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एक शुद्ध मोल्ड-पाड़ मुक्त तीन आयामी कार्डियक ऊतक निर्माण की विधि आधारित

Bioengineering

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Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शुद्ध मोल्ड आधारित विधि के लिए तीन आयामी पाड़-संतोषजनक संरचनात्मक अखंडता और तुल्यकालिक पिटाई व्यवहार के साथ मुक्त कार्डियक ऊतकों बनाने के लिए ।

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Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक उपंयास और आसान शुद्ध मोल्ड-विधि आधारित तीन आयामी (3-डी) अतिरिक्त पाड़ सामग्री के बिना हृदय के ऊतकों बनाने के लिए । मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes (iPSC-सीएमएस), मानव कार्डियक fibroblasts (HCFs), और मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) अलग कर रहे है और ७०% iPSC-सीएमएस, 15% HCFs, और 15% HUVECs के साथ एक सेल निलंबन उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया । वे सह रहे है एक अल्ट्रा कम लगाव "फांसी ड्रॉप" प्रणाली है, जो एक समय में spheroids के सैकड़ों संघनित्र के लिए micropores शामिल में संस्कृति । कोशिकाओं को समग्र और अनायास सह के 3 दिनों के बाद spheroids पिटाई के रूप में संस्कृति । spheroids काटा, एक उपंयास मोल्ड गुहा में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और मशीन में एक शेखर पर संस्कृति । spheroids एक परिपक्व कार्यात्मक ऊतक लगभग 7 दिनों के बोने के बाद हो जाते हैं । परिणामी multilayered ऊतकों संतोषजनक संरचनात्मक अखंडता और तुल्यकालिक पिटाई व्यवहार के साथ जुड़े spheroids से मिलकर बनता है । इस नई विधि एक reproducible और लागत प्रभावी विधि के रूप में भविष्य में दिल की विफलता के उपचार के लिए इंजीनियर ऊतक बनाने के लिए क्षमता का वादा किया है ।

Introduction

वर्तमान कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग के लक्ष्य के लिए एक चिकित्सा की जगह या संरचना और घायल रोधगलन1के समारोह की मरंमत के लिए विकसित करने के लिए है । 3-डी कार्डियक टिशू मॉडल बनाने के तरीके मूल कार्डियक ऊतक के महत्वपूर्ण सिकुड़ा और electrophysiological गुणों का प्रदर्शन तेजी से2,3का विस्तार किया गया है । रणनीतियों की एक किस्म का पता लगाया गया है और अध्ययन में इस्तेमाल किया4,5। इन तरीकों में विशिष्ट सिंथेटिक और प्राकृतिक जैव सक्रिय hydrogels के उपयोग से लेकर, जैसे जिलेटिन, कोलेजन, फाइब्रिन, और पेप्टाइड्स6, बायो-इंक साठा टेक्नोलॉजीज2 और प्रिंटिंग टेक्नोलॉजीज7.

यह दिखाया गया है कि पाड़ मुक्त तरीकों के रूप में तुलनीय ऊतकों का उत्पादन कर सकते है भौतिक आधारित तरीकों, विदेशी मचान सामग्री8शामिल की कमियां के बिना । Oren Caspi एट अल. प्रदर्शन किया है कि कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के शामिल उच्च संवहनी मानव इंजीनियर कार्डियक ऊतक9की पीढ़ी में सक्षम बनाता है । चिन एट अल. spheroids से कार्डियक पैच निर्माण के लिए एक 3-डी मुद्रण पद्धति विकसित की है । परिणामस्वरूप पैच एक 70:15:15 अनुपात10में cardiomyocytes, fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं से बना रहे हैं । Spheroids के लिए प्रभावी हो दिखाया गया है "निर्माण ब्लॉक" पाड़ के मुक्त कार्डियक ऊतक निर्माण, के रूप में वे हाइपोक्सिया के खिलाफ प्रतिरोधी रहे है और प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त यांत्रिक अखंडता के अधिकारी11,12। पिछले अध्ययनों से अंडाकार आकृति निर्माण के लिए कई निर्माण विधियों का प्रदर्शन किया है, फांसी छोड़ विधि के उपयोग सहित, स्पिनर कुप्पी13, microfluidic सिस्टम14, और गैर-अनुयाई संस्कृति बिना कोट या लेपित सतहों agarose माइक्रो मोल्ड्स15. इस प्रोटोकॉल में, हम हैंगिंग ड्रॉप डिवाइस का उपयोग करते हैं, जिसमें एक समय में सैकड़ों spheroids के लिए micropores होते हैं ।

यह अध्ययन एक उपंयास और कुशल पाड़ कार्डियक ऊतक निर्माण, जो मैंयुअल रूप से एक वर्ग मोल्ड गुहा में spheroids बोने और परिपक्वता के लिए एक शेखर पर ऊतक मशीन शामिल करने के लिए मुक्त विधि प्रस्तुत करता है । हमेशा की तरह स्थिर संस्कृति की स्थिति के तहत, ऑक्सीजन प्रसार ऊतक निर्माण के बाहरी पहलुओं के लिए सीमित है, केंद्रीय परिगलन में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि, नेट मोल्ड के साथ, सभी spheroids मोल्ड में वरीयता प्राप्त एक निरंतर द्रव गति के साथ मीडिया में डूबे हुए हैं, पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की वृद्धि प्रसार के लिए अनुमति दी । इसके अतिरिक्त, इस सांचे में ढालना आधारित विधि अलग के एक साथ निर्माण के लिए अनुमति देता है-ंयूनतम मैनुअल प्रयास के साथ ऊतक पैच आकार और परिणामी ऊतक आसानी से मोल्ड से हटाया जा सकता है । इस उपंयास विधि पाड़ मुक्त, multilayered कार्डियक पैच के कुशल और reproducible निर्माण के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

1. Cardiomyocytes की तैयारी

  1. कोट 6-अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और संस्कृति मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के साथ प्लेटें के रूप में पहले17वर्णित है ।
  2. hiPSC में hiPSCs अंतर-सीएमएस पहले वर्णित विधियों का उपयोग18
  3. 16-18 d पद-विभेदन में, प्रत्येक अच्छी तरह से cardiomyocytes को 2 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना, 1 मिलीलीटर/trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट के साथ मशीन द्वारा पीछा के साथ धोने के द्वारा निलंबित ( की तालिका देखें सामग्री) कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ।
  4. trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट बेअसर ( सामग्री की तालिकादेखें) रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) सेल मीडिया बी के साथ पूरक के एक बराबर मात्रा का उपयोग कर 27 (RPMI/ पिपेट ऊपर और नीचे किसी भी पालन कोशिकाओं को ढीला करने के लिए ।
  5. एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ निलंबित cardiomyocytes लीजिए और उन्हें एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए ।
  7. RPMI/बी-27 सेल मीडिया के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  8. ०.४% Trypan नीले समाधान की एक बराबर राशि के साथ सेल निलंबन के 20 µ एल गठबंधन और धीरे मिश्रण ।
  9. सेल सस्पेंशन की एकाग्रता और कोशिका व्यवहार्यता को गिनने और प्राप्त करने के लिए मैनुअल hemocytometer का उपयोग करें ।

2. Fibroblasts की तैयारी

  1. एक मानव कार्डियक fibroblast (एचसीएफ) की एक संस्कृति आरंभ (वयस्क वेंट्रिकुलर प्रकार) सेल लाइन के रूप में पहले16वर्णित है ।
  2. उन्हें trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट की एक उचित राशि के साथ मशीन द्वारा HCFs निलंबित ( सामग्री की तालिकादेखें) कमरे के तापमान16पर 5 मिनट के लिए । एक T175 कुप्पी के लिए, trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट का 10 मिलीलीटर इस्तेमाल किया गया था ।
  3. trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट को बेअसर ( सामग्री की तालिकादेखें) मध्यम की एक समान मात्रा का उपयोग कर, तो एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक प्राप्त करने के लिए गोली.
  4. fibroblast विकास मध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  5. ०.४% trypan नीले समाधान की एक बराबर राशि के साथ एचसीएफ सेल निलंबन के 20 µ एल गठबंधन और धीरे मिश्रण ।
  6. नए सेल सस्पेंशन की एकाग्रता और कोशिका व्यवहार्यता को गिनने और प्राप्त करने के लिए स्वचालित सेल काउंटर या मैनुअल hemocytometer का उपयोग करें ।

3. Endothelial कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक मानव गर्भनाल नस endothelial सेल (HUVEC) रेखा के रूप में पहले17वर्णित की एक संस्कृति आरंभ । उन्हें trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट की एक उचित राशि के साथ मशीन द्वारा HUVECs निलंबित ( सामग्री की तालिकादेखें) कमरे के तापमान17पर 3 मिनट के लिए । trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट को बेअसर ( सामग्री की तालिकादेखें) मध्यम की एक समान मात्रा का उपयोग कर, तो एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २५० एक्स जी में सेल निलंबन केंद्रापसारक एक गोली प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: एक T175 कुप्पी के लिए, trypsin या सेल पृथक्करण रिएजेंट का 10 मिलीलीटर इस्तेमाल किया गया था ।
  2. endothelial सेल विकास मध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. HUVEC निलंबन के 20 µ एल का मिश्रण है और यह ०.४% Trypan नीले समाधान और धीरे मिश्रण की एक बराबर राशि के साथ दाग ।
  4. सेल सस्पेंशन की एकाग्रता और कोशिका व्यवहार्यता को गिनने और प्राप्त करने के लिए स्वचालित सेल काउंटर या मैनुअल hemocytometer का उपयोग करें ।

4. फांसी छोड़ Spheroids का निर्माण

  1. हैंगिंग ड्रॉप डिवाइस है जो ८५० micropores (३५० µm के एक व्यास के साथ प्रत्येक) बाँझ 6 अच्छी तरह से प्लेटों में शामिल रखें ।
  2. ऊपर बताए गए अनुसार तीन प्रकार के कक्षों को अलग करें: hiPSC-CMs, HCFs और HUVECs । उन्हें ७०% iPSC-सीएमएस, 15% HCFs, और 15% HUVECs के अनुपात में RPMI/बी-27 सेल मीडिया के साथ २,४७५,००० कोशिकाओं के प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर गठबंधन ।
  3. (३५० µm के एक micropore व्यास के साथ) एक अल्ट्रा कम संलग्नक फांसी ड्रॉप प्रणाली के प्रत्येक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली में बैठे सेल निलंबन (२,४७५,००० प्रति मिलीलीटर) के 4 मिलीलीटर वितरण ।
  4. Spheroids सहज रूप से फांसी ड्रॉप डिवाइस में सेल निलंबन के वितरण के 12 ज के भीतर फार्म जाएगा । ७२ एच (3 डी) की कुल के लिए संस्कृति में ३७ ° c, 5% CO2, और ९५% आर्द्रता spheroids की परिपक्वता के लिए जारी रखें ।
  5. संस्कृति के ७२ ज के बाद, फसल spheroids के माध्यम से एक डिश में उपकरण रखकर लटका छोड़ प्रणाली के तल पर pores के माध्यम से और यह धीरे घूमता हैंगिंग ड्रॉप डिवाइस से spheroids जारी है ।

5.3 डी पैच निर्माण उपंयास नेट मोल्ड का उपयोग

  1. आधार, नीचे वर्ग प्लेट, नीचे शुद्ध, और 10 स्तरित पक्ष जाल बाँझ संदंश की एक जोड़ी की सहायता से उपन्यास मोल्ड बनाने के लिए इकट्ठे कर रहे हैं. सबसे पहले, ढेर और आधार, नीचे वर्ग प्लेट, और नीचे जाल कोने पदों का उपयोग कर संरेखित करें । फिर, स्टैक और परत बारी दिशाओं में 10 पक्ष जाल ठीक स्टेनलेस स्टील के शूल का एक शुद्ध बनाने के लिए ।
  2. पंजाब या मध्यम के साथ भरने के आधार फ्लश सतह तनाव को कम करने के लिए और फिर, भरने के आधार पर इकट्ठे मोल्ड हस्तांतरण ।
  3. एक ही विधि में पंजाबियों या माध्यम के साथ शुद्ध मोल्ड गुहा गीला । धीरे से इच्छित आकार के (2 x 2 x 1 मिमी, 4 x 4 x 1 मिमी, या 6 x 6 x 1 मिमी) की इच्छा की गुहा में spheroids भरें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि spheroids की अनुमानित मात्रा का १२०% गुहा में खिलाया जाता है ताकि सेल समुच्चय तंग कनेक्शन में हों और स्थिर रहें ।
  4. कोने पदों पर शीर्ष शुद्ध और शीर्ष वर्ग प्लेट इकट्ठा करने और डाट और पकड़ ट्यूबों सुरक्षित spheroids के एक वॉशआउट को रोकने के लिए ।
  5. RPMI के 6 मिलीलीटर के साथ एक 6-अच्छी थाली के लिए भरा शुद्ध मोल्ड प्रणाली हस्तांतरण/बी-27 सेल मीडिया या पर्याप्त माध्यम के साथ एक बाँझ कंटेनर में पूरे इकट्ठे मोल्ड कवर करने के लिए ।
  6. ३,०००-४,००० x जीपर 7-10 दिनों के लिए एक झूल शेखर पर भरा मोल्ड प्रणाली के साथ 6 अच्छी तरह से थाली मशीन
    ध्यान दें: इस मशीन की अवधि कार्डियक पैच के आकार से निर्णय लिया है । बड़े पैच के साथ, मशीन समय कार्डियक पैच परिपक्वता के लिए वृद्धि की आवश्यकता होगी ।

6. उपंयास नेट मोल्ड से पैच को हटाने

  1. मीडिया से मोल्ड प्रणाली निकालें और यह एक बाँझ 10 सेमी डिश में निष्फल हैंडलिंग चटाई पर जगह है ।
  2. होल्डिंग ट्यूब, डाट, शीर्ष वर्ग प्लेट, और शीर्ष शुद्ध निकालें । ध्यान से बाँझ संदंश की एक जोड़ी के साथ स्तरित पक्ष जाल एक से बाहर स्लाइड. decannulation के बाद, एक बरकरार हृदय पैच नीचे नेट के ऊपर प्राप्त की है ।
  3. बाँझ संदंश का उपयोग पैच के साथ नीचे शुद्ध उठाओ और RPMI/B27 मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ एक ३५ मिमी डिश में नीचे शुद्ध हस्तांतरण । धीरे डिश, या एक बाँझ सेल खुरचनी के साथ में शुद्ध घूमता द्वारा नीचे शुद्ध से नीचे पैच ढीला. नीचे शुद्ध से अलगाव के बाद, कार्डियक ऊतक RPMI/B27 मीडिया के साथ कल्चरित किया जा सकता है ।
  4. ३५-mm डिश में फ्री-फ्लोटिंग 3-डी कार्डियक पैच की मशीनिंग जारी रखें । कार्यात्मक तुल्यकालिक धड़कन के रूप में जल्दी के रूप में 24 ज मोल्ड से हटाने के बाद मनाया जा सकता है ।
  5. नेट मोल्ड से पैच को हटाने के बाद, अपने आकार अखंडता के साथ बनाए रखा है कि निरीक्षण और समय के साथ तुल्यकालिक पिटाई बढ़ जाती है की तीव्रता ।
    नोट: 3-डी नेट मोल्ड आधारित कार्डियक पैच decannulation के बाद घटक cardiospheres के विद्युत एकीकरण का प्रदर्शन किया । हम एक पिटाई ६० से ८० धड़कता है कि अधिक से अधिक ६० दिनों के लिए बनी प्रति मिनट से लेकर आवृत्ति मनाया ।

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Representative Results

हमारे प्रयोगों में, हम ७०% iPSC-सीएमएस, 15% HCFs, और 15% HUVECs में RPMI/बी-27 सेल मीडिया के प्रति मिलीलीटर २,४७५,००० कोशिकाओं की एकाग्रता पर एक सेल निलंबन का उपयोग किया । सेल निलंबन बनाने के बाद, हम एक अल्ट्रा कम अनुलग्नक हैंगिंग ड्रॉप प्रणाली, के रूप में प्रोटोकॉल के चरण ४.३ में वर्णित की एक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 4 मिलीलीटर तिरस्कृत । फांसी ड्रॉप प्रणाली का उपयोग ३७ ° c, 5% CO2, और ९५% आर्द्रता पर संस्कृति के 3 दिनों के बाद spheroids पिटाई के सैकड़ों के सहज गठन में हुई । spheroids आसानी से ३५० µm के एक औसत व्यास के साथ 4x और 10x आवर्धन पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत पिटाई हो मनाया गया संस्कृति के ७२ ज (चित्रा 1) के बाद ।

प्रोटोकॉल के चरण ६.५ के अंत में, spheroids फसल कटाई के बाद, मोल्ड आसानी से सरल pipetting तरीकों के साथ वरीयता प्राप्त था । मोल्ड के संवर्धन spheroids के एक संलयन के लिए अनुमति दी; मोल्ड के बाद हटाने यांत्रिक अखंडता के साथ एक बरकरार कार्डियक पैच के परिणामस्वरूप । मोल्ड और संस्कृति के 24 ज से हटाने के बाद, कार्यात्मक और हृदय ऊतक के तुल्यकालिक धड़कन मनाया गया था, spheroids (चित्रा 2, बाएं) के यांत्रिक एकीकरण की पुष्टि । हम यह भी कहा कि spheroids के कई परतों सहज प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर एक समंवित फैशन में धड़क रहा था (2 चित्रा, सही) ।

नेट मोल्ड आधारित 3-डी कार्डियक पैच का एक immunohistochemical विश्लेषण भी कार्डियक मार्कर ट्रोपोनिन टी फोकल इमेजिंग के साथ प्रदर्शन किया गया था कि अच्छी तरह से गठबंधन cardiomyocytes सभी ट्रोपोनिन टी अभिव्यक्ति (चित्रा 3) का प्रदर्शन दिखाया.

Figure 1
चित्रा 1 : फांसी छोड़ spheroids का निर्माण । मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes (hiPSC-सीएमएस), मानव कार्डियक fibroblasts (HCFs), और मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) अलग थे और ७०% iPSC-सीएमएस, 15% HCFs, और 15% HUVECs के साथ एक सेल निलंबन उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया, एक प्रति मिलीलीटर २,४७५,००० कोशिकाओं की एकाग्रता । ७२ ज के बाद, प्रत्येक micropore में सहज रूप से गठित spheroids को हल्की माइक्रोस्कोपी के नीचे धड़कते हुए आसानी से मनाया जाता था. बाएँ फलक में स्केल बार = १,००० µm; पैमाने पर सही पैनल में पट्टी = ४०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2 : एक multilayered कार्डियक घटक spheroids के एकीकरण प्रदर्शित ऊतक के निर्माण । नेट मोल्ड से अलगाव के बाद, 3-डी कार्डियक पैच अपने आकार बनाए रखा और तुल्यकालिक पिटाई का प्रदर्शन किया, spheroids के यांत्रिक एकीकरण का संकेत है, के रूप में बाएं पैनल में दिखाया गया है (जहां पैमाने बार = १,००० µm) । spheroids की खड़ी multilayers प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ निरीक्षण किया गया, के रूप में सही पैनल में दिखाया गया है (जहां पैमाने पर बार = ४०० µm), और मनाया को अनायास धड़क रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : कार्डिएक ऊतक के इम्यूनोफ्लोरेसेंस मूल्यांकन । इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण पर, नेट मोल्ड आधारित 3-डी कार्डियक ऊतक ट्रोपोनिन टी अभिव्यक्ति के साथ अच्छी तरह से गठबंधन cardiomyocytes से मिलकर पाया गया था । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

इस विधि का महत्व इसके reproducibility और परिणामी multilayered कार्डियक ऊतक की प्रभावशीलता में निहित है । कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में, मौजूदा लक्ष्यों में से एक को धड़क रहा है, multilayered, और कार्यात्मक 3 डी कार्डियक पैच का निर्माण करने के लिए एक विधि की पहचान है । हम एक उपंयास शुद्ध मोल्ड में cardiomyocytes, endothelial कोशिकाओं, और fibroblasts से बना spheroids के प्रत्यक्ष मैनुअल सीडिंग द्वारा multilayered कार्डियक ऊतकों को बनाने की एक कुशल और reproducible विधि की रिपोर्ट । इस विधि में प्रयुक्त शुद्ध मोल्ड 2 x 2 x 1 मिमी से 6 x 6 x 1 मिमी से लेकर ऊतकों के निर्माण के लिए विभिन्न आकारों की एक किस्म है । तकनीक हम भी विभिंन ढालना आकार और प्रणालियों के लिए वांछित ऊतक ज्यामिति के आधार पर संशोधित किया जा सकता है वर्णित है । वर्णित कोशिका सांद्रता और अनुपात पहले hiPSC-सीएमएस के लिए अनुकूलित किया गया है, और एक अलग सेल प्रकार के संशोधनों के अतिरिक्त मूल्यांकन की आवश्यकता होगी ।

में इन विट्रो निर्माण 3-डी कार्डियक ऊतकों का उपयोग कर के साथ-साथ चिकित्सकीय और नैदानिक मॉडल विकसित करने की आशा के साथ पता लगाया गया है । हालांकि, मौजूदा प्रिंटिंग तरीके बोझिल और महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता होती है और इस तरह सुई या पाड़ सामग्री के रूप में सहायक संरचनाओं का उपयोग करें । इन सहायक संरचनाओं की उपस्थिति के पोषक तत्वों और18ऑक्सीजन का प्रसार कम हो जाती है । इसलिए, मध्य परिगलन वर्तमान 3-डी हृदय के निर्माण में एक प्रमुख चिंता का विषय है, केशिकाओं की कमी के कारण ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति करने के लिए19. Sakaguchi एट अल. उंमुख सेल शीट और संवहनी बिस्तर के लिए एक endothelial20नेटवर्क विकसित करने के लिए प्रयोग करने वाले का उपयोग कर सैंडविच की विधि लागू किया । शुद्ध मोल्ड यहां प्रस्तुत प्रणाली में, मोल्ड गुहा किसी भी समर्थन संरचनाओं या पाड़ों की आवश्यकता के बिना पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के पर्याप्त प्रसार की अनुमति कर सकते हैं । इसके अलावा, शुद्ध मोल्ड आधारित विधि कुशल है और दोनों के लिए विशेष कौशल की आवश्यकता नहीं है मोल्ड में spheroids के बोने और बाद में पैच के रखरखाव । जैसे, यह एक त्वरित और सस्ती तरीके से करने के लिए तुल्यकालिक पिटाई और कार्यात्मक कार्डियक पैच प्राप्त है ।

अंडाकार आकृति व्यास और प्रत्येक फांसी ड्रॉप डिवाइस में इस्तेमाल spheroids की संख्या का अनुकूलन करने के लिए, हम समस्या निवारण और सेल प्रकार और मात्रा के बारे में संशोधनों के बाहर किया. इस शुद्ध मोल्ड के लिए आधारित विधि, अंडाकार आकृति व्यास और इस्तेमाल spheroids की संख्या सर्वोपरि महत्व के थे पर्याप्त आकार के एक कार्यात्मक कार्डियक ऊतक बनाने के लिए । हम हृदय ऊतक निर्माण के लिए सबसे अच्छा अंडाकार आकृति आकार का अनुकूलन करने के लिए अलग सेल सांद्रता की कोशिश की । हैंगिंग ड्रॉप डिवाइस द्वारा कार्डियक spheroids बनाने के लिए तीन प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग किया गया, जिसमें ७०% iPSC-सीएमएस, 15% HCFs, और 15% HUVECs शामिल थे । प्रकाश माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत प्रत्येक micropore में सहज रूप से गठित spheroids को ७२ एच के बाद धड़कते हुए आसानी से मनाया जाता था. हमने देखा है कि ' spheroids व्यास हैंगिंग ड्रॉप डिवाइस के सेल एकाग्रता के साथ वृद्धि हुई है । हम spheroids के विभिंन सांद्रता की कोशिश की, १०० spheroids से ३०० spheroids प्रत्येक डिवाइस में, RPMI/B27 मध्यम के 4 मिलीलीटर के साथ । कई परीक्षणों के साथ, हमने पाया है कि प्रति मिलीलीटर २,४७५,००० कोशिकाओं की एकाग्रता परिणामी spheroids का एक इष्टतम व्यास झुकेंगे । spheroids के अनुकूलित व्यास के साथ, हम सरल संग्रह और खड़ी शुद्ध मोल्ड, जो बहुपरत कार्डियक ऊतक निर्माण के लिए शुद्ध मोल्ड आधारित विधि के लिए महत्वपूर्ण कदम थे में spheroids के बोने का अनुभव किया ।

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम अंडाकार आकृति आकार का अनुकूलन है । यह उल्लेख है कि इस विधि में इस्तेमाल किया spheroids अंडाकार आकृति अंय में प्रयुक्त शरीर के आकार की तुलना में कम कर रहे है लायक है21तकनीक प्रिंटिंग । बड़ा spheroids पोषण और22ऑक्सीजन के अपर्याप्त प्रसार के कारण केंद्रीय परिगलन है पाया गया है । एक छोटे व्यास के साथ spheroids के साथ, पोषक तत्वों और प्रत्येक अंडाकार आकृति के केंद्र के लिए ऑक्सीजन के पर्याप्त प्रसार और अधिक आसानी से पूरा हो गया है, परिणामी पैच के सभी क्षेत्रों में सेलुलर व्यवहार्यता में वृद्धि. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, ३५० µm के एक अंडाकार आकृति व्यास बेहतर सेल व्यवहार्यता और spheroids, जो हमें विश्वास है कि इस शुद्ध मोल्ड का उपयोग कर कार्डियक ऊतक के सफल निर्माण में योगदान के बीच अधिक संपर्क सतह क्षेत्र के लिए अनुमति देता है । इसलिए, यह वर्णित पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम है । प्रोटोकॉल को अंय कक्ष प्रकारों में रूपांतरित करने के लिए, अतिरिक्त अंडाकार आकृति आकार ऑप्टिमाइज़ेशन प्रयोगों की आवश्यकता है ।

इस दृष्टिकोण की सीमाओं को ठीक से spheroids के stacking नियंत्रण अक्षमता शामिल हैं । परिणामस्वरूप ऊतक पैच और heterogenous मोटाई की गैर एकरूपता के क्षेत्रों में यह परिणाम है । इसके अलावा, हालांकि वास्तविक हाथ spheroids के बोने के लिए समय पर कम है, बड़े multilayered पैच के निर्माण के लिए एक विस्तारित संस्कृति समय की आवश्यकता के लिए spheroids के फ्यूजन के लिए अनुमति देते हैं ।

भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए के रूप में, इस उपंयास शुद्ध मोल्ड आधारित विधि 3-डी, ंयूनतम मैंयुअल प्रयास के साथ पाड़ मुक्त हृदय के ऊतकों को बनाने का एक कुशल और reproducible विधि है । परिणामस्वरूप multilayered ऊतकों संतोषजनक संरचनात्मक अखंडता और तुल्यकालिक पिटाई व्यवहार के साथ जुड़े spheroids से मिलकर बनता है । इस शुद्ध मोल्ड आधारित विधि इंजीनियर ऊतकों के वर्तमान जैव निर्माण विधियों के लिए एक लागत प्रभावी और स्केलेबल विकल्प प्रस्तुत करता है और के लक्ष्य के साथ दिल की विफलता के उपचार के लिए नैदानिक लागू कार्डियक ऊतकों बनाने की क्षमता है कोरोनरी या बेकार cardiomyocytes की जगह23. इसके अतिरिक्त, इस विधि के रोगी के लिए हृदय ऊतक बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है-संभावित उपंयास दवा चिकित्सा24के विशिष्ट प्रदर्शन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक निंनलिखित धन स्रोत: जादू है कि हृदय अनुसंधान के लिए कोष मामलों स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

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References

  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120, (8), 1318-1325 (2017).
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