التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ICP0 يخضع إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. ولا يعرف الآلية الجزيئية لهذا الحدث. هنا يصف لنا استخدام مجهر [كنفوكل] كأداة لقياس حركة ICP0 في هامبورغ-1 العدوى، الذي يرسي الأساس لتحليل كمي إزفاء ICP0 في الدراسات الميكانيكية في المستقبل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Samrat, S. K., Gu, H. Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58504, doi:10.3791/58504 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) لفيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) بروتين مبكر فوري الذي يحتوي على ليجاسى ubiquitin E3 عصابة من نوع. أنها مسؤولة عن تدهور proteasomal المضيف العوامل المقيدة وتفعيل الجينات الفيروسية اللاحقة. ICP0 يحتوي على تسلسل تعريب النووي المتعارف عليه (NLS). أنه يدخل النواة فورا بعد توليف حيثياته وينفذ مهامه الدفاع المضادة المضيف أساسا في النواة. ومع ذلك، لاحقاً في الإصابة، ICP0 يتم العثور على فقط في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. يفترض أن يتيح إزفاء ICP0 ICP0 تعدل مهامها وفقا لمواقعها سوبسيلولار في مراحل مختلفة من العدوى. كي تحدد الوظيفة البيولوجية وآلية تنظيمية من ICP0 النووية إلى هيولى إزفاء، قمنا بتعديل أسلوب الفحص المجهري إيممونوفلوريسسينت لرصد الاتجار ICP0 خلال هامبورغ-1 العدوى. ويشمل هذا البروتوكول تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، [كنفوكل] مجهر التصوير، والنووية مقابل توزيع هيولى تحليل. والهدف من هذا البروتوكول التكيف مع حالة ثابتة [كنفوكل] الصور التي اتخذت في دورة وقت إلى توثيق كمية الحركة ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب يمكن أن يعمم لتحليل كمي النووية مقابل الحصول على التعريب هيولى من البروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى دون إشراك تكنولوجيا التصوير الحي.

Introduction

يسبب فيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) مجموعة واسعة من معتدلة إلى شديدة الأمراض الحلئيه بما في ذلك لابياليس الحلأ الحلأ التناسلي، التهاب القرنية stromal والتهاب الدماغ. وبمجرد إصابة، ينشئ الفيروس عدوى مدى الحياة كامنة في الخلايا العصبية ganglia. في بعض الأحيان، يمكن إعادة تنشيط الفيروس بأسباب مختلفة مثل الحمى والإجهاد وقمع المناعة1، مما أدى إلى إصابة القوباء المتكررة. بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) منظم فيروسية أساسية حاسمة للحال والكامنة على السواء هامبورغ-1 العدوى. أنها ترانساكتيفاتيس الفيروس المصب الجينات عن طريق التصدي للمضيف الدفاعات المضادة للفيروسات مضمن الفطرية/2،3. وقد ICP0 بنشاط ليجاسى ubiquitin E3، الذي يستهدف عدة عوامل خلية لتدهور تعتمد على بروتوزوم3. أنه يتفاعل أيضا مع مختلف مسارات الخلية لتنظيم أنشطتها وبعد ذلك إزاحة القيود المضادة للفيروسات المضيف3. ومن المعروف ICP0 لتحديد موقع في المقصورات سوبسيلولار مختلفة كما تنتقل العدوى3،،من45. وقد البروتين إشارة تعريب نووية يسين/ارجينين--الغنية (NLS) الموجود في المخلفات إلى 500 5066. عند توليف حيثياته في وقت مبكر هامبورغ-1 العدوى، يتم استيراد ICP0 فورا إلى النواة. أنها أول مرة اكتشفت في دينامية نووية وصف بنية المجال النووي 10 (ND10)7. نشاط ليجاسى ubiquitin E3 ICP0 يتسبب تدهور البروتينات المنظم ND10، promyelocytic سرطان الدم (الرابطة الإسلامية) البروتين، والبروتين الأرقط 100 كاتشين (Sp100)8،،من910. بعد فقدان البروتينات المنظم، مشتتة الهيئات النووية ND10 وهو موزع ICP0 لملء4،أسرة نواة11.

من المثير للاهتمام، بعد بدء تكرار الحمض النووي الفيروسي، يختفي ICP0 من النواة. إلا يوجد في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى متأخراً في هامبورغ-1 العدوى4،12. ويعني اشتراط تكرار الحمض النووي مشاركة محتملة أواخر protein(s) الفيروسية في تيسير نقل جسد هيولى من هامبورغ-1 ICP04،12. ICP0 الاتجار فيما بين الأقسام المختلفة أثناء الإصابة تمكن على ما يبدو ICP0 تعدل اتصالاتها على مختلف المسارات الخلوية بطريقة مكانية الزمانية، وتنسيق ذلك وظائفها المتعددة لغرامة ضبط التوازن بين الحال والكامن هامبورغ-1 العدوى13. لفهم أفضل لتعدد الوظائف ICP0 وتنسيق مجالات وظيفية ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال، نحن بعناية تشريح الأساس الجزيئي الحيوي إزفاء ICP012. لإجراء الدراسات الميكانيكية سبق الإبلاغ عنها12، المطبقة لدينا أسلوب المصبوغة إيمونوفلوريسسينت لتصور التعريب ICP0 سوبسيلولار في حالة الإصابة مختلفة تحت المجهر [كنفوكل]. كما قمنا بتطوير بروتوكول كمية لتحليل النووية مقابل هيولى توزيع ICP0 باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. كان جدولت سكان هامبورغ-1 إصابة الخلايا في مراحل الإصابة وحللت اتجاهات الحركة ICP0، تحت مختلف علاجات البيوكيماوية12. هنا نحن تصف البروتوكول مفصلاً أن إزفاء الوثائق ICP0 في هامبورغ-1 العدوى. ونحن نقترح أنه يمكن اعتماد هذا الأسلوب كوسيلة عامة للدراسة النووية مقابل هيولى نقل جسد للبروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى، التي يمكن أن تخدم كبديل للتصوير الحي عندما يكون غير قابل للتطبيق نظراً لتقنية التصوير الحي مشاكل مثل تسمية الأسلوب، وكثافة إشارة، أو وفرة البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية البذر والإصابة بالفيروسات

  1. في 20 – 24 ساعة قبل الإصابة بالفيروس، البذور 5 × 104 خلايا الرئة الجنينية البشرية (هيل) تنتجها الخلايا الليفية أو خلايا أخرى ينبغي بحثها على شريحة متداخلة مم 11 4-جيدا في النمو المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع الأبقار الجنين 10% المصل (FBS)). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2).
    ملاحظة: كل جيد ينبغي أن يكون كونفلوينسي خلية 70-80% في وقت الإصابة.
  2. في اليوم التالي، إزالة المتوسطة النمو وتصيب الخلايا بالفيروسات في المتوسط-199 في طائفة من 4 – 10 بفو/خلية. احتضان الخلايا المصابة بالفيروسات ح 1 في 37 درجة مئوية. الاحتفاظ بالهز الشريحة أثناء فترة الحضانة.
  3. وبعد تفريخ ح 1، إزالة المتوسطة-199 والملحق مع متوسط النمو.
    ملاحظة: يمكن إضافة الأدوية التي تتداخل مع الإصابة بمختلف المراحل في هذه الخطوة، أو قبل امتصاص الفيروسية.
  4. احتضان الخلايا المصابة بالفيروس عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لأطوال مختلفة من فترة الإصابة.

2. تثبيت وبيرميبيليزيشن

  1. وفي الوقت السليم العدوى، بسرعة تغسل الخلايا المصابة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 3 مرات وإضافة 200 ميكروليتر من 4% بارافورمالدهيد طازج في برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع بارافورمالدهيد لمدة 8-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا في كل بئر.
  2. نضح بارافورمالدهيد وغسل الآبار مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات. تماما نضح برنامج تلفزيوني بعد الغسيل 3rd .
  3. إضافة 100 ميكروليتر من السطح غير الأيونية 0.2% لكل بئر بيرميبيليزي الخلايا لمدة 5 – 10 دقائق.
  4. نضح الفاعل غير الأيونية وغسل الآبار مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات.

3-إيمونوفلوريسسينت تلطيخ

  1. تماما نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت حظر (ألبومين المصل البقري 1% (BSA) و 5% مصل الحصان في برنامج تلفزيوني) في كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  2. إضافة تركيز تصميماً تجريبيا لجسم الأولية (الأرنب ICP0 مكافحة جسم [بولكلونل]12) في المخزن المؤقت لحظر واحتضان جسم الأولية في درجة حرارة الغرفة ح 2 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  3. يغسل مع المخزن المؤقت حظر 3 مرات مع حضانة 10 دقيقة. إضافة مترافق 594 أليكسا الماعز الأرنب المضادة جسم الثانوي (1: 400 المخفف في المخزن المؤقت لحظر) واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة ح 1. ثم يغسل الشرائح 3 مرات مع المخزن المؤقت لحظر عند الفاصل الزمني 10 دقيقة.
  4. وأخيراً غسل الشريحة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا جيش صرب البوسنة ومصل الحصان.
  5. أضف قطره واحدة من المتوسطة تصاعد أنتيفادي مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) جبل الشريحة، وختم ذلك ساترة باستخدام طلاء الأظافر الشفاف.

4-[كنفوكل] التصوير

  1. مع مجهر [كنفوكل]، تعيين الطول الموجي في 590 – 650 نانومتر 594 أليكسا و 410 – 520 نانومتر ل DAPI. حدد تنسيق الصورة في 1024 × 1024 وخط متوسط 8 للحصول على صور عالية الدقة.
  2. تحليل كل بئر على الشريحة 4-البئر تحت المجهر [كنفوكل]. الحصول على الصور الممثل الخلية تحت الهدف X 100، كما هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2.
  3. لعد عدد كبير من الخلايا، التقاط صور لحقول متتالية تحت الهدف X 40.
    ملاحظة: يتطلب الصور 5-10 تتراكم الخلايا المصابة ما يزيد على 200 من كل نقطة مرة كل العدوى.
  4. في كل تجربة، والتقاط الصور مع معلمات [كنفوكل] ثابتة لجميع العينات الحاجة إلى مقارنة.

5-تحليل النووية مقابل توزيع هيولى

  1. فتح المشروع مع برنامج التطبيق [كنفوكل]. حدد صورة من خلالها الخلايا بحاجة إلى تكون مبوبة للنووي مقابل هيولى توزيع ICP0.
  2. انقر فوق علامة التبويب "الكمية" من أعلى القائمة وحدد "فرز رويس" من القائمة "أدوات".
  3. رسم خط طولي عبر الخلية يتم تحليلها عن طريق تحديد "رسم خط" من القائمة العلوية.
    ملاحظة: سوف يظهر الرسم البياني تبين كثافة الأسفار على طول الخط لكل من ICP0 و DAPI. في الرسم البياني، الخط الأزرق يمثل DAPI بكسل وعلامات حدود النواة بينما يمثل الخط الأحمر ICP0 بكسل.
  4. استناداً إلى تلوين الخلفية، قم بإعداد عتبة ثابتة لكثافة ICP0 لتحليل التوزيع ICP0 سوبسيلولار في كل تجربة.
    1. كما يتمثل في الشكل 2، إذا كانت الإشارة الحمراء في المتوسط عن العتبة في منطقة نووية لكن عتبة خارج الحدود الزرقاء، وتصنيف إشارة حمراء يقع معظمها في السيتوبلازم.
    2. إذا كانت إشارة حمراء فوق العتبة في جميع أنحاء النواة وتتجاوز حدود الإشارات الزرقاء، المجموعة إشارة حمراء كنواة بالإضافة إلى تعريب هيولى.
    3. إذا كان إشارة حمراء فوق العتبة في النواة ولكن في المتوسط هو أقل من ذلك خارج حدود الإشارات الزرقاء، المجموعة إشارة حمراء كمسلم النووي.
  5. جدولة الخلايا المصابة أكثر من 200 من كل عينة في وقت الإصابة مختلفة والأرض في رسم بياني شريطي لتوضيح حركة ICP0 وفقا للوقت (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لفهم الأساس الجزيئي والوظائف البيولوجية ICP0 الاتجار خلال هامبورغ-1 العدوى، نستخدم أسلوب الفحص المجهري إيمونوفلوريسسينت لتحليل التوزيع ICP0 سوبسيلولار في مراحل مختلفة من العدوى. ويبين الشكل 1 الخلايا الممثل مع التعريب ICP0 المميزة مع تقدم الإصابة. لتحديد مقدار إزفاء النووية إلى هيولى من ICP0، نحن نحلل توزيع ICP0 بالنسبة إلى النواة بتصنيف الخلايا المصابة إلى ثلاث مجموعات: النووية التعريب والتعريب هيولى (التعريب النووية بالإضافة إلى هيولى الشكل 2). لفهم العناصر اللازمة للاتجار ICP0 أثناء الإصابة، نحن تتبع حركات ICP0 في نوع البرية أو المسخ هامبورغ-1 في مراحل مختلفة من العدوى. ويبين الشكل 3 مثال على نتائج الجدولة للتوزيع سوبسيلولار من ICP0 في نقطة زمنية مختلفة من العدوى.

Figure 1
رقم 1: الاتجار ICP0 بالحيوية خلال العدوى هامبورغ-1- خلايا هيل نمت على شرائح 4-جيدا كانوا مصابين باولي هامبورغ-1 (السلالة F) في 10 بفو/خلية. في 1 و 5 و 9 ح بعد الإصابة (hpi)، خلايا كانت ثابتة وبيرميبيليزيد، واستجاب لأرنب الماوس ومكافحة ICP0 مكافحة--حزب الرابطة الإسلامية أضداد الأولية وثم رد فعل الأرنب المضادة مترافق 594 أليكسا واليكسا 488-كوجوجاتيد المضادة الماوس الثانوي الأجسام المضادة التصوير تحت 100 X أهداف. بمثابة Promyelocytic سرطان الدم (الرابطة الإسلامية) البروتين بروتين علامة للهيئات النووية ND10، الذي يختفي في hpi 5 و 9 بسبب تدهور حزب الرابطة الإسلامية في الإصابة. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل لتوزيع سوبسيلولار ICP0. اللوحة اليسرى: مع مجهر [كنفوكل]، جرى توسيع الخلايا الممثل لإظهار الخط الطولي الذي رسمته عبر الخلية التي تحدد المنطقة التي تهم (ROI). اللوحة اليسرى: كثافة بكسل Fluorescence في عائد الاستثمار كمياً لكل من ICP0 و DAPI في الخلايا الفردية ويتضح كرسوم بيانية ببرنامج التطبيق [كنفوكل]. تم تعيين حد تعسفي (الخط الأخضر) تعكس تلوين الخلفية. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: النسبة المئوية لتوزيع البرية من نوع سوبسيلولار ومحطة ج اقتطاع ICP0. خلايا هيل كانت مصابة بفيروسات التوليفية التي تحتوي على ICP0 البرية من نوع (ICP0 WT) أو اقتطاع ج-محطة ICP0 (ICP0 ج-اقتطاع) في 4 بفو/خلية. في النقاط الزمنية المشار إليها، كانت الخلايا الملون وتحليلها كما هو موضح أعلاه. وقد جدولت الخلايا ما يزيد على 200 لموقع ICP0. كانت النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على المواد النووية وهيولي، أو النووية + ICP0 هيولى المرسومة مع برنامج حساب جدول بيانات. هذه تجربة نموذجية لإظهار أن استخدام هذا الأسلوب، نكون قد حددنا ICP0 ج-تيرمينوس كمجال المطلوب إزفاء النووية إلى هيولى ICP0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة إزفاء النووية إلى هيولى من هامبورغ-1 ICP0. ICP0 يخضع الاتجار سوبسيلولار خلال هامبورغ-1 العدوى (الشكل 1). من المحتمل يتفاعل ICP0 مع مختلف مسارات الخلية القيام بمهام مختلفة في مواقع مختلفة. وهذا يتيح ICP0 لتهذيب وظائفها المتعددة في شد مع الإنسان المضيف13. ومع ذلك، كيف ينسق ICP0 وظائف متعددة في طريقة مكانية الزمانية لا جيدا درس. مع بروتوكول الفحص المجهري نيون الموصوفة أعلاه، بدأنا بتحليل الأساس الجزيئي إزفاء النووية إلى هيولى ICP0. وحتى الآن، وقد حددنا ج ICP0--المحطة الطرفية 35 من الأحماض الأمينية كعنصر مطلوب هام لنقل جسد هذا. نظراً لغياب ج-تيرمينوس، مقيدة ICP0 داخل النواة طوال الإصابة (الشكل 3). كما وجدنا أن ICP0 E3 ليجاسى-تعتمد على استبقاء نووية قوة تأخير النووي-إلى-هيولى إزفاء في الخلايا U2OS12. وعلاوة على ذلك، لقد اكتشفنا أن ICP0 ج-تيرمينوس والتعبير عن البروتينات الفيروسية أواخر التعاون للتغلب على الاحتفاظ بالنووية وتسهيل نقل جسد هيولى12. حاليا، نحن نستخدم هذا البروتوكول إلى الشاشة للبروتينات الفيروسية أواخر المشاركة في نقل جسد النووية إلى هيولى ICP0.

ووضع البروتوكول في البداية لدراسة دينامية الاتجار ICP0 في هامبورغ-1 العدوى. كما هو مبين في الشكل 1، مبكرا في هامبورغ-1 العدوى، هو كولوكاليزيد ICP0 مع ND10، حيث العديد من المكونات الرئيسية من العوامل المقيدة الخلوية والمكونات ND10 مثل حزب الرابطة الإسلامية و Sp1008، هي المتدهورة. بعد اللاإنسانية المكونات الرئيسية ND10، ICP0 ينشر طوال النواة والمتأخرة في الإصابة، ICP0 هو ذوبانها إلى السيتوبلازم. لأنه يخضع ICP0 التوليف حيثياته عند الإصابة، أبوندانسي البروتين الأولية منخفضة جداً وثم توليف فيروسية قوية سوف يحجب بسرعة حركة أي الجزيئات الفردية، مما يجعل من الصعب تتبع باستخدام جزيء واحد تكنولوجيا التصوير الحي. لذلك، اخترنا عمدا لا استخدام التصوير الحي. بدلاً من ذلك، اعتمدنا على البروتوكول أعلاه لدراسة التعريب ثابت الدولة ICP0 في الإصابة بمختلف النقاط التي خدمتنا جيدا في تتبع حركة ICP0 الزمنية في عدد سكان من هامبورغ-1 إصابة الخلايا.

لارتفاع نسبة الإشارة إلى خلفية في التحليل [كنفوكل]، اثنين من الخطوات الحاسمة جديرة بالملاحظة في الجزء الرطب-مقاعد البدلاء من هذا البروتوكول. أولاً، تسمح شرائح متداخلة جيدا 4 عينات متعددة معالجتها على شريحة واحدة واحدة. فإنه يحفظ إلى حد كبير استخدام الكواشف الثمينة مثل الفيروسات والأجسام المضادة. ومع ذلك، لأن وحدة التخزين في كل بئر صغيرة جداً، يمكن أن تتداخل المخزن المؤقت المتبقية مسح لا تماما خلال المخزن المؤقت تغييرات مع الكاشف اللاحقة. ولذلك، مطلوب مطمح شامل في كل مفتاح المخزن المؤقت، قبل إضافة المخزن المؤقت الجديد. ثانيا، استناداً إلى تجاربنا، مدى نفاذية crosslinking وغشاء الخلية من المهم لوضوح إشارات الأسفار. لقد حددنا عدد 10 دقيقة بارافورمالدهيد والعلاجات الفاعل النطاق تجريبي. ووجدنا أن الوقت كثير أطول أو أقصر من 10 دقيقة يمكن إنقاص نسبة الإشارة إلى الخلفية. كما هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2، وكذلك في دراسة سابقة12، الصور التي تم الحصول عليها في تجاربنا واضحة وضوح الشمس. إشارة زرقاء بارزة أن يحدد بوضوح الحدود النووية مفتاح لتحديد توزيع سوبسيلولار ICP0. في الجزء الحسابي من هذا البروتوكول، خطوة حاسمة لتحديد عتبة مستمرة للقضاء على الخلفية. تلطيخ ناجحة مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الخلفية هو المفتاح لانخفاض عتبة خط وأفضل إشارة التباين. حفظ عتبة ثابتة لجميع العينات في نفس التجربة، ومع ذلك، هو الأساس لتوثيق كمي ICP0 (الشكل 2 و الشكل 3).

البروتوكول أيضا بمثابة أداة عامة لدراسة الاتجار سوبسيلولار للبروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى عندما تفتقر إلى أسلوب تصوير العيش مناسبة. في تقنية التصوير الحي، وتحفظ الخلايا في البيئة الفيزيولوجية المثلى للحفاظ على خلية الحالة الأيضية14،15. هو شرط أساسي لتصوير الخلايا الحية لتسمية فلوريسسينتلي البروتين المستهدفة، التي يمكن أن تتحقق بالصمامات البروتين المستهدف مع علامة نيون16، أو لتسليم fluorophore مترافق جزيء محددة للبروتين المستهدف17 . وفي كلتا الحالتين، قد ترتفع المشاكل إذا كان انصهار علامة نيون بتغيير خاصية البروتين الهدف أو جزيء fluorophore مترافق بصعوبة عبر غشاء الخلية. فوتوبليتشينج الذي يسبب تلف الخلايا في هذه العملية شاغل إضافي في التصوير يعيش18. ولذلك، ستظل استراتيجيات جديدة للتغلب على الحد تصوير مباشر على الحدود لتطوير التكنولوجيا. ويوفر البروتوكول وصفناها هنا التحليل الزمني للصور [كنفوكل] حالة ثابتة، والتي يمكن أن تخدم كأداة بديلة عندما لا يتوفر أسلوب تصوير العيش سليم. الطريقة سهلة ويمكن الاعتماد عليها. ويوفر كشف واضح للتعريب سوبسيلولار البروتين مع خلفية الحد الأدنى. باستخدام البرمجيات [كنفوكل]، نحن قادرون على تحليل النسبة المئوية للخلايا مع توزيعات مختلفة من البروتين المستهدف في عدد سكان خلية كمياً وتوثيق حركة البروتين المستهدف في مراحل مختلفة من الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدعم المالي من منحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1AI118992) منحت قو هاي. ونحن نشكر مرفق الفحص المجهري، والتصوير وقياس الموارد (MICR) الأساسية في جامعة ولاية وين للدعم التقني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and viruses
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS
HSV-1 viral Stock (Strain F) Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen  11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-500ml
Medium-199 (10x) Gibco 11825-015
Reagents
4- well 11 mm staggered slide Cel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Fisher reagents BP151-1C0
Bovine Serum Abumin (BSA) Calbiochem CAS 9048-46-8
Horse Serum Sigma H1270
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) Dr. Haidong Gu lab
NaCl       Fisher Bioreagent BP358-212
KH2PO4             Fisher Bioreagent BP362-500
KCl              Fisher Scientific  BP366-500
Na2HPO4              Fisher Bioreagent BP332-500
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 antibody Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG santa Cruz Biotechnology SC-966
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG invitrogen A11012
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG invitrogen A11001
Vectashield Mouting medium with DAPI Vector laboratories H-1200
Pasteur pipette Fisher Brand 13-678-20D
Nail Polish Sally Hansen
Equipment
Confocal Microscope Leica SP8
Confocal Software Leica LAS X Application suite
Excel software Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Scientific Order code 51026282

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5, (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75, (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71, (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68, (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75, (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18, (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90, (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3, (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89, (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92, (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13, (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122, (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23, (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300, (5616), 82-86 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics