mub40肽在中性炎症事件检测中的应用

Biology

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Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以检测中性粒细胞的存在在固定/渗透组织学切片, 并评估活纯化中性粒细胞的激活状态。特别是, mub40肽结合了存在于中性粒细胞特异性和三级颗粒中的乳铁蛋白。颗粒内容物通过渗透或中性粒细胞活化暴露, 可以标记中性粒细胞。

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Anderson, M. C., Injarabian, L., Andre, A., Tournebize, R., Marteyn, B. S. The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events. J. Vis. Exp. (143), e58367, doi:10.3791/58367 (2019).

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Abstract

在这里, 我们提供了一个涉及使用 mub40的协议, mub 40 是一种合成肽, 能够将高浓度的糖基化乳铁蛋白结合起来, 储存在中性粒细胞的特定颗粒和三级颗粒中。该协议详细介绍了如何使用 mub40直接与荧光体结合, 以染色固定渗透组织中的中性粒细胞, 以及如何在活细胞成像中使用, 以检测中性粒细胞的活化和去粒化。中性粒细胞检测方法仅限于物种特异性单克隆抗体, 这些抗体并不总是适用于某些应用。mub40不会穿透细胞膜, 因此被排除在储存在非活性无渗透中性粒细胞中的乳铁蛋白中。mub40的额外优点是可以从广泛的宿主范围内识别乳铁蛋白, 这使得它特别适用于比较涉及多个研究模型的研究结果、减少重复试剂的数量和简化协议通过单步染色。

Introduction

中性粒细胞是先天免疫系统的主要武器之一, 经常被招募到身体周围的炎症部位。中性粒细胞的研究在很大程度上受到其体寿命短 (不到 8小时) 以及在基础条件下或激活后的有限检测工具的影响。在这里, 我们提出了一个经过很好检验的协议, 广泛和具体的检测哺乳动物中性粒细胞在固定渗透样品。我们还提供了一个详细的协议染色活中性粒细胞与 mub40。利用活性中性粒细胞染色协议, 可以确定中性粒细胞活化的时间和位置。该方案是理想的研究人员谁希望研究中性粒细胞激活或颗粒释放。除了抗菌功能, 中性粒细胞现在被视为免疫调节细胞, 参与了广泛的疾病和免疫反应 (先天和适应性)1,2。中性粒细胞存在于大多数炎症组织中, 在感染组织中的数量较多, 在炎症性肿瘤3中, 在 ibs 和克罗恩的爆发过程, 在 4, 以及在非传染性炎症的地区, 如类风湿关节炎滑膜 (ra) 患者5。中性粒细胞含有四类预先形成的颗粒, 分别称为阿佐罗非 (α)、特异性 (β1)、三级 (β2) 颗粒和分泌囊泡 (γ)6。当迁移到炎症部位时, 被招募的中性粒细胞就会被激活并依次分泌颗粒含量 (由粘附、抗菌化合物和免疫调节分子组成), 从而促进进一步的招募, 并有助于进一步的招募。感染分辨率 (也对宿主组织损伤)7。虽然中性粒细胞被认为是先天免疫的一个关键方面, 但到目前为止, 可用于研究它们的检测试剂很少, 可用于评估活中性粒细胞激活状态的试剂更少。

目前检测中性粒细胞的方法依赖于针对细胞表面暴露的抗原产生的单克隆抗体, 如 ly-6g2在基础条件下专门储存在中性粒细胞颗粒中的蛋白质 (髓过氧化物酶), 乳铁蛋白)。单克隆抗体的优点包括在各种检测条件下具有很强的结合性、灵敏度和多功能性。然而, 使用单克隆抗体, 特别是抗 le-6g 有几个缺点。这些缺点包括特异性, 因为 Ly-6G 存在于骨髓中的大多数骨髓细胞和包括嗜酸性粒细胞在内的所有粒细胞上;因此, 用这种标记从嗜酸性粒细胞中破译中性粒细胞需要更多的复合物接近8。单克隆抗体的另一个常见权衡是它们的宿主特异性范围往往有限, 因此很难与不止一种动物进行比较研究。抗体检测方法的第三个缺点, 特别是在使用活细胞或在体内使用时,是它们有可能破坏细胞功能或导致细胞激活。例如, 对小鼠使用抗 le-6g 通常用于中性粒细胞的消耗和短暂性中性粒细胞减少9。此外, 抗体注射还可以刺激中性粒细胞的抗肿瘤功能10。最后, 中性粒细胞的抗体检测并不能揭示细胞的激活状态。

