MUB40 peptid for bruk i å oppdage nøytrofile-mediert betennelse hendelser

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage tilstedeværelsen av nøytrofile i fast/permeabilized histology deler og vurdere aktiveringsstatusen for live renset nøytrofile. Spesielt binder MUB40 peptid Laktoferrin i nøytrofile-spesifikke og tertiær granulat. Eksponering av granule innholdet via permeabilization eller nøytrofile Aktivering muliggjør merking av nøytrofile.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Anderson, M. C., Injarabian, L., Andre, A., Tournebize, R., Marteyn, B. S. The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events. J. Vis. Exp. (143), e58367, doi:10.3791/58367 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Her gir vi en protokoll med bruk av MUB40, et syntetisk peptid muligheten til å binde glycosylated Laktoferrin lagret i høy konsentrasjoner i bestemte og tertiær granulater av nøytrofile. Denne protokollen detaljer hvordan MUB40 konjugert direkte til en fluorophore kan brukes stain nøytrofile fast/permeabilized vev samt hvordan dette kan brukes i live-celle imaging til analysen for nøytrofile aktivisering og de korning. Nøytrofile gjenkjenningsmetoder er begrenset til artsspesifikke monoklonale antistoffer, som ikke alltid egnet for bestemte programmer. MUB40 trenge ikke cellemembranen og er derfor utelukket fra Laktoferrin lagret i ikke-aktivert/ikke-permeabilized nøytrofile. MUB40 har den ekstra fordelen av å gjenkjenne Laktoferrin fra et bredt vert område, slik at det er spesielt nyttig for å sammenligne resultatene i studier som involverer flere forskning modeller, reduserer like reagenser og forenkle protokoller gjennom enkeltsteg flekker.

Introduction

Nøytrofile er en av de primære våpen av det medfødte immunsystemet og rekrutteres rutinemessig til nettstedene til betennelse rundt i kroppen. Studiet av nøytrofile har vært i stor grad svekket ved deres kort lifespan i vitro (mindre enn 8 timer) og begrenset gjenkjenningsverktøy basale vilkår eller etter aktivering. Her presenterer vi en godt testet protokoll for bred og konkret påvisning av pattedyr nøytrofile i fast/permeabilized prøver. Vi tilbyr også en detaljert protokoll til farging live nøytrofile MUB40. Bruker live nøytrofile flekker protokollen, kan tidsberegningen og plasseringen av nøytrofile aktivisering bli rettet. Denne protokollen er ideell for forskere som ønsker å studere nøytrofile aktivisering eller granule utgivelsen. Utover deres antimicrobial funksjoner er nøytrofile nå verdsatt som immunmodulerende celler involvert i en rekke sykdommer og immunreaksjoner (medfødte og adaptive)1,2. Nøytrofile er tilstede i mest provoserende vev, på høye tall i infiserte vev, inflammatorisk svulster3, under IBS og Crohns flare-ups4, og områder av ikke-smittsomme betennelser som synovia av revmatoid artritt ( RA) pasienter5. Nøytrofile inneholder fire klasser av pre-formet granulater azurophil (α), spesifikke (β1), tertiær (β2) granulater og sekretoriske blemmer (γ)6. Overføring til et provoserende rekruttert nøytrofile bli aktivert og skiller sekvensielt granule innholdet (komponert av vedheft, antimikrobielle forbindelser og immunmodulerende molekyler), som fremmer videre rekruttering og bidrar til infeksjon oppløsning (men også til vert vevsskade)7. Mens nøytrofile anses en kritisk del av medfødt immunitet, ennå det er få oppdagelsen reagenser tilgjengelig å studere dem, og enda færre som kan brukes til å vurdere aktiveringsstatusen for levende nøytrofile.

Gjeldende metoder av oppdager nøytrofile er avhengige av monoklonale antistoffer generert mot celle-overflate eksponert antigener, for eksempel Ly - 6 G2 eller proteiner spesielt lagret i nøytrofile granulater under basale forhold (f.eks myeloperoxidase lactoferrin). Fordelene av monoklonale antistoffer inkluderer sine sterke bindende, følsomhet og allsidighet under ulike analysen forhold. Det er imidlertid flere downsides å benytter monoklonale antistoffer og anti-Ly - 6G spesielt. Disse ulempene inkluderer spesifisitet, som Ly - 6G finnes på et flertall av myeloide celler i beinet margtransplantasjon og på alle granulocytter inkludert eosinofile; dermed krever tyde nøytrofile fra eosinofile med dette merket flere komplekser tilnærminger8. En annen hyppige bakdelen med monoklonale antistoffer er deres ofte begrenset vert spesifisitet, gjør sammenligning studier med flere dyrearter vanskelig. En tredje ulempen av antistoff gjenkjenningsmetoder, spesielt når du bruker live celler eller i vivo, er deres potensial til å forstyrre funksjonen celle eller føre til celle aktivering. Administrasjonen av anti-Ly - 6G til mus brukes for eksempel ofte til nøytrofile uttømming og forbigående nøytropeni9. Det har i tillegg blitt demonstrert at antistoff injeksjon kan stimulere nøytrofile antitumor funksjonen10. Til slutt avslører ikke antistoff påvisning av nøytrofile aktiveringsstatusen for cellen.

Vi har identifisert en 40-amino acid peptid kalt MUB40, som kan brukes i en rekke analyser etiketten nøytrofile under i vitro eller vivo forhold samt analysen aktiviseringen rang av live nøytrofile11. MUB40 er avledet fra MUB7012, et domene av Lactobacillus reuteri overflaten Slim-bindende protein opprinnelig beskrevet for sin evne til å binde Slim13,14. MUB40 samhandler med glycosylated Laktoferrin som finnes i høy konsentrasjoner i nøytrofile-spesifikke og tertiær granulat. MUB40 kan bli utsatt for disse granulater gjennom standard permeabilization trinnene i histopatologi eller fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) protokoller for robust farging av fast nøytrofile. Når live nøytrofile beholdes i deaktivert tilstand MUB40 peptid er utelukket fra granule innholdet og cellene flekker ikke positivt med markøren. Ved aktivering, kan MUB40 binde til utsatte Laktoferrin og føre til robust farging med peptid. MUB40 kan dermed brukes til å bestemme aktiveringsstatusen for renset nøytrofile, noe som gjør det til et attraktivt markør følge smittsomme prosessen. Muligheten til å binde til live aktivert nøytrofile kan også MUB40 skal brukes som et verktøy for å oppdage områder av nøytrofile betennelse i levende dyr modeller (f.eks en mus leddgikt modell15). Protokollene i dette manuskriptet detalj hvordan fluorescently merket MUB40 kan brukes å avsløre nøytrofile histology vev og hvordan analysen aktivering av live renset nøytrofile i vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er vurdert og godkjent av de franske organisasjonene CoRC (Comité de Recherche Clinique) CPP (Comité de beskyttelse des Personnes) og CNIL (Kommisjonen Nationale Informatique et Liberté).

1. farging nøytrofile i histopatologi vev med Fluorescently merket MUB40

  1. For å få vev for histopatologi, fikse vev/biopsi inndelinger i en passende mengde 4% paraformaldehyde (PFA) i 30 min opptil 4 h avhengig av tykkelsen på prøven. Sett prøvene i 4 ° C kjøleskap under fiksering.
    Merk: Alternative fiksering metoder/tidsberegninger kan erstattes basert på brukerens unike behov.
    1. Fjerne PFA, legge til 16% sukrose løsning med nok volum til dekker utvalget og plasser prøven på 4 ° C for 4 h opp over natten.
    2. Fjerne 16% sukrose løsning og legge til 30% sucrose løsning på et stort nok volum til dekker utvalget, og plassere det på 4 ° C for 4 h til overnatting.
    3. Fjern 30% sukrose løsningen og blot av overflødig løsning fra vevet med et papirhåndkle. Plasser delen vev i optimal kutte temperatur (OCT) media og snapin-fryse i 2-methylbutane avkjølt i tørris-etanol badekar (-72 ° C). Når frosset fast (etter ~ 2 min), fjerne blokker fra 2-methylbutane og plassere dem på tørris til alle blokkene er ferdig og klar for langtidslagring. Lagre frosne blokkene ved-80 ° C for langtidslagring.
  2. Natten før vev er kuttet, fjerne dem fra-80 ° C fryseren og plassere dem på 20 ° C over natten til equilibrate.
    1. Bruke en kryostaten, skåret OCT-embedded vev i 10 - 30 μm tykke skiver og adsorberes til høy kvalitet glass lysbilder.
      Merk: Tykkere eller tynnere kan brukes utløst eksperimentelle.
    2. Med en voks penn eller andre hydrofobe metode, tegne en ramme rundt vev slice på av objektglass og la tørke.
    3. Forberede flekker løsningen ved å utføre en 1:1,000 fortynning av MUB40-Cy5 (eller andre fluorescerende MUB40versjon, 1 mg/mL lagerløsning) i 0,1% saponin-PBS løsning. Optimal endelige MUB40 konsentrasjonen bør være 1 μg/mL.
      Merk: Lavere siste konsentrasjoner kan brukes (0,1-0.01 μg/mL), men kan føre til lavere signal intensitet.
      FORSIKTIG: Saponin pulver kan forårsake puste hudirritasjon. Sikre å veie saponin i et skap eller beskyttet. Alternativ permeabilization metoder kan brukes som Triton. Legge til ekstra markører i produsenten anbefalte konsentrasjoner (f.eks., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, fluorescerende antistoffer).
    4. Forsiktig dukkert av objektglass i en løsning av 0,1% saponin-PBS tre ganger.
    5. Forsiktig blot bort overflødig væske rundt delen vev og legge nok flekker løsning som dekker delen vev. Plass lysbildet i en fuktighet kammer å unngå fordampning og ruge det 1t ved romtemperatur. Beskytt maskinen mot lyset.
    6. Forsiktig dukkert lysbildet inn i 0,1% saponin-PBS løsning 3 x. Deretter forsiktig dukkert lysbildet inn i PBS løsning 3 x. Til slutt, forsiktig dukkert lysbildet inn i destillert H2O 3 x. Nøye tørke overflødig væske fra lysbildet.
    7. Legge en liten mengde (~ 20 μL) montering medium (20 mM Tris pH 8.0, 0,5% N-propyl gallate, 90% glyserol) ved siden av vev slice og forsiktig legge ned et glass dekkglassvæske på toppen av objektglass. Forsiktig og jevnt Trykk på dekkglassvæske på delen vev, og med tørkepapir, nøye Fjern alt montering utskriftsmateriale som spyr rundt kantene på dekkglassvæske.
    8. Plass montert lysbildet i et mørkt skap 24 h å tillate montering media å stivne. Alternativt sted montert lysbildet på 37 ° C i 1 time.
  3. Bilde vev skiver på fluorescerende mikroskop etter ønsket anskaffelsesmetoden.

2. visualisering av nøytrofile aktivisering med Retro-Inverso-MUB-40-Cy5 peptid

  1. Få menneskelige nøytrofile ved hjelp av følgende protokollen. Klargjør følgende løsninger og plassere dem i en anoksisk CAB overnight. Kontakt med oksygen begynner å aktivere nøytrofile og ytterligere indusere celle død16,17.
    Merk: Nøytrofile kan bli alternativt renset "på benken" for MUB40-merking eksperimenter; Vær imidlertid klar over at oksygen eksponering vil begynne å påvirke nøytrofile aktivisering.
    1. Klargjør følgende løsning:
      Løsning 1 [natriumklorid (NaCl) 0,9%]: legge til 4.5 g av NaCl 500 mL H2O. Filter løsningen.
      Løsning 2 (dekstran 6%): legge til 6 g dekstran i NaCl 0,9% løsning 100 mL.
      Løsning 3 (vask buffer): oppløse ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i PBS pH 7.2 til en siste EDTA konsentrasjon av 2 mM. Umiddelbart før bruk, løses bovin serum albumin (BSA) i PBS/EDTA løsningen slik at den endelige BSA konsentrasjonen er 10% w/v.
    2. Sentrifuge blod samling rør på 650 x g for 20 min uten pauser.
    3. Uten å forstyrre atskilt blod, overføre blod samling rør til en anoksisk skap og samle plasma brøker (øverst) i et 50 mL konisk rør.
    4. Fjerne plasma inneholder røret fra anoksisk regjering og sentrifuge 2.900 x g for 20 min med pauser til pellets blodplater.
    5. Uten å forstyrre pelleted blodplater, forsiktig overføre plasma røret til anoksisk regjering og Pipetter Platederivert dårlig plasma i en fersk 50 mL tube (heretter kalt "plasma").
  2. Separasjon av røde blodlegemer fra leukocytter
    1. Bruke rør som inneholder de røde blodlegemene (RBCs) fra trinn 2.1.3., kombinere RBCs i en konisk 50 mL tube (5 blod samling innhold per 50 mL tube).
    2. Legg NaCl 0,9% til totalt volum når 44 mL. Legge til 6 mL av dekstran 6% (siste).
    3. Bland forsiktig blod/dekstran blandingen ved å snu røret 10 - 20 ganger. La røret sediment i minst 30 min.
    4. Mens sedimentering skjer, forberede Percoll gradering ved å legge 4,2 mL Percoll løsning til 5,8 mL plasma i et 15 mL konisk rør, og bland godt invertere røret.
    5. Samle øverste delen av dekstran under forsøk på å unngå pipettering røde blodlegemer.
    6. Stram skrukork, fjerne dekstran røret fra anoksisk kammeret og sentrifuge røret på 300 x g i 10 min med pauser.
    7. Nøye sett røret tilbake i anoksisk kammeret uten å forstyrre pelleted cellene, og fjern væsken via pipettering.
    8. Forsiktig å avbryte celle pellet 1 mL av plasma og veldig sakte legge til toppen av Percoll løsningen. Være forsiktig ikke for å indusere blanding av lagene når pipettering cellene på toppen.
    9. Fjern forsiktig Percoll løsning røret fra anoksisk kammer (unngå blanding) og sentrifuge 800 x g for 20 min uten pauser. Perifert blod mononukleære celler (PBMCs) vil forbli på Percoll løsning overflaten, og nøytrofile vil pellets med RBCs.
  3. Fjerning av forurensende RBCs
    1. Forberede 14 mL vaske buffer løsning ved å legge til 700 μL PBS + 10% BSA 14 mL vaske bufferen.
    2. Sett Percoll løsning røret tilbake i anoksisk kammeret. Fjern Percoll og PBMCs via pipettering og å suspendere pelleted cellene i 1 mL av vaske buffer løsning. Pellet skal re suspendert vil ha en rød farge på grunn av forurensende RBCs.
    3. Tilsett 200 μL av anti-CD235a (glycophorin) magnetiske perler re suspendert cellene, bland forsiktig og ruge i minst 15 minutter. Dette trinnet laster de forurensende RBCs med magnetiske perler slik at de kan fjernes.
    4. Vask kolonnen separasjon med 2 mL vaske bufferen 3 x.
    5. Mens du holder en 15 mL konisk rør under kolonnen separasjon, sakte Pipetter nøytrofile/RBC blandingen til toppen av kolonnen. Samle cellene i 15 mL konisk røret som de flyter gjennom. Gjennomflytsenhet bør være skyet og miste sin røde farge skyldes RBCs gjenværende bundne kolonnen.
    6. Legg 2 mL vaske bufferen til toppen av kolonnen og samle i samme 15 mL konisk rør. På slutten av 2 mL vask, bør gjennomflytsenhet være klart, betyr at alle nøytrofile har vært samlet.
    7. Bland forsiktig røret for å sikre jevn fordeling av nøytrofile og samle 10 μL for cellen opptelling. Merk det siste bindet for celle teller formål. Spesifisere antall celler med en standard celle telling metoden.
    8. Fjern nøytrofile røret fra anoksisk kammeret, og sentrifuge nøytrofile 300 x g for 20 min med pauser.
    9. Plasser sedimented nøytrofile tilbake i anoksisk kammeret og fjern vaske bufferen via pipettering. Nytt avbryte nøytrofile pellet plasma med en maksimale tetthet av 107 PMN/mL.
  4. Opplisting av renset nøytrofile og visualisering ved hjelp MUB40
    1. Tilsett 1 μL RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) til 1 mL av Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium uten fenol red. Bland ved pipettering godt.
    2. I forbindelse med denne protokollen, har resultatet blitt beskrevet som om en potent nøytrofile aktivere reagens, N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanin (FMLP), legges. Legge til 1 μm av FMLP RPMI/RI-MUB40-Cy5 rør og bland via pipettering opp og ned.
      Merk: Hver eksperimentelle prosedyren vil være forskjellig fra dette punktet fremover, avhengig av spørsmål blir adressert.
    3. Overføre det 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP blandingen til et glass bunn mikroskopi rett. Legge til en mengde renset cellene tilsvarer 106 totalt nøytrofile denne parabolen. Bland ved forsiktig pipettering.
    4. Plasser rett i en invertert fluorescerende mikroskop og starte bildeopptak. For eksempel anbefales å kjøpe opprinnelige bilder før tillegg av en nøytrofile-aktivere reagens som FMLP eller bakterier. I dette eksemplet starter oppkjøpet av RPMI/RI-MUB40-Cy5/nøytrofile, og på et senere timepoint, Pipetter nøytrofile-aktivere reagensen i glass rett og fortsette bildeopptak.
      Merk: Endringer på disse trinnene kan gjøres basert på vitenskapelige behov.
    5. Prosessen kjøpt bilder/tid-lapse filmer som gjelder bestemte mikroskopet brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatene MUB40-farget vev fra histopatologi lysbilder avslører vanligvis enkeltceller spredt over hele vevet. MUB40 flekker Laktoferrin, som er tilstede i nøytrofile granulater og compartmentalized. Dermed vanligvis sett vises punctate flekker og flere store atskilt områder av signalet kommer fra personlige nøytrofile (figur 1). Det er nyttig å legge til en andre cellen markør som DAPI å lokalisere co MUB40 signalet med farget cellen. Totalt antall oppdaget celler avhenger av antall nøytrofile i synsfeltet og variere dramatisk avhengig av kilde og styrke immunforsvaret. Vist her er representativt bilder fra renset fast menneskelige nøytrofile (figur 1A) og en vev biopsy av en ulcerøs kolitt pasient (figur 1B). Også vist er bilder tatt fra et relativt lavt nivå av nøytrofile i lungene mus infisert med Klebsiella pneumoniae (figur 1C) og høy nøytrofile i tykktarmen av et marsvin infisert med Shigella sonnei (Figur 1D).

Resultater med live, renset nøytrofile vanligvis viser lite til ingen celle flekker på tidlig tidspunkt, og øke gradvis i RI-MUB40 flekker over tid som flere nøytrofile bli aktivert. Vist her er en tid kurs serie med bilder fra et eksperiment med renset menneskelige nøytrofile infisert med fluorescerende S. sonnei (figur 2). Avhengig av aktivering signalet, kan nøytrofile begynne flekker med MUB40 raskt, så det anbefales å begynne å anskaffe bilder før tillegg av aktivator. Når celler bli aktivert og RI-MUB40 positiv, bør de viser en lignende flekker profilen til faste og permeabilized celler, som gir en vises punctate flekker. Optimal konsentrasjonen av MUB40 for både live og fast celle flekker er 1 μg/mL (Figur 3). Lavere konsentrasjoner (0,1-0.01 μg/mL) kan brukes bortsett fra resultere i lavere signal intensitet. Det anbefales også å bruke en DIC bilde eller andre live-celle flekken for å skille hvilke celler viser en RI-MUB40 signal.

Figure 1
Figur 1 : MUB 40 -farget nøytrofile menneske, musen og marsvin opprinnelse. (A) representant MUB40 flekker (grønn) av nøytrofile renset fra sunne menneskelige givere. Cellen kjerner er farget med DAPI (blå). (B) Beising av menneskelig nøytrofile i vev fra en ulcerøs kolitt biopsi. Nøytrofile er avslørt med MUB40 (grønn) og celle kjerner er farget med DAPI (blå). (C) histopatologi fra lungene museklikk infisert med Klebsiella pneumoniae. Musen nøytrofile avsløres i vevet bruker MUB40 (grønn) og celle kjerner er farget med DAPI (blå). (D) histopatologi fra kolon av et marsvin infisert med Shigella sonnei. Nøytrofile svarer til infeksjonen er avslørt i vevet MUB40 (grønn). S. sonnei bakterier (rød) express fluorescerende dsRED protein. Cellen kjerner er farget med DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Live nøytrofile flekker med MUB 40 bare når aktivert. Valgte bilder fra en tid forfalle med renset menneskelige nøytrofile infisert med S. sonnei i nærvær av RI-MUB40. I første møter rekke bilder (øverst) en nøytrofile en S. sonnei bakterie (rød) vises med grønn pil. Over gang løpet, er bakterien internalisert nøytrofile og fordøyd. Som nøytrofile blir aktivert fra bakterier, flekker det stadig sterkere med RI-MUB40. Bildene til venstre er fluorescerende kanaler kledde med DIC bilder. Bildene til høyre er bare fluorescerende kanaler. Bildene ble tatt i 5 minutters intervaller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Effekten av ulike MUB 40 konsentrasjoner på nøytrofile farging. Representant farging av fast/permeabilized nøytrofile med ulike konsentrasjoner av MUB40-Cy5. Renset menneskelige nøytrofile var fast og farget med angitte konsentrasjonen av MUB40-Cy5. Cellen kjerner er farget med DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her er to analyser beskrevet som MUB40 peptid brukes til å studere nøytrofile betennelse og aktivisering. Vi viser hvordan MUB40 kan avsløre nøytrofile presentere i histopatologi deler eller vise deres aktiveringsstatus bruker live renset nøytrofile. De avgjørende skritt for å bruke MUB40 som en flekker reagens er den samme som med andre fluorescerende oppdagelsen metoden. Hensyn må tas for å sikre kompatibilitet med fluorescerende signaler og at tilstrekkelig vask skritt er tatt for å fjerne bakgrunnen flekker. De viktigste å oppnå gode flekker resultater er kvaliteten på mikroskopet, glass lysbilder/cover følgesedler og delene vev. Når du ser live renset nøytrofile, er de viktigste trinnene i en renselsesprosess selv. Nøytrofile er følsomme og kan aktiveres av en rekke ulike signaler. For å sikre at eksperimentet produserer meningsfulle resultater, må være forsiktig å oppbevare de renset nøytrofile inaktiv før de er klar til å brukes. Dette kan oppnås ved å utføre nøytrofile rensing protokollen i en anoksisk kammer å begrense nøytrofile kontakt med oksygen.

Både begrensningen og nytte av MUB40, avhengig av det eksperimentelle spørsmålet blir adressert, er at MUB40 bare flekker aktivert nøytrofile med mindre de er liksom permeabilized. Dette kan være en stor fordel om eksperimentet krever følgende betennelse i en levende dyr eller renset celle, men det kan være en ulempe hvis eksperimentet krever påvisning av alle levende nøytrofile uansett aktiveringsstatus. En andre potensielle begrensning til denne protokollen er faktum at lactoferrin er i forskjellige kroppslige sekret som tårer, melk og slim. For histopatologi flekker der disse sekreter vedlikeholdes (f.eks colonic biopsier som mucus laget er intakt), vil MUB40 også flekken Slim laget sammen med alle nåværende nøytrofile. Dette har ennå ikke påvirker vår analyse i praksis, men det bør bemerkes som en potensiell signalkilde.

Foreløpig er MUB40 den bare nøytrofile biomarkør som kan skille mellom aktivert og ingen-aktivert live nøytrofile. MUB40, i motsetning til antistoff oppdagingsmetoder, vises også ikke endre funksjonen eller overlevelse av nøytrofile i vitro eller i vivo. Tillegg av spesifikke antistoffer mot live nøytrofile kan for eksempel være en aktivering signal påvirker nøytrofile funksjon eller overlevelse i verten. Dette gjør MUB40 en svært nyttig reagens for forskning nøytrofile aktivisering eller granule utgivelsen i vitro eller i vivo. I tillegg MUB40 har en bred vert spesifisitet og kan være direkte konjugert til en rekke forskjellige fluorophores, slik at for bruk i enkeltsteg flekker analyser over flere verter. Dermed MUB40 flekker er sammenlignbare mellom mus, menneskelig, og andre pattedyr mål, og det forenkler og reduserer antall reagenser for å oppdage nøytrofile.

Mens denne protokollen fokuserer spesielt på histopatologi og levende celle bildevisning MUB40, vi har også brukt peptid i FACS sortering og leve dyr i vivo bildebehandling. Vi forventer at MUB40 vil være mottakelig for mange ulike analyser påvisning av nøytrofile eller visualisering av inflammatoriske hendelser i kroppen, og at fremtidige studier og protokoller skal utvikles til videre utnytte spekteret av MUB 40 bruker, særlig med ikke-invasiv tenkelig technics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.S.M. er oppført som en oppfinner på MUB40 patenter:

MUB40: europeiske Patent EP11290403.2, 09/09/2011.

RI-MUB40: europeiske Patent EP nr. 17306746.3, 11/12/17.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) og ANR JCJC gir (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MUB40-Cy5 Benoit Marteyn benoit.marteyn@pasteur.fr Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5 Benoit Marteyn benoit.marteyn@pasteur.fr Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Fixative for histology
Sucrose Sigma-Aldrich S7903 Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) Sakura Finetek USA 4583 Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane Sigma-Aldrich M32631 Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol Sigma-Aldrich 1.00974 Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat Leica Biosystems CM1520 Used to section tissues
Glass microscopy slides Fisher Scientific 12-518-101
Cover slips Thor Labs CG15CH Hi precision coverslip
Dako pen  Sigma-Aldrich Z377821 Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 Stains DNA 
Alexa fluor 488 Phalloidin  Fisher Scientific A12379 Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant Fisher Scientific P36930 Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope Various Various Used to image IF slides
Anoxic Cabinet Various Various Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL Sigma-Aldrich S7653
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Washing buffer component
MACS BSA buffer Miltenyi Biotec 130-091-376 Washing buffer component
Percoll Sigma-Aldrich P4937 Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads Miltenyi Biotec 130-050-501 Used to remove contaminating RBCs
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red Sigma-Aldrich R8755 Used for neutrophil assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6, (3), 173-182 (2006).
  2. Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46, (1), 15-28 (2017).
  3. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16, (7), 431-446 (2016).
  4. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, (9), 1618-1631 (2010).
  5. Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. (2018).
  6. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89, (10), 3503-3521 (1997).
  7. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, (5), 657-670 (2010).
  8. Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81, (4), 343-350 (2012).
  9. Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187, (10), 5293-5298 (2011).
  10. Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122, (18), 3160-3164 (2013).
  11. Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25, (4), 483-493 (2018).
  12. Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287, (19), 15916-15922 (2012).
  13. Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
  14. Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
  15. Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186, (4), 1899-1903 (2011).
  16. Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201, (1), 105-115 (2005).
  17. Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128, (7), 993-1002 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics