Functionele karakterisering van Carboxylesterases in Insecticide resistente huis vliegt, Musca Domestica

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een protocol om te produceren huis vliegen carboxylesterase eiwitten in vitro met een baculovirus gemedieerde insect cel expressie systeem en later functioneel karakteriseren van hun rollen in metaboliseringssysteem permethrin, daarmee overdracht van pyrethroïde weerstand door het uitvoeren van cel-gebaseerde MTT assay en in vitro metabole studies.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Carboxylesterase-gemedieerde metabolisme wordt beschouwd als een belangrijke rol spelen in insecticide resistentie bij verschillende insecten. Meerdere carboxylesterase genen bleken omhoog-geregeld in de resistente huis vliegen stam, terwijl hun rol in de overdracht van het insecticide resistentie bleef om te worden onderzocht. Hier, ontwierpen we een protocol voor de functionele karakterisering van carboxylesterases. Drie voorbeeld experimenten worden gepresenteerd: (1) expressie en isolatie van proteïnen van de carboxylesterase door een insect van baculovirus-gemedieerde Spodoptera frugiperda (Sf9) systeem voor de expressie van de cel; (2) een cel-gebaseerde MTT (3-[5-dimethykthiazol-2-yl 4] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) cytotoxiciteit assay voor het meten van de tolerantie van insect cellen tot verschillende permethrin behandelingen; en (3) in vitro metabole studies om te verkennen de metabole mogelijkheden van carboxylesterases naar permethrin. Het carboxylesterase gen MdαE7 werd gekloond uit een resistente huis vliegen stam ALHF en gebruikt voor de constructie van een recombinant baculovirus voor Sf9 cellen infectie. De viabilities van de cel tegen verschillende permethrin behandelingen werden gemeten met de MTT-test. De verbeterde cel tolerantie van de experimentele groep (MdαE7-recombinant baculovirus geïnfecteerde cellen) vergeleken met die van de controlegroepen (CAT-recombinant baculovirus geïnfecteerde cellen en GFP-recombinant baculovirus geïnfecteerde cellen) naar permethrin behandelingen voorgesteld de mogelijkheden van MdαE7 in de stofwisseling van insecticiden, waardoor de bescherming van cellen tegen chemische schade. Daarnaast werden carboxylesterase eiwitten uitgedrukt in insect cellen van de Sf9 en om uit te voeren van een metabole studie in vitro geïsoleerd. Onze resultaten aangegeven een aanzienlijke in vitro metabole efficiëntie van MdαE7 naar permethrin, direct de betrokkenheid van carboxylesterases in de stofwisseling van insecticiden die aangeeft en dus de toekenning van insecticide resistentie in huis vliegt.

Introduction

Insecticide resistentie is momenteel een groot probleem voor huis vliegen controle wereldwijd1,2. Inspanningen om het mechanisme van insecticide resistentie vergemakkelijkt beter begrip van deze kwestie en bieden daardoor nieuwe strategieën om effectief voorkomen of minimaliseren van de verspreiding van resistentie ontwikkeling3. Carboxylesterases, hebben als een van de grote Detoxificatie-enzymen, aangetrokken veel aandacht voor hun rollen in vastleggen en insecticiden in verschillende insecten4,5,6hen te metaboliseren. Onze vorige studie geconstateerd meerdere carboxylesterases in huis vliegt en hun expressie niveaus waren niet alleen constitutively omhoog-geregeld in de resistente stam van de ALHF maar kunnen ook geïnduceerde naar hogere niveaus in reactie op permethrin behandelingen7 . De functionele karakteristieken van deze carboxylesterase genen in de stofwisseling van insecticiden moeten echter nog worden onderzocht.

Sinds het eerste verslag in de vroege jaren 19808, heeft een baculovirus-gemedieerde buitenlandse gen expressie systeem wijd uitgeoefend vanwege de hoge eiwit productie-efficiëntie en het eukaryotische eiwit verwerking mogelijkheden9. Deze binaire systeem bestaat uit twee essentiële elementen: de geconstrueerde recombinante baculovirus leveren van vreemde genen in de cellen van de gastheer, en de grootschalige uitdrukking van interesse eiwitten door cellen besmet door recombinant baculovirus. In de afgelopen decennia, het baculovirus gemedieerde cel expressie systeem is wijd verbeid gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, variërend van cytosolische enzymen aan membraan-gebonden eiwitten in insect duizenden en zoogdier cellen10. Onze vorige studie heeft met succes meerdere CYP450 enzymen in insect cellen van de Sf9 met dit systeem11. In deze studie, we gebouwd een carboxylesterase-recombinant baculovirus om insecten Sf9 cellen infecteren, onderzocht de tolerantie van de cel voor verschillende permethrin behandelingen, en grootschalige uitgedrukt carboxylesterase eiwitten in vitro voor functionele verkenning. In plaats van het onderzoeken van meerdere carboxylesterase isozyme mengsels van insecten homogenates zoals aangenomen door de vorige studies12,13, dit insect cel baculovirus-gemedieerde expressie systeem maakt het mogelijk de specifieke expressie en isolatie van gerichte eiwitten voor betere karakterisering van de biochemische en structurele eigenschappen.

De tetrazolium zout gebaseerde bepaling (MTT) is een high-throughput colorimetrische methode ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het meten van de levensvatbaarheid van de cellen. Deze test is gebaseerd op het mechanisme dat alleen levende cellen hen metaboliseren het geel uitdrukkingsloos MTT reagens aan een donkere paarse gekleurde formazan neerslag, die kan worden colorimetrisch geanalyseerd kunnen nadat opgelost in organische oplosmiddelen14, 15. Verschillende nauwkeuriger maar tijdrovende methoden, zoals Trypan blauwe uitsluiting en de thymidine titratie assay16,17, ontwikkeld in de afgelopen jaren. De MTT cel-gebaseerde bepaling is echter nog steeds erkend als de meest snelle en gemakkelijk bediende methode voor snel opsporen levensvatbaarheid van de cellen. Hier, gebruiken we de MTT-test om te verkennen de tolerantie van de cel tegen insecticide behandelingen. De verbeterde tolerantie van cellen wanneer geïnfecteerd met carboxylesterase recombinante baculovirus sterk ondersteunt de metabole functies van carboxylesterases tot insecticiden, die op zijn beurt suggereert hun betrokkenheid in insecticide resistentie.

Bovendien werd een in vitro metabole test ook uitgevoerd in deze studie. Vergeleken met de algemene carboxylesterase tests waarmee gemeenschappelijke substraten zoals α-napthyl acetaat (α-nvt) en β-naphthyl-acetaat (β-nvt) weerspiegelen Hydrolytische activiteiten van carboxylesterases, wordt de in vitro metabole studie beschouwd als een accurate manier direct meten activiteiten van carboxylesterases naar insecticiden18. Deze methode heeft met succes gewerkt in verschillende insecten te karakteriseren van meerdere cytochroom P450s i.s.m. insecticide resistentie11,19,20. Echter, deze methode heeft nog niet vereffend in carboxylesterase studies. Met de beschikbaarheid van carboxylesterase-eiwitten geproduceerd door baculovirus-gemedieerde expressie systeem, we kunnen het uitvoeren van een in vitro metabole studie van carboxylesterases naar permethrin, die verder harde bewijzen voor de betrokkenheid kan bieden van carboxylesterases in de toekenning van pyrethroïde weerstand in huis vliegt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. weergave en isolatie van Target proteïnen met een Insect cel Baculovirus-gemedieerde expressie systemen

  1. Gerichte kloon blunt-ended PCR producten van doel eiwitten uit huis vliegt.
    1. Ontwerp PCR inleidingen van groen fluorescent proteïne (GFP) en het huis vliegen MdαE7 gen gebaseerd is op hun reeksen en de bijzondere noden van de gekozen vector (tabel 1).
    2. Een thermostable, corrigeren polymerase van DNA- en grondlagen uit stap 1.1.1 gebruiken voor het uitvoeren van een 150 µL PCR reactie (30 µL van reactie buffer, 3 µL van 10 mM dNTPs, 1.5 µL van polymerase van DNA, 6 µL van huis vliegen sjabloon DNA, 7,5 µL voorste primer 7,5 µL van omgekeerde primer, met water tot een eindvolume 150 µL). Verwarm de PCR reactie op 98 ° C gedurende 30 s, gevolgd door 35 cycli van 98 ° C voor 10 s, 53 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 60 s, waarna een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 2 minuten).
      1. Een 1% agarose gel met 150 µL van het PCR-product worden uitgevoerd.
    3. Accijnzen in het target-DNA-fragmenten van het agarose gel met een scherpe, schone scalpel: 1317 bp voor MdαE7 en 858 bp voor GFP. Het zuiveren van het DNA met behulp van commercieel verkrijgbare gel extractie kit volgens fabrikant protocol (Tabel van materialen). Los van het gezuiverde DNA in 15 µL van gedistilleerd water.
    4. Voer een 1% agarose gel met 1 µL van gezuiverde DNA om integriteit te controleren. Gebruik een ander 1 µL van gezuiverde DNA voor het meten van de concentraties met de spectrofotometer.
  2. Bouwen van een plasmide vermelding voor doel eiwitten
    1. Instellen van de klonen reactie. Mix vers gezuiverd DNA producten uit stap 1.1.3 en verkrijgbare vermelding vectoren met attL-sites (Tabel of Materials) bij een molaire verhouding van 1:1 (0.5-2 µL van verse PCR product bij 70-200 ng/µL concentraties: 0,5 µL vector). Dan Voeg 1 µL van verkrijgbare zoutoplossing (NaCl, 1,2 M2 en2MgCl 0.06 M) en voeg water toe tot een eindvolume van 6 µL. meng zachtjes en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    2. Breng 4 µL van het klonen reactieproducten in stap 1.2.1 in 50 µL van chemisch bevoegde E. coli cellen. Incubeer op ijs voor 30 min. warmte-schok de cellen voor 30 s in een waterbad van 42 ° C zonder schudden.
    3. Zet de buis terug in ijs voor een ander 2 min. 250 toevoegen µL van kamertemperatuur S.O.C. medium (2% trypton; 0,5% gistextract; 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM glucose). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur met voorzichtig schudden.
    4. Verspreiden van 50-200 µL van de bacteriecultuur in stap 1.2.3 op de selectieve LB platen (1 g trypton 1 g NaCl; 0,5 g gistextract; 1.5 g van agar opgelost in 100 mL gedestilleerd water. Autoclaaf en toevoegen van 0,1% van 50 mg/mL kanamycine). Incubeer LB platen gedurende 16 uur bij 37 ° C voor de groei van de kolonie.
    5. Kies 5-10 kolonies en resuspendeer hen individueel in 5 µL van gedistilleerd water.
    6. PCR uitvoeren door toevoeging van 5 µL van reactie buffer, 0,5 µL van 10 mM dNTPs, 0,25 µL van de polymerase van DNA, 1 µL van zwevende kolonies, 1,25 µL van 10 µM M13 voorwaartse primer, 1,25 µL van 10 µM omgekeerde primer van de target-gen, en water tot een eindvolume van 25 µL. Verwarm de PCR reactie op 98 ° C gedurende 30 s, gevolgd door 35 cycli van 98° C voor 10 s, 53 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 60 s, waarna een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 2 minuten (tabel 1).
    7. Opnieuw cultuur 3 µL van zwevende kolonies uit stap 1.2.5 in TB media (100 mL fosfaatbuffer met 0,17 M KH2PO4 en 0,72 M K2HPO4 met 450 mL basis Bouillon opslagmedium met 6 g trypton, 12 g gist en 2 mL glycerol, gesteriliseerd, met 0,1% 50 mg/mL kanamycine) voor 16 h. uitpakken Ultra zuivere plasmide DNA volgens protocol van de fabrikant.
    8. Gebruik 200 ng/µL Ultra zuivere plasmide uit stap 1.2.7 voor commerciële Sanger sequencing met M13 inleidingen voor forward en reverse. Controleer of de juiste invoeging van het target-gen in vector gebaseerd op de kaart van de reeks geboden door fabrikant.
    9. Opslaan van de reeks-geverifieerd Ultra zuivere plasmide DNA-monsters van MdαE7 en GFP in-20 ° C.
      Opmerking: Dit zijn de vermelding plasmide DNA van MdαE7 en GFP.
  3. Een recombinante baculovirus bouwen door het uitvoeren van Lambda recombinatie (LR) reactie.
    1. Respectievelijk, meng 1 µL van 300 ng/µL vermelding plasmide DNA van GFP, MdαE7 uit stap 1.2.7 of vermelding plasmide DNA van chlooramfenicol acetyltransferase gen (CAT) verstrekt door de cel transfectie kit met 5 µL van commercieel beschikbare (met attL sites) C-termijn lineaire DNA (met attR sites) in 250 µL PCR buizen. Toevoegen TE buffer zodat een totaal volume van 8 µL.
      Opmerking: De reacties van GFP en CAT werden gebruikt als controlegroep.
    2. Voeg 2 µL van verkrijgbare Lambda recombinatie (LR) enzym mix (Tabel van materialen) in elk mengsel van stap 1.3.1 te katalyseren van de LR-reactie. Zacht mengen en Incubeer bij 25 ° C's nachts (≈16 h).
      Opmerking: De reactie van LR vergemakkelijkt de recombinatie van een attL-bevattende vermelding plasmide DNA met een attR-bevattende C-termijn lineaire DNA voor het genereren van een attB-bevattende waarin virus. Deze stap produceert de recombinante baculovirus voor elke doelgroep proteïne.
    3. Verdunnen 1 µL van LR reactieproducten uit stap 1.3.2 20 X. Het uitvoeren van PCR met behulp van een Polyhedrin doorsturen primer en V5 reverse primer (tabel 1). Gebruik 5 µL van het PCR producten wilt uitvoeren van een 1% agarose gel om te controleren van de kwaliteit. Figuur 1 toont een voorbeeld van de LR reactieproduct van het MdαE7-gen.

Figure 1
Afbeelding 1: voorbeeld van de resultaten van MdαE7 LR reactie door PCR analyse. Verdun 2 µL van LR reactie 200-fold en 2 µL van verdunning samen met Polyhedrin vooruit primer en V5 omgekeerde primer gebruiken voor het uitvoeren van een 25 µL PCR. Gebruik 5 µL van het PCR producten wilt uitvoeren van 1% agarose gel om te controleren de kwaliteit van LR reactie. een

  1. Transfect insecten Sf9 cellen
    1. Cultuur insect Sf9 cellen met 5 mL van de volledige cel groeimedium (serumvrij gemiddeld met 10% foetale runderserum (FBS)) in T25 behandeld kolven op 27 ˚C.
    2. Verwijder het supernatant en spoelen onder vastgehechte cellen met 3 mL verse volledige cel groeimedium. 0,5 mL opnieuw zwevende cellen overbrengen in een maatkolf van nieuwe T25 behandeld. Voeg 4.5 mL volledige groeimedium. Incubeer bij 27 ° C gedurende 3-4 dagen tot de volgende overdracht.
    3. Zaad 2 mL log-fase groei insect Sf9 cellen cultuur (≈3.0-5.0 × 106 cellen) gelijkmatig op de cultuur van de cel goed. Cellen toevoegen voor ten minste 3 uur bij kamertemperatuur in de kap toestaan.
    4. Controleer de cel bijlage door het observeren van met een omgekeerde fase Microscoop op 250 X. Het kweekmedium cel verwijderen en vervangen van 2 mL van Grace insect medium.
    5. Bereiden van transfectie mengsel A oplossing (8 µL van verkrijgbare cel infectie reagens (Tabel of Materials) met 100 µL van Grace insect medium) en transfectie mengsel B oplossing van elk doel-gen (9 µL van LR reactieproducten uit stap 1.3 met 100 µL van unsupplemented Grace insect medium) in 1,5 mL Centrifugeer buizen, respectievelijk.
    6. Meng voorzichtig transfectie mengsel A en B samen door te tikken op de buizen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 35 minuten in de kap.
    7. Toevoegen het mengsel gelijkmatig uit stap 1.4.6 ontkleuring op de geplaatste cellen uit stap 1.4.4. Zegel van putjes met tapes en na een nacht bebroeden bij 27 ° C.
    8. Vervang 2 mL van Grace insect medium met 2 mL volledige groeimedium. Voeg 100 µM ganciclovir in elk putje negatief tegen niet-recombinant baculovirus selecteren. Zegel van putten met tape en Incubeer bij 27 ° C gedurende 72 uur.
    9. 72 h post infectie cel kweekmedium van elk putje verzamelen en overbrengen van 1,5 mL centrifuge buizen. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C om cellen of grote puin te verwijderen.
    10. Breng het supernatant in nieuwe 1,5 mL centrifuge buizen. Bewaar ze bij 4 ° C met bescherming tegen licht.
      Nota: Dit zijn de P1 virus voorraadoplossingen voor elk doel-gen.
    11. Versterken van de lage-titer P1 virale voorraad (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) met een hoge titer P2 virale voorraad (5 × 10-7-1 × 108 pfu/mL).
    12. Zaad 2 mL log-fase groei insect Sf9 cellen cultuur (≈3.0-5.0 × 106 cellen) gelijkmatig op de cultuur van de cel goed. Cellen toevoegen voor ten minste 3 uur bij kamertemperatuur in de kap toestaan.
    13. Inoculeer 5 µL van P1 virus materieel verkregen in stap 1.4.10 in de cel zaadjes goed van stap 1.4.12, respectievelijk. Dan, voeg 100 µM ganciclovir aan elk putje. Zegel van putten en Incubeer bij 27 ° C gedurende 72 uur.
    14. P2 virus voorraadoplossingen van 72 h post infectie verzamelen. Bewaren bij 4 ° C met bescherming tegen licht.
      Nota: Dit zijn de P2 virus voorraadoplossingen voor elk doel-gen.
    15. (Optioneel) Herhaal stappen 1.4.12-1.4.14 met 5 µL van P2 virus materieel voor het verzamelen van P3 virus stamoplossingen.
      Nota: Dit zijn de P3 virus voorraadoplossingen voor elk doel-gen.
    16. Bewaar alle gebouwde baculovirus bij 4 ° C met bescherming tegen licht.
      Opmerking: Het GFP en kat gen waren diende als controlegroep. Figuur 2 toonde de tekenen van cellen wanneer septisch tegen GFP-recombinant baculovirus in verschillende versterking stadia.

Figure 2
Figuur 2: voorbeeld van besmette tekenen van Sf9 cellen in verschillende baculovirus amplificatie stadia. De figuur toont het GFP-recombinant baculovirus cellen onder natuurlijke licht en TL licht. In het stadium van de infectie P1 is de verhouding van de infectie laag. In het stadium van de infectie P2, was de verhouding tussen de infectie aanzienlijk verbeterd. In het stadium van de infectie P3, bijna alle cellen bleek symptomen van onthechting van cel cultuur plaat, stijging van de diameter van de cel, alsook de beëindiging van de celgroei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Grootschalige expressie van doel proteinen in insecten Sf9 cellen
    1. Cultuur 10 mL log fase groei insect Sf9 cellen met volledige groei mediumvloeistof in kolven van T25 niet-behandelde.
    2. Voeg 200 µL van P2 virus stockoplossing (verkregen in stap 1.4.14) te infecteren celculturen in stap 1.5.1 gedurende 72 uur.
    3. Verzamelen van 72 h post infectie cel kweekmedium. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    4. Gooi supernatant en wassen pellets tweemaal met 1 mL 0,1 M PBS buffer (pH 7.5).
    5. Volledig los cel pellets met 1 mL insect cel eiwit extractie & lysis-buffermengsel (Tabel van materialen). Voeg toe 10% glycerol lysis van de cel. Onmiddellijk opslaan bij-80 ° C.
    6. Herhaal stappen 1.5.1-1.5.5 met P2 virus stockoplossing van CAT eiwitten om te dienen als de controlegroep.
      Let op: Herhaal stap 1.5 in drievoud voor verschillende eiwit preparaten.

2. een bepaling van de cytotoxiciteit cel-gebaseerde MTT

  1. Cultuur 5 mL log fase groei (1,5-2,5 × 106 cellen/mL) insect Sf9 cellen met volledige groei mediumvloeistof in kolven van T25 niet-behandelde.
  2. Voeg 25 µL van P1 virus stockoplossing (verkregen in stap 1.4.14) om te infecteren celculturen in stap 2.1 voor 48 h met zacht schudden bij 27 ˚C.
  3. Bereiden 100 mM permethrin standaard voorraadoplossingen in acetonitril. Hiermee kunt u dat acetonitril Verdun tot 50 mM, 25 mM, 12,5 mM en 6,25 mM door toevoeging van 62,5 µL permethrin stockoplossing, 500 µL, 250 µL en 125 µL in een totaal volume van 1.000 µL, respectievelijk.
  4. Gelijkmatig zaad 200 µL van geïnfecteerde celculturen uit stap 2.2 aangevuld met 300 µL van volledige groeimedium in 24-well plaat duikt met een bevolkingsdichtheid van 2 × 105 cellen/mL.
  5. Voeg 4 µL van permethrine standaardoplossingen (6,25 mM 12,5 mM, 25 mM en 50 mM) in elk putje te maken een eindconcentratie 50 µM, 100 µM, 200 µM en 400 µM, respectievelijk. Voeg alleen 4 µL van acetonitril in putten voor cel levensvatbaarheid berekeningen (Figuur 3).
  6. Zegel van de platen met tapes en Incubeer bij 27 ° C gedurende 48 h met bescherming tegen licht.
  7. Bereiden van 5 mg/mL MTT (Thiazolyl blauwe Tetrazolium Bromide) reagens opgelost in buffer (2,0 g NaCl, KCl, 0,05 g 0,36 g van NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g van NaH2PO4, 0,05 g van KH2PO4 in 200 mL opgelost gedistilleerd water, pH 7.5).
  8. Cel kweekmedium uit stap 2.6 na 48 uur broedtijd verwijderen zonder het aanraken van de bodem-ingeschrevenen cellaag. Voeg 200 µL van MTT reagens in stap 2.7 in elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur tot donker paars formazan precipitaten gevormd in elk putje (Figuur 3).
  9. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur tot donker paars formazan vorm in elk putje precipitaten. Voeg 500 µL van DMSO te ontbinden volledig precipitaten (Figuur 3).

Figure 3
Figuur 3: voorbeeld van MTT resultaten. Na 48u post infectie met P1 virus stockoplossing van CAT recombinante baculovirus oplossing, gelijkmatig zaad 500 µL cellen die CAT-gen uitdrukt in een 24-well cel cultuur plaat. Respectievelijk toevoegen 4 µL permethrin bij een verschillende dosis (6,25 mM 12,5 mM, 25 mM en 50 mM) in elke rij om de uiteindelijke concentratie tot 50 µM, 100 µM, 200 µM en 400 µM. De controle rij werd behandeld met alleen acetonitril en gemarkeerd als CK in de plaat. (A) na 48 uur broedtijd bij 27 ° C, het kweekmedium cel op de bovenste laag verwijderen en vervangen door 200 µL van geel gekleurde MTT reagentia. Vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende 48 h. donker paars gekleurde vermindering vorm precipitaten in elk goed die aangeeft dat de overleving cellen geschikt zijn voor de stofwisseling van de gele kleur MTT reagentia in het donker paars gekleurde neerslag. (B) 500 µL van DMSO oplosmiddel was toegevoegd aan elk putje te los het precipitaat op gevormd. De waarde van de extinctie van elk goed werd ontdekt door de spectrofotometer bij 540 nm. Zoals permethrin concentraties te verhogen, zal de kleur geleidelijk veranderen van donkerrood tot licht rood, wat suggereert dat de cel viabilities geleidelijk werden verlaagd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Breng 200 µL van opgeloste oplossing in 96-wells-plaat. Meten van de extinctie waarden bij 540 nm microplate lezer (Tabel of Materials) gebruikt.
  2. Levensvatbaarheid van de cellen berekenen door de waarden van de extinctie van permethrine behandeld cellen met die van alleen acetonitril behandeld cellen te vergelijken.
  3. Herhaal alle stappen met P2 virus stockoplossing van chlooramfenicol acetyltransferase (CAT) recombinant baculovirus verkregen in stap 1.4 voor de controlegroep.
  4. Herhaal 4 keer voor verschillende virus preparaten.

3. in Vitro metabole Assay

  1. Bereiden 100 mM permethrin standaard voorraadoplossingen in acetonitril. Hiermee kunt u dat acetonitril Verdun tot 50 mM, 25 mM, 12,5 mM en 6,25 mM. Detecteren van de overeenkomstige piekoppervlakte onder elke concentratie met behulp van HPLC. Maken en berekenen de standaard curve van permethrine op basis van de piekoppervlakte met verschillende permethrin concentraties.
  2. Het meten van de concentraties van de eiwitten in stap 1.5 met Bradford methoden21.
  3. 700 µL van metabole reactie met 40 µM permethrin standaard en 1 mg van eiwitten verkregen in stap 1.5 opgelost in 0,2 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) voorbereiden. Incubeer bij 30 ° C gedurende 2 uur met zacht schudden. Beschermen tegen licht.
  4. Doven de reactie door toevoeging van 700 µL van ijskoude acetonitril. Incubeer bij 30 ˚C voor een andere 30 min met zacht schudden. Beschermen tegen licht.
  5. Centrifugeer het reactiemengsel bij 16.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. De bovendrijvende vloeistof en filter door een 0,45 µm membraan te verzamelen. Breng de filtratie in ultraclean bruine glazen flesjes voor HPLC analyse.
  6. Voer de HPLC onder de optimale gaschromatografische omstandigheden (mobiele fase A: 90% acetonitril en 10% water; Mobiele fase B: 5% acetonitril aangepast aan de pH 2.3 met 85% fosforzuur). Kleurovergang Elueer met een debiet van 1 mL/min en maatregel bij een golflengte van 232 nm.
  7. Bereken het percentage van de uitputting van permethrine door te vergelijken met reacties zonder eiwitSteekproef toegevoegd.
  8. CAT-eiwit verkregen in stap 1.5.6 gebruiken om te dienen als het besturingselement.
  9. Herhaal alle stappen met de voorbereidingen van de verschillende eiwitten in stap 1.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De levensvatbaarheid van de cellen naar verschillende permethrin behandelingen (MTT assay)

De cytotoxiciteit van permethrine werd onderzocht in MdαE7-recombinant baculovirus besmet Sf9 cellen (experimentele groep) en CAT-recombinant baculovirus (verstrekt door baculovirus besmet kit) geïnfecteerde cellen (controlegroepen). De verbeterde cel toleranties aan permethrine in MdαE7 uitdrukken cellen sterk ondersteunen de metabolische functies van deze carboxylesterase tegen insecticiden en aldus voor de bescherming van cellen tegen chemische schade. In onze studie, de levensvatbaarheid van de cellen tegen verschillende permethrin concentraties (50, 100, 200 en 400 µM) werd berekend in vergelijking met cellen met acetonitril alleen behandeld. Onze resultaten toonden aan dat de levensvatbaarheid van de MdαE7 cellen uiten was aanzienlijk hoger (variërend van 86,00% tot 101.92%) (Figuur 4B) dan die van controle cellen (variërend van 67.59% naar 81.43%) (Figuur 4A) wanneer blootgesteld aan permethrin bij verschillende concentraties, die de belangrijke rol van MdαE7 in de stofwisseling van permethrine in insect cellen aangeeft.

Figure 4
Figuur 4: de viabilities van insecten Sf9 cellen onder verschillende permethrin behandelingen. (A) de levensvatbaarheid van cellen besmet door CAT recombinante baculovirus (B) de levensvatbaarheid van experimentele cellen septisch tegen MdαE7 recombinante baculovirus. Vier replicaties werden uitgevoerd voor elke concentratie permethrin. Gegevens bleek als gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In vitro metabolisme van permethrine door MdαE7

Permethrin metabolisme werd bepaald door een 40 µM permethrin standaardoplossing samen met MdαE7 eiwitten gewonnen uit de geïnfecteerde cellen van de Sf9 aan het broeden. De reacties met CAT eiwitten diende als besturingselementen. Het percentage van de uitputting van permethrine werd berekend in vergelijking met reacties zonder enzym toegevoegd. Reacties van gasten werden gecontroleerd door omgekeerde-fase HPLC na een incubatieperiode van 120 min. Aangezien de standaard permethrin eigenlijk een mengsel van cis - en trans-isomeren is, twee bergtoppen werden waargenomen in de HPLC chromatografische profielen, met de tijden van de elutie van 10,67 min en 10,87 min voor trans-permethrin en cis-permethrin, respectievelijk (Figuur 5). Het percentage van de uitputting van permethrine door MdαE7 eiwitten (39.18±3.78%) was aanzienlijk hoger dan die van CAT eiwitten (7.29±0.81%) (Figuur 6), die is niet alleen overeenstemming met MTT resultaten maar ook rechtstreeks demonstreert de mogelijkheden van MdαE7 in de stofwisseling van permethrine in vitro.

Figure 5
Figuur 5: The HPLC-Profiel van standaard permethrin. De permethrin standaard gebruikt in deze studie is een mengsel van isomeren van trans-permethrin en cis-permethrin. De rode pijlen geven de toppen voor de trans-permethrin isomeer en cis-permethrin isomeer, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: In vitro metabolisme van permethrine door MdαE7 en kat recombinante eiwitten. De percentages van de uitputting van permethrine door MdαE7 en kat eiwitten werden berekend. Drie replicaties werden uitgevoerd voor elke concentratie permethrin. Gegevens bleek als gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de afgelopen decennia hebben heterologe expressiesystemen wijd gebruikt om te uiten en isoleren van grote hoeveelheden eiwitten, waardoor biochemische en functionele vastberadenheid en karakterisering van enzymen in vitro. Tot op heden zijn verscheidene verschillende modelsystemen waaronder Escherichia coli, Sacccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisen Spodoptera frugiperda aangepast voor recombinant eiwit expressie, en de keuze van de in vitro systeem is van cruciaal belang voor grootschalige generatie interesse eiwitten22,23,24,25. In onze studie, werd het insect cel baculovirus-gemedieerde expressie systeem voor het genereren van huis vliegen carboxylesterases gekozen omdat het biedt een gelijkaardig intracellulaire milieu naar insect cellen en sommige belangrijke eukaryotische verwerkingsmogelijkheden onderhoudt 9. ondanks de voordelen van het baculovirus-gemedieerde waarin systeem, ook zijn beperkingen moeten worden aangepakt. Het systeem van insect cel baculovirus-gemedieerde expressie kan doel eiwitten produceren alleen als het insect cellen waren geïnfecteerd met geconstrueerde recombinante baculovirus. De huidige ontwikkeling van het creëren van stabiel getransformeerde insect cellijnen heeft daardoor niet alleen tot constitutively interesse eiwitten bij gebrek aan baculovirus infectie, maar ook ter verbetering van de mogelijkheden van de cel van glycosylating en vouwen gegenereerde proteïnen tot en met technische wijzigingen9.

Beter onderzoek doen naar de rol van carboxylesterases in de stofwisseling van insecticiden in cellen, en waardoor de bescherming van cellen tegen chemische schade, werd de MTT-assay voor het meten van de cytotoxiciteit cel tegen verschillende permethrin behandelingen uitgevoerd. Tijdens dit proces kan een heleboel experimentele parameters die zijn gekoppeld aan de celstofwisseling, zoals cel middellange composities, groei van de cel, concentratie en consumptie van energie levering metabolieten, invloed hebben op de reductie van MTT en daardoor leiden tot onjuiste resultaten. Om te minimaliseren van de meer dan / onderschatting van de MTT assay, het kweekmedium cel, cel groei staat en de incubatieomstandigheden consistent houden onder verschillende experimentele behandelingen26. Om te bepalen van de cel levensvatbaarheid effecten veroorzaakt door baculovirus infectie in plaats van permethrine, we toonden aan dat het proces van de infectie van het GFP-recombinant baculovirus naar insecten Sf9 cellen, en vond in het stadium van de infectie P2, de cellen hebben het hoogste de verhouding van de infectie met laagste cel dood verhouding in vergelijking met andere stadia van de infectie (Figuur 2). Dit kan de reden van het kiezen van cellen P2 infectie stadium te voeren de MTT assay beter uitleggen.

Door het vergelijken van de viabilities van cellen wanneer septisch tegen MdαE7 - en CAT-recombinant baculovirus in een MTT-studie, vonden we een verbeterde levensvatbaarheid van cellen als uiting van MdαE7 eiwitten, die beter de metabolische functies van carboxylesterases naar permethrin ondersteunen kunnen in insect cellen en cellen te beschermen tegen chemische schade (Figuur 4). De in vitro metabole studie, die wordt herkend als een directe methode om na te denken van de metabole mogelijkheden van carboxylesterases naar insecticiden, moet ook zijn onderzocht ter compensatie van de beperkingen van MTT assay beter karakteriseren van eiwit metabole functies.

In deze studie, de heterologe uitdrukking van carboxylesterases in insect cellen van de Sf9 met een expressie baculovirus-gemedieerde systeem, het meten van cel viabilities naar verschillende permethrin behandelingen door de bepaling van MTT, en de karakterisatie van carboxylesterases door middel van een metabolisme in vitro assay al werk samen om te zorgen voor een nauwkeurige, systematische en wetenschappelijke strategie om te onderzoeken van de rollen van detoxificatie-enzymen in de insecten, waardoor een beter begrip van insecticide resistentie mechanismen en daardoor ontwikkelen innovatieve strategieën voor de bestrijding van plagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107, (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65, (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22, (12), 1583 (2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7, (1), 587 (2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90, (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114, (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235, (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22, (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22, (12), 1583 (2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, (2), 211 (2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69, (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574, (2), 193-203 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics