Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, bir aracılı baculovirus böcek hücre ifade sistemi ile ev sinek carboxylesterase proteinler vitro üretmek ve daha sonra işlevsel olarak Permetrin, metabolize onların rolleri böylece, karakterize bir protokol pyrethroid veriyor mevcut rezistansının hücre tabanlı MTT tahlil ve vitro metabolik çalışmalar yürütmektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Carboxylesterase-aracılı metabolizma çeşitli böcek böcek ilacı direnci önemli bir rol oynamaktadır düşünülmektedir. Böcek ilacı direnci veriyor onların rolleri keşfedilmeyi kaldı, ancak birkaç carboxylesterase genler dayanıklı ev sinek gerginliği, yukarı düzenlenir bulunamadı. Burada, biz bir protokol carboxylesterases fonksiyonel karakterizasyonu için tasarlanmıştır. Üç örnek deneyler sunulmaktadır: (1) ifade ve yalıtım carboxylesterase protein aracılığıyla bir baculovirus-aracılı böcek Spodoptera frugiperda (Sf9) hücre ifade sistemi; (2) bir hücre tabanlı MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromür) böcek hücreleri toleransları farklı Permetrin tedavilere; ölçmek için sitotoksisite tahlil ve carboxylesterases doğru Permetrin metabolik yeteneklerini keşfetmek için (3) vitro metabolik çalışmaları. MdαE7 dayanıklı bir evden klonlanmış carboxylesterase gen soy ALHF sinek ve Sf9 hücreleri enfeksiyon için rekombinant baculovirus oluşturmak için kullanılan. Hücre viabilities farklı Permetrin tedaviler karşı MTT tahlil ile ölçüldü. Permetrin için denetim gruplarının (kedi-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri ve GFP-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) ile karşılaştırıldığında deney grubu (MdαE7-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) Gelişmiş hücre toleransları tedaviler MdαE7 yeteneklerini böylece hücrelerin kimyasal zararlardan korunması, böcek öldürücüler, metabolize önerdi. Bunun yanı sıra, carboxylesterase proteinler böcek Sf9 hücrelerde ifade ve vitro metabolik çalışma yapmak için izole. Bizim sonuçları önemli vitro bir metabolik verimlilik MdαE7 Permetrin, doğrudan böcek ilaçları metabolize içinde carboxylesterases tutulumu gösteren doğru belirtilen ve böylece evde böcek ilacı direnci veriyor uçar.

Introduction

Böcek ilacı direnç Şu anda evi sinek denetim dünya çapında1,2önemli bir konudur. Böcek ilacı direnç mekanizmasının belirlemek için çabaları bu konunun daha iyi anlamayı kolaylaştırır ve böylece etkili önlemek veya direnç geliştirme3yayılmasını en aza indirmek için roman stratejileri sağlamak. Carboxylesterases, bir büyük detoksifikasyon enzimler olarak iyon ve böcek öldürücüler çeşitli böcekler4,5,6metabolize rolleri için ilgi çok çekmiştir. Bizim önceki çalışma evi sinekler içinde birden çok carboxylesterases tespit etti ve onların ifade düzeyleri sadece yapısal dayanıklı ALHF zorlanma yukarı düzenlenir değildi ama aynı zamanda yanıt olarak Permetrin tedaviler7 indüklenen için daha yüksek düzeyde olabilir . Ancak, böcek ilaçları metabolize içinde bu carboxylesterase gen işlevsel karakterizasyonu keşfedilmeyi kalır.

Erken 1980'li yıllarda8ilk raporda beri yabancı gen baculovirus-aracılı ifade sistem yaygın olarak yüksek protein üretim verimliliği ve ökaryotik protein yetenekleri9işleme nedeniyle istihdam edilmiştir. Bu ikili sistem iki temel unsurdan oluşur: konak hücreleri ve büyük ölçekli ifade rekombinant baculovirus tarafından enfekte hücreleri tarafından baktılar proteinlerin içine yabancı gen teslim inşa rekombinant baculovirus. Son on yıl boyunca baculovirus aracılı hücre ifade sistem yaygın rekombinant proteinler membran bağlı proteinler arasında böcek sitozolik enzimler arasında değişen, binlerce üretmek için kullanılmıştır ve10memeli hücreleri. Bizim önceki çalışma başarıyla birden fazla CYP450 enzimleri bu sistem11ile böcek Sf9 hücrelerdeki dile getirdi. Bu çalışmada, böcek Sf9 hücre bulaştırmak için bir carboxylesterase-rekombinant baculovirus inşa, farklı Permetrin tedaviler ve büyük ölçekli ifade carboxylesterase proteinler vitro için hücre tolerans incelenmiştir fonksiyonel keşif. Önceki çalışmalar12,13tarafından kabul edilen birden çok carboxylesterase izozim karışımları böcek homogenates üzerinden araştıran yerine, bu böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistemi belirli ifade sağlar ve biyokimyasal ve yapısal özelliklerini daha iyi karakterizasyonu için hedeflenen proteinlerin yalıtım.

