरण का कारण बनता है । परिपत्र प्रवाह, एक केंद्रापसारक बल और संस्कृति मध्यम और एक पोत के बीच एक घर्षण के कारण होता है, केंद्र में राज्यभर कोशिकाओं11,12। इसके अलावा, बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए पारंपरिक संस्कृति बैग वर्ग के आकार के हैं, जो कक्षा में मिलाने के लिए उपयुक्त नहीं है ।

इस अध्ययन में, हम एक उपंयास संस्कृति एक कक्षा मिलाते संस्कृतियों के लिए उपयुक्त बैग विकसित की है । इस बैग की नवीनता इसकी हे आकार है जो एक केंद्र क्षेत्र नहीं है, तो कोशिकाओं को नीचे केंद्र क्षेत्र में सभा से रोका जाता है । हम भी एक HEK293 संस्कृति के साथ इन जहाजों की हैंडलिंग का प्रदर्शन किया है के लिए इन थैलियों की संभावना को प्रदर्शित करने के लिए प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों ।

Protocol

1. कोशिकाओं और सामग्री की तैयारी

  1. एक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम में HEK293 कोशिकाओं की खेती । ६.८-७.६ के लिए संस्कृति माध्यम के पीएच समायोजित करें ।
  2. 5 से 7 डी के लिए संवर्धन के बाद, अलग कर देना कोशिकाओं को ०.२५% trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड समाधान (trypsin-EDTA) और कोशिकाओं को पुनर्बीज 5000-10000 कोशिकाओं/

2. एक ओ के आकार का बैग में कोशिकाओं सीडिंग

  1. अलग कर देना चरण १.२ में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को और उंहें 2-5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में resuspend ।
  2. किसी एकल कक्ष निलंबन को एकत्रित करने के लिए कक्ष का निलंबन एक सेल छलनी (४० µm) के माध्यम से फ़िल्टर करें ।
  3. trypan ब्लू धुंधला और स्वचालित सेल काउंटर द्वारा कोशिकाओं की संख्या की गणना, और फिर सेल निलंबन की 20 मिलीलीटर तैयार (२.० x 105 कोशिकाओं/एमएल) ।
  4. एक गोताख़ोर बिना एक clamped ५० मिलीलीटर सिरिंज के लिए ओ के आकार का बैग (आंकड़ा 1a) के प्रवेश से कनेक्ट करें ।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध छवियों और ओ के आकार वाहिकाओं के चित्र । (a1) यह एक ओ के आकार का बैग के एक योजनाबद्ध छवि है । (a2) यह एक ओ के आकार का बैग की एक तस्वीर है । (b1) यह एक ओ के आकार का पकवान की एक योजनाबद्ध छवि है । (b2) यह एक ओ के आकार का पकवान की एक तस्वीर है । ओ के आकार का बैग के बाहरी और भीतरी व्यास क्रमशः ९० मिमी और 20 मिमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. पिपेट ने तैयार सेल सस्पेंशन को ओ-आकार के बैग में clamped सिरिंज के माध्यम से किया ।
  2. एक साफ सिरिंज के साथ पहले clamped सिरिंज बदलें । साफ सिरिंज के माध्यम से साफ हवा के ५५ मिलीलीटर जोड़ने के लिए पूरी तरह से बैग का विस्तार ।
  3. प्रवेश ट्यूब दबाना और फिर प्रवेश बंद । अंत में, ट्यूब से दबाना निकालें ।
  4. उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2की स्थिति में ४५ rpm पर मिलाते हुए ओ के आकार का बैग में कोशिकाओं को मशीन ।

3. मध्यम परिवर्तन (वैकल्पिक)

  1. प्रवेश के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  2. यह 2 मिनट के लिए २०० x g पर कमरे के तापमान पर, और फिर supernatant महाप्राण ।
  3. संस्कृति मध्यम के 20 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं resuspend ।
  4. चरण २.४-२.७ का पालन करते हुए ओ-आकार बैग करने के लिए resuspend कक्षों जोड़ें ।
  5. उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2की स्थिति में ४५ rpm पर मिलाते हुए ओ के आकार का बैग में कोशिकाओं को मशीन ।

