Une orbitale secouant la Culture des cellules de mammifères dans les vaisseaux en forme de O pour produire des agrégats uniformes

Bioengineering
 

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de vaisseaux en forme de O, spécialisés pour les cultures en suspension d’agrégats cellulaires, avec agitation orbitale. Les cellules HEK293 cultivés dans ce sac forment plusieurs agrégats homogènes que ceux cultivés dans des récipients de culture conventionnelle.

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Horiguchi, I., Suzuki, I., Morimura, T., Sakai, Y. An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates. J. Vis. Exp. (143), e57922, doi:10.3791/57922 (2019).

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Abstract

Cultures en suspension des agrégats de cellules de mammifères sont requis pour des applications diverses dans les domaines médicales et biotechnologiques. La méthode axée sur le sac jetable est une des techniques plus simples pour la production en masse des agrégats cellulaires, mais il ne protège pas les cultures contre l’agrégation excessive, qui se produit quand ils se réunissent en bas au centre du navire la culture. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un plat en forme de O et un sac en forme de O, dont aucune ne contient une région centrale. Agrégats cultivées dans deux navires en forme de O culture étaient sensiblement plus uniformes en taille que les agrégats cultivés dans les navires conventionnels. Les analyses histologiques ont montré qui regroupe dans les plats classiques de la culture contenaient nécrotiques noyaux très probablement causée par une alimentation pauvre en oxygène. En revanche, agrégats qui ont été cultivés dans le sac en forme de O, même ceux avec des diamètres semblables aux agrégats dans les plats classiques de la culture, n’ont pas montré de carottes nécrotiques. Ces résultats suggèrent que le sac en forme de O fournit suffisamment d’oxygène pour les agrégats en raison de la perméabilité à l’oxygène de la pellicule. Nous proposons donc que ce sac roman perméable au gaz en forme de O culture est adapté à la production en masse des agrégats uniformes qui sont nécessaires dans différents domaines biotechnologiques.

Introduction

Culture en suspension cellulaire joue un rôle important dans la production de cellules pour la médecine régénérative1 et recombinant protein production2 car il est facile d’intensifier et d’atteindre la densité cellulaire élevée, parfois jusqu'à plus de 10 cellules de7 / mL5. Cellules d’ovaires de hamster chinois (CHO)3 rein embryonnaire humain cellules 293 (HEK293)4 ont été cultivées en suspension et les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont récemment été cultivés dans les systèmes de culture de suspension pour régénératrice thérapies1,6,7. L’utilisation de cultures en suspension devrait augmenter à l’avenir.

Dans la culture en suspension, certaines lignées de cellules ne peuvent pas se développer comme cellules individuelles et doivent, par conséquent, forment des agrégats. Par exemple, hPSCs ne peut pas survivre dans des conditions de suspension sans former des agrégats. Toutefois, cette exigence pour la croissance agrégée présente des difficultés pour les cultures en suspension uniforme. Une des difficultés est la formation d’agrégats uniformes dans le début de la période de la culture, qui détermine l’efficacité de la culture de suspension8. Une autre difficulté est le transfert de masse d’éléments nutritifs en agrégats. En particulier, l’apport d’oxygène limite la taille maximale des agrégats, et une alimentation pauvre en oxygène provoque des nécroses dans le centre de granulats9. En conséquence, les cultures en suspension d’agrégats cellulaires sont plus difficiles à obtenir que les cultures de suspension classique. Néanmoins, les cultures en suspension sont cruciales pour biomédicale et applications de la biotechnologie.

Orbitales secouant navires sont un des systèmes de culture plus simples suspension qui atteignent les mélanges de milieu de culture sans agitation de roue. Contrainte de cisaillement de la turbine et le flux du fluide dynamique est le problème majeur de la culture en suspension car elle provoque la différenciation et des dommages cellulaires. Pour atteindre l’agitation avec une contrainte de cisaillement inférieure, chercheurs et industries ont mis au point une variété de navire de secousse orbitale systèmes2,10.

Toutefois, les récipients de culture conventionnelle ne sont pas conçus pour l’orbitale secouant les cultures. Dans l’orbitale secouant les vaisseaux, cellules gravitent vers centre-bas des vaisseaux par un type de débit moyen, connu comme le « thé d’Einstein leaf paradox »11, ce qui provoque l’agrégation inhomogène des cellules. Le flux circulaire, causé par une force centrifuge et la friction entre le milieu de culture et d’un navire, balaie les cellules dans le centre11,12. En outre, sacs de culture conventionnelle pour la culture de masse sont en forme de carré, qui n’est pas adapté pour secouer les orbitales.

Dans cette étude, nous avons développé un sac de culture roman adapté aux orbitales secouant les cultures. La nouveauté de ce sac est sa forme-O qui n’a pas un centre de la région, donc les cellules sont voient empêchés de rassemblement dans la région de centre du fond. Nous avons aussi démontré la manipulation de ces navires avec une culture HEK293 de démontrer la possibilité de ces sacs pour applications biotechnologiques.

Protocol

1. préparation des cellules et des matériaux

  1. Cultiver les cellules HEK293 en milieu d’Eagle modifié de Dulbecco avec un 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) et 1 % des acides aminés non essentiels. Ajuster le pH du milieu de culture à 6,8-7,6.
  2. Après mise en culture pendant 5 à 7 jours, se dissocient les cellules avec une solution acide de 0,25 % trypsine-tétraacétique (EDTA-trypsine) et réensemencer les cellules à 5 000-10 000 cellules/cm2.

2. les cellules dans un sac en forme de O l’ensemencement

  1. Dissocier les cellules comme indiqué au point 1.2 et les remettre en suspension dans 2 à 5 mL de milieu de culture.
  2. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de la cellule (40 µm) pour recueillir une suspension monocellulaire.
  3. Compter le nombre de cellules par une coloration bleu trypan et compteur de cellules automatique et préparer ensuite 20 mL de la suspension cellulaire (2,0 x 105 cellules/mL).
  4. Se connecter à l’entrée du sac en forme de O (Figure 1 a) à une seringue cramponné 50 mL sans un piston.

Figure 1
Figure 1 : schémas images et photos de vaisseaux en forme de O. (a1) Il s’agit d’une image schématique d’un sac en forme de O. (a2) Il s’agit d’une photo d’un sac en forme de O. (b1) Il s’agit d’une image schématique d’un plat en forme de O. (b2) Il s’agit d’une photo d’un plat en forme de O. Le diamètre extérieur et l’intérieur du sac en forme de O sont de 90 mm et 20 mm, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Pipetter la suspension cellulaire préparés dans le sac en forme de O les attaches d’une seringue.
  2. Remplacez la première seringue enserrée par une seringue propre. Ajouter 55 mL d’air pur grâce à la propre seringue d’élargir le sac complètement.
  3. Serrer le tube d’aspiration, puis fermez l’entrée. Enfin, retirer la bride du tube.
  4. Incuber les cellules dans le sac en forme de O par les secousses à 45 tr/min dans des conditions de 37 ° C et 5 % de CO2.

3. moyen changement (facultatif)

  1. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 50 mL par le biais de l’entrée.
  2. Il centrifuger pendant 2 min à 200 x g à la température ambiante et puis aspirer le surnageant.
  3. Ajouter 20 mL de milieu de culture et remettre les cellules en suspension.
  4. Ajouter les cellules resuspendues dans le sac en forme de O par étapes suivantes 2.4-2.7.
  5. Incuber les cellules dans le sac en forme de O par les secousses à 45 tr/min dans des conditions de 37 ° C et 5 % de CO2.

4. recueillir les cellules du sac

  1. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 50 mL par le biais de l’entrée.
  2. Laver l’intérieur du sac avec 20 mL de tampon phosphate sans calcium/magnésium saline [PBS(-), pH = 7,4 à 7,6] et puis vider le contenu dans un tube à recueillir les cellules restantes du sac.
  3. Centrifuger la suspension de cellules recueillies pendant 3 min à 200 x g à la température ambiante et puis aspirer le surnageant.
  4. Ajouter 10 mL de PBS(-) et laver les agrégats.
  5. Les centrifuger pendant 3 min à 200 x g à la température ambiante et puis aspirer le surnageant pour collecter les agrégats.
  6. Ajouter 4 mL de PBS et 1 mL de la trypsine et les incuber avec les agrégats pendant 10 min à 37 ° C, de dissocier les cellules de comptage (en option).

5. préparation d’un plat en forme de O (facultatif)

Remarque : Voir la Figure 1 b pour une image schématique du plat en forme de O.

  1. Découper le fond d’un plat de 60 mm ou 35 mm avec un couteau chaud et l’utiliser comme un plat intérieur.
  2. Mettre le plat 60 mm à l’envers sur le centre d’un plat de 100 mm.
    NOTE : Une feuille guide peut aider à déterminer la position de l’antenne de 60 mm.
  3. Si nécessaire, mettre cyclohexanone viscosité-rectifiée sur la commissure de l’intérieur du plat de 60 mm.
  4. Sécher le plat en forme de O pendant quelques jours et stériliser par gaz d’oxyde d’éthylène ou de rayons gamma.

Representative Results

Selon nos mesures, agrégats cultivés dans le plat traditionnel avaient varié de diamètres après 5 jours d’agitation orbitale. En revanche, agrégats cultivés dans des récipients en forme de O pour 5D avaient beaucoup plus de diamètre uniforme. La culture conventionnelle plat a montré des petits agrégats (50 à 200 µm), alors que les cultures dans les vaisseaux en forme de O ne contenait pas de tout petits agrégats (Figure 2 a). Selon la mesure de la taille basée sur les images, la culture classique plat a montré deux crêtes différentes (Figure 2 b 1), indiquant un large écart de taille des granulats. Ce résultat implique qu’agrégats dans le plat traditionnel croissaient dans deux conditions différentes dans la même culture, qui pourraient résulter en qualité de cellules hétérogènes. En revanche, agrégats dans les vaisseaux en forme de O a montré un pic unique et moins de déviation de diamètre que celles dans le plat traditionnel (Figure 2 b2 et 2 b 3), ce qui suggère que ces agrégats peuvent être d’une qualité plus uniforme.

Figure 2
Figure 2 : diamètres des agrégats cultivés dans divers bâtiments et Morphologies. Ces panneaux montrent des images de fond clair (un) et histogrammes (b) des agrégats cultivés dans les deux (a1 et b1), un classique plat (a2 et b2) un O en forme de plat, ou (a3 et b3) un sac en forme de O. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Hématoxyline et éosine la coloration des coupes globales ont montré qu’agrégats cultivés dans le plat traditionnel des cellules énucléés et carottes nécrotiques (Figure 3 a). Cependant, agrégats cultivés dans des récipients en forme de O n’a pas montré les noyaux nécrotiques (Figure 3 b et 3C). En particulier, agrégats cultivés dans le sac en forme de O étaient aussi grands que ceux dans le plat conventionnel mais n’avaient pas de n’importe quel carottes nécrotiques (Figure 3C). Ces résultats suggèrent que le sac perméable au gaz fourni assez d’oxygène à la culture.

Figure 3
Figure 3 : coupes transversales d’agrégats dans divers vaisseaux. Les sections 12 µm d’épaisseur et ont été préparées à partir d’échantillons congelés. Les sections ont été colorées à l’hématoxyline et éosine pour visualiser les cellules. (a) la cellule granulats grandis dans une culture de la suspension classique a montré carottes nécrotiques. Agrégats de cellules cultivées en soit (b) un plat en forme de O ou (c), un sac en forme de O ont montré une nécrose très peu dans leurs cœurs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nombre de cellules ont montré que plus de 85 % des cellules ont survécu pendant 5 jours de culture en suspension dans chaque récipient (Figure 4 a). La densité cellulaire finale a été d’environ 1,5 à 2,0 x 106 cellules/mL. Bien qu’il n’y avait pas de différence significative, le taux de croissance dans le sac en forme de O était plus élevé que celles des autres navires (Figure 4 b). Le taux de croissance spécifique des cellules dans le plat traditionnel, le plat en forme de O et le sac en forme de O entre les jours 2 et 5 ont été 0,018 et 0,025 0,020 h-1, respectivement.

Figure 4
Figure 4 : viabilité et la croissance des cellules. Ces panneaux montrent la (une) cellule viabilité et (b) densité cellulaire des cellules HEK293 dans divers récipients de culture après 2 jours de culture (2e jour) et 5D de la culture (jour 5). Les valeurs indiquées représentent la moyenne des résultats de 3 expériences indépendantes. Les valeurs pour chaque expérience ont été calculées à partir de cellules bleu trypan comptées avec un compteur de cellule automatique. Les barres d’erreur indiquent la déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : distribution en 2 formats différents plat dans diverses conditions de secousses de billes. Ce panneau montre la distribution de perle au cours de diverses conditions d’agitation (30, 40 et 45 tr/min) dans un plat classique et en forme de O. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette étude, nous mis au point des bateaux en forme de O et effectué une culture en suspension HEK293 dedans pour une formation uniforme des agrégats et l’expansion. Dans la boîte de pétri conventionnels, une orbitale secouant la culture produit deux diamètres différents des agrégats, alors que nous avons observé des agrégats uniformes dans les vaisseaux en forme de O (Figure 1). Selon l’observation de la distribution des perles colorées dans les conditions d’agitation orbitales, perles se réunissent dans le centre-fond d’un plat de culture conventionnelle. Ce rassemblement a provoqué probablement la différence de densité des cellules conduisant à des granulats de différentes tailles. Alternativement, les perles ont été distribués dans le plat en forme de O qui n’a pas de la région centre-bas (la Figure 1). Cette distribution provoque probablement les agrégats de taille uniformément dans les vaisseaux en forme de O. Un autre — couramment — approche à la production d’agrégats uniformes est la mise en culture dans des micropuits, mais cette approche a des problèmes, tels que dans la fourniture d’un milieu de culture sans agrégats abandonnent le micropuits13. Dans le cas de bateaux en forme de O, uniforme d’agrégats peuvent être produits dans une culture en suspension simple.

L’orbitale secouant la culture est un système de culture populaire utilisé pour les cellules mammifères. Il existe diverses méthodes de culture pour la production de masse de cellules de mammifères, tels que le réservoir agité bioréacteur14, sacs fit signe la vague15et en faisant tourner les bouteilles. Cultures agitateur orbitales n’incluent pas d’une hélice interne pour agiter le milieu, à la différence du réservoir agité le bioréacteur fait. Cette fonctionnalité est similaire à la vague-a fait signe de sacs et bouteilles rotatives. Ces systèmes de culture sans roue peuvent éviter des lésions cellulaires de la force de cisaillement qui entoure les roues et se rendent compte de la contrainte de cisaillement faible culture en suspension. Surtout, systèmes de culture vibrante orbitale sont efficaces pour la production de masse de cellules sensibles telles que les cellules de mammifères en raison de leur haute évolutivité et la faible contrainte de cisaillement.

Bateaux en forme de O peut améliorer le problème restant d’orbitale vibrante culture dans la formation d’agrégats. Dans l’orbitale secouant les systèmes de culture, flottants cellules migrent vers le centre et le fond du navire, qui est connu comme le « thé d’Einstein leaf paradox »11. Cette migration provoque l’agrégation inhomogène et la production totale non uniforme dans classique orbitale secouant les navires. Dans cette étude, les vaisseaux en forme de O a empêché la concentration de cellules dans le centre-fond des vaisseaux, qui est supposé comme motif d’agrégation uniforme dans les vaisseaux en forme de O agitateur orbitales.

Des analyses histologiques montrent que les agrégats dans le plat traditionnel contient des cellules énucléés (Figure 2 a). En revanche, les cellules énucléés ne figuraient pas dans les agrégats de vaisseaux en forme de O (Figure 2 b et 2C). Il est possible que ces cellules énucléés étaient causées par un manque de substrats tels que le glucose, glutamine et oxygène9. Selon la mesure de la taille, agrégats dans les vaisseaux en forme de O avaient homogènes diamètres inférieurs à 400 µm. En revanche, dans un plat classique, certains agrégats avaient un diamètre supérieur à 400 µm, et ces agrégats inclus cellules énucléés. Ce résultat suggère que la création d’agrégats de taille homogène dans les vaisseaux en forme de O est efficace pour contrôler la qualité des agrégats. En outre, il est également supposé que l’oxygénation par le biais de la pellicule de polyéthylène perméable au gaz a empêché l’apparition de cellules énucléés dans le sac en forme de O.

Ces expériences ont montré la possibilité de ces bâtiments en forme de O comme un système simple de production de granulats uniformes. Bien que les autres sacs de culture pour la culture en suspension ont été développés15, ces sacs de culture sont en forme de carré, qui empêche la culture d’obtenir effectivement mélangé en secouant orbitale. Le sac dans la présente étude a un roman rond forme convenable pour secouer les orbitales pour produire des agrégats d’une taille homogène. Cette caractéristique des vaisseaux est importante pour contrôler les conditions et la reproductibilité élevée des cellules dans la production de masse. L’application éventuelle du bateau en forme de O est très répandue. Il peut être utilisé lors de la production de protéines recombinantes de cellules et de médecine régénérative lorsqu’ils traitent avec des cellules souches.

En conclusion, nous avons développé un roman en forme de O sac adaptée pour produire des agrégats de cellules uniformes avec une culture vibrante orbitale. Le sac présente possibilités pour diverses applications biomédicales telles que la médecine régénérative.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Cette recherche est financée par une collaboration avec FUKOKU, S.a.r.l Takao Yoshida de FUKOKU, CO., Ltd. a fourni l’idée du sac en forme de O la culture. Takamasa Sato de FUKOKU, CO., Ltd. a appuyé cette recherche en termes d’une simulation de calcul pour développer le sac de culture en forme de O. Nous voudrions apprécier affiliation actuelle de la correspondante de l’auteur, Université d’Osaka, pour nous permettre de travailler sur la publication.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 RIKEN Bio resorce centre RCB1637
DMEM, high glucose, pyruvate GIBCO 11995040
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions GIBCO 10437-028
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X GIBCO 11140050
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO 25200056
Dulbecco's PBS (–) Cell Science & Technology Institute 1102P05
Cell Strainer 40µm CORNING 352340
50 mL Syringe TERUMO SS-50ESZ
Shaker AS ONE 2-1987-02
Centrifuge Tube 50 mL AS ONE 1-3500-02
Automated cell counter BioRad TC20

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References

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