Tetrazolium tuz tabanlı tahlil (MTT) geliştirilen ve hücre canlılığı ölçmek için optimize edilmiş yüksek üretilen iş kolorimetrik yöntemi olduğunu. Bu tahlil sadece canlı hücreler sarı renkli MTT reaktif colorimetrically sonra çözünmüş organik çözücüler14'analiz edilebilir bir koyu mor renkli formazan çökelti için metabolize yeteneğine mekanizması dayanır, 15. Birkaç daha doğru ama Trypan mavi dışlama ve timidin titrasyon tahlil16,17, gibi zaman alan yöntemleri son yıllarda geliştirilmiştir. Ancak, hücre tabanlı MTT tahlil hala şu anda hızlı bir şekilde hücre canlılığı algılamak için en hızlı ve kolay işletilen yöntemi olarak tanınır. Burada, böcek ilacı tedaviler karşı hücre tolerans keşfetmek için MTT tahlil kullanırız. Güçlü carboxylesterase rekombinant baculovirus ile enfekte hücreleri geliştirilmiş dayanıklılık için böcek öldürücüler, buna karşılık onların katılımı böcek ilacı direnç www.cdc.gov/drugresistance öneriyor carboxylesterases metabolik rolleri destekleyen.

Ayrıca, bir vitro metabolik tahlil de bu çalışma yapılmıştır. Carboxylesterases hydrolytic faaliyetleri yansıtmak için α-napthyl asetat (α-NA) ve β-naftil asetat (β-NA) gibi ortak yüzeylerde kullanın genel carboxylesterase deneyleri ile karşılaştırıldığında, vitro metabolik çalışma doğru bir yol kabul edilmektedir doğrudan carboxylesterases böcek öldürücüler18doğru faaliyetlerinin ölçmek için. Bu yöntem başarılı bir şekilde çeşitli böcek böcek ilacı direnç11,19,20ile birlikte birden çok sitokrom P450s karakterize etmek için istihdam edilmiştir. Ancak, bu yöntem henüz carboxylesterase çalışmalarda uygulanmamıştır. Baculovirus-aracılı ifade sistem tarafından üretilen carboxylesterase proteinler durumu ile daha da güçlü kanıtı sağlayabilir Permetrin doğru carboxylesterases bir vitro metabolik çalışma gerçekleştirebilirsiniz pyrethroid direnç içinde ev veriyor, carboxylesterases, uçar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ifade ve yalıtım bir böcek hücre Baculovirus-aracılı ifade sistemi ile hedef proteinlerin

  1. Directionally evi sinekler üzerinden hedef proteinlerin PCR ürünleri künt uçlu klon.
    1. PCR astar yeşil flüoresan protein (GFP) ve ev sinek MdαE7 gene onların dizileri ve seçtikleri vektörü (Tablo 1) özel gereksinimleri temel tasarım.
    2. Bir transfer, prova-okuma DNA polimeraz ve astar adım 1.1.1 150 µL PCR reaksiyon (30 µL tepki arabelleği, 10 mM dNTPs, DNA polimeraz 1,5 µL, ev sinek şablon DNA, ileri astar 7.5 µL 6 µL 3 µL yapmak için kullanın Bir son Hacim 150 µL su ile ters astar 7.5 µL). PCR reaksiyon için 30 98 ° c ısı 35 98 ° C devredir 10 ardından s, s, 53 ° C 30 s ve 72 ° C 60 s ve sonra son bir uzantısı için 2 dk 72 ° C'de).
      1. % 1'özel jel ile 150 µL PCR ürününün çalıştırın.
    3. Özel hedef DNA parçalardan jel keskin, temiz neşterle tüketim: 1317 bp MdαE7 ve 858 için bp GFP için. Piyasada bulunan jel ekstraksiyon kiti üreticisinin protokolüne (Malzemeler tablo) kullanarak DNA arındırmak. 15 µL distile su içinde saf DNA geçiyoruz.
    4. % 1'özel jel bütünlüğünü kontrol etmek için saf DNA 1 µL ile çalıştırın. Saf DNA'ın başka bir 1 µL konsantrasyonları ile spektrofotometre ölçmek için kullanın.
  2. Bir giriş plazmid hedef proteinler için inşa
    1. Klonlama tepki kadar ayarla. Mix taze DNA ürün--dan adım 1.1.3 saflaştırılmış ve ticari olarak mevcut giriş vektörler içeren attL-siteleri (Tablo reçetesi) molar oranı 1:1 (0,5-2 70-200 ng/µL konsantrasyonlarda taze PCR ürününün µL: 0.5 µL vektör). Daha sonra piyasada bulunan tuz solüsyonu (1, 2 M NaCl2 ve 0,06 M MgCl2) 1 µL ekleyin ve bir final hacmi 6 µL. için su ekleyin karışımı yavaşça ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. Kimyasal olarak yetkili E. coli 50 µL içine adım 1.2.1 reaksiyon ürünleri klonlama 4 µL aktarım hücreleri. 30 dk. Isı şok buz üzerinde 30 için hücreleri kuluçkaya s sallayarak olmadan bir 42 ° C su banyosunda.
    3. Tüp buz için başka bir 2 dk. eklemek 250 µL oda sıcaklığında S.O.C. Orta (%2 tryptone % 0.5 maya ekstresi 10 mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM glikoz) geri koyun. Hafifçe sallayarak ile 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. 50-200 µL adım 1.2.3 seçici LB tabaklarda (1 g tryptone NaCl 1 g Maya ekstresinin 0.5 g; 1,5 g 100 mL distile su içinde çözünmüş agar. bakteriyel kültürünün yaymak Basınçlı kap ve %0,1 50 mg/mL sefaloridin ekleyin). LB plakalar koloni büyüme için 37 ° C'de 16 h için kuluçkaya.
    5. 5-10 kolonileri alın ve onları tek tek askıya 5 µL distile su yeniden.
    6. PCR reaksiyon arabelleği 5 µL, 10 mM dNTPs 0.5 µL, DNA polimeraz, askıya alınan kolonilerin 1 µL, 10 µM M13 ileri astar 1,25 µL 0,25 µL ekleyerek gerçekleştirmek, hedef gen ve su son hacmiyle 25 µL. 10 µM ters astar 1,25 µL PCR ısı reaksiyon 98 ° c 30 35 98 ° C devredir 10 ardından s, s, 53 ° C 30 s ve 72 ° C 60 s ve sonra 2 dk (Tablo 1) için 72 ° C'de son bir uzantısı.
    7. Adım 1.2.5 (100 mL 0,17 M KH2PO4 ve 0,72 M K2HPO4 ile 6 g tryptone, 12 g Maya ve 2 mL içeren taban suyu orta 450 mL içeren fosfat tampon TB medyada askıya alınan kolonilerin 3 µL yeniden kültür sterilize, gliserol, %0,1 50 mg/mL sefaloridin içeren) için 16 h. üreticisinin protokol sonrası ultra-saf plazmid DNA ayıklayın.
    8. 1.2.7. adımdaki ticari Sanger kullanım 200 ng/µL ultra-saf plazmid M13 ileriye ve geriye doğru astar ile sıralama. Vektör üreticisi tarafından sağlanan sıra harita dayalı hedef gene doğru ekleme doğrulayın.
    9. -20 ° c ' MdαE7 ve GFP sıra doğrulanmış ultra-saf plazmid DNA örnekleri depolamak
      Not: Bu giriş plazmid DNA MdαE7 ve GFP vardır.
  3. Rekombinant baculovirus Lambda rekombinasyon (LR) tepkimesi gerçekleştirerek oluşturmak.
    1. Sırasıyla, 300 ng/µL giriş plazmid DNA GFP, MdαE7 adım 1.2.7 veya giriş plazmid DNA ile ticari olarak kullanılabilir (içeren attL siteleri) 5 µL hücre transfection kit tarafından sağlanan Kloramfenikol Asetiltransferaz gen (CAT) 1 µL mix C-terim doğrusal DNA ( attR siteleri içeren) 250 µL PCR tüpleri '. Toplam hacmi 8 µL yapmak TE arabellek ekleyin.
      Not: GFP ve kedi reaksiyonları kontrol grubu kullanılmıştır.
    2. Piyasada bulunan Lambda rekombinasyon (LR) enzim karışımı (Tablo reçetesi) her adım 1.3.1 LR reaksiyonu katalizler karışımı içine 2 µL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 25 ° C gece (≈16 h) kuluçkaya.
      Not: LR tepki bir attL içeren giriş plazmid DNA bir attbir attB içeren ifade virüs oluşturmak için R içeren doğrusal DNA C-vade ile rekombinasyon kolaylaştırır. Bu adım her hedef protein için rekombinant baculovirus oluşturur.
    3. 1.3.2. adımdaki LR tepki ürünlerin 1 µL seyreltik 20 X. PCR bir Polyhedrin ileri astar ve V5 ters astar (Tablo 1) kullanarak gerçekleştirin. 5 µL PCR ürünlerinin kalite kontrol etmek için % 1'özel jel çalıştırmak için kullanın. Şekil 1 MdαE7 gen gelen LR reaksiyon ürünü bir örnek gösterir.

Figure 1
Şekil 1: örnek sonuçlarını PCR analizi ile MdαE7 LR tepki. 2 µL LR tepki 200-fold sulandırmak ve seyreltme Polyhedrin ileri astar ve V5 ters astar ile birlikte 2 µL 25 µL PCR gerçekleştirmek için kullanın. 5 µL PCR ürünlerinin % 1'özel jel LR tepki kalitesini kontrol etmek için çalıştırmak için kullanın. bir

  1. Böcek Sf9 hücre transfect
    1. Kültür böcek Sf9 hücrelerle T25 tam hücre büyüme orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS) ile orta serum içermeyen) 5 mL şişe 27 ˚C, tedavi.
    2. Süpernatant kaldırmak ve alt bağlı hücrelerle taze tam hücre büyüme orta 3 mL sifonu. 0.5 mL yeniden askıya alınan hücre yeni bir tedavi T25 şişesi aktarın. Tam büyüme orta 4.5 mL ekleyin. 27 ° C'de 3-4 gün öncesine kadar sonraki transfer için kuluçkaya.
    3. Tohum log fazı büyüme böcek Sf9 2 mL kültür hücreleri (≈3.0-5.0 × 106 hücreler) hücre kültürü iyi üzerinde eşit olarak. Hücreleri başlıklı oda sıcaklığında en az 3 h için eklemek izin verir.
    4. Hücre ek bir ters faz mikroskop vasıl 250 X ile gözlemleyerek kontrol edin. Hücre kültür orta kaldırın ve Grace'in böcek Orta 2 mL ile değiştirin.
    5. Transfection karışımı A çözüm (100 µL Grace'in böcek orta ile piyasada bulunan hücre enfeksiyon reaktif (Tablo reçetesi) 8 µL) ve transfection karışımı B çözüm her hedef gen (9 µL LR reaksiyon ürünleri adım 1.3 hazırlamak unsupplemented Grace'in böcek orta 100 µL ile) 1,5 mL santrifüj kapasitesi tüpler, anılan sıraya göre.
    6. Transfection karışımı A ve B birlikte tüpler dokunarak karışımı yavaşça. Başlıklı 35 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. Eşit olarak adım 1.4.4 adımından 1.4.6 dropwise numaralı seribaşı hücreleri üzerine karışımı ekleyin. Wells bantlar ile mühür ve 27 ° C'de gecede kuluçkaya.
    8. Grace'in böcek Orta 2 mL tam büyüme orta 2 mL ile değiştirin. Rekombinant baculovirus karşı olumsuz seçmek için her kuyuya 100 µM Gansiklovir ekleyin. Wells teyp ile mühür ve 72 h 27 ° C'de kuluçkaya.
    9. 72 h sonrası enfeksiyon hücre kültür orta her kuyudan toplamak ve 1,5 mL santrifüj tüpleri için transfer. 4 ° C'de hücreler veya büyük enkaz kaldırmak için 5 min için 1.500 x g, santrifüj kapasitesi.
    10. Süpernatant yeni 1,5 mL santrifüj tüpler içine aktarın. Onlara ışık koruma 4 ° C'de depolayın.
      Not: P1 virüs hisse senedi çözümleri her hedef gen için bunlar.
    11. Düşük-titresi P1 viral stok (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) bir yüksek titresi P2 viral stok (5 × 107-1 × 108 pfu/mL) yükseltmek.
    12. Tohum log fazı büyüme böcek Sf9 2 mL kültür hücreleri (≈3.0-5.0 × 106 hücreler) hücre kültürü iyi üzerinde eşit olarak. Hücreleri başlıklı oda sıcaklığında en az 3 h için eklemek izin verir.
    13. P1 virüs stokunun de adımı 1.4.12, sırasıyla seribaşı adımda 1.4.10 hücre elde 5 µL aşılamak. Daha sonra her şey için 100 µM Gansiklovir ekleyin. Kuyu mühür ve 72 h 27 ° C'de kuluçkaya.
    14. P2 virüs hisse senedi çözümleri 72 h sonrası enfeksiyon toplamak. Işık koruma 4 ° C'de depolayın.
      Not: Bu P2 virüs hisse senedi çözümleri her hedef gen vardır.
    15. (İsteğe bağlı) Adımları 1.4.12-1.4.14 P3 virüs hisse senedi çözümleri toplamak için P2 virüs stokunun 5 µL ile yineleyin.
      Not: Bu P3 virüs hisse senedi çözümleri her hedef gen vardır.
    16. Tüm inşa baculovirus ışık koruma 4 ° C'de depolayın.
      Not: GFP ve kedi gen kontrol grubu servis. Şekil 2 farklı amplifikasyon aşamalarında GFP-rekombinant baculovirus tarafından enfekte hücreleri belirtileri gösterdi.

Figure 2
Resim 2: Sf9 enfekte belirtileri örneği hücreleri farklı baculovirus amplifikasyon aşamalarında. Rakam GFP-rekombinant baculovirus hücreleri altında doğal ışık ve floresan ışık gösterir. P1 enfeksiyon aşamada enfeksiyon oranı düşüktür. P2 enfeksiyon aşamada enfeksiyon oranı önemli ölçüde geliştirilmiş oldu. P3 enfeksiyon aşamada hücre çapı, hem de hücre büyümesini kesilmesi hemen hemen tüm hücreleri hücre kültür plaka, dekolmanı belirtileri gösterdi artırır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Böcek Sf9 hücrelerdeki hedef proteinlerin büyük ölçekli ifade
    1. Kültür günlük faz büyüme böcek Sf9 hücre T25 olmayan tedavi şişeler ortamda tam büyüme ile 10 mL.
    2. 1.5.1. adımda 72 h hücre kültürleri bulaştırmak için 200 µL P2 virüs hisse senedi çözüm (1.4.14. adımda elde) ekleyin.
    3. 72 h sonrası enfeksiyon hücre kültür orta toplamak. 4 ° C'de 5 min için 1.500 x g, santrifüj
    4. 1 mL 0.1 M PBS arabelleği (pH 7.5) ile iki kez süpernatant ve yıkama granül atmak.
    5. Tam olarak hücre topakları böcek hücre proteini ayıklama & lizis arabellek (Tablo reçetesi) 1 mL ile geçiyoruz. % 10 gliserol hücre lizis ekleyin. Hemen-80 ° C'de depolayın
    6. Adımları 1.5.1-1.5.5 P2 virüs hisse senedi çözüm kontrol grubu hizmet etmek için kedi proteinlerin ile yineleyin.
      Not: 1.5 nüsha olarak farklı protein hazırlıkları adımları yineleyin.

2. bir hücre tabanlı MTT sitotoksisite tahlil

  1. Kültür günlük faz büyüme (1.5-2.5 × 106 hücre/mL) böcek Sf9 hücre T25 olmayan tedavi şişeler ortamda tam büyüme ile 5 mL.
  2. 2.1. adımda nazik sallayarak 27 ˚C ile 48 h hücre kültürleri bulaştırmak için P1 virüs hisse senedi çözüm (1.4.14. adımda elde) 25 µL ekleyin.
  3. 100 mM Asetonitril Permetrin standart stok çözümlerinde hazırlayın. Asetonitril 50 mM, 25 mM, 12,5 mM ve 6.25 mM 500 µL, 250 µL, 125 µL ve 62.5 µL Permetrin hisse senedi çözüm toplam hacmi çok 1000 µL, sırasıyla ekleyerek sulandırmak için kullanın.
  4. Eşit olarak 2 × 105 hücre/mL yoğunluğu 24-şey plaka içine tam büyüme orta 300 µL ile desteklenmiş adım 2.2 enfekte hücre kültürleri 200 µL tohum.
  5. Permetrin standart çözümleri (6.25 mM, 12,5 mM, 25 mM ve 50 mM) 4 µL son konsantrasyonu 50 µM, 100 µM, 200 µM ve 400 µM, sırasıyla yapmak için her kuyuya ekleyin. Sadece Asetonitril 4 µL kuyular için hücre canlılığı hesaplamaları (Şekil 3) içine ekleyin.
  6. Plakalarının bantları ve ışık koruma ile 48 h 27 ° C'de kuluçkaya.
  7. 5 mg/mL MTT (Thiazolyl mavi Tetrazolium bromür) reaktif arabellekte çözünmüş hazırlamak (NaCl, KCl, 0,05 g 2.0 g 0,36 g NaH2PO4∙2H2O, NaH2PO4, 0,05 g 0,28 g KH2PO4 çözünmüş 200 mL distile su, pH 7.5).
  8. Hücre kültür orta adım 2.6 48 h kuluçka sonra alt bağlı hücre katmanı dokunmadan kaldırın. 200 µL MTT reaktif adım 2.7 her kuyuya ekleyin. Her şey (Şekil 3) oluşan koyu mor formazan precipitates kadar 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
  9. Koyu mor formazan her şey formunda precipitates kadar 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Tam precipitates (Şekil 3) çözülmeye DMSO 500 µL ekleyin.

Figure 3
Şekil 3: örnek MTT sonuçları. 48 saat sonra kedi gen bir 24-şey hücre kültür plaka ifade eşit olarak tohum 500 µL hücreleri kedi rekombinant baculovirus çözüm, P1 virüs hisse senedi çözümü ile enfeksiyon sonrası. Sırasıyla, 50 µM, 100 µM, 200 µM ve 400 µM nihai toplama yapmak için her satırda farklı bir doz (6.25 mM, 12,5 mM, 25 mM ve 50 mM), 4 µL Permetrin ekleyin. Denetim satır sadece Asetonitril ile tedavi ve plaka CK işaretlenmiş. (A) sonra kuluçka 27 ° C'de 48 h, hücre kültürü orta üst katmandaki atmak ve sarı renkli MTT reaktifler 200 µL ile değiştirin. Sonra 48 h. koyu mor renkli azaltma her şey hayatta kalma hücreleri sarı renk metabolize yeteneğine sahip olduğunu gösteren form precipitates için 37 ° C'de MTT reaktifler koyu mor renkli çökelti kuluçkaya. (B) 500 µL DMSO solvent kurulan çökelti çözülmeye her kuyuya eklendi. Her absorbans değeri de 540, spektrofotometre tarafından algılandı nm. Permetrin konsantrasyonları arttıkça, rengi koyu kırmızı ışık kırmızı hücre viabilities yavaş yavaş azalma düşündüren, yavaş yavaş değişir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Çözünmüş çözüm 200 µL 96-şey plaka aktarın. Ölçmek absorbans değerleri, 540 nm Mikroplaka Okuyucu (Tablo reçetesi) kullanarak.
  2. Hücre canlılığı bu sadece tedavi Asetonitril hücre ile tedavi Permetrin hücrelerin absorbans değerleri karşılaştırarak hesaplayın.
  3. Kontrol grubu için Kloramfenikol Asetiltransferaz (CAT) Rekombinant baculovirus 1.4. adımda elde P2 virüs hisse senedi çözümü ile tüm adımları yineleyin.
  4. 4 kez farklı virüs hazırlıkları için yineleyin.

3. Vitro metabolik tahlil

  1. 100 mM Asetonitril Permetrin standart stok çözümlerinde hazırlayın. Asetonitril 50 mM, 25 mM, 12,5 mM ve 6.25 mM sulandırmak için kullanın. HPLC kullanarak her konsantrasyon altındaki karşılık gelen en yüksek alan tespit. Oluşturmak ve farklı Permetrin konsantrasyonları ile en yüksek alanına bağlı Permetrin standart eğri hesaplamak.
  2. Adım 1.5 Bradford yöntemleri21ile protein konsantrasyonları ölçmek.
  3. 700 µL 40 µM Permetrin standart metabolik reaksiyon ve proteinlerin 0.2 M Tris-HCl tampon (pH 7,4) çözünmüş adım 1.5 elde 1 mg hazırlamak. Nazik sallayarak ile 2 h 30 ° C'de kuluçkaya. Işıktan korumak.
  4. Reaksiyon buz gibi Asetonitril 700 µL ekleyerek gidermek. Nazik sallayarak ile başka bir 30 dk 30 ˚C, kuluçkaya. Işıktan korumak.
  5. 16.000 x g oda sıcaklığında 2 min için tepki karisimin santrifüj kapasitesi. Süpernatant ve 0,45 µm membran filtreden toplamak. Filtrasyon HPLC analiz için ultraclean kahverengi cam şişe içine aktarın.
  6. HPLC (mobil faz A: % 90 Asetonitril ve % 10 su; optimal kromatografik koşullar altında çalıştırmak PH %2.3 85 fosforik asit ile için mobil faz B: %5 Asetonitril ayarlanabilir). Degrade elute 1 mL/dk ve bir dalga boyu, ölçü 232 bir akış oranı ile nm.
  7. Eklendi protein örnek reaksiyonlar ile karşılaştırarak Permetrin tükenmesi yüzdesini hesaplamak.
  8. 1.5.6. adımda elde kedi protein denetimi olarak sunmak için kullanır.
  9. 1.5.7. adımda farklı protein ürünleri ile tüm adımları yineleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre canlılığı farklı Permetrin tedaviler (ÇMT tahlil) doğru

Permetrin sitotoksisite MdαE7-rekombinant enfekte baculovirus Sf9 hücreleri (deney grubu) ve kedi-rekombinant (enfekte baculovirus kit tarafından sağlanan) baculovirus enfekte hücreleri (kontrol grubu) incelenmiştir. Gelişmiş hücre toleransları için hücreleri kuvvetle ifade Permetrin MdαE7 içinde bu carboxylesterase böcek öldürücüler ve böylece koruma hücreleri kimyasal zararlardan karşı metabolik rollerini destekler. Bizim çalışmada, farklı Permetrin konsantrasyonları karşı hücre canlılığı (50, 100, 200 ve 400 µM) ile karşılaştırıldığında Asetonitril ile tedavi hücreleri hesaplanmıştır. Sonuçlarımız hücreleri ifade MdαE7 canlılık (%101.92 %86,00 arasında değişen) daha yüksek olduğunu gösterdi (Şekil 4B) kontrol hücreleri (%81.43 %67.59 arasında değişen) daha (Permetrin böcek hücrelerde metabolize MdαE7 önemli roller belirten Permetrin farklı konsantrasyonlarda maruzŞekil 4A).

Figure 4
Şekil 4: farklı Permetrin uygulamaları altında böcek Sf9 hücrelerinin viabilities. (A) kontrol hücreleri canlılığı kedi rekombinant baculovirus tarafından (B) MdαE7 rekombinant baculovirus tarafından enfekte deneysel hücre canlılığı bulaşmış. Dört çoğaltmalar her Permetrin konsantrasyon için yapılmıştır. Verileri ortalama ± SEM gösterildi Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Permetrin MdαE7 tarafından in vitro metabolizma

Permetrin metabolizma bir 40 µM Permetrin standart çözüm enfekte Sf9 hücrelerinden çıkarılan MdαE7 proteinleri birlikte kuluçka tarafından denetlesinler. KEDİ proteinler ile tepkiler denetimleri görev yaptı. Permetrin tükenmesi yüzdesi reaksiyonlar ile karşılaştırıldığında eklendi enzim hesaplanır. Tepkiler 120 dk kuluçka döneminden sonra ters fazlı HPLC tarafından takip. Aslında bir karışımı, CIS - ve trans-İzomerler, Permetrin standart bu yana iki doruklarına 10,67 min ve 10,87 min elüsyon kez trans-Permetrin ve CIS-Permetrin, HPLC kromatografik profilleri sırasıyla gözlendi (Şekil 5). MdαE7 protein (%39.18±3.78) tarafından Permetrin tükenmesi yüzdesi önemli ölçüde kedi protein (%7.29±0.81) daha yüksek (Şekil 6), hangi sadece ÇMT'tutarlı değil var olmak olduğunu sonuç ama aynı zamanda doğrudan Permetrin vitrometabolize MdαE7 yeteneklerini gösterir.

Figure 5
Şekil 5: HPLC profili, Permetrin standart. Bu çalışmada kullanılan standart Permetrin trans-Permetrin ve CIS Permetrin izomerler karışımıdır. Kırmızı oklar tepeler için trans-Permetrin izomer ve CIS Permetrin izomer, sırasıyla gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Permetrin MdαE7 ve kedi rekombinant proteinler tarafından in vitro metabolizma. MdαE7 ve kedi proteinler tarafından Permetrin tükenmesi yüzdeleri hesaplanır. Üç çoğaltmalar her Permetrin konsantrasyon için yapılmıştır. Verileri ortalama ± SEM gösterildi Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Son yıllarda, kapaklı ifade sistemleri yaygın olarak hızlı ve büyük miktarda protein, böylece biyokimyasal ve fonksiyonel belirlenmesi ve enzimler vitrokarakterizasyonu izin izole etmek için kullanılmıştır. Bugüne kadar Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeve Spodoptera frugiperda gibi birkaç farklı model sistemleri Rekombinant protein ifade ve seçim için adapte edilmiştir vitro sistem baktılar proteinler22,23,24,25büyük ölçekli oluşturulmasında önemlidir. Bu böcek hücreleri benzer bir hücre içi ortamı sağlar ve bazı önemli ökaryotik işleme yetenekleri tutar çünkü bizim çalışmada, ev sinek carboxylesterases üretmek için böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem seçildi 9. baculovirus-aracılı ifade sisteminin avantajları rağmen aynı zamanda kendi sınırlamaları ele alınmalıdır. Sadece böcek hücreleri ile inşa rekombinant baculovirus bulaşmış olduğunu Eğer böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistemi hedef proteinler üretebilir. Geçerli geliştirme stabil dönüştürülmüş böcek hücre satırları oluşturma sadece yapısal baculovirus enfeksiyon yokluğunda baktılar proteinleri üretmek için aynı zamanda glycosylating ve katlama hücre yeteneklerini geliştirmek için mümkün kıldı oluşturulan proteinler ile mühendislik değişiklikleri9.

Daha iyi böcek öldürücüler hücrelerde metabolize ve böylece hücrelerin kimyasal zararlardan korumak carboxylesterases rollerini araştırmak için MTT tahlil hücre sitotoksisite karşı farklı Permetrin tedavi ölçmek için yapılmıştır. Bu işlem sırasında deneysel parametreleri cep orta besteleri, hücre büyüme hızı, konsantrasyon ve enerji kaynağı metabolitleri, tüketimi gibi hücre metabolizması ile ilgili bir sürü MTT azaltma etkisi ve böylece için yanlış yol sonuçlar. Üzerinde en aza indirmek için / küçümseme MTT testin tutmak hücre kültür orta, hücre büyüme devlet ve kuluçka koşulları farklı deneysel tedaviler26arasında tutarlı. Baculovirus enfeksiyon olarak Permetrin yerine neden olduğu hücre canlılığı etkileri belirlemek için GFP-rekombinant baculovirus böcek Sf9 hücrelere enfeksiyon sürecinin gösterdi ve P2 enfeksiyon aşamada hücreleri en yüksek bulduk enfeksiyon oranı ile en düşük hücre ölüm oranı ile karşılaştırıldığında diğer enfeksiyon aşamaları (Şekil 2). MTT tahlil yapmak için P2 enfeksiyon aşamada hücreleri seçme nedeni daha iyi açıklayabilirim.

Bir ÇMT çalışmada MdαE7 ve kedi rekombinant baculovirus tarafından enfekte hücreleri viabilities karşılaştırarak, gelişmiş bir canlılık hücre carboxylesterases Permetrin için metabolik rollerini daha iyi destekleyebilir MdαE7 proteinler ifade edilirken bulduk böcek hücrelerinde ve kimyasal zararlardan (Şekil 4) hücreleri korumak. Carboxylesterases böcek öldürücüler doğru metabolik yeteneklerini yansıtacak şekilde doğrudan bir yöntem olarak tanınan, vitro metabolik çalışma gerektiğini de be keşfedilmeyi MTT tahlil sınırlamaları daha iyi dengelemek için protein karakterize metabolik işlevleri.

Bu çalışmada, carboxylesterases baculovirus-aracılı ifade sistemiyle, hücre viabilities farklı Permetrin tedaviler MTT tahlil tarafından doğru ölçümü ve karakterizasyonu böcek Sf9 hücrelerdeki Contegra ifade carboxylesterases bir vitro metabolizma ile birlikte detoksifikasyon enzimler böceklerde, böylece böcek ilacı daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak rollerini araştırmak için sistemli, bilimsel ve doğru bir strateji sağlamak için tüm iş tahlil direnç mekanizmaları ve böylece gelişmekte olan yenilikçi stratejiler haşere yönetimi için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107, (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65, (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22, (12), 1583 (2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7, (1), 587 (2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90, (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114, (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235, (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22, (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22, (12), 1583 (2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, (2), 211 (2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69, (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574, (2), 193-203 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics