Normotérmica Ex Situ coração perfusão na modalidade de trabalho: avaliação da função cardíaca e metabolismo

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Summary

Normotérmica ex situ coração perfusão (ESHP), preserva o coração em um estado semi fisiológico, batendo. Quando executada em um modo de funcionamento, ESHP fornece a oportunidade de realizar avaliações sofisticadas de doador viabilidade de função e de órgão do coração. Aqui, descrevemos nosso método para a avaliação de desempenho do miocárdio durante ESHP.

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Hatami, S., White, C. W., Ondrus, M., Qi, X., Buchko, M., Himmat, S., Lin, L., Cameron, K., Nobes, D., Chung, H. J., Nagendran, J., Freed, D. H. Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism. J. Vis. Exp. (143), e58430, doi:10.3791/58430 (2019).

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Abstract

O método padrão atual de preservação de órgão (armazenamento frio, CS), expõe o coração a um período de isquemia fria que limita o tempo de conservação segura e aumenta o risco de resultados adversos de pós-transplante. Além disso, a natureza estática do CS não permite para avaliação de órgão ou intervenção durante o intervalo de preservação. Normotérmica ex situ coração perfusão (ESHP) é um método novo para preservação do coração doado que minimiza a isquemia fria fornecendo perfusato oxigenado, ricos em nutrientes para o coração. ESHP foi mostrado para ser não-inferior a CS na preservação de doador padrão-critérios corações e também facilitou o transplante clínico dos corações doados após a determinação circulatória da morte. Atualmente, o dispositivo de ESHP clínica disponível apenas perfuses o coração em um estado descarregado, não trabalham, limitando as avaliações de desempenho do miocárdio. Por outro lado, ESHP na modalidade de trabalho oferece a oportunidade para avaliação detalhada do desempenho cardíaco pela avaliação de parâmetros funcionais e metabólicas em condições fisiológicas. Além disso, mais cedo os estudos experimentais têm sugerido que ESHP na modalidade de trabalho pode resultar em melhor preservação funcional. Aqui, descrevemos o protocolo para ex situ perfusão do coração em um modelo de grandes mamíferos (suínos), que é reprodutível para coração tamanhos e modelos diferentes de animais. O programa de software no aparelho ESHP permite controle automatizado e em tempo real da velocidade da bomba para manter a desejada pressão atrial esquerda e da aorta e avalia uma variedade de parâmetros funcionais e eletrofisiológicos com necessidade mínima de supervisão/manipulação.

Introduction

Relevância clínica

Enquanto a maioria dos aspectos do transplante cardíaco têm evoluído significativamente desde o primeiro coração transplante em 1967, armazenamento frio (CS) continua a ser o padrão para o doador coração preservação1. CS expõe o órgão para um período de isquemia fria que limita o intervalo de segurança preservação (4 – 6 horas) e aumenta o risco de disfunção de prótese primária2,3,4. Devido à natureza estática de CS, avaliações de função ou intervenções terapêuticas não são possíveis no tempo entre a colheita de órgãos e transplante de órgãos. Esta é uma limitação específica em doadores de critérios estendidos incluindo corações doadas após a morte circulatória (DCD), criando um obstáculo para a superação da disparidade considerável entre a demanda e o atual doador piscina5,6. Para endereço que esta limitação, ex situ perfusão de coração tem sido proposta como um método de preservação corações doados, minimização da exposição à isquemia fria, fornecendo à novo, semi fisiológico oxigenado, perfusato ricos em nutrientes para o coração durante o tempo de preservação 1 , 7 , 8.

Ex situ perfusão de coração

Um dos métodos mais frequentemente utilizados para ex situ exame do coração isolado é Langendorff perfusão. Neste método, introduzido por Oskar Langendorff em 1895, o sangue flui para as artérias coronárias e do seio coronário do coração isolado, com o coração em um vazio e batendo estado9,10. ESHP clínica em um modo de Langendorff com o aparelho do sistema de cuidados do órgão Transmedics (OCS) foi mostrado para ser não-inferior a CS na preservação da norma-critérios doador corações1e tem facilitado o transplante clínico de corações DCD 11. no entanto, existem preocupações sobre a capacidade do dispositivo para avaliar a viabilidade do órgão, como um número de corações doadores inicialmente pensados para ser para transplante foram descartado após a perfusão do OCS3. O OCS suporta o coração no modo Langendorff (não-trabalho) e, portanto, possui uma capacidade limitada para avaliação da função de bombeamento do coração3,12. Um corpo crescente de evidências sugere que os parâmetros funcionais oferecem uma melhor forma de avaliar a viabilidade do órgão, sugerindo que a avaliação da função cardíaca pode se tornar uma ferramenta confiável para a avaliação e seleção de coração para transplante durante ESHP3 ,12,13,14, além disso, nossos estudos sobre corações porcina ex situ perfundidos sugerem que ESHP na modalidade de trabalho fornece maior preservação funcional do coração durante a perfusão intervalo15,16.

Um aparelho ESHP capaz de preservar o coração em uma modalidade de trabalho deve possuir um nível de automação em segurança e precisamente manter pré-carga, pós-carga e taxas de fluxo. Além disso, tal sistema deve possuir a flexibilidade para facilitar avaliações abrangentes da função cardíaca a ser empreendida. ESHP o aparelho usado aqui é equipado com software personalizado que 1) fornece e mantém desejado da aorta (Ao) e esquerdo (LA) atrial pressão/fluxo e 2) fornece a análise em tempo real de parâmetros funcionais e avaliação visual de ondas de pressão com mínima necessidade de supervisão. Dados de pressão são adquiridos com transdutores de pressão padrão cheio de líquido, e dados de fluxo são adquiridos com sondas doppler fluxo de tempo de trânsito. Estes sinais são digitalizados com uma ponte e entrada analógica, respectivamente. O coração é posicionado horizontalmente com uma ligeira elevação para os grandes vasos em uma membrana de silicone macio. Os acessórios de canulação passam através da membrana, incorporando uma câmara de conformidade para amortecimento de ejeção ventricular. O objetivo deste trabalho é apresentar os pesquisadores no campo do transplante cardíaco com um protocolo para ex situ perfusão e avaliação do coração, sob condições normotérmico, semi fisiológicas na modalidade de trabalho, em um modelo de grande mamífero (porco Yorkshire).

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Protocol

Todos os procedimentos neste manuscrito foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense de cuidado Animal e o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado animal da Universidade de Alberta. Este protocolo foi aplicado em porcos de Yorkshire fêmeas juvenis entre 35 a 50 kg. Todos os indivíduos envolvidos em procedimentos ESHP tinham recebido formação adequada de biossegurança.

1. pré-cirúrgicas preparações

  1. Coloque a câmara de órgão corretamente no carrinho aparelho e instalar a membrana de suporte de silicone no interior da câmara de órgão. Ao Ao, artéria pulmonar (PA) e pontos de conexão de LA pode ser visto na Figura 1.
  2. Instale o oxigenador de rede (representado na Figura 2AB) ESHP tubulação e o filtro. Anexe as linhas de água do trocador de calor e a tubulação de gás de varredura para o oxigenador.
  3. Lugar o fluxo sondas de medição do seio coronário/PA e LA fluxo do tubo correspondente.
  4. Os transdutores de pressão Ao e LA conecte as linhas representativas do circuito.
  5. Certifique-se de que todas as conexões de tubulação estão bem fixas e todas as torneiras e fechaduras luer estão devidamente fechadas nos sites desanexados.
  6. Prime do circuito com 750 mL de tampão de Krebs-Henseleit modificado (NaCl, 85; KCl, 4.6; NaHCO3, 25; KH2PO, 1.2; MgSO4, 1.2; glicose, 11; e CaCl2, 1,25 mmol/L) contendo 8% de albumina. Eliminação do ar as bombas Ao e LA posicionando a saída da bomba acima da entrada para que o ar sai a câmara da bomba (Figura 3). A solução normalmente não precisa ser oxygenized antes do início da perfusão.
  7. Após Ao iniciar o software e LA bombas de são veiculadas e o circuito é carregado.

2. ajustes e inicialização de Software ESHP

Nota: O aparelho ESHP usado aqui é equipado com um programa de software personalizado para permitir o controle de velocidade da bomba, a fim de atingir e manter desejado LA e Ao pressões. O software também analisa parâmetros funcionais e fornece uma avaliação visual de ondas de pressão (Figura 4).

  1. Para iniciar o programa ESHP, clique no atalho do programa no monitor.
  2. Na página "configuração", clique em "inicializar". A mensagem de inicialização aparecerá no quadro (Figura 5).
  3. Na mesma página, zero os sensores de fluxo, clicando em "zero LA fluxo" e "zero fluxo de PA". A mensagem irá aparecer no quadro.
  4. Ajustar a altura dos transdutores de pressão para a altura do suporte de silício. Para zero os transdutores de pressão, abra Ao e Transdutores de pressão LA (e quaisquer outros transdutores configurados para verificar a pressão) para a atmosfera e, em seguida, clique o botão "zero todas as pressões". A mensagem irá aparecer no quadro.
  5. Na página "principal", aumente a velocidade da bomba Ao gradualmente até o ponto onde o fluxo da cânula Ao aparece na câmara do órgão. No actual sistema, isto é conseguido com rotações de 900-1000 por minuto (RPM).
  6. Adicionar 750 mL de sangue para a solução de perfusato para trazer o volume total de perfusato para 1,5 L (conforme descrito no "cirurgia, colheita de sangue e aquisição de coração" seção) e depois aumente a LA bomba PRM (800-900 RPM) para que nenhum ar permanece na cânula de LA ou a tubagem de LA abaixo da membrana de apoio de silicone.
  7. Após inicializar o software de controle e de aeração do aparato ESHP, aquisição de coração doador pode prosseguir.

3. preparações e anestesia

  1. Administre 20 mg/kg de ketamina e 0,05 mg/kg de atropina por via intramuscular para pré-medicação.
  2. Transfira o porco para a sala de cirurgia e o porco na mesa de operação com mesa de aquecimento para manter normotermia.
  3. Titula-se taxa de fluxo de oxigênio para a indução de máscara de acordo com o peso do animal e o sistema anestésico. Para os circuitos de anestésicos-círculo fechado o fluxo de oxigênio deve ser de 20-40 mL/kg.
  4. Ligue o isoflurano para 4-5%; após um ou dois minutos, isto pode ser reduzido para 3%.
  5. Avalie a profundidade da anestesia. O porco não está no plano cirúrgico se não houver nenhum reflexo de retirada em resposta aos estímulos nocivos.
  6. Após a confirmação da profundidade da anestesia adequada, proceda à intubação.
  7. Coloque a sonda de oxímetro de pulso na língua (preferida) ou ouvido. A saturação de oxigênio medida por oximetria de pulso deve permanecer acima de 90%.
  8. Tire manchas de cabelo nas regiões do cotovelo esquerdo e direito e sufocar a esquerda. Lave a oleosidade da pele com água e sabão, enxaguar com álcool e secar completamente. Coloque os contatos de ECG. Evite a interferência de fio de chumbo com o sítio cirúrgico. Ligue as pontas para os locais corretos.
  9. Para manter a anestesia, ajuste o fluxo de oxigênio (20-40 mL/kg) e taxa de gases inalantes (1 – 3%). A frequência cardíaca deve ser 80 – 130 batimentos/min. taxa de respiração deve ser de 12 a 30 respirações por minuto.
  10. Raspar, lavar e assepticamente, preparar o local da incisão.

4. sangue coleta e aquisição de coração

  1. Avalie o nível de anestesia cada mínimo cada 5min para confirmar o avião cirúrgico (sem pedal reflexo e não reflexo de piscar, sem resposta a estímulos dolorosos).
  2. Execute uma esternotomia mediana.
    1. Identifica jugulum e xifoide como Marcos.
    2. Usando o eletrocautério, desenvolva a linha média entre os marcos dividindo-se o tecido subcutâneo e fáscia entre as fibras do músculo peitoral maior.
    3. Marca a linha média ao longo do osso esterno com o cautério. Realize a osteotomia esternal com uma serra elétrica ou pneumática. Para evitar a criação de lesões com as estruturas subjacentes (por exemplo, pericárdio e veia braquiocefálica e artéria innominate), procedam-se gradualmente com a serra.
    4. Retrai o esterno gradualmente, usando um retractor esternal. Para evitar tensão excessiva e lesão vascular, não coloque o retractor demasiado longe cranialmente.
    5. Livre dos ligamentos sternopericardial da superfície posterior do esterno usando cauterização.
    6. Abrir o pericárdio com uma tesoura de Metzenbaum e corrigir as bordas pericárdicas ao esterno usando sutura de seda de 1-0.
  3. Estender a incisão mediana cranialmente por 2 – 3 cm e expor a artéria carótida comum direita e a veia jugular interna.
  4. Obter controle proximal e distal dos navios circundando os vasos com gravatas de seda (2-0).
  5. Amarre os laços envolventes cranianos em cada navio.
  6. Abra o 1/3 anterior de cada navio com uma lâmina 11 e insira uma bainha de 5-6 em cada vaso. Forros de gravata a caudal gravata cerco em torno de cada embarcação para garantir a respectiva.
  7. Monitore a pressão venosa central e arterial conectando cada bainha a um transdutor de pressão.
  8. Entrega 1.000 U/kg de heparina intravenosa.
  9. Coloque um 3-0 polipropileno sutura em bolsa ao redor do apêndice atrial direito e fixe-a com um laço.
  10. Dentro da sutura em bolsa, crie uma incisão de 1 cm sobre o apêndice usando uma lâmina 11. Introduza uma cânula venosa de dois estágios (28/36 FR) dentro da incisão e a posição da ponta distal da veia cava inferior. Fixe a cânula por laço de dependência para a cânula venosa. Controle a saída da cânula com um grampo da tubagem.
  11. De dois estágios cânula venosa colocada no átrio direito, coletar 750 mL de sangue total do porco gradualmente ao longo de um período de 15 min em um recipiente de vidro esterilizado e simultaneamente, substitua o volume 1 L de uma solução cristaloide isotônica, tais como . Plasmalyte
  12. Adicione o sangue para o circuito de perfusão (que foi previamente preparado com albumina de 8% contendo tampão Krebs-Henseleit de 750 mL) para alcançar um volume final de 1,5 L de perfusato. O perfusato é uma combinação de 1:1 de Krebs-Henseleit contendo solução de 8% de albumina e sangue de animais doadores 17.
  13. Coloque uma agulha de cardioplegia (14 – 16) na Ao ascendente e fixe-a com um laço.
  14. Conecte a cânula de cardioplegia com o saco de cardioplegia e adicionar 100 mL de sangue de 400 mL de cardioplegia (St. Thomas Hospital solução) para alcançar um volume final de 500 mL sangue cardioplegia.
  15. Eutanásia o porco por perda de sangue. Se pretende adicionar mais sangue para o perfusato após o início da perfusão (de acordo com os objectivos do estudo), coletar o sangue e adicione 10 a 30 U/mL de heparina e armazená-lo em um recipiente de vidro ou um saco de plástico a 4 ° C para durações curtas (horas
  16. Ao ascendente com uma braçadeira Ao e entregar a solução de página na raiz Ao grampear.
  17. Após a entrega da solução de página estiver concluída, remova o grampear e executar o cardiectomy.
    1. Para facilitar a fixação do Ao e PA a sua representante cânula, parcialmente disse a ascendente Ao partir o PA usando uma tesoura de Metzenbaum.
    2. Transecto a superior e inferior veia cava, deixando aproximadamente 1 cm de comprimento em cada um.
    3. Separe o coração do mediastino posterior por cruza das veias pulmonares.
    4. O coração, garantindo a todos Ao arco dos navios são adquiridos juntamente com um segmento da descida Ao imposto especial de consumo. Preserve até a bifurcação da PA.
  18. Pese o coração vazio. A quantidade de ganho de peso durante o intervalo de conservação ex situ pode ser usada como uma métrica para edema de órgão.

5. colocação do coração para o aparelho ESHP e o início da perfusão

  1. Apare o excesso de tecido em torno do LA com uma tesoura de Metzenbaum e corte entre as veias pulmonares, para criar um orifício comum.
  2. Coloque uma sutura em bolsa ao redor do orifício de LA usando uma sutura de polipropileno 3-0.
  3. Sutura e fechar a veia cava inferior com uma sutura de polipropileno 3-0. Deixe a veia cava superior aberta no início da perfusão para garantir que o ventrículo direito (RV) descompactado até o perfusato aquecido e um ritmo organizado é alcançado.
  4. Coloque a cânula de LA no orifício LA e fixe-a com um laço (Figura 6).
  5. Esprema suavemente os ventrículos para eliminação de ar no coração"de 5.5. e adicioná-lo para 5,7. como aumentar a velocidade da bomba à 1600rpm como delicadamente apertando o coração. O ar restante Ao raiz será ejetado através dos ramos inominados e subclávios.
  6. Ao fixe a cânula Ao embebido na membrana do silicone. Fixe à volta da cânula com um laço de seda. Guarnição do para alcançar uma mentira apropriada sem tensão ou torção.
  7. Aumente a velocidade da bomba à 1600 RPM. O ar restante Ao raiz será ejetado através dos ramos inominados e subclávios.
  8. Conecte a linha de expurgo à artéria innominate. Fixe a conexão com um laço de seda.
  9. Armadilha do orifício da artéria subclávia esquerda com uma gravata de seda. Prenda o fecho com um laço e snap. Através do orifício da artéria subclávia, coloque uma bainha introdutora (5f). Certifique-se de que o comprimento do cateter e sua orientação é ajustado para que não interfira com o funcionamento da válvula de Ao.
  10. Conecte o transdutor de pressão Ao porto lateral da bainha introdutora.
  11. Ler a pressão no monitor. Ajuste a velocidade da bomba para alcançar uma pressão média de 30 mm Hg. Neste momento (tempo 0), a perfusão terá começado no modo não-trabalho (modo de Langendorff) e aparência de um perfusato venoso escuro na linha de PA é um refletor de restabelecimento do fluxo coronariano. Defina um temporizador para seguir a duração da perfusão, se necessário.
  12. Ligue o permutador de calor e definir a temperatura de 38 ° C. O perfusato aquecerá até 37 – 38 ° C em cerca de 10 min. Para perfusão normotérmica de um coração suíno, manter a temperatura a 38 ° C, durante a perfusão.
  13. Manter a perfusão no modo de não-trabalho para a primeira hora da perfusão. Ajuste a velocidade da bomba de LA para manter a pressão de LA a 0 mmHg.
  14. Uma vez que a temperatura do perfusato > 34 ° C, avaliar o ritmo cardíaco e o ritmo e desfibrilar como necessários (5-20 joules). Certifique-se de que coração é completamente descompactado antes de tentar a cardioversão.
  15. Verificar o status de gás dissolvido usando um analisador de gás de sangue. Ajustar a mistura de gás para manter um pH: pressão parcial arterial de 7,35 – 7,45, dióxido de carbono (PumCO2): 35-45 mmHg, pressão parcial arterial de oxigênio (PumO2): de 100-150 mmHg e oxigênio saturação (então2) ≥ 95%.
  16. Uma vez que o coração é normotérmico e em um ritmo estável, ligate da veia cava superior.
  17. Prenda pacemaker temporário na parede atrial direita e ritmo do coração em um modo AAI em 100 batimentos/min.
  18. Coloque os eléctrodos de eletrocardiografia Epicárdica para a superfície do coração.
  19. Alternar para o modo de funcionamento após 1 h de perfusão no modo de Langendorff. Para essa finalidade, digite o desejo LA pressão (normalmente 6 a 8 mmHg) no lado esquerdo da página principal, na seção "desejado colo" do software e clique no botão para iniciar o ciclo de feedback. A modalidade de trabalho ativado será exibido como um botão verde, e a velocidade da bomba de LA automaticamente irá aumentar e diminuir para alcançar e manter a pressão desejada de LA.
  20. Como o coração começa a trabalhar, resistência vascular coronariana vai cair, resultando em uma baixa pressão diastólica. Ajuste a velocidade da bomba para manter a pressão diastólica de 40 mmHg como pós-carga durante a perfusão no modo de trabalhar.

6. metabólico apoio durante ESHP

Nota: Soluções de perfusão de órgãos, incluindo a solução-tampão Krebs-Henseleit, normalmente contêm glicose como o substrato de energia primária.

  1. Verifique o nível de glicose (por exemplo, com gasometria arterial) em intervalos regulares durante a perfusão. Acordo com as taxas de consumo, usando uma glicose de substituição de bomba de infusão padrão por doses arteriais contínuas da infusão e/ou em bolus, para manter uma concentração arterial de 6 a 8 mmol/L de glicose durante a perfusão.
  2. Usando uma bomba de infusão separada, entrega 2 U/h de insulina para o perfusato em toda a perfusão, alterando a velocidade de infusão de insulina de acordo com os objectivos do estudo.
  3. Para a estimulação β-adrenoceptores do coração, entregar o perfusato usando uma bomba de infusão padrão 0,08 µ g/min de epinefrina e continuar durante a perfusão. Alternativamente, uma infusão de 4 µ g/min de dobutamina pode ser usada.

7. antimicrobiana e anti-inflamatórios agentes

  1. Adicione um antibiótico de largo espectro (por exemplo, de 3,375 gramas de piperacillin-tazobactama) para o perfusato no início da perfusão.
  2. Adicione agentes anti-inflamatórios (por exemplo, 500 mg de metilprednisolona) para o perfusato em conformidade com os objectivos do estudo, se necessário.

8. avaliação da função

Nota: O ESHP software de controlo automaticamente calcula e registra índices hemodinâmicos e funcionais de estado estacionário a cada 10 segundos.

  1. Avaliação da função sistólica e diastólica de estado estacionário
    1. Para a avaliação e gravação dos dados de estado estacionário, através da bainha introdutora colocado anteriormente na artéria subclávia, colocar um cateter pigtail cheias de líquido para o ventrículo esquerdo (LV), enquanto no modo de trabalhar.
      1. Irrigue o cateter pigtail com soro fisiológico e colocar o fio guia dentro dela.
      2. Insira cuidadosamente o cateter dentro da cânula de bainha anteriormente colocada na artéria subclávia. Assim que ele passa através da válvula Ao, retire o fio-guia lentamente e conectar o cateter pigtail para a linha de pressão de LV.
      3. Siga a onda de pressão de LV no monitor. A diastólica parte da onda de pressão vai chegar a zero quando o cateter tem colocado corretamente dentro a LV. Digno de nota, esta etapa só é possível na modalidade de trabalho, desde que a válvula Ao deve abrir normalmente para o cateter pigtail poder entrar na câmara. Uma vez que o cateter pigtail é colocado em LV e conectado ao transdutor de pressão de LV, a taxa máxima e mínima do LV da mudança na pressão (dP/dT min e max dP/dT) será gravada automaticamente.
    2. Determine o desempenho do miocárdio indexando o flow medido na linha de LA, para massa de coração (mL·min– 1·g– 1), em uma determinada pressão constante de LA (6 – 8 mmHg) e uma pressão diastólica de 40 mm Hg e uma frequência cardíaca de 100 beats·min– 1. A pressão de LA é igual o débito cardíaco, assumindo que não há nenhum Ao insuficiência. Examine a forma de onda Ao pressão para garantir que não há nenhum Ao insuficiência.
  2. Avaliação do trabalho de pré-carga recrutável AVC (PRSW)
    Nota: PRSW é a relação linear entre o volume diastólico final e trabalho de curso de LV (LVSW) e representa um índice para a avaliação da função ventricular, independente do tamanho dos ventrículo18,19, pré-carga e pós-carga. PRSW pode ser medido com este sistema de forma não-invasiva, como descrito abaixo13.
    1. Remova o cateter pigtail o LV, desde que o cateter pode induzir arritmias durante a análise PRSW que afectará negativamente a precisão dos resultados.
    2. Na página principal, na seção "Capture LPC", ajustar a taxa desejada de queda na velocidade da bomba de LA durante a análise (tipicamente 100-200 RPM) e desejado tempo durante o qual a análise ocorrerá (tipicamente de 10 – 12 s) (Figura 4).
    3. Depois de realizar os ajustes mencionados acima, clique em "Record PVL". O software automaticamente sair do modo de trabalho e reduzir gradualmente a LA bomba RPM enquanto gravava simultaneamente a pressão LVSW e LA. Na conclusão da coleta de dados, o software irá realizar a regressão linear sobre o dataset recém adquirido para produzir PRSW. Depois que o software ESHP foi concluída a análise, uma mensagem aparecerá na página principal, mostrando o coeficiente de correlação da análise. Pressione "Okey" se o coeficiente (r) é desejável (normalmente > 0,95). Os resultados da análise PRSW serão gravados.
    4. Depois de realizar a análise, para retornar a perfusão no modo de trabalho, clique em "Pressione para iniciar a modalidade de trabalho;" caso contrário, o software vai continuar no modo de Langendorff (não-trabalho). O botão cinza vai virar verde indicando um retorno ao modo de trabalho. Se repetir a análise PRSW é necessário, antes de cada nova tentativa de assegurar que os valores de pressão/fluxo de LA voltar os valores anteriores de estado estacionário.

9. metabólica avaliação do Ex Situ perfundidos coração

  1. Avaliar o estado metabólico do coração e o perfusato durante ESHP, usando as informações obtidas a partir da análise do gás de sangue das amostras de perfusato colhidos tanto Ao (arterial) e PA (venosas) linhas cada 1 – 2 h.
  2. Realizar gasometria arterial (cada 1 – 2 h) para monitorar o gás e o estado iônico do perfusato. Ajustar a composição de gases (O2 e CO2) e varrer a velocidade para manter um pH de 7,35 – 7,45, paO2 de 100-150 mmHg e paCO2 de 35-45 mmHg. Ajustar e manter a concentração iônica de perfusato de potássio e cálcio na faixa fisiológica durante a perfusão (por exemplo, por adição de cloreto de cálcio, se necessário).
  3. Use as informações obtidas a gasometria arterial e fluxo sanguíneo coronariano para calcular parâmetros metabólicos. Por exemplo, calcular o consumo de oxigênio do miocárdio (MVO2), e LV eficiência mecânica (ME) como segue:
    1. Determine MVO2 (mL O2 · min-1 · 100 g-1) multiplicando a diferença arterial-venosa no teor de oxigénio (CaO2 – CvO2) o fluxo de sangue coronário (CBF).
      MVO2 = [CaO2 - CvO2 (mL O2 · 100 mL-1)] × CBF (mL. min-1 . 100g massa de coração), onde;
      Conteúdo arterial de oxigênio (CaO2) = [1.34 (mL O2 . g Hb-1) × saturação de oxigênio do Hb concentração (g · 100 mL-1) × (%)] + [0.00289 (mL O2 · mm Hg-1 · 100 mL-1) × PaO2 (mm Hg)]
      Conteúdo de oxigênio venoso (CvO2) = [1.34 (g · mL O2 Hb-1) × saturação de oxigênio do Hb concentração (g · 100 mL-1) × (%)] + [0.00289 (mL O2 · mm Hg-1 · 100 mL-1) × PvO2 (mm Hg)]
    2. Calcule a eficiência mecânica de LV (ME) como segue:
      ME = LVSW (J. Bata-1) / MVO2 (J. Bata-1) onde
      Curso de trabalho = {pressão arterial média (mmHg) - LA pressão (mmHg)} × {LA fluxo (mL. min-1) / taxa de coração (bate. min-1)} × 0.0001334 (J. mL-1 . mmHg-1), e
      MVO2 (J. Bata-1) = {MVO2 (mL. min-1) / taxa de coração (bate. min-1)} × 20 (joules. mL-1)

10. remover o coração do aparelho ESHP ao final da perfusão

  1. Sai do modo de trabalho. Trazer a LA bomba RPM para zero.
  2. Diminua a bomba Ao RPM para zero.
  3. Remova o pigtail e bainhas.
  4. Rapidamente Retire todos os acessórios para o coração.
  5. Pese o coração vazio para determinar o grau de formação de edema miocárdico.
  6. Tomar rapidamente as amostras de tecido do tamanho apropriado dos ventrículos direito e esquerdos e coloque-os em gel de temperatura (OCT) corte ideal, formalina e/ou snap congelá-los em nitrogênio líquido. Armazenar as amostras para futuras investigações (OCT e encaixe as amostras congeladas em um freezer-80 ° C, amostras de formalina-armazenados num recipiente adequadamente fechado à temperatura ambiente).
  7. Feche o programa; todos os dados gravados serão salvos.
  8. Descarte o tecido restante, sangue, materiais bioativos e componentes de aparelhos usados ESHP de acordo com protocolos institucionais.
  9. Limpe o carrinho ESHP usando uma superfície dura e saneantes limpa (por exemplo, 70% de etanol).

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Representative Results

No início da perfusão (no modo de não-trabalho), o coração vai retomar normalmente um ritmo sinusal quando a temperatura do sistema e do perfusato se aproxima normotermia. Quando entrar no modo de funcionamento, como as pressões de LA aproximam-se os valores desejados, ejeção sobre o traçado de pressão Ao deve ser observada e o fluxo de LA (um reflexo do débito cardíaco) deve aumentar gradualmente. Em um modelo de porco Yorkshire (35 – 50 kg) e um peso inicial de coração de 180 – 220 gramas, o fluxo inicial de LA será ~ 2.000 mL/min, e isso normalmente se aproximarão ~ 2.750 mL/min durante a primeira hora de perfusão na modalidade de trabalho. A Figura 7 exibe tendências na pressão Ao (A), bem como o LA e o fluxo arterial pulmonar (B) mais de 12 h de perfusão.

Durante ESHP no modo de funcionamento fisiológico, várias avaliações metabólicas do coração também são possíveis. Avaliações do gás de sangue análise/metabólica realizadas nas amostras de perfusato obtidas durante ESHP fornecem informações abrangentes sobre o status metabólico do coração ao longo do tempo (tabelas 1 e 2) e (Figura 8A, B)20 . Além de gasometria arterial, perfusato amostras podem ser coletadas e avaliadas para biomarcadores diferentes tais como o peptídeo natriurético cerebral e troponina-I; no entanto, deve notar-se que ESHP ocorre em um sistema fechado, com nenhuma troca de solução de perfusato. Na ausência dos órgãos que naturalmente metabolizar/limpar estes factores (por exemplo, rins), o acúmulo de biomarcadores ao longo do tempo na solução de perfusato é tipicamente observado (Figura 9).

Avaliação funcional do coração usando esta plataforma pode incluir ambos os parâmetros de carga-dependente [incluindo desempenho miocárdico (índice cardíaco, CI), LVSW, máximos e mínimos taxas de variação de pressão (dp/dt max e min)] e parâmetros de carga independente ( PRSW) (tabela 3). A Figura 10 demonstra a avaliação do LV PRSW durante uma redução linear no LA pressão13, controlado por computador. Em nossa experiência com ESHP de > 200 suínos corações e > 10 corações humanos, o uso de um programa de software automatizado ESHP tem sido em associação com o desenvolvimento de procedimentos operacionais padrão, resultando em variabilidade mínima intere intraoperador em os parâmetros funcionais. O sistema de software e aparelhos ESHP usado aqui foram projetados para manter a pressão desejada e coletar os parâmetros funcionais com necessidade mínima de ajustes manuais, e temos observado um interclass coeficiente de correlação (ICC) ≥0.9 para todos os parâmetros avaliados (p. ex. LVSW e dP/dt max e min) que é responsável por excelente confiabilidade inter avaliador, intra-avaliador e teste-reteste. Neste sistema, a monitorização eletrocardiográfica do coração durante a perfusão pode também ocorrer usando dois eletrodos, conforme descrito no protocolo, fornecendo informações sobre a frequência cardíaca e o ritmo durante a perfusão (Figura 4).

A avaliação do coração durante ESHP pode ser prorrogada para diferentes modalidades de imagem. Ecocardiografia durante ESHP pode fornecer informações adicionais sobre a função miocárdica (por exemplo, fração de ejeção ventricular) e parâmetros anatômicos (Figura 11 e Figura 12). Além disso, é possível com imagem angiográfica21uma avaliação da vasculatura coronária.

Executar uma análise de regressão linear identifica quais parâmetros melhores correlacionaram com o desempenho do miocárdio (índice cardíaco: mL·min1·g1) durante ESHP. Mostramos anteriormente que, apesar da variação significativa na capacidade dos parâmetros medidos funcionais para prever o desempenho miocárdico, parâmetros globais, funcionais apresentam uma alta correlação com débito cardíaco. Os melhores preditores funcionais incluíram trabalho de curso sistólica [coeficiente de determinação (R2) = 0.759], função sistólica e mínima dP/dt, (R2 = 0,738) para a função diastólica. Curiosamente, parâmetros metabólicos sozinhos mostram uma capacidade muito limitada para prever o desempenho do miocárdio (consumo de oxigênio: R2 = 0,28; resistência vascular coronariana: R2 = 0,20; concentração de lactato: R2 = 0,02). 13 a perfusão do coração em uma modalidade de trabalho normotérmica oferece a oportunidade de obter avaliações abrangentes metabólicas e funcionais do coração durante a preservação de órgão. Um dispositivo ESHP clínica com a capacidade de suportar o coração do doador na modalidade de trabalho irá fornecer a equipe de saúde com a possibilidade de decisões feitas sobre a viabilidade do órgão com base em dados objectivos antes do transplante.

Figure 1
Figura 1: A membrana de suporte de silicone para o coração. Suporte de membrana retratado com cânula aórtica integrada (A), cânula atrial esquerda (B) e cânula da artéria pulmonar (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: circuito ESHP o. (A) figura esquemática do circuito ESHP. (B) ESHP aparelhos utilizados em nosso ambiente. A = órgão câmara e silicone suporte de membrana, B = reservatório, C = filtro de linha arterial, D = bomba atrial esquerda, E = bomba aórtica, F = oxigenador de membrana e trocador de calor, G = misturador de gás, H = tubo sensor de fluxo, eu = sensor de pressão, J = torneira/conector luer lock. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: de arejar as bombas posicionando a saída da bomba para um nível superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: tela tiro do programa de software executando ESHP mostrando os parâmetros funcionais cardíacos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: tela tiro do programa de software ESHP inicializado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A cânula atrial esquerda magnética fixada à face posterior do átrio esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: monitoramento de fluxos e pressões durante a perfusão. (A) tendências na pressão aórtica durante 12 h de ESHP. (B) tendências na artéria pulmonar e atrial esquerda flui durante 12 h de ESHP clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: tendências ao longo do tempo. Consumo de oxigênio do miocárdio (A) e (B) venoso lactato concentração durante 12 h de ESHP clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: tendências ao longo do tempo a concentração de perfusato da troponina cardíaca-I durante 12 h de ESHP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: avaliação da pré-carga recrutável curso trabalho um mal funcionamento do coração (cinza) versus um coração funcione bem (preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: imagens representativas de ecocardiográficas bidimensionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12: imagens ecocardiográficas representante modo-M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetros (arteriais) da aorta Parâmetros (venosos) PA
T1 T5 T11 T1 T5 T11
Valores de gasometria
pH 7.28 7.44 7,33 7.25 4.42 7: 30h
pO2 (mmHg) 123.00 149,00 141.00 44.00 55,40 57.80
pCO2 (mmHg) 38,00 33.90 42,50 43,00 37.10 46.10
Valores de oximetria
HB (g/dL) 4.20 4.10 3,90 4.20 4.10 3,90
Então2 (%) 100,00 100,00 100,00 64,00 95.50 92.00
Valores de eletrólito
K+ (mmol/L) 4.20 4.60 5.20 4.20 4.60 5.20
At+ (mmol/L) 142.00 144.00 149,00 142.00 144.00 149,00
CA2 + (mmol/L) 1,02 1.20 1.40 1,02 1.20 1.40
CL(mmol/L) 107.00 109.00 114.00 107.00 109.00 114.00
OSM (mmol/kg) 291.30 292.50 302.40 291.90 292.90 302.40
Valores de metabólito
Glicose (mmol/L) 7,00 5,30 5.10 7,00 5.20 5,00
Lactato (mmol/L) 3.00 2.30 2,00 3.10 2.40 1,90
Status de Base ácida
HCO 3(mmol/L) 17.60 23,10 21.90 18.50 23.70 22.40

Tabela 1: um caso da análise do gás de sangue realizado durante o ex situ perfusão de coração. CA2 +, íons de cálcio; CL-, íon cloreto; HB, hemoglobina; HCO3-, íon bicarbonato; K+, íons de potássio; At+, íons de sódio; OSM, osmolaridade; paCO2, pressão parcial arterial de dióxido de carbono; paO2, pressão parcial arterial de oxigênio; Então2, saturação de oxigênio; T1, 1 h de ex situ perfusão (início da perfusão); T5, 5h de ex situ perfusão (meio da perfusão); T11, 11 h de ex situ perfusão (final da perfusão)

Tempo
Parâmetros metabólicos T1 T5 T11
MVO2 mL/min/100g 6.68 2,44 1,77
Venoso lactato mmol/L 3.1 2.4 1.9
Venoso - lactato Arterial diferença mmol/L 0.1 0.1 -0.1
Utilização de glicose g/h 1.23 0.6 1.14

Tabela 2: parâmetros metabólicos calculados usando os dados de análise de gás de sangue. MVO2, consumo de oxigênio do miocárdio; T1, 1 h de ex situ perfusão (início da perfusão); T5, 5h de ex situ perfusão (meio da perfusão); T11, 11 h de ex situ perfusão (final da perfusão)

Tempo
Parâmetros funcionais T1 T5 T11
CI (mL/min/g) 10,26 9,66 7,50
SW (mmHg * mL) 2253 1965 1323
dP/dT máxima (mmHg/s) 1781 1783 1482
Sys p (mmHg) 128 121 91
ME (%) 6,69 16.85 21.68
PRSW 399 348.38 248.63
dP/dT min (mmHg/s) -1444 -2350 -844

Tabela 3: um caso de esquerda parâmetros funcionais ventriculares avaliada durante ex situ perfusão de coração. CI, índice cardíaco; dP/dT máxima, máxima taxa de mudança de pressão; dP/dT min, taxa mínima de mudança de pressão; ME, eficiência mecânica; PRSW, trabalho de pré-carga recrutável derrame; SW, trabalho de curso; Sys p, pressão sistólica; T1, 1 h de ex situ perfusão (início da perfusão); T5, 5h de ex situ perfusão (meio da perfusão); T11, 11 h de ex situ perfusão (final da perfusão).

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Discussion

Perfusão de sucesso é definido de acordo com os objectivos do estudo; no entanto, isto deve incluir ESHP ininterrupto para a quantidade desejada de tempo e a coleção completa dos dados sobre a função cardíaca durante a perfusão. Para este efeito, a poucos passos críticos no protocolo devem ser seguidos.

O coração é um órgão com oxigênio alto e demandas de energia e minimizar o tempo de isquemia antes canulação e perfusão é um princípio importante que deve ser seguido. O processo de aquisição, o coração de montagem sobre o aparelho ESHP e iniciar perfusão não deve exceder 20 a 30 min.

Para perfusão eficiente e confiável avaliação funcional, o processo de montagem o coração em cima da aparelho tem importância crítica. Alinhamento anatômico adequado das grandes artérias desempenha um papel importante a este respeito. O coração deve ser obtido com um comprimento adequado de PA e Ao arco ramos para que esses navios não são esticados quando anexado para as representante cânulas. Desde o início da perfusão, perfusão coronariana eficiente desempenha um papel fundamental na proteção do coração durante a ex situ da perfusão. Após o início da perfusão no modo de não-trabalho, a pressão Ao deve ser monitorizada e ajustada pelo menos 30 mmHg para apoiar a perfusão coronariana eficientemente. A aparência de um perfusato venoso escuro na linha de PA é um refletor do restabelecimento do fluxo coronariano. Depois de alternar para o modo de trabalho, a pressão Ao deve ser ajustada para 40 mmHg para fornecer pressão de perfusão coronariana adequada para o trabalho de coração.

Deairing as câmaras cardíacas e Ao é essencial para o sucesso ESHP. Na época de anexar a cânula de LA, espremer as câmaras ajudará em deairing o coração. Todo o ar restante no LV que é ejetado deve recircular através da linha de expurgo na artéria innominate, que minimiza o risco de embolia coronária. No entanto, se ar substancial permanece no coração esquerdo no momento da comutação para o modo de funcionamento, embolia coronária é possível levando a uma diminuição significativa da função miocárdica.

O objetivo da abordagem apresentada é fornecer uma plataforma confiável e reprodutível em estudos experimentais de ESHP em modelos de grande mamífero. Esse sistema fornece a oportunidade para perfusão em um modo de funcionamento fisiológico e extensa avaliação do coração perfundido. Isso fornece uma oportunidade para avaliar cardioprotetores protocolos vistos ressuscitar os órgãos do doador disfuncional. Este sistema facilita avaliações simples e reprodutíveis de parâmetros funcionais cardíacas juntamente com parâmetros metabólicos durante ESHP, fornecendo dados objetivos que podem ser usados para identificar órgãos viáveis para transplante. Uma avaliação tão abrangente é de particular importância quando avaliar critérios estendidos doou e corações doadas após a morte circulatória. Além disso, de acordo com as nossas observações no cenário de ESHP experimental, corações perfundidas em uma modalidade de trabalho exibir superior preservação da função sistólica e diastólica ao longo do tempo, em comparação com corações preservadas em um modo de Langendorff e podem ajudar a estender o cofre tempo de conservação.

ESHP em um modo de trabalho é um método eficiente para preservar o coração doado e avaliar sua viabilidade, ainda é um ambiente artificial, falta muitos dos aspectos fisiológicos do corpo (por exemplo, em tempo real hormonal e nutricional equilíbrio/suporte e radicais livres sistemas de eliminação). O coração é um órgão com as demandas de energia sofisticada/metabólica. Assim, fornecendo suporte metabólico consistente e eficiente para o coração perfundido é criticamente importante. Temos observado um declínio na função do ex situ perfundido coração, particularmente durante a perfusão prolongada vezes22. Tal um declínio pode ser reflexivo de ineficiências metabólicas que afetam a função do coração perfundido de modo a trabalhar. Mais estudos são garantidos para caracterizar o suporte metabólico ideal para o coração durante ESHP. Um desafio adicional é a complexidade da perfusão do coração de modo a trabalhar. Apesar da simplicidade reforçada de ESHP neste sistema, a perfusão de modo a trabalhar deve ser realizada por pessoal bem treinado.

Aparelho com capacidade para realizar uma avaliação funcional e metabólica global dos corações em um modelo de grandes mamíferos, ESHP oferece grande potencial para desenvolver protocolos terapêuticos translacionais para melhorar disfuncional/suboptimal corações doadas . ESHP pode servir como uma plataforma para administrar intervenções terapêuticas, visando a uma ampla gama de condições (por exemplo, lesão por isquemia reperfusão) e avaliar seus efeitos sobre os parâmetros metabólicos e funcionais do coração perfundido12. Além disso, a modalidade de trabalho ESHP pode facilitar a extensão do intervalo de preservação segura, que pode ajudar a superar limitações geográficas da doação de órgãos e facilitar a melhor alocação dos corações doadas.

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Disclosures

FHD detém patentes sobre métodos e ex situ tecnologia de perfusão de órgão. FHD e Jo são fundadores e principais accionistas da Tevosol, Inc.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por concessões do canadense nacional transplante programa de pesquisa. SH é o destinatário de uma faculdade de medicina e odontologia Motyl Studentship pós-graduação em Ciências cardíaca. A FHD é um beneficiário de uma subvenção de projetos de pesquisa colaborativa (CHRP) em auxílio do nacional de Ciências e engenharia Research Council e institutos canadenses de pesquisa em saúde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Debakey-Metzenbaum dissecting scissors Pilling 342202
MAYO dissecting scissors Pilling 460420
THUMB forceps Pilling 465165
Debakey straight vascular tissue forceps  Pilling 351808
CUSHING Gutschdressing forceps Pilling 466200
JOHNSON needle holder Pilling 510312
DERF needle holder Pilling 443120
Sternal saw Stryker 6207
Sternal retractor Pilling 341162
Vorse tubing clamp Pilling 351377
MORRIS ascending aorta clamp Pilling 353617
Surgical snare (tourniquet) set Medtronic CVR79013
2-0 SILK black 12" x 18" strands ETHICON A185H
3-0 PROLENE blue 18" PS-2 cutting ETHICON 8687H
Biomedicus pump drive (modified) Medtronic 540 Modified to allow remote electronic control of pump speed
Biomedicus pump Maquet BPX-80
Membrane oxigenator D 905 SORIN GROUP 50513
Tubing flow module   Transonic Ts410
PXL clamp-on flow sensor Transonic ME9PXL-BL37SF
TruWave pressure transducer Edwards VSYPX272
Intercept tubing 3/8" x 3/32" xX 6' Medtronic 3506
Intercept tubing 1/4" x 1/16" x 8' Medtronic 3108
Heated/Refrigerated Bath Circulator  Grant TX-150
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer Radiometer 989-963
DLP cardioplegia cannula (aortic root cannula) Medtronics 20613994495406
5F Ventriculr straight pigtail cathter CORDIS 534550S
5F AVANTI+ Sheath Introducer CORDIS 504605A
Emerald Amplatz Guidewire CORDIS 502571A
Dual chamber pace maker Medtronic 5388
Defibrilltor CodeMaster M1722B
Infusion pump Baxter AS50
Surgical electrocautery device Kls Martin ME411
Gas mixer SECHRIST 3500 CP-G
Medical oxygen tank praxair 2014408
Cabon dioxide tank praxair 5823115
Bovine serum albumin MP biomedicals 218057791

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References

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