Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

Immunology and Infection

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Summary

ICP0 sufre translocación nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. No se conoce el mecanismo molecular de este evento. Aquí describimos el uso de microscopio confocal como una herramienta para cuantificar el movimiento ICP0 infección por HSV-1, que establece las bases para el análisis cuantitativo de desplazamiento ICP0 en futuros estudios mecanicistas.

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Samrat, S. K., Gu, H. Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58504, doi:10.3791/58504 (2018).

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Abstract

Proteína de la célula infectada 0 (ICP0) del virus del herpes simple 1 (HSV-1) es una proteína principios inmediata que contiene una anillo tipo E3 ubiquitina ligasa. Es responsable de la degradación proteasomal de factores restrictivos de host y la activación de genes virales subsecuentes. ICP0 contiene una secuencia canónica de localización nuclear (NLS). Entra en el núcleo inmediatamente después de la síntesis de novo y ejecuta sus funciones de defensa del huésped contra principalmente en el núcleo. Sin embargo, más adelante en la infección, ICP0 se encuentra exclusivamente en el citoplasma, lo que sugiere la ocurrencia de un desplazamiento nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. Probablemente ICP0 desplazamiento permite ICP0 modular sus funciones según sus localizaciones subcelulares en fases diferentes de la infección. Con el fin de delinear la función biológica y mecanismo regulador de translocación nuclear-a-citoplásmico ICP0, modificamos un método de microscopia inmunofluorescente para supervisar tráfico ICP0 durante la infección de HSV-1. Este protocolo trata de coloración inmunofluorescente, microscopio confocal imagen y nuclear vs distribución citoplásmica análisis. El objetivo de este protocolo es adaptar las imágenes confocales estado estacionario en un curso de tiempo en una documentación cuantitativa del movimiento ICP0 durante la infección lítica. Proponemos que este método se puede generalizar para analizar cuantitativamente nuclear vs localización citoplásmica de otras proteínas virales o celulares sin la participación de tecnología de imagen vivo.

Introduction

Virus del herpes simple 1 (HSV-1) causa una amplia gama de leves a graves enfermedades herpéticas incluyendo herpes labial, herpes genital, encefalitis y queratitis stromal. Una vez infectado, el virus establece una infección latente de por vida en las neuronas de los ganglios. Ocasionalmente, el virus puede reactivarse por varios motivos como la fiebre, el estrés y la supresión inmune1, conduce a la infección por herpes recurrente. Proteína de la célula infectada 0 (ICP0) es un regulador viral clave crucial para lítica y latente la infección HSV-1. Transactivates virus aguas abajo genes por medio de contrarrestar el host intrínseca/innata defensas antivirales2,3. ICP0 tiene una actividad de ligasa de ubiquitina E3, que apunta a varios factores celulares de degradación proteasome-dependiente3. También interactúa con diversas vías de células para regular sus actividades y posteriormente compensar host antiviral restricciones3. ICP0 se sabe ubicar en diferentes compartimentos subcelulares como la infección procede de3,4,5. La proteína tiene una señal de arginina/lisina-ricos de localización nuclear (NLS) en residuos 500 a 5066. Sobre la síntesis de novo en la infección temprana por HSV-1, ICP0 se importa inmediatamente en el núcleo. Primero se detecta en una dinámica nuclear estructura denominado dominio nuclear 10 (ND10)7. La actividad de ligasa de ubiquitina E3 de ICP0 provoca la degradación de proteínas de organizador ND10, proteína de promyelocytic leucemia (PML) y proteína moteado 100 kDa (Sp100)8,9,10. Después de la pérdida de proteínas del organizador, ND10 cuerpos nucleares están dispersas y ICP0 se difunde para llenar el núcleo entero4,11.

Curiosamente, después del inicio de la replicación del DNA viral, ICP0 desaparece el núcleo. Únicamente se encuentra en el citoplasma, lo que sugiere la ocurrencia de un desplazamiento nuclear-a-citoplásmico en la infección de HSV-14,12. El requisito de la replicación del DNA implica la posible participación de una proteína viral finales para facilitar la translocación citoplásmica de HSV-1 ICP04,12. Al parecer ICP0 tráfico entre diferentes compartimentos durante la infección permite a ICP0 para modular sus interacciones a diversas vías celulares de una manera espacial y temporal, y por lo tanto coordinar sus múltiples funciones para ajustar el equilibrio entre la lítica y latente HSV-1 infección13. Para entender mejor ICP0 multifuncionalidad y la coordinación de dominios funcionales ICP0 durante la infección lítica, diseccionamos cuidadosamente la base molecular de la dinámica de desplazamiento ICP012. Para llevar a cabo el estudio de mecanismos previamente divulgados12, hemos aplicado un método de tinción inmunofluorescente para visualizar ICP0 localización subcelular en el estado de infección diferentes bajo el microscopio confocal. También hemos desarrollado un protocolo cuantitativo para analizar la nuclear vs citoplásmico distribución de ICP0 utilizando el software confocal. La población de células infectadas por HSV-1 se tabularon en las fases de la infección y se analizaron las tendencias de movimiento ICP0, bajo diferentes tratamientos bioquímicos12. Aquí describimos el protocolo detallado desplazamiento de documentos ICP0 en infección por HSV-1. Proponemos que este método puede ser adoptado como un método general para el estudio de la translocación citoplásmico nuclear vs otras proteínas virales o celulares, que puede servir como alternativa al vivo la proyección de imagen cuando la técnica de imagen vivo es inaplicable debido a problemas tales como etiquetado método, intensidad de la señal o abundancia de la proteína.

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Protocol

1. célula siembra y la infección del Virus

  1. A 20 – 24 h antes de la infección del virus de la semilla 5 x 104 células de fibroblastos de pulmón embrionario humano (HEL) o de otras células para examinar en un portaobjetos escalonadas 11 mm 4 pozos en medio de cultivo (de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% bovino fetal suero (FBS)). Incube las células a 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2).
    Nota: Cada bien debe tener confluencia de células de 70-80% en el momento de la infección.
  2. Al día siguiente, retire el medio de crecimiento e infectar las células con virus en medio 199 en un rango de 4 – 10 UFP/célula. Incube las células infectadas por virus por 1 h a 37 ° C. Seguir agitando la diapositiva durante el período de incubación.
  3. Después de la incubación de 1 h, quite medio 199 y complementar con medio de cultivo.
    Nota: Pueden añadirse fármacos que interfieren con las fases diferentes de la infección en este paso o antes de la absorción viral.
  4. Incube las células infectadas por el virus a 37 ° C con 5% CO2 para varias longitudes de periodo de infección.

2. fijación y permeabilización

  1. Adecuado de la infección, rápidamente lavar las células infectadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces y añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% recién preparado en PBS. Incubar las células con paraformaldehido para 8 – 10 min a temperatura ambiente para fijar las células en cada pozo.
  2. Paraformaldehido de aspirar y lavar los pocillos con 200 μL de PBS por 3 veces. Aspire completamente PBS después del lavado 3rd .
  3. Añada 100 μL de surfactante no iónico 0,2% a cada pocillo para permeabilizar las células durante 5 – 10 minutos.
  4. El tensioactivo no-iónico de aspirar y lavar los pocillos con 200 μL de PBS por 3 veces.

3. coloración inmunofluorescente

  1. Totalmente Aspire PBS y añadir 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 5% de suero equino en PBS) en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 ° C durante la noche.
  2. Añadir determinado experimentalmente concentración de anticuerpo primario (conejo anticuerpos policlonales anti-ICP012) en solución amortiguadora de bloqueo e incubar anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 2 h o a 4 ° C durante la noche.
  3. Lavar con solución amortiguadora de bloqueo 3 veces con 10 minutos de incubación. Añadir anticuerpo secundario de cabra 594 Alexa conjugado anti-conejo (diluida en solución amortiguadora de bloqueo 1: 400) e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 h. Luego lavar los portaobjetos 3 veces con solución amortiguadora de bloqueo en el intervalo de 10 minutos.
  4. Finalmente Lave lo portaobjetos una vez con PBS para eliminar residuos de BSA y suero de caballo.
  5. Añada una gota de medio de montaje antifade con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para montar la corredera y sellar con cubreobjetos usando esmalte de uñas transparente.

4. confocal imagen

  1. Con un microscopio confocal, fijó la longitud de onda 590-650 nm para Alexa 594 y 410-520 nm para DAPI. Seleccionar formato de imagen en 1024 x 1024 y línea media de 8 para adquirir imágenes de alta resolución.
  2. Analizar cada pozo en la diapositiva 4 pozos microscopio confocal. Adquisición de imágenes representativas de la célula bajo el objetivo X 100, como se muestra en la figura 1 y figura 2.
  3. Para contar el gran número de células, tomar imágenes de campos consecutivos bajo el objetivo de X 40.
    Nota: Requieren 5 a 10 imágenes para acumular las células infectadas más de 200 de cada momento de cada infección.
  4. En cada experimento, tomar fotos con parámetros constantes confocales para toda necesidad de las muestras a comparar.

5. Análisis Nuclear vs distribución citoplásmica

  1. Proyecto abierto con el software de aplicación confocal. Seleccione una imagen de que las células necesitan ser tabulados para nuclear vs distribución citoplásmica de ICP0.
  2. Haga clic en la ficha "Cantidad" del menú superior y seleccionar "ordenar ROIs" del menú herramientas.
  3. Trace una línea longitudinal a través de la célula para ser analizadas por seleccionar "Dibujar línea" del menú superior.
    Nota: Histograma aparecerá mostrando la intensidad de fluorescencia a lo largo de la línea para ICP0 y DAPI. En el histograma, línea azul representa los píxeles DAPI y marca el límite del núcleo mientras que la línea roja representa ICP0 píxeles.
  4. Basado en la tinción de fondo, establecer un umbral constante de intensidad ICP0 analizar distribución subcelular ICP0 en cada experimento.
    1. Como se ejemplifica en figura 2, si el rojo señal en promedio está por debajo del umbral de la región nuclear pero es por encima del umbral más allá del límite azul, categorizar la señal rojo como predominante se encuentra en el citoplasma.
    2. Si la señal roja está por encima del umbral a lo largo del núcleo y más allá del límite de la señal azul, grupo la señal roja como núcleo más localización citoplásmica.
    3. Si la señal roja está por encima del umbral en el núcleo pero en promedio está por debajo de ella fuera de los límites de la señal azul, grupo la señal roja como localización nuclear.
  5. Tabular las células infectadas más de 200 de cada muestra en el tiempo de infección diferentes y parcela en gráfico de barras para ilustrar ICP0 movimiento según el tiempo (figura 3).

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Representative Results

Para entender la base molecular y funciones biológicas de la ICP0 se trata durante la infección de HSV-1, utilizamos un método de microscopia inmunofluorescente para analizar distribución subcelular ICP0 en fases diferentes de la infección. La figura 1 muestra las células representativas con distintivo ICP0 localización conforme avanza la infección. Para cuantificar la translocación nuclear-a-citoplásmico de ICP0, analizamos ICP0 distribución en relación con el núcleo de las células infectadas de la categorización en tres grupos: localización nuclear, localización citoplásmica y localización nuclear y citoplásmico ( Figura 2). Para comprender los elementos requeridos para el tráfico de ICP0 durante la infección, rastreamos ICP0 movimientos en el tipo salvaje o mutante de HSV-1 en fases diferentes de la infección. La figura 3 muestra un ejemplo de los resultados de la tabulación de la distribución subcelular de ICP0 en distintos momento de la infección.

Figure 1
Figura 1: dinámica trata de ICP0 durante la infección de HSV-1. Las células HEL cultivadas en las diapositivas 4-bien fueron infectadas con HSV-1 (CEPA F) prototipo en 10 UFP/célula. En 1, 5 y la h 9 post infección (hpi), las células fueron fijo, permeabilized, reaccionó al conejo anti-ICP0 ratón anti-PML primaria los anticuerpos y y entonces reaccionó y Alexa 488 cojugated anti-ratón secundarios anticuerpos anti-conejo conjugado con Alexa 594 proyección de imagen objetivos X menos de 100. Promyelocytic leucemia (PML) proteína sirve como un marcador proteico para ND10 cuerpos nucleares, que desaparece en 5 y 9 hpi debido a la degradación de la PML en la infección. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de la distribución subcelular ICP0. Panel de la izquierda: con un microscopio confocal, células representativas fueron agrandadas para mostrar la línea longitudinal a través de la célula que define la región de interés (ROI). Panel derecho: intensidades de fluorescencia pixel en la ROI se ha cuantificado para ICP0 y DAPI en celdas individuales e ilustrados como histogramas por el software de aplicación confocal. Un umbral arbitrario (línea verde) fue creado para reflejar la tinción de fondo. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: porcentaje de distribución subcelular de tipo salvaje y c-terminal truncarán ICP0. Las células HEL fueron infectadas por el virus recombinantes que contienen ICP0 tipo salvaje (WT ICP0) o c-terminal truncado ICP0 (ICP0 C-truncamiento) en 4 UFP/célula. En momentos indicados, las células fueron manchadas y analizadas como se describió anteriormente. Más de 200 células fueron tabuladas para ICP0 ubicación. Porcentaje de células que contienen nucleares, citoplasmáticos o nucleares + citoplásmico ICP0 se trazaron con un software de cálculo hoja de cálculo. Se trata de una experiencia ejemplar para mostrar que mediante este método, hemos identificado ICP0 c-terminal como un dominio necesario para la translocación nuclear-a-citoplásmico ICP0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo se ha utilizado para el estudio de la translocación nuclear-a-citoplásmico de ICP0 HSV-1. ICP0 sufre tráfico subcelular durante la infección por HSV-1 (figura 1). Probablemente, ICP0 interactúa con diversas vías de la célula para llevar a cabo diferentes funciones en diferentes lugares. Esto permite ICP0 a la consonancia fina sus múltiples funciones en el tira y afloja con el huésped humano13. Sin embargo, cómo ICP0 coordina las múltiples funciones de una manera espacial y temporal no ha sido bien estudiado. Con el protocolo de microscopia fluorescente descrito anteriormente, comenzamos a analizar la base molecular de la translocación nuclear-a-citoplásmico ICP0. A partir de ahora, hemos identificado el terminal C ICP0 35 aminoácidos como un necesario elemento importante para este desplazamiento. En la ausencia de C-terminal, es refrenada ICP0 dentro del núcleo a lo largo de la infección (figura 3). También hemos encontrado un desplazamiento de la nuclear-a-citoplásmico de retrasos ICP0 E3 retención nuclear dependiente de ligasa fuerza U2OS células12. Además, hemos descubierto que ICP0 c-terminal y la expresión de proteínas virales finales cooperan para superar la retención nuclear y facilitar el desplazamiento citoplásmicos12. Actualmente, estamos utilizando este protocolo a la pantalla para las tardias proteínas virales involucradas en la translocación nuclear-a-citoplásmico ICP0.

El protocolo fue inicialmente desarrollado para estudiar la dinámica trata de ICP0 en infección por HSV-1. Como se muestra en la figura 1, temprano en la infección por HSV-1, ICP0 es colocalized con ND10, donde son degradados en varios componentes claves del celulares factores restrictivos y ND10 como PML y Sp1008. Después de degradar componentes clave ND10, ICP0 se difunde a lo largo del núcleo y a finales de la infección, ICP0 se transloca al citoplasma. Porque ICP0 sufre de novo síntesis sobre la infección, la abundancia de proteína inicial es muy baja y luego una sólida síntesis viral oscurecen rápidamente el movimiento de cualquier moléculas individuales, lo que dificulta un seguimiento de una sola molécula utilizando la tecnología de imágenes en vivo. Por lo tanto, elegimos deliberadamente no usar proyección de imagen de vivo. En cambio, aprobó el protocolo anterior para estudiar la localización de estado estacionario ICP0 en puntos diferentes de la infección, que nos sirve bien en el seguimiento de movimiento temporal ICP0 en una población de células infectadas por HSV-1.

Para una alta relación de señal a fondo en análisis confocal, destacan dos pasos críticos en la parte del mojado-banco del presente Protocolo. En primer lugar, las diapositivas de 4 pozos escalonadas permiten múltiples muestras para ser manejados en una sola diapositiva. Ahorra grandemente el uso de reactivos preciosos como virus y anticuerpos. Sin embargo, debido a que el volumen en cada pozo es tan pequeño, buffer residual no totalmente despejado durante los cambios de tampón puede interferir con el reactivo posterior. Por lo tanto, en cada interruptor de buffer, es necesario una aspiración cuidadosa antes de agregar el nuevo búfer. En segundo lugar, basado en nuestras experiencias, el grado de permeabilidad de reticulación y la membrana de la célula es importante para la claridad de las señales de fluorescencia. Hemos puesto un número empírico de 10 min para tratamientos de surfactante no iónico y paraformaldehído. Encontramos ese tiempo mucho más largo o más corto de 10 minutos puede disminuir el cociente señal a fondo. Como se muestra en la figura 1 y figura 2, así como en un estudio anterior de12, imágenes obtenidas en nuestros experimentos son cristalinas. La señal azul prominente que claramente describe la frontera nuclear es clave para determinar la distribución subcelular de ICP0. En la parte computacional del presente Protocolo, un paso crucial es establecer un umbral constante para eliminar el fondo. Un éxito de tinción con alta relación de señal a fondo es la clave para una línea de umbral más bajo y mejor contraste de la señal. Mantener un umbral constante para todas las muestras en el mismo experimento, sin embargo, es la base para la documentación cuantitativa de ICP0 (figura 2 y figura 3).

El protocolo también puede servir como una herramienta general para el estudio de tráfico subcelular para otras proteínas virales o celulares cuando se carece de un adecuado método de imagen vivo. En técnica de imagen vivo, las células se mantienen en el ambiente fisiológico óptimo para mantener el estado metabólico de la célula14,15. Un requisito básico para la proyección de imagen de células vivas es la etiqueta fluorescente de la proteína diana, lo que puede lograrse mediante la fusión de la proteína diana con una etiqueta fluorescente16, u ofrecer un fluoróforo conjugada específica de la molécula de la proteína diana17 . En cualquier caso, problemas pueden subir si la fusión de la etiqueta fluorescente cambia destino proteína propiedad o fluoróforo conjugada molécula tiene dificultad para atravesar la membrana de la célula. Fotoblanqueo que provoca daño celular en el proceso es una preocupación adicional en vivo imagen18. Por lo tanto, nuevas estrategias para superar la limitación de la proyección de imagen vivo siguen siendo la frontera del desarrollo tecnológico. El protocolo que se describe aquí proporciona análisis temporal de las imágenes confocales de estado estacionario, que puede servir como una herramienta alternativa cuando un método de proyección de imagen vivo apropiado no está disponible. El método es fácil y confiable. Proporciona detección clara de la localización subcelular de la proteína con el Fondo mínimo. Usando el software confocal, somos capaces de analizar el porcentaje de células con diferentes distribuciones de la proteína de la blanco en una población celular cuantitativa y documentar el movimiento de la proteína diana en fases diferentes de la célula.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Agradecemos el apoyo financiero de una subvención del NIH (RO1AI118992) concedida a Haidong Gu. Agradecemos a la instalación de microscopía, la proyección de imagen y base de recursos de citometría (MICR) en Wayne State University para soporte técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and viruses
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS
HSV-1 viral Stock (Strain F) Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen  11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-500ml
Medium-199 (10x) Gibco 11825-015
Reagents
4- well 11 mm staggered slide Cel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Fisher reagents BP151-1C0
Bovine Serum Abumin (BSA) Calbiochem CAS 9048-46-8
Horse Serum Sigma H1270
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) Dr. Haidong Gu lab
NaCl       Fisher Bioreagent BP358-212
KH2PO4             Fisher Bioreagent BP362-500
KCl              Fisher Scientific  BP366-500
Na2HPO4              Fisher Bioreagent BP332-500
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 antibody Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG santa Cruz Biotechnology SC-966
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG invitrogen A11012
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG invitrogen A11001
Vectashield Mouting medium with DAPI Vector laboratories H-1200
Pasteur pipette Fisher Brand 13-678-20D
Nail Polish Sally Hansen
Equipment
Confocal Microscope Leica SP8
Confocal Software Leica LAS X Application suite
Excel software Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Scientific Order code 51026282

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References

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