4. बैग से कोशिकाओं को इकट्ठा

  1. प्रवेश के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  2. कैल्शियम की 20 मिलीलीटर के साथ बैग के अंदर धोने/मैग्नीशियम-मुक्त फास्फेट बफर खारा [पंजाब (-), पीएच = ७.४-७.६] और फिर बैग से शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक ट्यूब में सामग्री नाली ।
  3. कमरे के तापमान पर २०० x g पर 3 मिनट के लिए एकत्र सेल निलंबन केंद्रापसारक, और फिर supernatant महाप्राण ।
  4. पंजाब (-) के 10 मिलीलीटर जोड़ें और समुच्चय धो लो ।
  5. उंहें कमरे के तापमान पर २०० x g पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक, और फिर महाप्राण supernatant इकट्ठा करने के लिए समुच्चय ।
  6. पंजाब के 4 मिलीलीटर और trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए समुच्चय के साथ मशीन (वैकल्पिक) गिनती के लिए कोशिकाओं अलग कर देना ।

5. एक ओ के आकार का पकवान की तैयारी (वैकल्पिक)

नोट: ओ के आकार का पकवान की एक योजनाबद्ध छवि के लिए चित्र 1b देखें ।

  1. एक गर्म चाकू के साथ एक ६० mm या ३५ mm पकवान के नीचे कट और एक आंतरिक पकवान के रूप में उपयोग ।
  2. ६० mm डिश उल्टा एक १०० mm डिश के केंद्र पर रखो ।
    नोट: एक गाइड शीट के लिए ६० mm डिश की स्थिति तय करने में मदद कर सकते हैं ।
  3. यदि आवश्यक हो, ६० mm पकवान के अंदर से संयोजिका पर चिपचिपापन समायोजित cyclohexanone रखो ।
  4. कुछ दिनों के लिए ओ आकार के पकवान सूखी और यह गामा रे या ईथीलीन ऑक्साइड गैस द्वारा निष्फल ।

Representative Results

हमारे माप के अनुसार, पारंपरिक पकवान में उगाया समुच्चय कक्षीय मिलाते के 5 डी के बाद व्यास विविध था । इसके विपरीत, समुच्चय ओ में उगाया-आकार वाहिकाओं के लिए 5 डी बहुत अधिक वर्दी व्यास था । पारंपरिक पकवान संस्कृति छोटे समुच्चय दिखाया (५०-२०० µm), जबकि ओ के आकार वाहिकाओं में संस्कृतियों के किसी भी छोटे समुच्चय (चित्रा 2a) शामिल नहीं था । छवि आधारित आकार माप के अनुसार, पारंपरिक पकवान संस्कृति दो अलग चोटियों (चित्रा 2b1), समग्र आकार का एक व्यापक विचलन का संकेत दिखाया । यह परिणाम निहित है कि पारंपरिक पकवान में समुच्चय एक ही संस्कृति है, जो विषम कोशिका गुणवत्ता में परिणाम सकता है में दो अलग शर्तों के तहत बढ़ रहे थे । दूसरी ओर, ओ के आकार के जहाजों में समुच्चय एक चोटी और पारंपरिक पकवान (चित्रा2 बी और 2b3) में उन से व्यास में कम विचलन दिखाया, सुझाव है कि इस तरह के समुच्चय और अधिक समान गुणवत्ता का हो सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2: Morphologies और विभिन्न जहाजों में उगाई समुच्चय के व्यास. इन पैनलों (a) brightfield छवियां और () या तो (a1 और b1) एक पारंपरिक पकवान, (a2 और b2) एक ओ के आकार का पकवान, या (a3 और b3) एक ओ के आकार का बैग में हो समुच्चय के हिस्टोग्राम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Hematoxylin और eosin कुल पार के दाग-वर्गों से पता चला है कि पारंपरिक पकवान में उगाया समुच्चय कुछ denucleated कोशिकाओं और गल कोर (आंकड़ा 3ए) था । हालांकि, ओ के आकार का जहाजों में उगाया समुच्चय किसी भी गल कोर (चित्र 3बी और सी ) नहीं दिखा था । विशेष रूप से, ओ के आकार का बैग में उगाया समुच्चय पारंपरिक पकवान में उन के रूप में बड़े थे अभी तक किसी भी गल कोर (आंकड़ा 3सी) नहीं था । इन परिणामों ने सुझाव दिया कि गैस-पारगंय बैग संस्कृति को पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति की.

Figure 3
चित्रा 3: पार विभिंन जहाजों में समुच्चय के वर्गों । क्रॉस-सेक्शन 12 µm मोटी हैं और जमे हुए नमूनों से तैयार किए गए थे । वर्गों hematoxylin और eosin के साथ दाग थे कोशिकाओं कल्पना । () एक पारंपरिक निलंबन संस्कृति में उगाई गई कोशिका समुच्चय में पाई गई कोर दिखाई देती है । सेल समुच्चय या तो में हो () एक ओ के आकार का पकवान या () एक ओ के आकार का बैग उनकी कोर में बहुत कम परिगलन दिखाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सेल गिनती से पता चला कि कोशिकाओं के ८५% से अधिक निलंबन संस्कृति के 5 डी के लिए प्रत्येक पोत में जीवित (चित्र 4a) । अंतिम सेल घनत्व लगभग १.५-२.० x 106 कोशिकाओं/ हालांकि कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, ओ के आकार का बैग में वृद्धि अनुपात अंय जहाजों (चित्रा 4b) में उन लोगों की तुलना में अधिक था । पारंपरिक पकवान में कोशिकाओं की विशिष्ट वृद्धि दर, ओ के आकार का पकवान, और दिन के बीच ओ आकार का बैग 2 और दिन 5 थे ०.०१८, ०.०२५, और ०.०२० एच-1, क्रमशः ।

Figure 4
चित्रा 4: कोशिका व्यवहार्यता और विकास । इन पैनलों () सेल व्यवहार्यता और () संस्कृति के 2 डी (दिन 2) और संस्कृति के 5 डी के बाद विभिंन संस्कृति वाहिकाओं में HEK293 कोशिकाओं के सेल घनत्व (5 दिवस) दिखा । दिखाए गए मान 3 स्वतंत्र प्रयोगों से परिणामों के माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रत्येक प्रयोग के लिए मान एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिना trypan नीले दाग कोशिकाओं से गणना की गई । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक चित्रा 1: विभिंन झटकों की स्थिति में 2 अलग पकवान स्वरूपों में मनका वितरण । इस पैनल के विभिंन झटकों की स्थिति (30, ४०, और ४५ rpm) के दौरान मनका वितरण से पता चलता है एक पारंपरिक और ओ के आकार का पकवान में । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

इस अध्ययन में, हम ओ के आकार का जहाजों विकसित की है और एक समान समुच्चय गठन और विस्तार के लिए उन में एक HEK293 निलंबन संस्कृति का प्रदर्शन किया । पारंपरिक संस्कृति पकवान में, एक कक्षीय मिलाते हुए संस्कृति समुच्चय के दो अलग व्यास का उत्पादन किया, जबकि हम ओ के आकार का जहाजों में समान समुच्चय (चित्रा 1) मनाया । कक्षीय मिलाते हुए शर्तों में दाग मोती के वितरण के अवलोकन के अनुसार, मोती एक पारंपरिक संस्कृति पकवान के केंद्र-तल में इकट्ठा । वह सभा संभवतः सेल घनत्व में अंतर समुच्चय के विभिंन आकारों के लिए अग्रणी कारण । वैकल्पिक रूप से, मोती ओ के आकार का पकवान है जो केंद्र-नीचे क्षेत्र (पूरक चित्रा 1) नहीं है में वितरित किया गया । यह वितरण संभवत: ओ-आकार के जहाजों में समान रूप से आकार के समुच्चय का कारण बनता है । एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया-समान समुच्चय के उत्पादन के लिए दृष्टिकोण microwells में संवर्धन है, लेकिन इस दृष्टिकोण इस तरह के समग्र microwells13से बाहर छोड़ने के बिना एक संस्कृति माध्यम की आपूर्ति में के रूप में कुछ समस्याओं, है । ओ के आकार का जहाजों के मामले में, एक सरल निलंबन संस्कृति में समान समुच्चय का उत्पादन किया जा सकता है ।

कक्षीय मिलाते हुए संस्कृति एक लोकप्रिय संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं के लिए उपयोग प्रणाली है । वहां स्तनधारी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए विभिंन संस्कृति तरीके हैं, जैसे हड़कंप टैंक के रूप में14, वेव-गति बैग15, और घूर्णन बोतलें । कक्षीय मिलाते संस्कृतियों मध्यम सरगर्मी के लिए एक भीतरी उत्तेजित देनेवाला शामिल नहीं है, हड़कंप टैंक के विपरीत प्रतिक्रिया करता है । यह फीचर वेव-प्रमोशन्ड बैग्स और रोटेटिंग बॉटल्स के समान है । ये उत्तेजित करनेवाला मुक्त संस्कृति प्रणालियों उत्तेजित करनेवालों आसपास के कतरनी बल से सेलुलर नुकसान से बचने और निलंबन संस्कृति में कम कतरनी तनाव का एहसास कर सकते हैं । विशेष रूप से, कक्षीय मिलाते हुए संस्कृति प्रणालियों क्योंकि उनके उच्च दरिद्रता और कम कतरनी तनाव के स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में संवेदनशील कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए प्रभावी रहे हैं ।

ओ के आकार का जहाजों समुच्चय के गठन में कक्षीय मिलाते हुए संस्कृति की शेष समस्या में सुधार कर सकते हैं । कक्षीय मिलाते हुए संस्कृति प्रणालियों में, फ्लोटिंग कोशिकाओं के केंद्र और पोत है, जो "आइंस्टीन चाय पत्ती विरोधाभास"11के रूप में जाना जाता है के नीचे की ओर पलायन । यह माइग्रेशन पारंपरिक परिक्रमा मिलाने वाले जहाजों में सजातीय एकत्रीकरण और गैर-एकरूप कुल उत्पादन का कारण बनता है । इस अध्ययन में, ओ के आकार का जहाजों के केंद्र में कोशिकाओं की एकाग्रता को रोका जहाजों के नीचे, जो कक्षा में वर्दी एकत्रीकरण के कारण के रूप में अटकलें है ओ के आकार का जहाजों ।

ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण से पता चला कि पारंपरिक पकवान में समुच्चय denucleated कोशिकाओं (चित्रा 2a) निहित । इसके विपरीत, denucleated कोशिकाओं को ओ के आकार का जहाजों (चित्रा 2 बी और 2c) से समुच्चय में दिखाई नहीं दिया । यह संभव है कि इन denucleated कोशिकाओं सब्सट्रेट की कमी के कारण थे जैसे ग्लूकोज, glutamine, और ऑक्सीजन9. आकार माप के अनुसार, ओ के आकार का जहाजों में समुच्चय ४०० µm से कम सजातीय व्यास था । इसके विपरीत, एक पारंपरिक पकवान में, कुछ समुच्चय एक व्यास ४०० µm से बड़ा था, और इन समुच्चय denucleated कोशिकाओं को शामिल किया । इस परिणाम से पता चलता है कि ओ के आकार का जहाजों में सजातीय आकार समुच्चय बनाने समुच्चय की गुणवत्ता को नियंत्रित करने में प्रभावी है । इसके अलावा यह भी अटकलें लगाई जा रही हैं कि गैस-पारगंय पॉलीथीन फिल्म के जरिए ऑक्सीजन ने ओ-आकार के थैले में denucleated कोशिकाओं की शक्ल को रोका ।

इन प्रयोगों ने समान समुच्चय के उत्पादन के लिए एक सरल प्रणाली के रूप में इन ओ के आकार वाहिकाओं की संभावना को दिखाया । हालांकि निलंबन संस्कृति के लिए अंय संस्कृति बैग15विकसित किया गया है, उन संस्कृति बैग वर्ग के आकार का है, जो हो रही से संस्कृति रोकता है प्रभावी ढंग से मिलाते हुए कक्षा में मिलाया । इस अध्ययन में बैग एक सजातीय आकार के साथ समुच्चय का उत्पादन करने के लिए परिक्रमा मिलाते के लिए एक उपंयास गोल आकार उपयुक्त है । जहाजों की इस विशेषता की स्थिति और बड़े पैमाने पर उत्पादन में कोशिकाओं के उच्च reproducibility को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । ओ के आकार का पोत के संभावित आवेदन व्यापक है । यह इस्तेमाल किया जा सकता है जब कोशिकाओं से रिकॉमबिनेंट प्रोटीन का उत्पादन और अपक्षयी दवा के लिए जब स्टेम सेल से निपटने ।

अंत में, हम एक उपंयास ओ के आकार का एक कक्षा मिलाते संस्कृति के साथ वर्दी सेल समुच्चय के उत्पादन के लिए उपयुक्त बैग विकसित की है । बैग ऐसी अपक्षयी दवा के रूप में विभिंन जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए संभावनाओं से पता चलता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

इस शोध FUKOKU, कं, लिमिटेड तकाओ योशिदा से FUKOKU, कं, लिमिटेड के साथ सहयोग द्वारा समर्थित है ओ आकार संस्कृति बैग के विचार प्रदान की है । FUKOKU, कं, लिमिटेड से Takamasa सातो ने ओ के आकार का कल्चर बैग विकसित करने के लिए गणनात्मक सिमुलेशन के संदर्भ में इस शोध का समर्थन किया । हम इसी लेखक की वर्तमान संबद्धता की सराहना करना चाहते हैं, ओसाका विश्वविद्यालय, हमें प्रकाशन पर काम करने के लिए अनुमति देने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 RIKEN Bio resorce centre RCB1637
DMEM, high glucose, pyruvate GIBCO 11995040
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions GIBCO 10437-028
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X GIBCO 11140050
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO 25200056
Dulbecco's PBS (–) Cell Science & Technology Institute 1102P05
Cell Strainer 40µm CORNING 352340
50 mL Syringe TERUMO SS-50ESZ
Shaker AS ONE 2-1987-02
Centrifuge Tube 50 mL AS ONE 1-3500-02
Automated cell counter BioRad TC20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mihara, Y., et al. Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, (11), 3193-3201 (2017).
  2. Raven, N., et al. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 112, (2), 308-321 (2015).
  3. Han, Y., et al. Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. Journal of Bioscience and Bioengineering. 102, (5), 430-435 (2006).
  4. Portolano, N., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).
  5. Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science. 164, (3879), 555-557 (1969).
  6. Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells. Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).
  7. Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 4, (3), 165-179 (2010).
  8. Horiguchi, I., Sakai, Y. Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture. Biotechnology Progress. 32, (4), 1009-1016 (2016).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46, (10), 5320-5329 (1986).
  10. Hang, H., et al. Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16, (3), 567-575 (2011).
  11. Einstein, A. The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law. Die Naturwissenschaften. 14, (1926).
  12. Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere. The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).
  13. Miyamoto, D., Nakazawa, K. Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture. Journal of Bioscience and Bioengineering. 122, (4), 507-512 (2016).
  14. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18, (10), 772-784 (2012).
  15. Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics