एक दाद सिंप्लेक्स वायरस के परमाणु-cytoplasmic Translocation के लौकिक विश्लेषण Immunofluorescent फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 1 प्रोटीन

Immunology and Infection

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Summary

एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान ICP0 बहोत न्यूक्लियर-टू-cytoplasmic translocation । इस घटना का आणविक तंत्र ज्ञात नहीं है. यहां हम एचएसवी-1 संक्रमण है, जो मात्रात्मक भविष्य में यंत्रवत अध्ययन में ICP0 translocation विश्लेषण के लिए आधार देता है में ICP0 आंदोलन यों तो एक उपकरण के रूप में फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग का वर्णन ।

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Samrat, S. K., Gu, H. Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58504, doi:10.3791/58504 (2018).

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Abstract

संक्रमित कोशिका प्रोटीन 0 (ICP0) दाद सिंप्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी-1) एक अंगूठी प्रकार E3 ubiquitin ligase युक्त तत्काल जल्दी प्रोटीन है । यह मेजबान प्रतिबंधात्मक कारकों और बाद में वायरल जीन सक्रियण के proteasomal क्षरण के लिए जिंमेदार है । ICP0 में एक विहित नाभिकीय स्थानीयकरण अनुक्रम (एनएलएस) होता है । यह तुरंत डी नोवो संश्लेषण के बाद नाभिक में प्रवेश करती है और नाभिक में मुख्य रूप से अपने विरोधी मेजबान रक्षा कार्य निष्पादित करता है । हालांकि, बाद में संक्रमण में, ICP0 केवल कोशिका द्रव्य में पाया जाता है, एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान एक परमाणु-cytoplasmic translocation की घटना का सुझाव । शायद ICP0 translocation अलग संक्रमण चरणों में अपने उपसेलुलर स्थानों के अनुसार अपने कार्यों को मिलाना ICP0 सक्षम बनाता है । ICP0 परमाणु-टू-cytoplasmic translocation के जैविक कार्य और विनियामक तंत्र को चित्रित करने के लिए, हमने immunofluorescent-1 संक्रमण के दौरान ICP0 तस्करी पर नजर रखने के लिए एक एचएसवी माइक्रोस्कोपिक पद्धति को संशोधित किया था । इस प्रोटोकॉल immunofluorescent धुंधला, फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग, और परमाणु बनाम cytoplasmic वितरण विश्लेषण शामिल है । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को स्थिर राज्य फोकल lytic संक्रमण भर में ICP0 आंदोलन के एक मात्रात्मक प्रलेखन में एक समय पाठ्यक्रम में ले लिया छवियों अनुकूलन है । हम प्रस्ताव है कि इस विधि को मात्रात्मक अंय वायरल या सेलुलर प्रोटीन के परमाणु बनाम cytoplasmic स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए लाइव इमेजिंग प्रौद्योगिकी को शामिल किए बिना सामान्यीकृत किया जा सकता है ।

Introduction

दाद सिंप्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी-1) दाद labialis, जननांग दाद, stromal स्वच्छपटलशोथ, और इन्सेफेलाइटिस सहित गंभीर ददहा रोगों के लिए हल्के की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है । एक बार संक्रमित, वायरस गैंग्लिया न्यूरॉन्स में एक आजीवन अव्यक्त संक्रमण स्थापित करता है. कभी-कभार, वायरस विभिन्न कारणों से इस तरह के बुखार के रूप में सक्रिय किया जा सकता है, तनाव, और प्रतिरक्षा दमन1, आवर्तक दाद संक्रमण के लिए अग्रणी. संक्रमित सेल प्रोटीन 0 (ICP0) lytic और अव्यक्त एचएसवी-1 संक्रमण दोनों के लिए एक महत्वपूर्ण वायरल नियामक है । यह मेजबान आंतरिक/जन्मजात एंटीवायरल2,3सुरक्षा प्रतिक्रिया के माध्यम से बहाव वायरस जीन transactivates । ICP0 एक E3 ubiquitin ligase गतिविधि है, जो proteasome के लिए कई सेल कारकों पर निर्भर क्षरण3लक्ष्य है । यह भी विभिन्न सेल रास्ते के साथ बातचीत करने के लिए उनकी गतिविधियों को विनियमित करने के लिए और बाद में ऑफसेट करने के लिए मेजबान एंटीवायरल प्रतिबंध3. ICP0 अलग उपसेलुलर डिब्बों पर संक्रमण आय3,4,5के रूप में पता लगाने के लिए जाना जाता है । प्रोटीन एक lysine/arginine-रिच परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) ५०० ५०६6के अवशेषों पर स्थित है । जल्दी एचएसवी-1 संक्रमण पर डी नोवो संश्लेषण पर, ICP0 तुरंत नाभिक में आयात किया जाता है । यह पहली बार एक गतिशील परमाणु संरचना में पाया जाता है परमाणु डोमेन 10 (ND10) का कार्यकाल7। E3 ubiquitin ligase गतिविधि के ICP0 ट्रिगर ND10 आयोजक प्रोटीन, promyelocytic ल्यूकेमिया (पीएमएल) प्रोटीन का क्षरण, और धब्बेदार प्रोटीन १०० केडीए (Sp100)8,9,10. आयोजक प्रोटीन के नुकसान के बाद, ND10 परमाणु शरीर फैलाया जाता है और ICP0 पूरे नाभिक को भरने के लिए फैलाना है4,11.

दिलचस्प है, वायरल डीएनए प्रतिकृति की शुरुआत के बाद, ICP0 नाभिक से गायब हो जाता है । यह केवल कोशिका द्रव्य में पाया जाता है, एक परमाणु-cytoplasmic translocation देर एचएसवी-1 संक्रमण4,12की घटना का सुझाव । डीएनए प्रतिकृति की आवश्यकता से तात्पर्य है एक देर से वायरल प्रोटीन की क्षमता की भागीदारी (ओं) को सुविधाजनक बनाने में एचएसवी के cytoplasmic translocation-1 ICP04,12। जाहिरा तौर पर संक्रमण के दौरान विभिंन डिब्बों के बीच ICP0 तस्कर ICP0 अधिकार के लिए एक स्थानिक लौकिक फैशन में विभिंन सेलुलर रास्ते के लिए अपनी बातचीत मिलाना, और इसलिए इसके कई कार्यों के बीच संतुलन धुन ठीक करने के लिए समंवय lytic और अव्यक्त एचएसवी-1 संक्रमण13. बेहतर ICP0 multifunctionality और lytic संक्रमण के दौरान ICP0 कार्यात्मक डोमेन के समंवय को समझने के लिए, हम ध्यान से गतिशील ICP0 translocation12के आणविक आधार विदारक । यंत्रवत अध्ययन पहले12की रिपोर्ट का संचालन करने के लिए, हम फोकल माइक्रोस्कोप के तहत विभिन्न संक्रमण की स्थिति में ICP0 उपसेलुलर स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए एक immunofluorescent धुंधला विधि लागू किया है. हम भी एक मात्रात्मक प्रोटोकॉल विकसित किया है ICP0 के परमाणु बनाम cytoplasmic वितरण का विश्लेषण करने के लिए फोकल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । एचएसवी-1 संक्रमित कोशिकाओं की आबादी संक्रमण चरणों भर में सारणीबद्ध और ICP0 आंदोलन की प्रवृत्तियों का विश्लेषण किया गया था, विभिन्न जैव रासायनिक उपचार के तहत12. यहां हम विस्तृत प्रोटोकॉल है कि दस्तावेजों एचएसवी-1 संक्रमण में ICP0 translocation का वर्णन । हम प्रस्ताव है कि इस विधि के लिए एक सामांय विधि के रूप में अपनाया जा सकता है अंय वायरल या सेलुलर प्रोटीन के लिए परमाणु बनाम cytoplasmic translocation अध्ययन, जो इमेजिंग जीने के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते है जब लाइव इमेजिंग तकनीक के कारण लागू है ऐसे लेबलिंग विधि, संकेत तीव्रता, या प्रोटीन बहुतायत के रूप में समस्याओं ।

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Protocol

1. सेल सीडिंग और वायरस के संक्रमण

  1. वायरस के संक्रमण से पहले 20-24 एच में, बीज 5 x 10 मानव भ्रूण फेफड़े (हेल) fibroblast कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं के 4-अच्छी तरह से 11 मिमी के विकास में चौंका हुआ स्लाइड पर जांच की जा करने के लिए एक 4-खैर में वृद्धि मध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड (2CO) के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से संक्रमण के समय में 70-80% सेल प्रवाह होना चाहिए ।
  2. अगले दिन, वृद्धि के माध्यम को हटाने और मध्यम में वायरस के साथ कोशिकाओं को संक्रमित-१९९ की श्रेणी में 4 – 10 pfu/सेल । ३७ ° c पर 1 ज के लिए वायरस-संक्रमित कोशिकाओं की मशीन । गर्मी की अवधि के दौरान स्लाइड मिलाते रहो ।
  3. 1 ज की मशीन के बाद, मध्यम-१९९ और विकास माध्यम के साथ पूरक निकालें ।
    नोट: दवाओं है कि विभिंन संक्रमण चरणों के साथ हस्तक्षेप इस कदम पर जोड़ा जा सकता है या वायरल अवशोषण से पहले ।
  4. संक्रमण की अवधि के विभिंन लंबाई के लिए 5% सह2 के साथ ३७ ° c पर वायरस संक्रमित कोशिकाओं की मशीन ।

2. निर्धारण और Permeabilization

  1. उचित संक्रमण समय पर, जल्दी से संक्रमित कोशिकाओं को फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) 3 बार के साथ धो लें और 4% paraformaldehyde के २०० μL को नए सिरे से पंजाब में तैयार करें । कमरे के तापमान पर 8-10 मिनट के लिए paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए मशीन ।
  2. महाप्राण paraformaldehyde और 3 बार के लिए पंजाब के २०० μL के साथ कुओं को धो लें । 3rd वॉश के बाद पूरी तरह से महाप्राण पंजाबियों ।
  3. जोड़ें १०० μL के ०.२% गैर ईओण surfactant के लिए एक अच्छी तरह से करने के लिए कोशिकाओं permeabilize के लिए 5-10 मिनट ।
  4. महाप्राण गैर ईओण surfactant और 3 बार के लिए पंजाब के २०० μL के साथ कुओं धो लो ।

3. Immunofluorescent धुंधला

  1. पूरी तरह से महाप्राण पंजाबियों और प्रत्येक अच्छी तरह से (1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और पंजाब में 5% घोड़ा सीरम) अवरुद्ध बफर के २०० μL जोड़ने और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी ।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रयोगात्मक निर्धारित एकाग्रता जोड़ें (खरगोश विरोधी ICP0 polyclonal एंटीबॉडी12) बफर और कमरे के तापमान पर 2 ज या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी में गर्मी अवरुद्ध ।
  3. 10 मिनट की मशीन के साथ 3 बार अवरुद्ध बफर के साथ धो लें । एलेक्सा ५९४-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400 बफर अवरुद्ध में पतला) जोड़ें और 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड की मशीन । फिर 10 मिनट के अंतराल पर स्लाइड्स को ब्लॉकिंग बफ़र के साथ 3 बार धोएं ।
  4. अवशिष्ट BSA और घोड़ा सीरम हटाने के लिए अंत में एक बार पंजाबियों के साथ स्लाइड धो लें ।
  5. स्लाइड माउंट और पारदर्शी नेल पॉलिश का उपयोग कर coverslip के साथ इसे सील करने के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ antifade बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें ।

4. फोकल इमेजिंग

  1. एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ, 590 पर तरंग दैर्ध्य सेट-650 एनएम Alexa ५९४ और 410 के लिए-520 एनएम DAPI के लिए । चुनें छवि प्रारूप पर १०२४ x १०२४ और 8 की पंक्ति औसत उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए ।
  2. फोकल माइक्रोस्कोप के तहत 4-well स्लाइड पर एक अच्छी तरह से विश्लेषण । 100X उद्देश्य के अंतर्गत प्रतिनिधि सेल छवियों को प्राप्त करें, जैसा चित्र 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है ।
  3. बड़ी संख्या में कक्षों की गिनती के लिए, 40X उद्देश्य के अंतर्गत लगातार फ़ील्ड्स की छवियाँ ले जाएँ.
    नोट: यह प्रत्येक संक्रमण के हर समय बिंदु से २०० संक्रमित कोशिकाओं पर जमा करने के लिए 5-10 छवियों की आवश्यकता है.
  4. प्रत्येक प्रयोग में, सभी नमूनों की तुलना करने की आवश्यकता के लिए लगातार फोकल मापदंडों के साथ तस्वीरें ले लो ।

5. परमाणु बनाम Cytoplasmic वितरण का विश्लेषण

  1. फोकल अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर के साथ खुला परियोजना । एक ऐसी छवि का चयन करें जिसमें से ICP0 के परमाणु बनाम cytoplasmic वितरण के लिए सारणीबद्ध की आवश्यकता हो ।
  2. ऊपरी मेनू से टैब "मात्रा" पर क्लिक करें और उपकरण मेनू से "क्रमबद्ध करें ROIs" का चयन.
  3. ऊपर मेनू से "ड्रा लाइन" का चयन करके विश्लेषण किया जा करने के लिए सेल भर में एक अनुदैर्ध्य लाइन ड्रा ।
    नोट: हिस्टोग्राम ICP0 और DAPI दोनों के लिए लाइन के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखा दिखाई देगा । हिस्टोग्राम में, ब्लू लाइन DAPI पिक्सल का प्रतिनिधित्व करता है और लाल रेखा ICP0 पिक्सल का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि नाभिक की सीमा के निशान ।
  4. पृष्ठभूमि धुंधला के आधार पर, प्रत्येक प्रयोग में ICP0 उपसेलुलर वितरण का विश्लेषण करने के लिए ICP0 तीव्रता के लिए एक निरंतर दहलीज की स्थापना की ।
    1. चित्रा 2में उदाहरण के रूप में, यदि औसत पर लाल संकेत परमाणु क्षेत्र में सीमा से नीचे है, लेकिन नीले सीमा से परे सीमा से ऊपर है, कोशिका द्रव्य में मुख्य रूप से स्थित के रूप में लाल संकेत वर्गीकृत ।
    2. लाल संकेत नाभिक भर में दहलीज के ऊपर है और नीले संकेत की सीमा से परे है, तो नाभिक प्लस cytoplasmic स्थानीयकरण के रूप में लाल संकेत समूह ।
    3. लाल संकेत नाभिक में सीमा के ऊपर है, लेकिन औसत पर यह नीले संकेत की सीमा के बाहर नीचे है, तो परमाणु स्थानीयकरण के रूप में लाल संकेत समूह ।
  5. सारणीबद्ध समय ग्राफ में अलग संक्रमण समय और साजिश पर प्रत्येक नमूने से २०० से अधिक संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 3) के अनुसार ICP0 आंदोलन को वर्णन करने के लिए ।

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Representative Results

एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान ICP0 ्े के आणविक आधार और जैविक कार्यों को समझने के लिए, हम विभिन्न संक्रमण चरणों में ICP0 उपसेलुलर वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक immunofluorescent माइक्रोस्कोपिक पद्धति का उपयोग करते हैं । चित्रा 1 विशिष्ट ICP0 स्थानीयकरण के साथ प्रतिनिधि कोशिकाओं को दिखाता है के रूप में संक्रमण की प्रगति । ICP0 के परमाणु-cytoplasmic translocation को यों तो हम तीन समूहों में संक्रमित कोशिकाओं को श्रेणीबद्ध करके नाभिक के सापेक्ष ICP0 वितरण का विश्लेषण करते हैं: नाभिकीय स्थानीयकरण, cytoplasmic स्थानीयकरण, और नाभिकीय प्लस cytoplasmic स्थानीयकरण ( चित्रा 2) । संक्रमण के दौरान ICP0 तस्करी के लिए आवश्यक तत्वों को समझने के लिए, हम विभिन्न संक्रमण चरणों में जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती एचएसवी-1 में ICP0 आंदोलनों ट्रैक । चित्रा 3 संक्रमण के विभिंन समय बिंदु पर ICP0 के सेलुलर वितरण के लिए सारणीकरण परिणामों का एक उदाहरण से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान ICP0 के गतिशील तस्करी । हेल कोशिकाओं पर उगाया 4-well स्लाइड प्रोटोटाइप एचएसवी-1 से संक्रमित थे (तनाव एफ) 10 pfu/ 1, 5, और 9 एच पोस्ट संक्रमण (hpi), कोशिकाओं तय, permeabilized थे, और खरगोश विरोधी ICP0 और माउस विरोधी पीएमएल प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की, और फिर alexa ५९४-संयुग्मित विरोधी खरगोश और alexa ४८८ के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की-cojugated विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 100X उद्देश्यों के अंतर्गत इमेजिंग । Promyelocytic ल्यूकेमिया (पीएमएल) प्रोटीन ND10 परमाणु निकायों के लिए एक मार्कर प्रोटीन के रूप में कार्य करता है, जो संक्रमण में पीएमएल क्षरण के कारण 5 और 9 hpi पर गायब हो जाता है । स्केल बार = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2: ICP0 उपसेलुलर वितरण का विश्लेषण । वाम पैनल: एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ, प्रतिनिधि कोशिकाओं अनुदैर्ध्य लाइन सेल है कि ब्याज के क्षेत्र (रॉय) को परिभाषित करता है भर में तैयार दिखाने के लिए बढ़े थे । दायां फलक: ROI में प्रतिदीप्ति पिक्सेल की तीव्रता, दोनों ICP0 और DAPI के लिए quantified की गई थी और यह फोकल एप्लीकेशन सॉफ्टवेयर द्वारा हिस्टोग्राम के रूप में सचित्र है । एक मनमाना दहलीज (ग्रीन लाइन) पृष्ठभूमि धुंधला को प्रतिबिंबित करने के लिए सेट किया गया था । स्केल बार = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्र 3: वाइल्ड-टाइप और सी-टर्मिनल के लिए उपसेलुलर वितरण का प्रतिशत कटा हुआ ICP0 । हेल कोशिकाएं रिकॉमबिनेंट वायरस से संक्रमित थीं जिनमें वाइल्ड-टाइप ICP0 (ICP0 WT) या सी-टर्मिनल से कटा हुआ ICP0 (ICP0 सी-कटने) पर 4 pfu/ संकेत दिया समय बिंदुओं पर, कोशिकाओं और दाग के रूप में ऊपर वर्णित विश्लेषण किया गया । ICP0 स्थान के लिए २०० से अधिक कक्षों को सारणीबद्ध गया । नाभिकीय, cytoplasmic, या नाभिकीय + cytoplasmic ICP0 वाले कक्षों का प्रतिशत एक स्प्रेडशीट गणना सॉफ़्टवेयर के साथ प्लॉट किए गए थे । यह एक अनुकरणीय प्रयोग है दिखाने के लिए कि इस विधि का उपयोग कर, हम ICP0 सी की पहचान की है एक ICP0 परमाणु-cytoplasmic translocation के लिए आवश्यक डोमेन के रूप में टर्मिनस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एचएसवी-1 ICP0 के न्यूक्लियर-टू-cytoplasmic translocation का अध्ययन करने के लिए किया गया है । एचएसवी-1 संक्रमण (figure 1) के दौरान ICP0 बहोत सेल् फी ्े । संभावना है, ICP0 विभिंन स्थानों पर विभिंन कार्यों को पूरा करने के लिए विभिन्न सेल मार्ग के साथ इंटरैक्ट करता है । यह मानव मेजबान13के साथ रस्साकशी के युद्ध में अपने कई कार्यों को ठीक धुन करने के लिए ICP0 सक्षम बनाता है । हालांकि, कैसे ICP0 एक स्थानिक लौकिक तरीके से कई कार्यों निर्देशांक अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल के साथ ऊपर वर्णित है, हम ICP0 परमाणु-cytoplasmic translocation के आणविक आधार का विश्लेषण शुरू कर दिया । अब के रूप में, हम एक आवश्यक इस translocation के लिए महत्वपूर्ण तत्व के रूप में ICP0 सी टर्मिनल ३५ अमीनो एसिड की पहचान की है । सी के अभाव में, ICP0 संक्रमण भर में नाभिक के भीतर प्रतिबंधित है (चित्रा 3) । हमने यह भी पाया है कि एक ICP0 E3 ligase-निर्भर परमाणु प्रतिधारण बल देरी U2OS कोशिकाओं में परमाणु-cytoplasmic translocation12। इसके अलावा, हमें पता चला है कि ICP0 सी टर्मिनस और देर वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए परमाणु प्रतिधारण को दूर करने में सहयोग और cytoplasmic translocation12की सुविधा । वर्तमान में, हम देर वायरल ICP0 परमाणु-cytoplasmic translocation में शामिल प्रोटीन के लिए स्क्रीन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे हैं ।

प्रोटोकॉल शुरू में एचएसवी-1 संक्रमण में ICP0 के गतिशील तस्करी का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था । के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है, एचएसवी-1 संक्रमण में जल्दी, ICP0 ND10 के साथ colocalized है, जहां सेलुलर प्रतिबंधात्मक कारकों और ND10 घटक जैसे पीएमएल और Sp1008के कई प्रमुख घटक, नीचा दिखा रहे हैं । ND10 प्रमुख घटक अपमानजनक, ICP0 नाभिक भर में फैलाना और संक्रमण में देर के बाद, ICP0 कोशिका द्रव्य के लिए translocated है । क्योंकि ICP0 संक्रमण पर डी नोवो संश्लेषण से गुजरती है, प्रारंभिक प्रोटीन abundancy बहुत कम है और फिर एक मजबूत वायरल संश्लेषण जल्दी से किसी भी व्यक्ति के अणुओं, जो यह मुश्किल का उपयोग कर एक अणु को ट्रैक करने के लिए बनाता है के आंदोलन को अस्पष्ट होगा लाइव इमेजिंग प्रौद्योगिकी । इसलिए, हम जानबूझकर लाइव इमेजिंग का उपयोग नहीं चुना । इसके बजाय, हम इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल अपनाया अलग संक्रमण बिंदुओं पर स्थिर राज्य ICP0 स्थानीयकरण अध्ययन, जो हमें अच्छी तरह से एचएसवी की आबादी में ICP0 लौकिक आंदोलन ट्रैकिंग-1 संक्रमित कोशिकाओं में कार्य किया ।

एक उच्च संकेत के लिए-फोकल विश्लेषण में पृष्ठभूमि अनुपात, दो महत्वपूर्ण कदम गीला-इस प्रोटोकॉल के बेंच भाग में उल्लेखनीय हैं । सबसे पहले, 4-अच्छी तरह से चौंका दिया स्लाइड एकाधिक नमूने एक ही स्लाइड पर संभाला जा करने के लिए अनुमति देते हैं । यह बहुत वायरस और एंटीबॉडी की तरह कीमती रिएजेंट के उपयोग बचाता है । हालांकि, प्रत्येक well में आयोजित मात्रा बहुत छोटा है, क्योंकि बफ़र परिवर्तन के दौरान पूरी तरह से साफ़ नहीं अवशिष्ट बफ़र क्रमिक एजेंट के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । इसलिए, प्रत्येक बफ़र स्विच में, नए बफ़र जोड़ने से पहले एक संपूर्ण आकांक्षा की आवश्यकता होती है । दूसरा, हमारे अनुभवों के आधार पर, कोशिका crosslinking और झिल्ली पारगम्यता की सीमा प्रतिदीप्ति संकेतों की स्पष्टता के लिए महत्वपूर्ण है । हम दोनों paraformaldehyde और ईओण surfactant उपचार के लिए 10 मिनट की एक अनुभवजंय संख्या निर्धारित किया है । हमने पाया है कि समय बहुत लंबा या कम से कम 10 मिनट संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात कम कर सकते हैं । जैसा कि चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है, साथ ही साथ एक पिछले अध्ययन12में, हमारे प्रयोगों में प्राप्त छवियों क्रिस्टल स्पष्ट कर रहे हैं. प्रमुख नीले संकेत है कि स्पष्ट रूप से परमाणु सीमा की रूपरेखा ICP0 के उपसेलुलर वितरण का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल के अभिकलनी भाग में, एक महत्वपूर्ण कदम के लिए पृष्ठभूमि को खत्म करने के लिए एक निरंतर दहलीज सेट है । उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात के साथ एक सफल धुंधला एक कम सीमा रेखा और बेहतर संकेत कंट्रास्ट के लिए महत्वपूर्ण है । एक ही प्रयोग में सभी नमूनों के लिए एक निरंतर दहलीज रखते हुए, तथापि, ICP0 (चित्रा 2 और चित्रा 3) के मात्रात्मक प्रलेखन के लिए नींव है.

प्रोटोकॉल भी एक सामान्य उपकरण के रूप में अन्य वायरल या सेलुलर प्रोटीन के लिए एक उपयुक्त लाइव इमेजिंग विधि कमी है जब सेलुलर तस्करी का अध्ययन करने के लिए सेवा कर सकते हैं. लाइव इमेजिंग तकनीक में, कोशिकाओं इष्टतम शारीरिक वातावरण में रखा जाता है कोशिका चयापचय स्थिति बनाए रखने के लिए14,15. लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक बुनियादी आवश्यकता के लिए फ्लोरोसेंट लक्ष्य प्रोटीन है, जो एक फ्लोरोसेंट टैग के साथ लक्ष्य प्रोटीन से इनकार करते हुए प्राप्त कियाजा सकता लेबल है, या एक fluorophore संयुग्मित अणु लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट उद्धार17 . या तो मामले में, समस्याओं वृद्धि हो सकती है अगर फ्लोरोसेंट टैग के फ्यूजन परिवर्तन लक्ष्य प्रोटीन संपत्ति या fluorophore संयुग्मित अणु कठिनाई को कोशिका झिल्ली पार है । Photobleaching कि प्रक्रिया में कोशिका क्षति का कारण बनता है लाइव इमेजिंग18में एक अतिरिक्त चिंता का विषय है । इसलिए, लाइव इमेजिंग की सीमा को दूर करने के लिए नई रणनीतियों के लिए प्रौद्योगिकी के विकास की सीमा होना जारी है । प्रोटोकॉल हम यहां वर्णित स्थिर राज्य फोकल छवियां, जो एक वैकल्पिक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते है जब एक उचित रहते इमेजिंग विधि अनुपलब्ध है की लौकिक विश्लेषण प्रदान करता है । विधि आसान और विश्वसनीय है । यह न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण का स्पष्ट पता लगाने प्रदान करता है । फोकल सॉफ्टवेयर का प्रयोग, हम मात्रात्मक एक सेल जनसंख्या में लक्ष्य प्रोटीन के विभिंन वितरण के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण और विभिंन सेल चरणों में लक्ष्य प्रोटीन के आंदोलन दस्तावेज़ में सक्षम हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

हम एक NIH अनुदान (RO1AI118992) Haidong गुजरात को संमानित किया से वित्तीय सहायता का शुक्र है । हम तकनीकी सहायता के लिए वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में माइक्रोस्कोपी, इमेजिंग एंड Cytometry रिसोर्स (MICR) कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and viruses
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS
HSV-1 viral Stock (Strain F) Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen  11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-500ml
Medium-199 (10x) Gibco 11825-015
Reagents
4- well 11 mm staggered slide Cel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Fisher reagents BP151-1C0
Bovine Serum Abumin (BSA) Calbiochem CAS 9048-46-8
Horse Serum Sigma H1270
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) Dr. Haidong Gu lab
NaCl       Fisher Bioreagent BP358-212
KH2PO4             Fisher Bioreagent BP362-500
KCl              Fisher Scientific  BP366-500
Na2HPO4              Fisher Bioreagent BP332-500
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 antibody Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG santa Cruz Biotechnology SC-966
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG invitrogen A11012
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG invitrogen A11001
Vectashield Mouting medium with DAPI Vector laboratories H-1200
Pasteur pipette Fisher Brand 13-678-20D
Nail Polish Sally Hansen
Equipment
Confocal Microscope Leica SP8
Confocal Software Leica LAS X Application suite
Excel software Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Scientific Order code 51026282

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
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