माउस Neocortex में सेलुलर संगठन के बड़े पैमाने पर तीन आयामी इमेजिंग

Neuroscience

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Summary

यहाँ हम ऊतक समाशोधन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन, फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और माउस मस्तिष्क ऊतक के बड़े पैमाने पर इमेजिंग, जिससे, neocortex में कोशिका प्रकार के तीन आयामी संगठन के दृश्य में सक्षम बनाता है.

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Yoneda, T., Sakai, S., Maruoka, H., Hosoya, T. Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex. J. Vis. Exp. (139), e58027, doi:10.3791/58027 (2018).

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Abstract

स्तनधारी neocortex उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स के कई प्रकार से बना है, विशिष्ट electrophysiological और जैव रासायनिक गुणों के साथ प्रत्येक, synaptic कनेक्शन, और vivo कार्यों में , लेकिन उनके बुनियादी कार्यात्मक और संरचनात्मक नेटवर्क स्केल करने के लिए सेलुलर से संगठन खराब समझ है । यहाँ हम cortical सेलुलर संगठन की जांच के लिए मस्तिष्क के बड़े क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट-लेबल वाले न्यूरॉन्स के तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार फ्लोरोसेंट प्रतिगामी न्यूरॉन्स या ट्रांसजेनिक चूहों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के इंजेक्शन द्वारा लेबल कर रहे हैं. ब्लॉक मस्तिष्क के नमूनों, जैसे, एक गोलार्द्ध, निर्धारण के बाद तैयार कर रहे हैं, ऊतक समाशोधन तरीकों के साथ पारदर्शी बनाया, और विशिष्ट कोशिका प्रकार के फ्लोरोसेंट immunolabeling के अधीन । बड़े क्षेत्रों फोकल या दो फोटॉन सूक्ष्मदर्शी बड़े काम दूरी उद्देश्यों और मोटर चालित चरणों से सुसज्जित का उपयोग कर स्कैन कर रहे हैं । इस विधि में माउस neocortex कक्ष प्रकार-विशिष्ट microcolumn कार्यशील मॉड्यूल की आवर्ती संगठन को हल कर सकते हैं । प्रक्रिया विविध मस्तिष्क क्षेत्रों और अंय जटिल ऊतकों में तीन आयामी सेलुलर वास्तुकला के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

स्तनधारी neocortex कोशिका प्रकार की एक बड़ी संख्या से बना है, विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ प्रत्येक, electrophysiological और जैव रासायनिक गुण, synaptic कनेक्शन, और vivo में कार्य करताहै 1,2 ,3,4,5,6,7. क्या इन सेल प्रकार दोहराया संरचनाओं में आयोजित कर रहे है अस्पष्ट है । Cortical कॉलम, दृश्य अभिविंयास कॉलम और somatosensory बैरल सहित, दोहराया संरचनाओं है, लेकिन उनके सेलुलर संगठन अस्पष्ट8,9रहता है । ये विशिष्ट cortical क्षेत्रों में विद्यमान हैं और मस्तिष्क-व्यापी व्यवस्था नहीं हैं.

neocortical परत 5 में, न्यूरॉन्स के बड़े बहुमत चार प्रमुख प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं. उत्तेजक न्यूरॉन्स की एक प्रमुख प्रकार, उप मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स, pons, रीढ़ की हड्डी, और बेहतर colliculus सहित subcortical लक्ष्यों को axons परियोजनाओं, और, इसलिए, प्रमुख cortical उत्पादन मार्ग10का प्रतिनिधित्व करता है. Cortical प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स, उत्तेजक न्यूरॉन्स की एक अन्य प्रमुख प्रकार, अंदर आना प्रांतस्था10. निरोधात्मक न्यूरॉन्स में भी दो प्रमुख वर्ग होते हैं: parvalbumin-एक्सप्रेस और सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेस कोशिकाओं11.

हाल के विश्लेषणों से संकेत मिलता है कि चार कक्ष प्रकार दोहराया संरचनाओं12,13,14में आयोजित कर रहे हैं । दोनों उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स12,13,14 और cortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स14 कक्ष-प्रकार विशिष्ट microcolumns में 1 – 2 कक्षों का व्यास के साथ व्यवस्थित करें । Parvalbumin-एक्सप्रेस और सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेस कोशिकाओं विशेष रूप से उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के microcolumns के साथ नहीं बल्कि cortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स14के microcolumns के साथ संरेखित करें. Microcolumns खुद को समय से एक षट्कोण जाली सरणी फार्म के लिए संरेखित करें और दृश्य, somatosensory, और माउस मस्तिष्क12,14 और भाषा में मोटर क्षेत्रों सहित कई cortical क्षेत्रों में मौजूद हैं मानव मस्तिष्क के क्षेत्रों13. ंयूरॉंस में व्यक्तिगत microcolumn प्रदर्शन सिंक्रनाइज़ गतिविधि और इसी तरह संवेदी प्रतिक्रियाएं14। इन टिप्पणियों का संकेत है कि परत 5 सेल प्रकार एक microcolumn जाली कार्यात्मक मॉड्यूल दोहरा के पहले ज्ञात मस्तिष्क व्यापक संगठन का प्रतिनिधित्व संरचना में संगठित ।

Microcolumns लगभग 10 µm के एक त्रिज्या है और लगभग ४० µm के एक स्थानिक समय-अवधि है । इसके अलावा, microcolumns के उंमुखीकरण उनके शिखर dendrites और परिवर्तन प्रांतस्था14में अपनी स्थिति के आधार पर समानांतर है । इसलिए, microcolumn प्रणाली micrometers के कुछ दसियों की एक ठेठ मोटाई के साथ पारंपरिक cortical स्लाइस का उपयोग कर विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, आवधिकता के विश्लेषण मस्तिष्क क्षेत्रों की एक विस्तृत रेंज से तीन आयामी डेटा की आवश्यकता है, और इसलिए, फोकल माइक्रोस्कोपी के ठेठ इमेजिंग क्षेत्र या vivo 2-फोटॉन इमेजिंग में भी संकीर्ण है ।

हाल ही में, तकनीक15,16के घने ऊतकों को स्पष्ट करने के लिए विकसित किया गया है । यहां हम इन तरीकों के आवेदन का वर्णन करने के लिए बड़े पैमाने पर, तीन माउस neocortical 5 परत में प्रमुख कोशिका प्रकार के आयामी चित्र है कि microcolumn प्रणाली शामिल प्राप्त करते हैं । उपमस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स प्रतिगामी लेबलिंग द्वारा या Crym-egfp ट्रांसजेनिक चूहों12में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा लेबल कर रहे हैं, और cortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स या तो प्रतिगामी द्वारा लेबल हैं लेबलिंग या Tlx3-cre/Ai9 चूहों में tdTomato अभिव्यक्ति द्वारा17. Parvalbumin-एक्सप्रेस और सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेस कोशिकाओं immunohistochemistry द्वारा लेबल कर रहे हैं । (एंटीबॉडी स्केल S) AbScale विधि18 का प्रयोग एंटीबॉडी दाग-धब्बों के लिए किया जाता है, जबकि (देखें डीप ब्रेन) SeeDB विधि19 का प्रयोग अन्य प्रयोगों के लिए किया जाता है । इन तरीकों पारंपरिक इमेजिंग तरीकों की उपर्युक्त कठिनाइयों को दूर करने और 514परत के सटीक सेलुलर संगठन का पता चलता है ।

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Protocol

आरआईकेईएन वको पशु प्रयोग समिति और आरआईकेईएन आनुवंशिक रिकॉमबिनेंट प्रयोग सुरक्षा समिति द्वारा सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया और आरआईकेईएन ब्रेन साइंस की पशु सुविधाओं के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया संस्थान.

1. इमेजिंग चैंबर्स की तैयारी

  1. इमेजिंग चैंबर19
    1. सिलिकॉन रबर शीट का प्रयोग, लगभग 5 मिमी और विभिंन मोटाई की फर्श प्लेटों की एक मोटाई के साथ एक चैंबर तैयार करते हैं । इसके अलावा, के साथ और एक गिलास नीचे (आंकड़ा 1a) बिना पेट्री व्यंजन तैयार करते हैं ।
  2. स्लाइस स्पेसर
    1. ०.५ मिमी (चित्रा 1C) की मोटाई के साथ सिलिकॉन रबर शीट का उपयोग कर, नमूनों को पकड़ने के लिए स्पेसर तैयार करें ।

2. अनुरेखक इंजेक्शन

नोट: या तो pons (२.१) या बेहतर colliculus (२.२) में इंजेक्शन बनाओ । दृश्य और मोटर क्षेत्रों सहित एक व्यापक मस्तिष्क क्षेत्र में pons लेबल उप मस्तिष्क प्रक्षेपण ंयूरॉंस में इंजेक्शन, जबकि बेहतर colliculus लेबल में इंजेक्शन दृश्य क्षेत्र में उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण ंयूरॉंस । नियंत्रण प्रयोगों के लिए, इंजेक्शन खारा के बजाय फ्लोरोसेंट-लेबल हैजा विष उपइकाई बी. बाँझ हालत के रखरखाव के लिए उपयोग निष्फल उपकरण और प्लास्टिक के दस्ताने इथेनॉल के साथ साफ ।

  1. वयस्क चूहों के pons में इंजेक्शन बनाओ ।
    1. एक 26G हैमिल्टन सिरिंज में फ्लोरोसेंट-लेबल हैजा विष उप इकाई बी (25 µ जी/µ एल) के 1 µ एल ड्रा ।
    2. सिरिंज पर एक इंजेक्टर पंप प्लेस ।
    3. एक stereotaxic साधन पर रखा एक जोड़तोड़ के उपकरण धारक पर सिरिंज और पंप प्लेस । जोड़ तोड़ 12 ° झुकाव अनुलंब अक्ष से पीछे ।
    4. Anesthetize एक पुरुष या महिला वयस्क माउस (C57BL/6J या Tlx3-cre/Ai9) द्वारा सोडियम pentobarbital intraperitoneally (६० मिलीग्राम/kg शरीर का वजन) या isoflurane प्रशासन द्वारा (2 – 3%) रुको जब तक माउस कोई जवाब नहीं है जब इसकी पूंछ संदंश के साथ चुटकी ली है, यह दर्शाता है कि माउस पूरी तरह से anesthetized है ।
    5. stereotaxic यंत्र पर माउस रखें ।
    6. ध्यान से एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर संक्रमण को रोकने के लिए बालों को हटाने और खोपड़ी के 10 मिमी इतनी कटौती कि bregma और लैंब्डा दिखाई दे रहे हैं । एक पिपेट का उपयोग कर 1% lidocaine के ०.१ एमएल प्रशासन । stereotaxic लिखत पर मुखपत्र के कार्यक्षेत्र की स्थिति का समायोजन कर सिर के कोण को सेट करें ताकि bregma और लैंब्डा का एक ही z तर हो.
    7. इस सिरिंज की नोक bregma के करीब है और जोड़तोड़ की स्थिति रिकॉर्ड है कि इतना stereotaxic साधन पर फिसलने से जोड़तोड़ की स्थिति को समायोजित करें । जोड़तोड़ पर उपकरण धारक ले जाकर सिरिंज को वापस ।
    8. जोड़तोड़ ५.४ mm पीछे और ०.४ mm बाद में ले जाएं । इतना है कि टिप खोपड़ी पर प्रवेश बिंदु के करीब है सिरिंज अग्रिम । सिरिंज को वापस लें और प्रविष्टि पॉइंट को चिह्नित करें ।
    9. चिह्नित स्थिति में, लगभग 1 मिमी के व्यास के साथ एक छेद ड्रिल.
    10. छेद के माध्यम से सिरिंज टिप डालें ताकि टिप गहराई ६.९ मिमी है कि bregma पर मापा से अधिक है.
    11. ०.२ µ एल पर पंप का उपयोग अनुरेखकों के 1 µ एल इंजेक्षन/
    12. मस्तिष्क से सिरिंज निकालें.
    13. यदि आवश्यक हो, microfibrillar hemostat और त्वरित चिपकने वाला के छोटे टुकड़े के साथ उजागर मस्तिष्क को कवर ।
    14. एक पिपेट के साथ दिया खारा का उपयोग कर उजागर मस्तिष्क कुल्ला संक्रमण को रोकने और खोपड़ी टांका ।
    15. stereotaxic यंत्र से माउस को हटा दें । माउस को एक मशीन में संज्ञाहरण से 30 ˚ सी में ठीक करने के लिए अनुमति दें, आम तौर पर 1 एच के लिए छोड़ माउस उपेक्षित जब तक यह पर्याप्त चेतना को फिर से प्राप्त किया है स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए नहीं है । यह पूरी तरह से बरामद किया गया है के बाद अन्य जानवरों की कंपनी के लिए माउस लौटें ।
    16. 3-7 दिनों के लिए माउस को बनाए रखें ।
  2. वयस्क चूहों की बेहतर colliculus में इंजेक्शन बनाओ ।
    1. 30-50 µm के टिप वाले व्यास के साथ एक ग्लास पिपेट तैयार करें ।
    2. एक प्लास्टिक ट्यूब (चित्रा 2a) के माध्यम से एक हैमिल्टन सिरिंज के लिए कांच पिपेट कनेक्ट.
    3. कांच पिपेट, प्लास्टिक ट्यूब, और तेल तरल के साथ हैमिल्टन सिरिंज भरें ।
    4. सिरिंज पर एक इंजेक्टर पंप प्लेस ।
    5. जोड़तोड़ पर कांच पिपेट प्लेस और जोड़ तोड़ ६० ° झुकाव ऊर्ध्वाधर अक्ष (चित्रा बी) से पीछे ।
    6. प्रदर्शन 2.1.4 – 2.1.9. जोड़तोड़ की स्थिति १.४ mm पीछे, ०.५ mm लैंब्डा को पार्श्व है ।
    7. खोपड़ी पर एक छोटे से प्लास्टिक की तेल फिल्म प्लेस, तो इस पर अनुरेखक समाधान के लगभग 1 µ एल डाल दिया. जल्दी से गिलास पिपेट अग्रिम और यह अनुरेखक समाधान के कम से ०.५ µ एल के साथ भरें ।
    8. ग् पिपेट डालें ताकि टिप की गहराई मस्तिष्क की सतह से ३.० mm हो ।
    9. ०.२ µ l/मिनट पर पंप का उपयोग अनुरेखकों के ०.५ µ एल इंजेक्षन.
    10. ग् पिपेट को ब्रेन से निकाल दें ।
    11. प्रदर्शन 2.1.13 – 2.1.16.

3. निर्धारण और छंटनी

  1. सोडियम pentobarbital इंजेक्षन (६० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) एक माउस में intraperitoneally (C57BL/6J या Tlx3-cre/Ai9, के साथ या बिना अनुरेखक इंजेक्शन के रूप में चरण 2 में वर्णित. रुको जब तक माउस कोई जवाब नहीं है जब इसकी पूंछ संदंश के साथ चुटकी ली है, यह दर्शाता है कि माउस पूरी तरह से anesthetized है ।
  2. Euthanize माउस humanely को perfusing कर ०.९% खारा के साथ20 transcardially ।
  3. माउस को ठीक20 perfusing द्वारा 4% paraformaldehyde (पीएफए) में ०.१ M फास्फेट बफर (पीएच ७.५).
  4. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग खोपड़ी में कटौती के रूप में20वर्णित खोपड़ी बेनकाब ।
    1. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर उजागर खोपड़ी के midline काट । संदंश का उपयोग कर खोपड़ी निकालें ।
    2. यदि bregma और लैंब्डा की स्थिति अंकन आवश्यक है, पहले खोपड़ी के एक गोलार्द्ध को दूर । मस्तिष्क पर शेष खोपड़ी पर bregma और लैंब्डा की स्थिति में पतली टंगस्टन सुई डालें, फिर शेष खोपड़ी को हटा दें ।
      नोट: मस्तिष्क 4 ˚ सी में पंजाब में संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. निरोधात्मक न्यूरॉन्स की एंटीबॉडी धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, स्लाइस में मस्तिष्क के नमूनों में कटौती.
    1. ब्रेन का नमूना एक vibratome पर रखें ।
    2. कट स्लाइसें ५०० µm को पंजाब में मोटी कमरे के तापमान पर और 5 कदम (AbScaएलई विधि) के लिए आगे बढ़ना ।
  6. यदि एंटीबॉडी धुंधलाना अनावश्यक है, ब्लॉक करने के लिए मस्तिष्क के नमूने ट्रिम (अप करने के लिए 3 मिमी मोटी) एक उस्तरा ब्लेड (चित्रा 3) का उपयोग और 4 कदम (SeeDB विधि) के लिए आगे बढ़ना.
    नोट: मस्तिष्क को काटने या ट्रिमिंग के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में संग्रहित किया जा सकता है । SeeDB विधि बेहतर है जब एंटीबॉडी धुंधलाना आवश्यक नहीं है क्योंकि यह AbScaएलई विधि से कम समय की आवश्यकता है ।

4. एंटीबॉडी धुंधला बिना समाशोधन (SeeDB विधि)

  1. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब ०.५% α के 20 मिलीलीटर-thioglycerol और 20% (डब्ल्यू/वी) फ्रुक्टोज और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते के साथ 4 एच के लिए यह मशीन के लिए एक रंग का उपयोग कर नमूना हस्तांतरण ।
  2. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब ०.५% α-thioglycerol और ४०% (डब्ल्यू/वी) फ्रुक्टोज के 20 मिलीलीटर युक्त और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते के साथ 4 एच के लिए यह मशीन के लिए एक रंग का उपयोग कर नमूना हस्तांतरण ।
  3. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब ०.५% α-thioglycerol और ६०% (डब्ल्यू/वी) फ्रुक्टोज के 20 मिलीलीटर युक्त और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते के साथ 4 एच के लिए यह मशीन के लिए एक रंग का उपयोग कर नमूना हस्तांतरण ।
  4. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब ०.५% α-thioglycerol और ८०% (डब्ल्यू/वी) फ्रुक्टोज के 20 मिलीलीटर युक्त और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते के साथ 12 घंटे के लिए यह मशीन के लिए एक रंग का उपयोग कर नमूना हस्तांतरण ।
  5. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब ०.५% α-thioglycerol और १००% (डब्ल्यू/वी) फ्रुक्टोज के 20 मिलीलीटर युक्त और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते के साथ 12 घंटे के लिए यह मशीन के लिए एक रंग का उपयोग कर नमूना हस्तांतरण ।
  6. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब ०.५% α के 20 मिलीलीटर-thioglycerol और ८०.२% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) फ्रुक्टोज के लिए एक रंग का उपयोग कर नमूना हस्तांतरण और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए के साथ 24 घंटे के लिए यह मशीन ।
    नोट: के रूप में संभव के रूप में छोटे विकृति रखने के लिए नमूना सावधानी से संभाल । अब नमूनों की तुलना में संकेत नहीं है, नमूने जल्दी अपारदर्शी हो सकता है के रूप में ।
  7. ८०.२% फ्रुक्टोज समाधान (चित्र 1b) से भरे इमेजिंग कक्ष में नमूना एंबेड करें । यदि आवश्यक हो, रबर चिपकने वाला के छोटे टुकड़े डाल द्वारा नमूना ठीक । अगर चैंबर बहुत गहरा हो तो नमूनों को रखने से पहले चैंबर में एक फ्लोर प्लेट लगा दें ।
  8. इमेजिंग चैंबर पर एक गिलास कवर के साथ पेट्री पकवान प्लेस और पकवान में पानी डाल दिया, और एक जल-विसर्जन लंबी काम दूरी उद्देश्य के साथ फोकल या दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि । उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और उत्सर्जन फ़िल्टर तालिका 1में वर्णित हैं । यदि आवश्यक हो, तो एक मोटर चालित अवस्था का उपयोग करें ।

5. एंटीबॉडी धुंधला के साथ समाशोधन (AbScaएलई विधि)

  1. एजेंट तालिका 2में वर्णित के रूप में तैयार करें ।
  2. Sca/eS0 समाधान के 4 मिलीलीटर युक्त एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए एक रंग का उपयोग कर स्लाइस हस्तांतरण और ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4B) पर कोमल झटकों के साथ 12 एच के लिए उन्हें मशीन ।
  3. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और Sca/eA2 समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों के साथ ३६ एच के लिए स्लाइसें गर्मी ।
  4. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और Sca/eB4 समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों के साथ 24 घंटे के लिए स्लाइसें की मशीन ।
  5. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और Sca/eA2 समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों के साथ 12 एच के लिए स्लाइसें गर्मी ।
  6. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और पंजाब के 4 मिलीलीटर जोड़ने और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए के साथ 6 एच के लिए स्लाइसें गर्मी ।
  7. ध्यान से एक रंग का उपयोग कर एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए स्लाइसें हटा दें ।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन (तालिका 3) AbScaएलई समाधान के 1 मिलीलीटर में ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4c) के साथ कोमल मिलाते हुए के लिए 48-72 ज ।
  9. ध्यान से एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब एक रंग का उपयोग करने के लिए स्लाइसें हटा दें ।
  10. कोमल मिलाते के साथ कमरे के तापमान पर 2 ज 2 बार के लिए AbScaएलई समाधान के 4 मिलीलीटर में मशीन ।
  11. ध्यान से एक रंग का उपयोग कर एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए स्लाइसें हटा दें ।
  12. फ्लोरोसेंट के साथ मशीन-माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की मेज, 1:100) AbScaएलई समाधान के 1 मिलीलीटर में ४८ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते के साथ ।
  13. ध्यान से एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब AbScaएलई समाधान के 4 मिलीलीटर युक्त और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते के साथ 6 एच के लिए स्लाइसें मशीन के लिए एक रंग का उपयोग स्लाइस को दूर ।
  14. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और AbScaएलई समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने और कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ 2 ज 2 बार के लिए स्लाइसें गर्मी ।
  15. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और 4% पीएफए के 4 मिलीलीटर जोड़ने और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए के साथ 1 एच के लिए स्लाइसें गर्मी ।
  16. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और पंजाब के 4 मिलीलीटर जोड़ने और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए के साथ 1 एच के लिए स्लाइसें गर्मी ।
  17. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से समाधान निकालें और Sca/eS4 समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों के साथ 12 एच के लिए स्लाइसें की मशीन ।
  18. एक गिलास स्लाइड पर स्पेसर प्लेस और स्पेसर में स्लाइसें जगह और Sca/eS4 समाधान के साथ स्लाइस विसर्जित कर दिया । एक कवर ग्लास (चित्रा 1 डी) के साथ स्पेसर सील ।
  19. एक जल विसर्जन लंबे समय से काम दूरी उद्देश्य के साथ फोकल या दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कवर ग्लास और छवि पर पानी रखो । यदि आवश्यक हो, तो एक मोटर चालित अवस्था का उपयोग करें ।
    नोट: जांचें कि क्या नमूने के गहरे भाग इसी तरह से सतही भागों को लेबल कर रहे है एक महत्वपूर्ण लेबलिंग पूर्वाग्रह के अभाव की पुष्टि करें ।
    नोट: परीक्षण एंटीबॉडी के प्रवेश तालिका 3में वर्णित है.

6. कक्ष स्थिति निर्धारण

  1. स्कैन की गई छवियों में प्रत्येक स्थिति के लिए, तीन-आयामी छवि फ़िल्टर14 (चित्र 5-5d) का उपयोग करके सहसंबंध मान परिकलित करें ।
  2. सहसंबंध मान (आरेख 5d) की चोटियों की स्थितियां निर्धारित करें ।
  3. कक्षों का पता लगाने के लिए चोटियों के आसपास छवियों की जाँच (चित्रा 5E).

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Representative Results

हम Tlx3में tdTomato की अभिव्यक्ति द्वारा cortical प्रक्षेपण ंयूरॉंस लेबल-cre/Ai9 ट्रांसजेनिक चूहों और visualized उप मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स CTB488 में प्रतिगामी अनुरेखक pons इंजेक्शन द्वारा । मस्तिष्क के बाएं गोलार्द्ध SeeDB विधि के अधीन था और एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्कैन एक जल विसर्जन लंबी काम दूरी उद्देश्य (25X, एनए १.१, काम दूरी 2 मिमी) और एक मोटर की अवस्था से सुसज्जित । ४०१ छवियों का ढेर (५१२ x ५१२ पिक्सेल; पिक्सेल आकार = ०.९९ µm) z-चरण = पर प्रत्येक 30 स्कैनिंग स्थिति में २.८ µm प्राप्त किया गया था । दो सेल प्रकार के कोशिका निकायों मस्तिष्क क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला पर दिखाई दे रहे थे (चित्रा 6), और ऑप्टिकल वर्गों आवर्ती microcolumns (चित्रा 7A) दिखाया. इसके अलावा, Crym-egfp चूहों के दिमाग (एक C57BL/6J पृष्ठभूमि के साथ heterozygotes के रूप में बनाए रखा) SeeDB विधि द्वारा मंजूरी दे दी और ऊपर के रूप में imaged थे । EGFP-एक्सप्रेस उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के सेल बॉडीज और शिखर dendrites ऑप्टिकल सेक्शन (फिगर 7B) में दिखाई दे रहे थे ।

हम भी CTB488 का उपयोग C57BL/6J चूहों में उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स की प्रतिगामी लेबलिंग प्रदर्शन किया । निश्चित मस्तिष्क लगभग ५०० µm की एक मोटाई के साथ राज्याभिषेक स्लाइस में काट दिया गया था और AbScaएलई विधि के अधीन parvalbumin-व्यक्त कोशिकाओं लेबल (विरोधी parvalbumin, 1:1000; विरोधी माउस आईजीजी-फ्लोरोसेंट लेबल,) । स्टैक छवियां (५१२ x ५१२ पिक्सेल, पिक्सेल आकार = १.२४ µm; z-चरण = २.१७ µm, २६८ चित्र/स्टैक) को एक जल-विसर्जन लंबी कार्यशील दूरी उद्देश्य (20X, एनए १.०, कार्य दूरी 2 मिमी) के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था । उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और parvalbumin-एक्सप्रेस कोशिकाओं दोनों स्लाइस (चित्रा 7C) में दिखाई दे रहे थे.

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग मंडलों और स्पेसर्स । (a) Top: हस्तनिर्मित ग्लास-बॉटम्ड पेट्री डिश (दाएं) और एक पेट्री डिश बिना शीशे के नीचे (बाएं) । नीचे: एक चैंबर (दाएं) और तल प्लेटें (बाएं) सिलिकॉन चादरें से बना है । () एक माउस गोलार्द्ध बेहतर colliculus में CTB555 के इंजेक्शन के बाद SeeDB विधि के अधीन कक्ष में सेट है । नमूना प्रयोज्य चिपकने वाला के एक टुकड़े के साथ तय हो गई है । () एक ग्लास स्लाइड (ऊपर) और एक स्पेसर ०.५ mm (नीचे) की मोटाई के साथ एक सिलिकॉन शीट का बना । () माउस मस्तिष्क के दो राज्याभिषेक स्लाइस स्पेसर में स्थापित किए गए थे और एक कवर ग्लास के साथ कवर किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अनुरेखक इंजेक्शन. (क) एक ग्लास पिपेट एक प्लास्टिक ट्यूब के माध्यम से एक हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ा । () एक माउस एक stereotaxic साधन पर रखा गया है । कांच पिपेट बेहतर colliculus में इंजेक्शन के लिए ऊर्ध्वाधर अक्ष से पीछे से लगभग ६० ° झुका है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मस्तिष्क के नमूनों की छंटनी. () बेहतर colliculus और निर्धारण में CTB555 के इंजेक्शन के बाद पूरे मस्तिष्क नमूना. bregma और लैंब्डा टंगस्टन सुई (ऐरोहेड) के साथ चिह्नित किया गया था । () एक गोलार्द्ध को प्राप्त करने के लिए छंटनी की एक ही नमूना । टंगस्टन सुई (ऐरोहेड) रहते हैं कि ध्यान दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: SeeDB और AbScaएलई तरीकों के लिए समाधान में मस्तिष्क के नमूनों का विसर्जन । (a) SeeDB पद्धति के लिए ०.५% α-thioglycerol और 20% (w/v) फ्रुक्टोज में डूबे एक गोलार्द्ध नमूने । () AbScaएलई विधि के लिए Sca/eA2 समाधान में डूबे राज्याभिषेक स्लाइस । () AbScaएलई विधि के लिए एंटीबॉडी युक्त AbScaएलई समाधान में डूबे राज्याभिषेक स्लाइसें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सेल पदों का निर्धारण । उप मस्तिष्क प्रक्षेपण ंयूरॉंस pons में प्रतिगामी अनुरेखक CTB488 इंजेक्शन द्वारा लेबल थे उंर के 5 सप्ताह में । बाएँ गोलार्द्ध SeeDB विधि के अधीन किया गया था और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ स्कैन (५१२ x ५१२ पिक्सल, पिक्सेल आकार = ०.९९ µm; जेड-चरण = २.८ µm, ६०१ छवियाँ/ () एक ही छवि । () एक ही छवि ढेर से पांच छवियां । () छवि फिल्टर CTB-लेबल उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण ंयूरॉंस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । (D) में (B) फ़िल्टर का उपयोग करके (C) में पांच छवियों के लिए सहसंबंध मान परिकलित । () खोजे गए उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के उदाहरण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: बड़े पैमाने पर इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम । Cortical प्रक्षेपण ंयूरॉंस (ग्रीन) Tlx3में tdTomato-अभिव्यक्ति द्वारा लेबल थे-cre/Ai9 ट्रांसजेनिक चूहों, और उप मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (रानी) के 7 सप्ताह में CTB488 में प्रतिगामी अनुरेखक pons इंजेक्शन द्वारा visualized थे उम्र. बायां गोलार्द्ध को SeeDB विधि के अधीन किया गया और क्षेत्र को १,२५० µm से २,६९० µm पार्श्व तथा-३,४०० µm से १,२३० µm पूर्वकाल को bregma दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का प्रयोग कर स्कैन किया गया. (A) शीर्ष दृश्य । cortical क्षेत्रों के अनुमानित पदों को दिखाया गया. (बी-डी) CTB ४८८ प्रतिदीप्ति का परोक्ष दृश्य उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स दिखा रहा है (ख), tdTomato प्रतिदीप्ति दिखा रहा है cortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (सी), और विलय छवि (डी). एक: पूर्वकाल; पी: पीछे; मी: औसत दर्जे का; डी: पृष्ठीय । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: प्रतिनिधि परिणामों के उच्च आवर्धन तस्वीरें । () चित्र 6Dमें छवि का एक ऑप्टिकल अनुभाग । छवि मोटाई = 20 µm. () EGFP-लेबल उप मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में एक heterozygous Crym-EGFP माउस 6 सप्ताह की उम्र में. छवि मोटाई = 30 µm. () उपमस्तिष्क प्रक्षेपण ंयूरॉंस (रानी) 6J दिन ४९ में C57BL/जन्मोत्तर चूहों के pons में CTB488 इंजेक्शन द्वारा लेबल थे, और parvalbumin-व्यक्त कोशिकाओं (ग्रीन) AbScaएलई विधि द्वारा visualized थे । छवि मोटाई = ५५ µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Fluorophore उदा. (एनएम) फ़िल्टर (एनएम)
EGFP ९१० 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)
tdTomato १,००० 578-633 (D605/55m, क्रोमा)
एलेक्सा Fluor ४८८ ७५० 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)
एलेक्सा Fluor ५५५ ७५० 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock)
एलेक्सा Fluor ५९४ ७५० 601-657 (FF01-629/56, Semrock)
DAPI ७०० 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)

तालिका 1: दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और फिल्टर ।

2 तालिका: AbScaएलई विधि के लिए रिएजेंट । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Antigen प्रतिरक्षित पशु उत्पाद ID एकाग्रता 3 एमएम ब्लॉक ५०० माइक्रोन स्लाइस
NeuN माउस MAB377 1:500 एन डी +
NeuN खरगोश ABN78 1:500 एन डी +
CTIP2 चूहा ab18465 1:100 L1-L6 +
Statb2 माउस ab51502 1:100 - -
GAD67 माउस MAB5406 1:200 एन डी +
Gaba खरगोश A2052 1:100 - -
Parvalbumin माउस २३५ 1:1000 एन डी +
Parvalbumin बकरी पीवी-गो-Af460 1:100 L1-L2/ +
Parvalbumin माउस P3088 1:1000 एन डी +
Parvalbumin खरगोश ab11427 1:500 एन डी -
सोमेटोस्टैटिन खरगोश टी-४१०३ 1:1000 L1-L2/ +
सी-फोस खरगोश PC38 1:1000 एन डी +

तालिका 3: परीक्षण एंटीबॉडी के प्रवेश । 3 मिमी मोटी ब्लॉकों के लिए परिणाम निम्नानुसार दिखाया गया है; L1-L6: पूरे cortical मोटाई में पैठ; L1-L2/3:2/3 परत के नीचे पैठ; -: नहीं लेबलिंग; एनडी: निर्धारित नहीं है । ५०० µm-मोटे स्लाइस के लिए परिणाम निम्नानुसार दिखाया गया है; +: वर्दी लेबलिंग; -: नहीं या सीमित लेबलिंग ।

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Discussion

हमने माउस neocortical लेयर 5 में प्रमुख कक्ष प्रकार के कक्ष प्रकार-विशिष्ट संगठन के बड़े पैमाने पर तीन-आयामी छवियां प्राप्त करने के लिए कार्यविधियां प्रस्तुत की हैं । पारंपरिक टुकड़ा धुंधला की तुलना में, विधि neocortex के तीन आयामी संगठन का निर्धारण करने में अधिक उपयोगी है । विधि व्यापक और vivo 2 में ठेठ की तुलना में गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों से छवि अधिग्रहण सक्षम बनाता है-फोटॉन माइक्रोस्कोपी या पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी और, इस प्रकार, neocortical सेलुलर के व्यापक विश्लेषण की अनुमति दे सकते हैं संगठन.

विधि का एक महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी पैठ है । एंटीबॉडी का एक सबसेट मोटी नमूनों में गरीब पैठ (तालिका 3) से पता चलता है, और इसलिए, AbScaएलई विधि के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी के साथ वर्दी लेबल प्राप्त करने के लिए, यह ५०० µm स्लाइस में मस्तिष्क में कटौती करने के लिए आवश्यक था. छोटे एंटीबॉडी टुकड़े का उपयोग, उदाहरण के लिए , फैब या एफ (अटल बिहारी ') 2 टुकड़े, और/या अंय समाशोधन तरीकों21,22,23,24,25,26, 27,28 परिणामों में सुधार हो सकता है ।

एंटीबॉडी प्रतिजन-बंधन विशिष्टता आमतौर पर पतली ऊतक स्लाइस में विशेषता है, लेकिन मोटी समाशोधन के लिए संसाधित ऊतकों में अलग हो सकता है । एंटीबॉडी विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के लिए, हम सह अनुरेखक इंजेक्शन और ट्रांसजेनिक जानवरों में मार्कर जीन अभिव्यक्ति के साथ ऊतक लेबल और भी प्रतिजन प्रोटीन और पेप्टाइड्स14का उपयोग कर अवरुद्ध प्रयोगों का प्रदर्शन किया. इन प्रक्रियाओं और नियंत्रण का उपयोग उत्परिवर्ती जानवरों के लक्ष्य एंटीजन कमी एंटीबॉडी की विशिष्टता की पुष्टि के लिए उपयोगी होना चाहिए ।

विधि की एक सीमा है कि नमूना के कुछ विकृति नरम थोक नमूनों की हैंडलिंग के कारण अपरिहार्य है । वीवो छवियों में प्राप्त करने से पहले निर्धारण और संदर्भ के रूप में इन छवियों का उपयोग करने के लिए इस तरह के विकृतियों को सही करने में मदद मिलेगी ।

वर्तमान प्रक्रियाओं neocortical परत 5 के विश्लेषण के लिए डिजाइन किए गए थे । हाल के विश्लेषणों की पहचान की है कई आणविक मार्करों कि लेबल के अन्य परतों में ंयूरॉन कोशिका प्रकार4,5,6,7, और वर्तमान विधि के लिए इन निर्माताओं के आवेदन सक्षम हो सकता है अंय परतों में महत्वपूर्ण सेलुलर संगठन की पहचान । इसके अलावा, यह मस्तिष्क में neocortex के अलावा अंय क्षेत्रों में समान विश्लेषण और मस्तिष्क के अलावा अंय अंगों में प्रदर्शन करना संभव होना चाहिए, जांच करने के लिए कि एक सटीक सेलुलर संगठन microcolumns के समान मौजूद है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम AbScaएलई प्रयोगों पर उनकी सलाह के लिए अतसुशी Miyawaki और हिरोशी हामा का शुक्रिया अदा करते हैं, चार्ल्स Yokoyama पांडुलिपि के संपादन के लिए, Eriko Ohshima और मियुकी Kishino उनकी तकनीकी सहायता के लिए । इस काम के लिए आरआईकेईएन से T.H. और अनुदान में अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित था शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी के मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (जापान के MEXT) T.H. (अभिनव क्षेत्रों "Mesoscopic Neurocircuitry"; २२११५००४) और एस॰एस॰ (२५८९००२३) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crym-egfp transgenic mice MMRRC 012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice MMRRC 36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice Jackson Laboratory JAX #7909
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-01 0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-02 1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-05 3.0 mm thickness
Petri dishes Falcon 351008
Cover glass Matsunami C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate Invitrogen C34778
26 G Hamilton syringe Hamilton 701N
Injector pump KD Scientific KDS 310 Pons injection
Injector pump KD Scientific KDS 100 Superior colliculus injection
Manipulator Narishige SM-15
Sodium pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Somnopentyl
Isoflurane Pfizer
Lidocaine AstraZeneca Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill Toyo Associates HP-200
Avitene microfibrillar hemostat Davol Inc 1010090
Alonalfa Daiichi-Sankyo Alonalpha A
Surgical silk Ethicon K881H
Incubator UVP HB-1000 Hybridizer
Glass pipette Drummond Scientific Company 2-000-075
Electrode puller Sutter Instrument Company P-97
Paraffin Liquid, light Nacalai tesque 26132-35
Saline Otsuka 1326
Paraformaldehyde Nacalai tesque 26126-54
Tungsten needle Inter medical Φ0.1 *L200 mm
Vibratome Leica VT1000S
50 mL plastic tube Falcon 352070
α-thioglycerol Nacalai tesque 33709-62
D(-) Fructose Nacalai tesque 16315-55
BluTack Bostik CKBT-450000
Two-photon microscope Nikon A1RMP
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage COMS PT100C-50XY
Filter Semrock FF01-492/SP-25
Filter Semrock FF03-525/50-25
Filter Semrock FF03-575/25-25
Filter Semrock FF01-629/56
Filter Chroma D605/55m
5 mL plastic tube AS ONE VIO-5B
2 mL plastic tube Eppendorf  0030120094
Urea Nacalai tesque 35905-35
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Glyserol Sigma-aldrich 191612
D(-)-sorbitol Wako 191-14735
Methyl-β-cyclodextrin Tokyo chemical industry M1356
γ-Cyclodextrin Wako 037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline Skin Essential Actives 33996-33-7
DMSO Nacalai tesque 13445-45
Bovine Serum Albumin Sigma-aldrich A7906
Tween-20 (1.1 g/mL) Nacalai tesque 35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206
Confocal microscope Olympus FV1000
Water-immersion long working distance objectives Olympus XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN Millipore MAB377
Anti-NeuN Millipore ABN78
Anti-CTIP2 Abcam ab18465
Anti-Statb2 Abcam ab51502
Anti-GAD67 Millipore MAB5406
Anti-GABA Sigma A2052
Anti-Parvalbumin Swant 235
Anti-Parvalbumin Frontier Institute PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin Sigma P3088
Anti-Parvalbumin Abcam ab11427
Anti-Somatostatin Peninsula Laboratories T-4103
Anti-c-Fos CalbioChem PC38

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References

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