我们已经确定了一种名为 mub 40 的 40-氨基酸, 它可用于在体外体内条件下标记中性粒细胞的一些检测, 并检测活中性粒细胞的激活状态11。mub40来源于mub 7012,这是尿尿乳杆菌表面粘液结合蛋白的一个领域, 最初描述的是它具有结合粘液13,14的能力。mub40与糖基化乳铁蛋白相互作用, 在中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中存在高浓度的糖基化乳铁蛋白。mub40可以通过组织病理学或荧光激活细胞分选 (facs) 协议中的标准渗透步骤暴露在这些颗粒中, 以实现固定中性粒细胞的鲁棒染色。当活中性粒细胞保持在失活状态时, mub40肽被排除在颗粒含量之外, 细胞不会用标记染色呈阳性。激活后, mub40可与暴露的乳铁蛋白结合, 并导致与肽的强染色。因此, mub40可以用来确定纯化中性粒细胞的活化状态, 使其成为跟踪感染过程的一个有吸引力的标记。结合活体激活中性粒细胞的能力还允许 mub40作为工具, 在活体动物模型中检测中性粒细胞炎症区域 (例如,小鼠关节炎模型15)。本手稿中的协议详细说明了如何荧光标记的 mub40可以用来揭示组织中的中性粒细胞, 以及如何检测活体纯化中性粒细胞在体外的激活。

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Protocol

法国的 comrc (clices)、cpp (人员保护委员会) 和国家信息和自由委员会 (cnil) 都审查并批准了这里所述的所有方法。

1. 用荧光标记的 mub 40 在组织病理组织染色中性粒细胞

  1. 要获得组织病理学组织, 根据样品厚度, 将组织/活检切片固定在4% 的甲醛 (pfa) 的适当体积中30分钟至4小时。固定时, 请将样品放在4°c 的冰箱中。
    注意: 可根据用户的独特需求替代替代固定方法。
    1. 取出 pfa, 添加10% 的蔗糖溶液, 并有足够的体积完全覆盖样品, 并将样品放置在4°c 下 4小时, 直到夜间。
    2. 去除16% 蔗糖溶液, 并在足够大的体积内添加30% 的蔗糖溶液, 以完全覆盖样品, 并将其放置在4°c 下4小时至夜间。
    3. 用纸巾去除30% 的蔗糖溶液, 并将多余的蔗糖溶液从组织中抹掉。将组织切片置于最佳切割温度 (oct) 介质中, 并在干冰乙醇浴 (-72°c) 冷却的 2-甲基丁烷中进行快速冷冻。一旦冻结固体 (约2分钟后), 从 2-甲基丁烷块中取出块, 并将其放置在干冰上, 直到所有块都完成并准备长期储存。将冷冻块存放在-80°c, 以便长期存放。
  2. 在组织块被切割的前一天晚上, 将其从-80°c 的冰柜中取出, 并将其放置在-20°c 过夜以平衡。
    1. 使用低温恒温器, 将 oct 嵌入的组织切割成10至30μm 厚的切片, 并吸附到高质量的玻璃幻灯片中。
      注意: 根据实验要求, 可以使用较厚或较薄的切片。
    2. 用蜡笔或其他疏水方法, 在玻璃滑梯上的纸巾切片周围画一个盒子, 然后晾干。
    3. 在0.1% 皂甙-pbs 溶液中, 对 mub 40-cy5 (或其他荧光 mub40版, 1 mg/ml 库存溶液) 进行1:1000 稀释, 准备染色溶液。最佳的最终 mub40浓度应为1μgml。
      注: 可使用较低的最终浓度 (0.1-0.01μg/ml), 但可能导致较低的信号强度。
      注意: 皂甙粉可引起呼吸刺激。确保在柜子或保护区内称量皂甙。可使用 triton 等替代渗透方法。在制造商推荐的浓度下添加额外的标记 (例如, 4 '、6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi)、phalloidin、荧光抗体)。
    4. 将玻璃滑块轻轻浸入0.1% 皂甙-pbs 的溶液中三次。
    5. 小心地抹掉组织切片周围多余的液体, 并添加足够的染色溶液, 以完全覆盖组织部分。将滑梯放入湿度室, 以避免蒸发, 并在室温下孵育1小时。保护它不受光线的影响。
    6. 轻轻将滑块浸入0.1% 皂甙-pbs 溶液3倍。然后, 轻轻地将幻灯片浸入 pbs 解决方案3倍。最后, 轻轻地将滑块浸入蒸馏的h2o3x 中。小心地干燥滑梯上多余的液体。
    7. 在组织切片旁边加入少量 (~ 20μl) 安装介质 (20 mm tris ph 值 8.0, 0.5% n-丙基没食子酸酯, 90% 甘油), 轻轻地将玻璃覆盖片放在玻璃滑块的顶部。轻轻均匀地将盖板按在纸巾部分, 并使用纸巾小心地取出在盖板边缘展开的任何安装介质。
    8. 将安装的幻灯片放置在24小时的深色机柜中, 使安装介质凝固。或者, 将安装的幻灯片置于37°c 下1小时。
  3. 根据所需的采集方法, 在荧光显微镜上对组织切片进行成像。

2. 逆转录逆转录酶-逆转录酶-cy5 肽对中性粒细胞活化的可视化

  1. 使用以下协议获取人类中性粒细胞。准备以下解决方案, 并将其放置在缺氧柜过夜。接触氧气将开始激活中性粒细胞, 并进一步诱导细胞死亡 16,17
    注: 中性粒细胞可交替纯化 "在板凳上" 进行 mub 40 标记实验;然而, 要知道, 氧气暴露将开始影响中性粒细胞的激活。
    1. 准备以下解决方案:
      溶液 1 [氯化钠 (氯化钠) 0.9%]: 将 4.5 g 的氯化钠添加到500ml 的 h2o.过滤溶液。
      解决方案 2 (糊精 6%): 在 nacl 0.9% 溶液中加入6克糊精, 加入100毫升。
      溶液 3 (洗涤缓冲液): 在 pbs ph 7.2 中溶解乙二胺四乙酸 (edta), 最终 edta 浓度为 2 mm。在使用前, 将牛血清白蛋白 (bsa) 溶解在 pbsedta 溶液中, 使最终的 bsa 浓度为 10% w/v。
    2. 离心采血管, 在 650 x 克, 20分钟没有休息。
    3. 在不干扰分离血液的情况下, 将采血管转移到缺氧柜, 并在50毫升锥形管中收集血浆分数 (顶部)。
    4. 从缺氧柜和离心机中取出含有血浆的管子, 以 2, 900 x 克的速度, 用断裂来颗粒血小板, 20分钟。
    5. 在不干扰颗粒血小板的情况下, 轻轻地将血浆管转移回缺氧柜, 并将血小板不良的血浆移入新鲜的50毫升管 (以下简称 "血浆")。
  2. 红细胞与白细胞的分离
    1. 使用步骤2.1.3 中含有红细胞 (rbc) 的管, 将 rbc 结合成一个锥形的 50 ml 管 (每50毫升管5种采血管)。
    2. 添加氯化钠 0.9%, 直到总体积达到44毫升。添加6毫升糊精 6% (最后)。
    3. 通过将试管倒置10-20 次, 轻轻混合血/糊精混合物。让管沉淀物至少30分钟。
    4. 在沉淀过程中, 在 15 ml 锥形管中的5.8ml 等离子体中加入 4.2 ml 的 percoll 溶液, 制备渗透率梯度, 并通过倒置管进行混合。
    5. 收集右旋糖酐的最高部分, 同时尽量避免移液红血球。
    6. 拧紧螺线管盖, 从缺氧室取出右旋糖管, 并以 300 x g 离心管 10分钟, 并有断裂。
    7. 小心地将管子放回缺氧室, 而不干扰颗粒状细胞, 并通过移液取出液体。
    8. 轻轻地在1毫升的血浆中重新悬浮细胞颗粒, 非常缓慢地添加到 percoll 溶液的顶部。在将细胞移入顶部时, 请注意不要诱导层的混合。
    9. 小心地从缺氧室取出 percoll 溶液管 (避免混合), 并以 800 x g 的速度离心 20分钟, 不受断裂。外周血单个核细胞 (pbmc) 将保留在渗透液表面, 中性粒细胞将与红细胞颗粒。
  3. 去除污染的红细胞
    1. 在洗涤缓冲液中加入 700μl pbs + 10% bsa, 制备14毫升洗涤缓冲液。
    2. 将 percoll 溶液管放回缺氧室。通过移液去除 percoll 和 pbmc, 并在1毫升的洗涤缓冲液中重新悬浮颗粒细胞。由于污染了 rbc, 要重新悬浮的颗粒将呈红色。
    3. 在重新悬浮的细胞中加入200μl 抗 cd235a (糖苷) 磁珠, 轻轻混合, 孵育至少15分钟。这一步将污染的 rbc 加载到磁珠中, 以便将其移除。
    4. 用2毫升的洗涤缓冲液3倍清洗分离柱。
    5. 当在分离柱下拿着一个15毫升的锥形管时, 慢慢地将中性粒细胞的 rbc 混合物移到色谱柱的顶部。收集细胞在15毫升锥形管, 因为他们流经。由于 rbc 仍然绑定到列, 流经应为多云, 并失去其红色。
    6. 在柱顶加入2毫升洗涤缓冲液, 收集在相同的15毫升锥形管中。到2毫升清洗结束时, 流经应该是清晰的, 这意味着所有的中性粒细胞都被收集了。
    7. 轻轻混合管, 以确保中性粒细胞的均匀分布, 并收集10μl 的细胞计数。请注意单元格计数的最终卷。用任何标准的单元格计数方法枚举单元格的总数。
    8. 从缺氧室取出中性粒细胞管, 并在 300 x g 离心中性粒细胞 20分钟, 并与休息。
    9. 将沉积的中性粒细胞放回缺氧室, 并通过移液取出洗涤缓冲液。在最大细胞密度为 107 pmnml 的等离子体中重新悬浮中性粒细胞颗粒。
  4. 使用 mub40对纯化的中性粒细胞进行计数和可视化
    1. 将 ri-mub 40-cy5(1mgml) 添加1μl 到玫瑰公园纪念研究所 (rpmi) 1640 介质中, 不含苯酚红色。通过很好的移液混合。
    2. 在本协议的目的下, 其结果已被概述, 仿佛一个强大的中性粒细胞激活试剂, n-甲基甲基-苯基丙氨酸 (fmlp), 被添加。在 rpmire-mub 40-cy5 管中加入 1μm fmlp,并通过上下移液混合。
      注: 每个实验过程将与此点不同, 具体取决于所处理的问题。
    3. 将1毫升 RPMI/RI-MUB 40-RPMI/RI-MUB 混合物转移到玻璃底显微镜盘中。在这道菜中, 添加相当于 106个中性粒细胞的纯化细胞量。轻轻移液混合。
    4. 将盘子放入倒置荧光显微镜中, 开始图像采集。例如, 建议在添加单富营养化活化剂 (如 fmlp 或细菌) 之前获取基线图像。在本例中, 开始获取 rpmire-mub40-cynex/中性粒细胞, 并在稍后的时间点将中性粒细胞活化试剂移入玻璃盘并继续图像采集。
      注: 可以根据科学需要对这些步骤进行修改。
    5. 过程中获得的图像/延时电影, 如属于所使用的特定显微镜。

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Representative Results

组织病理学幻灯片中 mub40染色组织的结果通常显示分散在组织中的单个细胞。mub40染色乳铁蛋白, 存在于中性粒细胞颗粒和条块分割。因此, 通常看到的是点状染色或来自单个中性粒细胞的几个大的分离区域的信号 (图 1)。添加第二个细胞标记 (如 dapi) 有助于将 mub40信号与染色细胞共定位。检测到的细胞总数取决于视野中存在的中性粒细胞的数量, 根据免疫反应的来源和强度, 可能会有很大的差异。这里显示的是来自纯化的固定人类中性粒细胞 (图 1a) 和溃疡性结肠炎患者组织活检的代表性图像 (图 1b)。还显示了从感染肺炎克雷伯菌的小鼠肺部中性粒细胞水平相对较低的图像 (图 1c) 和感染 shigella sonnei 的豚鼠结肠中的中性粒细胞水平较高(图 1d)。

使用活的、纯化的中性粒细胞的结果通常在早期显示很少到没有细胞染色, 随着时间的推移, 随着更多中性粒细胞被激活, ri-meub40染色逐渐增加。这里展示的是一个时间过程系列的图像, 从实验中使用纯化的人中性粒细胞感染荧光 s. sonnei (图 2) . 根据激活信号的强度, 中性粒细胞可能会迅速开始用 mub40染色, 因此建议在添加激活剂之前开始获取图像。当细胞被激活和 ri-mub40阳性时, 它们应该表现出与固定细胞和渗透细胞相似的染色特征, 从而进行一次穿刺染色。活细胞染色和固定细胞染色的 mub40的最佳浓度为 1μgml (图 3)。可使用较低的浓度 (0.1-0.01μg/ml), 但可降低信号强度。还建议使用 dic 图像或其他活细胞染色来区分哪些细胞显示 ri-mub40信号。

Figure 1
图 1: mub40-人类、小鼠和豚鼠来源的中性粒细胞。(a) 代表 mub40染色 (绿色) 中性粒细胞, 从健康的人类捐献者中纯化。细胞核被 dapi (蓝色) 染色。(b) 溃疡性结肠炎活检导致人中性粒细胞在组织中染色。中性粒细胞与 mub40 (绿色) 和细胞核染色 dapi (蓝色)。(c) 感染肺炎克雷伯菌的小鼠肺部的组织病理学。小鼠中性粒细胞显示在组织中使用 mub 40 (绿色) 和细胞核被染色 dapi (蓝色)。(d) 感染松内志贺氏菌的豚鼠结肠组织病理学。对感染有反应的中性粒细胞在组织中显示为 mub40 (绿色)。s . sonnei细菌 (红色) 表达荧光 dsred 蛋白。细胞核被 dapi (蓝色) 染色。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 活体中性粒细胞染色与 mub40只有在激活时.在 ri-mub 40 存在的情况下, 从一个时间间隔序列中的一些图像中的图像, 涉及到纯化的人类中性粒细胞感染了s. sonnei.在第一组图像 (顶部) 中, 中性粒细胞遇到了用绿色箭头显示的s. sonnei 细菌(红色)。随着时间的推移, 细菌被中性粒细胞内化并消化。当中性粒细胞从细菌中激活时, 它的污渍会随着 ri-mub40 的增加而变得越来越强烈。左边的图像是覆盖着 dic 图像的荧光通道。右侧的图像仅为荧光通道。图像是每隔5分钟拍摄一次。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 不同 mub 的效果40中性粒细胞染色上的浓度.固定渗透中性粒细胞的代表性染色与不同浓度的 mub 40-cy5.纯化后的人中性粒细胞被固定并染色与显示浓度的 mub 40-cy5.细胞核被 dapi (蓝色) 染色。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

在这里, 两个检测中描述了 mub40肽用于研究中性粒细胞炎症和激活。我们展示了 mub40如何揭示组织病理学部分中存在的中性粒细胞, 或使用活纯化的中性粒细胞显示其激活状态。使用 mub40作为染色试剂的关键步骤与任何其他荧光检测方法相同。必须注意确保荧光信号的兼容性, 并采取适当的洗涤步骤来消除背景染色。要获得良好的染色效果, 最重要的考虑因素是显微镜、玻璃滑盖和组织切片的质量。当观察活纯化的中性粒细胞时, 最重要的步骤是在纯化过程中本身。中性粒细胞是敏感的, 可以通过一些不同的信号激活。为了确保实验产生有意义的结果, 必须注意保持纯化后的中性粒细胞处于非活性状态, 直到它们准备好使用为止。这可以通过在缺氧室执行中性粒细胞净化方案来限制中性粒细胞暴露于氧气来实现。

mub40的一个局限性和优势, 取决于所解决的实验问题, 是 mub40只有污渍激活中性粒细胞, 除非它们以某种方式被渗透。如果实验需要跟踪活体动物或纯化细胞中的炎症, 这可能是一个巨大的优势, 但如果实验需要检测所有活的中性粒细胞, 而不管激活状态如何, 这可能是一个劣势。对这一协议的第二个潜在限制是乳铁蛋白存在于各种身体分泌物中, 如眼泪、牛奶和粘液。对于组织病理学染色, 其中这些分泌物保持 (例如,结肠活检, 其中粘液层完整), mub40也会染色粘液层以及任何现有的中性粒细胞。实际上, 这还没有影响我们的分析, 但应该注意这是一个潜在的信号源。

目前, mub40是唯一能够区分活化和非活化活中性粒细胞的中性粒细胞生物标志物。另外, mub40与抗体检测方法不同, 似乎不会在体外体内改变中性粒细胞的功能或存活。例如, 添加针对活中性粒细胞的特定抗体可能是影响中性粒细胞功能或宿主生存的激活信号。这使得 mub40成为一种非常有用的试剂, 用于研究在体外体内发生的中性粒细胞活化或颗粒释放。此外, mub40具有广泛的主机特异性范围, 可直接与许多不同的荧光体结合, 可用于跨多个主机的单步染色检测。因此, mub40染色可在小鼠、人类和其他哺乳动物靶标之间进行比较, 它简化并减少了检测中性粒细胞所需的试剂数量。

虽然该协议特别关注组织病理学和活细胞成像使用 mub40, 我们也成功地使用了多动仪分类和活体动物体内成像的肽。我们预计, mub40将适合接受许多不同的检测, 包括检测中性粒细胞或显示体内的炎症事件, 并将制定未来的研究和协议, 以进一步利用 mub 的频谱40种用途, 特别是使用非侵入性成像技术。

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Disclosures

b. s. m. 被列为 mub40项专利的发明者:

mub40: 欧洲专利 ep11290403.2, 09/09/2011。

ri-mub40: 欧洲专利 ep no. 17306746.3, 111/17。

Acknowledgments

这项工作得到了 laurette fugain 基金会 (lf-2015-15) (b. s. m.) 和 anr jcjc 赠款 (anr-17-ce15-0012) (b. s. m.) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MUB40-Cy5 Benoit Marteyn benoit.marteyn@pasteur.fr Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5 Benoit Marteyn benoit.marteyn@pasteur.fr Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Fixative for histology
Sucrose Sigma-Aldrich S7903 Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) Sakura Finetek USA 4583 Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane Sigma-Aldrich M32631 Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol Sigma-Aldrich 1.00974 Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat Leica Biosystems CM1520 Used to section tissues
Glass microscopy slides Fisher Scientific 12-518-101
Cover slips Thor Labs CG15CH Hi precision coverslip
Dako pen  Sigma-Aldrich Z377821 Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 Stains DNA 
Alexa fluor 488 Phalloidin  Fisher Scientific A12379 Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant Fisher Scientific P36930 Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope Various Various Used to image IF slides
Anoxic Cabinet Various Various Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL Sigma-Aldrich S7653
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Washing buffer component
MACS BSA buffer Miltenyi Biotec 130-091-376 Washing buffer component
Percoll Sigma-Aldrich P4937 Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads Miltenyi Biotec 130-050-501 Used to remove contaminating RBCs
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red Sigma-Aldrich R8755 Used for neutrophil assays

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References

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