एक इन विट्रो परख tRNA-Isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए

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Biochemistry

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Summary

यहां, हम खमीर आरएनए के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-एंजाइम को संशोधित करने, Mod5, और चर्चा कैसे इस प्रोटोकॉल अंय आरएनए-संशोधित एंजाइमों के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Chambers, A. E., Richardson, A. E., Read, D. F., Waller, T. J., Bernstein, D. A., Smaldino, P. J. An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity. J. Vis. Exp. (140), e58100, doi:10.3791/58100 (2018).

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Abstract

N6-isopentenyladenosine आरएनए संशोधनों कार्यात्मक विविध और prokaryotes और eukaryotes के बीच अत्यधिक संरक्षण कर रहे हैं । सबसे उच्च संरक्षित N6-isopentenyladenosine संशोधनों में से एक tRNAs का एक सबसेट में A37 स्थिति पर होता है । इस संशोधन ribosome के लिए tRNA के संबध को बढ़ाने के द्वारा अनुवाद दक्षता और निष्ठा में सुधार । eukaryotes में इस संशोधन के लिए जिंमेदार एंजाइमों के उत्परिवर्तन कई रोग राज्यों के साथ जुड़े रहे हैं, mitochondrial रोग और कैंसर सहित । इसलिए, इन एंजाइमों सब्सट्रेट विशिष्टता और जैव रासायनिक गतिविधियों को समझने सामान्य और रोग eukaryotic जीव विज्ञान की समझ के लिए महत्वपूर्ण है. तरीकों की एक विविध सरणी के लिए मैं6एक संशोधनों विशेषताएं कार्यरत किया गया है । इस स्पेसिफिकेशंस Mod5 द्वारा isopentenylation का पता लगाने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण वर्णित है । इस विधि एक रिकॉमबिनेंट isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़, RNase T1 पाचन द्वारा पीछा किया, और 1 आयामी जेल ट्रो विश्लेषण के साथ RNAs की मशीन का इस्तेमाल मैं6एक संशोधनों का पता लगाने के लिए । इसके अलावा, अंय आरएनए-संशोधित एंजाइमों को चिह्नित करने के लिए इस प्रोटोकॉल की संभावित अनुकूलन क्षमता पर चर्चा की है ।

Introduction

RNAs, सीधे आरएनए संरचना को प्रभावित करने, और अन्य के साथ आरएनए की बातचीत को प्रभावित करने के लिए विविध और संदर्भ पर निर्भर कार्यों को प्रदान करने के लिए इन संशोधनों के साथ कम से १६३ अलग posttranscriptional आरएनए संशोधनों की पहचान की गई है अणु1,2. संख्या और आरएनए संशोधनों की विविधता के लिए सराहना के रूप में बढ़ जाती है, यह है कि मज़बूती से दोनों आरएनए संशोधनों और उंहें उत्प्रेरित कि एंजाइमों पूछताछ कर सकते है परख विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

एक पहले आरएनए संशोधनों की पहचान की जानी करने के लिए tRNAs में ३७ आधार पर होता है, 3 ' पक्ष3,4पर विरोधी codon से सटे. एक isopentenyl समूह dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) से adenosine ३७ के N6 स्थिति (i6A37) 3,5 दोनों cytoplasmic और mitochondrial tRNAs के एक सबसेट पर स्थानांतरित किया जाता है । मैं6A37 ribosome4,6 और मैं6A37 के लिए tRNA के संबंध में वृद्धि द्वारा अनुवाद निष्ठा और दक्षता में सुधार7बैक्टीरिया में तनाव की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है । एंजाइमों कि इस संशोधन प्रदर्शन tRNA isopentenyl transferases और उच्च जीवाणु8,9, कवक10, कीड़े11, पौधों12, और उच्च eukaryotes 13 में संरक्षित कर रहे है का कार्यकाल कर रहे है , मनुष्यों सहित14.

मानव tRNA isopentenyl में उत्परिवर्तनों ट्रांस्फ़्रेज़ जीन, TRIT1, मानव रोग के साथ जुड़े रहे हैं । उदाहरण के लिए, TRIT1 में उत्परिवर्तन एक गंभीर mitochondrial रोग, mitochondrial प्रोटीन संश्लेषण15,16में एक दोष के कारण होने की संभावना के साथ संबंधित है । इसके अलावा, TRIT1 एक ट्यूमर शमन जीन17,18 के रूप में वर्णित किया गया है और मेलेनोमा19, स्तन20, गैस्ट्रिक21, और फेफड़ों के कैंसर 22 सहित कैंसर के कई प्रकार में फंसाया है ,23. अंत में, TRIT1 और Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन है कि फार्म prion तरह amyloid फाइबर24,25,26। इन टिप्पणियों संभावित neurodegenerative रोगों में tRNA isopentenyl transferases फंसाने, हालांकि इस के लिए प्रत्यक्ष सबूत अभी तक नहीं दिखाया गया है ।

कि isopentenyl अनुवाद और रोग में transferases खेलने की भूमिका को देखते हुए, तरीकों कि सीधे मैं6एक isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि उपाय सामांय और रोग राज्यों के तहत इन एंजाइमों की एक यंत्रवत समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं । तरीकों की एक बढ़ती संख्या के लिए मैं 6 एकआरएनए संशोधनों का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं, इन विट्रो isopentenylation परख सहित, मैं6एक (PHA6) परख, पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी), एमिनो एसिड के अभाव में सकारात्मक संकरण स्वीकृति गतिविधि परख, और जन स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण (रेफरी .4में समीक्षा की) ।

एक इन विट्रो isopentenylation परख वर्णित किया गया है कि उपयोग करता है 14सी-DMAPP और unlabel्ड tRNAs. इस परख में, रेडियोधर्मी कार्बन isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ द्वारा 14सी-DMAPP से आरएनए को हस्तांतरित किया जाता है । हालांकि इस परख अति संवेदनशील है, यह अक्सर है कि9,20,27संशोधित किया है विशिष्ट अवशेषों का निर्धारण करने के लिए मुश्किल है । PHA6 परख भारी मैं6एक ३२पी के संकरण के साथ हस्तक्षेप संशोधन-लेबल जांच संशोधित अवशेष फैले पर भरोसा करते हैं । जैसे, संकरण एक मैं6एक संशोधन18,28,29के अभाव में अधिक है । PHA6 परख अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, और सेलुलर lysates से निकाले गए कुल आरएनए का विश्लेषण करने में सक्षम हैं । इसके अतिरिक्त, डिजाइन जांच ब्याज की आरएनए के लिए विशिष्ट करने की क्षमता इस विधि पर्याप्त लक्ष्य लचीलापन देता है । हालांकि, PHA6 परख संशोधनों कि जांच के लक्षित क्षेत्र के भीतर अवशेषों पर होने के लक्षण वर्णन करने के लिए सीमित है और इसलिए कम करने के लिए उपंयास संशोधन साइटों की पहचान की संभावना है । इसके अलावा, के रूप में बाध्यकारी संशोधन का संकेत है, अंय संशोधनों या परिवर्तन कि आरएनए बाध्यकारी प्रभावित डेटा विश्लेषण मिल जाएगा ।

एक अंय दृष्टिकोण benzyl डीएए फाइबर (BD) फाइबर क्रोमैटोग्राफी एमिनो एसिड स्वीकृति गतिविधि के साथ मैं6tRNA30में एक संशोधनों के एक readout के रूप में जोड़ती है । यह दृष्टिकोण सीधे मैं6एक संशोधन के समारोह परख, लेकिन यह एक अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण के लिए मैं6एक संशोधन का पता लगाने और संकल्प का अभाव है आरएनए में एक विशिष्ट अवशेषों को नक्शे संशोधनों । एक टीएलसी दृष्टिकोण कुल tRNA मैं6एक संशोधनों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस दृष्टिकोण में, आंतरिक ३२P-लेबल tRNAs एकल न्यूक्लियोटाइड करने के लिए पचा रहे हैं और दो आयामी टीएलसी विश्लेषण isopentenylation की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह दृष्टिकोण एक दिया आरएनए नमूना में कुल मैं6एक का पता लगाने में अत्यधिक संवेदनशील है, लेकिन पाचन पर, सभी अनुक्रम जानकारी खो दिया है; इस प्रकार, जांचकर्ता जो अवशेषों31संशोधित किया गया है निर्धारित करने का कोई रास्ता नहीं है ।

हाल ही में, तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ms/ms) तरीकों कि मात्रात्मक प्रजातियों के बीच कुल आरएनए संशोधनों की तुलना विकसित किया गया है, सेल प्रकार, और प्रायोगिक शर्तों३२,३३, ३४. इस पद्धति की एक सीमा है कि यह कम से आरएनए के भीतर पहचान और स्थिति है जिसमें से संशोधित nucleoside३४व्युत्पंन था निर्धारित करने में सक्षम है । इसके अलावा, विशेषज्ञता और इन प्रयोगों को अंजाम आवश्यक उपकरण इस दृष्टिकोण की व्यावहारिकता सीमा ।

इसके अलावा, कई अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों आरएनए संशोधनों transcriptome-वाइड३४नक्शा करने के लिए विकसित किया गया है । एक विशेष संशोधन (रिप-Seq) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ RNAs के Immunoprecipitation एक विशिष्ट संशोधन३५,३६युक्त सभी दृश्यों की पहचान करने के लिए जांचकर्ता सक्षम करें । साथ ही, transcriptase-आधारित approaches जैसे कि रसायन-Seq और गैर-रैंडम बेमेल sequencing संशोधित अवशेषों३७,३८,३९पर रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के perturbations पर निर्भर करते हैं । इन तकनीकों के लाभ के बावजूद आरएनए संशोधनों transcriptome चौड़ा, चीर-seq और रसायन-seq प्रौद्योगिकियों विश्वसनीय एंटीबॉडी या प्रतिक्रियाशील प्रत्येक विशिष्ट संशोधन के लिए उपलब्ध रसायनों की कमी के द्वारा सीमित कर रहे हैं, क्रमशः३४। इसके अलावा, रिवर्स transcriptase एंजाइमों को करने के लिए आवश्यक रसायन Seq और गैर यादृच्छिक बेमेल sequencing तकनीक स्थिर आरएनए संरचनाओं द्वारा बाधित किया जा सकता है । tRNAs के उच्च संशोधित और संरचनात्मक रूप से स्थिर प्रकृति उन्हें विशेष रूप से इन तकनीकों का उपयोग कर पूछताछ करने के लिए मुश्किल बना. तारीख करने के लिए, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण आधारित प्रौद्योगिकियों अभी तक मैं6एक संशोधनों३४नक्शा करने के लिए उपयोग नहीं किया गया है ।

इस के साथ साथ, हम एक सरल और प्रत्यक्ष दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए मैं6 विट्रो मेंएक tRNA संशोधनों का पता लगाने । इस विधि रिकॉमबिनेंट एस cerevisiae isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ (Mod5), RNase T1 पाचन द्वारा पीछा किया, और 1 आयामी जेल ट्रो विश्लेषण के लिए मैं6एक संशोधनों के नक्शे के साथ RNAs की मशीन का इस्तेमाल करता है । इस दृष्टिकोण प्रत्यक्ष और छोटे विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता के लिए डेटा का विश्लेषण है । इसके अलावा, इस विधि के लिए अनुकूलनीय है अंय आरएनए एंजाइमों को संशोधित एंजाइमों सहित, कि covalently आरएनए के आणविक भार या जेल के माध्यम से एक आरएनए गतिशीलता बदल जाते हैं ।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल Ref. 24से अनुकूलित किया गया था ।

1. आरएनए और ब्याज की एंजाइम प्राप्त करें

  1. इन विट्रो में प्रयोग RNAs आंतरिक ३२पी के साथ लेबल, और रिकॉमबिनेंट His6-Mod5 में व्यक्त की और ई. कोलाईसे शुद्ध, के रूप में पहले24वर्णित है ।
    1. में परिचय इन विट्रो RNAs (धारा 3) unlabel्ड एटीपी की उपस्थिति में T7 आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर, UTP, CTP, GTP और 10 जेल के µ ci-शुद्ध, इथेनॉल-उपजी α-एटीपी, 1x ते में resuspend (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, ०.१ मिमी EDTA), और पर संग्रहीत-८० ° c 24.
  2. वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक उपलब्ध फ्लोरोसेंट ब्याज की RNAs लेबल प्राप्त करते हैं । किसी भी पसंदीदा अभिव्यक्ति प्रणाली में रुचि के एंजाइम (एस) का उत्पादन ।
    चेतावनी: आरएनए में आंतरिक फ्लोरोसेंट टैग एंजाइमों द्वारा आरएनए संरचना और मान्यता को बदल सकते हैं ।

2. एक 20% Polyacrylamide Denaturing जेल तैयार

नोट: आरएनए टुकड़े के पर्याप्त संकल्प प्राप्त करने के लिए, एक ४० cm लंबाई ऊर्ध्वाधर स्लैब जेल की सिफारिश की है । इस्तेमाल जेल की चौड़ाई नमूनों की संख्या से निर्धारित होता है विश्लेषण किया जाना है ।

  1. अच्छी तरह से साफ गिलास प्लेटें । सबसे पहले, साबुन और पानी से धो, पानी के साथ अच्छी तरह कुल्ला, और अंत में isopropanol और एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछे के साथ साफ ।
  2. प्लेटें और स्पेसर को इकट्ठा करें ।
  3. 20% acrylamide के १०० मिलीलीटर बनाने के लिए निम्नलिखित रिएजेंटों को मिलाएं, ७.५ एम यूरिया, 1x TBE जेल: ८० यूरिया जेल की एमएल ध्यान (२३७.५ g/acrylamide के एल, १२.५ जी/l के methylene bisacrylamide, ७.५ मीटर पानी में यूरिया), 10 मिलीलीटर यूरिया जेल मंदक (7.5 मीटर यूरिया में पानी) , और यूरिया जेल बफर के 10 मिलीलीटर (०.८९ मीटर Tris-बोराटे-20 मिमी EDTA बफर पीएच ८.३ और ७.५ मीटर यूरिया) ।
    नोट: जेल समाधान की मात्रा जेल के आयामों के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
  4. जोड़ें ४० µ एल के एन, एन, एन ′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) और हौसले से तैयार 10% अमोनियम µ (ए पी एस) के ८०० persulfate एल ।
  5. एक बड़ी सिरिंज में जेल समाधान ड्रा और कांच प्लेटों के बीच बांटना. बुलबुले के गठन को रोकने के लिए घनघोर जबकि उंगलियों के साथ कांच पर टैप करें ।
  6. 30 मिनट के लिए जमना के लिए जेल की अनुमति दें ।
  7. दबाना ऊर्ध्वाधर जेल उपकरण पर जम जेल बांधने की मशीन क्लिप्स का उपयोग ।
  8. 1x TBE के साथ ऊपरी और निचले बफर मंडलों भरें ।
  9. दो घंटे पहले जेल लोड करने के लिए, 20 mA पर जेल चलाने के पूर्व, 2 ज के लिए बफर सीमा की अनुमति के लिए सबसे छोटा oligonucleotides आगे बढ़ना-अंयथा सबसे छोटी न्यूक्लियोटाइड और oligonucleotides के लिए बफर मोर्चे पर गिर जाते हैं ।

3. आरएनए Isopentenylation परख

  1. 17 µ एल के एक अंतिम खंड में प्रतिक्रियाओं को तैयार, जिसमें ५८ एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ७.२), १.२ एमएम एटीपी, ५.८ एमएम MgCl2, ०.२ एमएम DMAPP, 10 यू ऑफ RNase अवरोधक (उदा., SuperRNaseIn), ४०,००० सीपीएम की आंतरिक रूप से ३२पी-लेबल आरएनए, ५.३ µ एम Mod5, और १.२ एमएम 2- mercaptoethanol ।
  2. 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन प्रतिक्रियाओं
  3. १००% इथेनॉल और 1/10 खंड (१.७ µ एल) के ३.५ एम सोडियम एसीटेट पीएच ५.५ के २.५ संस्करणों (४२.५ µ l) का उपयोग करते हुए इथेनॉल-हाला RNAs, और 1 ज या रात भर के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जगह ।
  4. १५,४०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आरएनए के नमूने केंद्रापसारक ।
  5. ध्यान से supernatant निकालें और ७०% इथेनॉल के ५०० µ एल के साथ आरएनए गोली धो.
  6. 5 मिनट १५,४०० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पर नमूने केंद्रापसारक ।
  7. ध्यान से supernatant और हवा सूखी आरएनए छर्रों 15 मिनट, या जब तक सभी इथेनॉल काफूर हो गया है के लिए निकालें ।
  8. 8 मीटर यूरिया के 10 µ एल में आरएनए छर्रों resuspend ।
  9. RNase T1 के १५० यू जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  10. 6x लोडिंग बफ़र के 2 µ l जोड़ें (६०% ग्लिसरॉल, ०.१% xylene cyanol) ।
  11. एक पूर्व-भागो, 20% polyacrylamide, ७.५ एम यूरिया जेल पर प्रत्येक आरएनए नमूना के 10 µ एल लोड (प्रोटोकॉल के खंड 2 देखें) ।
    नोट: Radiolabeled आरएनए आकार सीढ़ी एक अतिरिक्त गतिशीलता मार्कर के रूप में शामिल किया जा सकता है.
  12. 2 ज के लिए 25 mA में जेल चलाते हैं ।
  13. जेल बंद करो और उपकरण से निकालें ।
  14. दो गिलास प्लेटों के बीच तोड़ सील और ग्लास प्लेटों में से एक को हटा दें, "नीचे" प्लेट पर शेष जेल के साथ ।
    नोट: इस कदम के दौरान जेल फाड़ने के लिए नहीं ध्यान रखना ।
  15. जेल पर प्लास्टिक लपेटो की एक परत प्लेस और 3 एच के लिए एक फॉस्फोरस स्क्रीन पर बेनकाब, वैकल्पिक रूप से, क्रोमैटोग्राफी कागज पर जगह जेल और एक जेल ड्रायर के साथ सूखी फास्फोरस स्क्रीन जोखिम से पहले ।
  16. एक फास्फोरस imager पर छवि फास्फोरस स्क्रीन ।

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Representative Results

Mod5 एक tyrosine tRNA या tRNA की उपस्थिति या अनुपस्थिति में serine DMAPP के साथ मशीन था । संशोधन प्रतिक्रिया के बाद, उत्पादों RNase T1-पचा रहे थे, जो सभी guanosines के 3 ' अंत एक 3 ' guanosine monophosphates (जीएमपी)24 (चित्रा 1) जा सट । RNAs के पूर्ण पाचन radiolabeled टुकड़े (चित्रा 2) है, जो तब एक 20% polyacrylamide denaturing जेल पर हल कर रहे है की एक उंमीद के मुताबिक पैटर्न पैदा करता है । DMAPP से आरएनए के लिए एक isopentenyl समूह के हस्तांतरण संशोधित अवशेषों (चित्रा 1) से युक्त टुकड़ा की गतिशीलता बदलाव का कारण बनता है ।

इस प्रोटोकॉल मज़बूती से दोनों विहित और गैर विहित tRNA Mod524द्वारा संशोधित isopentenylation का पता लगाता है । उदाहरण के लिए, Mod5 tRNAs का एक सबसेट को संशोधित करने के लिए भविष्यवाणी की है, जिसमें पहले वर्णित एएए36-38 अनुक्रम आवश्यकता10, tyrosine tRNA और serine tRNA इस अध्ययन में इस्तेमाल किया शामिल है । Mod5 DMAPP की उपस्थिति में अनुमानित अवशेषों को संशोधित करता है के रूप में पाली 10 nt एएए36-38 tyrosine tRNA (चित्रा 2) में टुकड़ा युक्त द्वारा संकेत दिया है । इसी तरह, जब serine tRNA Mod5 और DMAPP, 10 nt एएए36-38 टुकड़ा युक्त की एक पूरी पारी के साथ मशीन है मनाया (चित्रा 2सी) । दिलचस्प है, एक 7 nt टुकड़ा की एक आंशिक बदलाव देखा है कि एएए36-38 (चित्रा 2सी) शामिल नहीं है । इन आंकड़ों का सुझाव है कि एएए36-38 अनुक्रम और संरचना इन विट्रो गतिविधि में Mod5 के लिए आवश्यक नहीं हैं; तथापि, LC-ms/ms या अंय विधियों का उपयोग कर भविष्य के अध्ययनों में संशोधन की सटीक रासायनिक प्रकृति की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ परख का चित्रण । tRNA, आंतरिक ३२पी के साथ लेबल-adeonsine, एस cerevisiae tRNA isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ (Mod5) के साथ, और एटीपी के साथ या DMAPP के बिना मशीन दिखाया गया है । पदों A36-A38 anticodon क्षेत्र से सटे संकेत कर रहे हैं । लाल तारक radiolabeled न्यूक्लियोटाइड प्रतिनिधित्व करते हैं । बाद की मशीन, RNAs RNase T1, निकाले के साथ पचा रहे हैं, और 20% denaturing द्वारा हल-पृष्ठ । tRNA के लिए DMAPP से एक isopentenyl समूह के हस्तांतरण ट्रो के दौरान एक मंदबुद्धि बैंड द्वारा संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : RNase T1 पाचन नक्शा और एक isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ परख के प्रतिनिधि परिणाम. (क) काले त्रिकोण RNase T1 दरार साइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रिकोण के ऊपर काले लाइनों जिसके परिणामस्वरूप टुकड़े कि कम से एक ३२पी-लेबल adenosine शामिल प्रतिनिधित्व करते हैं । ग्रे प्रकाश डाला अवशेषों मैं6एक संशोधन साइटों (यानी, A37) की भविष्यवाणी कर रहे हैं । (ख) Tyrosine tRNA और (ग) serine tRNA ३२पी-adenosine के साथ आंतरिक रूप से लेबल किए गए थे. एस cerevisiae isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़, Mod5, उपस्थिति या DMAPP की अनुपस्थिति में प्रत्येक आरएनए के साथ मशीन था । RNAs तो RNase T1 के साथ पचा रहे थे और denaturing पृष्ठ पर हल । DMAPP पर निर्भर खिसकाया बैंड एक संशोधित आरएनए अवशेषों की उपस्थिति का संकेत मिलता है । अनुमानित संशोधन साइट, A37, रेखांकित किया गया है, और संशोधित A37 अवशेषों को तारांकन चिह्न के साथ इंगित किया गया है । एक अप्रत्याशित और उपंयास संशोधन साइट की पहचान की है और के रूप में संकेत दिया "मैं6ए?" । यह आंकड़ा पढ़िए एट अल से संशोधित किया गया है । 24 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

आरएनए संशोधनों को सेलुलर और जीव समारोह में कभी अधिक महत्वपूर्ण और विविध भूमिकाओं को निभाते हुए दिखाया जाना चाहये. जैसे, परख के विकास के लिए पूछताछ करने के लिए आरएनए संशोधित एंजाइमों बेहतर जीव विज्ञान के बुनियादी पहलुओं को समझने के लिए केंद्रीय है । इस प्रोटोकॉल में एक उच्च संकल्प इन विट्रो परख का वर्णन करने के लिए Mod5 के tRNA संशोधन गतिविधि विशेषताएं ।

इस प्रोटोकॉल एक प्रत्यक्ष प्रदान करने का विशिष्ट लाभ है, और आसानी से isopentenylation के व्याख्यात्मक readout । प्रोटोकॉल isopentenyl transferases के मजबूत जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है वर्णित है । इसके अलावा, इस प्रणाली एंजाइम वेरिएंट या संशोधित आरएनए सब्सट्रेट के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, भूमिकाओं के प्रत्यक्ष निर्धारण के लिए अनुमति देता है कि विशिष्ट अवशेषों या डोमेन संशोधन पर है । भी अधिक से अधिक संकल्प हासिल करने के लिए, इस प्रोटोकॉल को आसानी से ऐसे RNase P1 और/या RNase एक है, जो सभी चार न्यूक्लियोटाइड पर या सी और यू, क्रमशः में सट के रूप में अंय RNases, के साथ समानांतर डाइजेस्टs शामिल अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस परख की एक सीमा है कि यह अपेक्षाकृत कम प्रवाह है और इस प्रकार कम RNAs कि व्यावहारिक रूप से आरएनए-अनुक्रमण और जन स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण३४की तुलना में विश्लेषण किया जा सकता है । इसलिए, यह अनुशंसित नहीं है कि इस प्रोटोकॉल जो आरएनए संशोधन साइटों transcriptome चौड़ा की पहचान करने के उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । इस प्रोटोकॉल के जांचकर्ताओं के लिए सबसे उपयोगी है जो एक विशेष ब्याज की विशेष RNAs के साथ एंजाइम संशोधित आरएनए की जांच में रुचि रखते हैं । हालांकि, आरएनए संशोधनों की पहचान करने के लिए प्रयुक्त कई transcriptome व्यापक तरीके से एक संशोधित न्यूक्लियोटाइड के लिए एक रासायनिक moiety के अलावा आबंध की आवश्यकता होती है । इस विधि एक सस्ते और कुशल परख जहां एक एक व्यक्ति सब्सट्रेट पर संशोधन प्रोटोकॉल परीक्षण के लिए एक transcriptome व्यापक प्रयास४०करने से पहले रासायनिक संशोधन का अनुकूलन कर सकता है प्रदान करता है । यद्यपि यह प्रोटोकॉल isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए एक सरल और प्रत्यक्ष परख प्रदान करता है, क्योंकि यह यहां वर्णित है, कुल आरएनए अंश का केवल प्रतिशत संशोधित किया जा सकता है और समूहों के बीच तुलना की जा सकती है । मात्रात्मक एंजाइम गतिविधि तुलना बनाने में रुचि शोधकर्ताओं पहले एंजाइम की एकाग्रता प्रति गतिविधि की इकाइयों की गणना करना चाहिए.

इस विधि की सफलता कुछ महत्वपूर्ण कदम पर भारी निर्भर करता है । यह महत्वपूर्ण है कि सेना के हित की अखंडता की पुष्टि की isopentenylation से पहले है । आरएनए नमूना के क्षरण से पहले isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ परख आरएनए संशोधन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है और डेटा व्याख्या पाया. इसके अलावा, इस तरह के क्षरण RNase T1 पाचन जगह ले ली है के बाद का पता लगाने के लिए मुश्किल है । इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है कि आरएनए अखंडता denaturing पृष्ठ द्वारा जाँच की है. इसके अलावा, पूरी तरह से और सही आरएनए संशोधन की हद तक की विशेषता के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है RNase T1 पाचन पूरा करने के लिए रवाना हो गया है. अतिरिक्त RNases, जैसे RNase P1 और/या RNase A, RNase T1 के साथ समानांतर में RNAs को पचाने के लिए उपयोग किया जा सकता है इस परख के संकल्प को बढ़ाने के लिए । ज्ञात लंबाई और अनुक्रम की Radiolabeled oligonucleotide सीढ़ी और अपच वाली आरएनए के नमूनों का उपयोग पाचन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है. अंत में, कुछ एंजाइमों के लिए, संशोधन की विशिष्टता "सही ढंग से" तह राज्य में किया जा रहा है आरएनए पर निर्भर करता है । जबकि सबसे tRNAs इन विट्रो में संश्लेषित संरचनाओं में अपने vivo संरचना में जैसी गुना, इस RNAs के अन्य वर्गों के लिए कम निश्चित है, विशेष रूप से अब RNAs४१के साथ.

हालांकि प्रोटोकॉल वर्णित tRNAs के Mod5 isopentenylation के लिए विशिष्ट है, इस विधि को आसानी से अंय आरएनए संशोधित एंजाइमों कि covalently एक रासायनिक moiety है कि महत्वपूर्ण आणविक वजन या जेल गतिशीलता बदल जोड़ने की विशेषता अनुकूलित किया जा सकता है आरएनए.

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कोई नहीं ।

Acknowledgments

हम उनके मार्गदर्शन और इस पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए डॉ डेविड Engelke शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । PJS-बॉल स्टेट यूनिवर्सिटी लेबोरेटरी स्टार्टअप फंड; ढाब-ग्रांट 1R15AI130950-01 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
UreaGel Concentrate National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Diluent National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Buffer National Diagnostics EC-833 As part of a kit
10x TBE National Diagnostics EC-833 As part of a kit
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich 7727-54-0
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Boric acid Sigma-Aldrich 10043-35-3
EDTA Sigma-Aldrich 60-00-4
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
DMAPP Caymen Chemical 1186-30-7
Super RNaseIN ThermoFisher Scientific AM2694
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
Ethanol Sigma-Aldrich 64-17-5
Sodiume acetate Sigma-Aldrich 127-09-3
Rnase T1 ThermoFisher Scientific EN0541
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
Xylene cyanol Sigma-Aldrich 2650-17-1
Equipment and Supplies
Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Vertical gel apparatus The Gel Company S2-3040
50 mL disposable syringe Fisher Scientific 03-377-26
Stainless steel binder clips Idea Scientific 1066
Phosphoscreen Sigma-Aldrich 28-9564-74
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