Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Samrat, S. K., Gu, H. Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58504, doi:10.3791/58504 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Enfekte hücre protein herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) 0 (ICP0), bir halka tipi E3 Ubikuitin ligaz içeren acil bir erken proteindir. Ana bilgisayar kısıtlayıcı faktörler ve sonraki viral gen harekete geçirmek proteasomal bozulması için sorumludur. ICP0 bir kanonik nükleer yerelleştirme sıra (NLS) içerir. Hemen de novo sentezi sonra çekirdek girer ve anti-konak savunma fonksiyonları çekirdeğinde esas olarak yürütür. Ancak, daha sonra enfeksiyon, sitoplazma içinde yalnızca, HSV-1 enfeksiyonu sırasında bir nükleer-için-sitoplazmik translocation geçtiği öne ICP0 bulunur. Muhtemelen ICP0 translocation fonksiyonları hücre altı onun konumları göre farklı enfeksiyon aşamaları modüle ICP0 sağlar. Biyolojik işlev ve ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation düzenleyici mekanizma betimlemek için ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında kaçakçılığı izlemek için bir immünfloresan mikroskopi yöntemi değiştirildi. Bu iletişim kuralı immünfloresan boyama, confocal mikroskop düşsel ve nükleer vs. sitoplazmik dağıtım analiz içerir. Bu iletişim kuralı bir saat ders boyunca litik enfeksiyon ICP0 hareketinin niceliksel bir dokümantasyon içine çekilen kararlı duruma confocal görüntüler adapte hedeftir. Önerdiğimiz bu yöntem canlı görüntüleme teknolojisi içeren olmadan nükleer vs diğer viral veya hücresel proteinler sitoplazmik yerelleştirilmesini kantitatif analiz etmek için genelleştirilmiş.

Introduction

Herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) hafif ağır herpetik hastalığa herpes labialis, genital herpes, stromal keratit ve ensefalit gibi geniş bir dizi neden olur. Enfekte sonra Virüs sinir gangliyon hücreleri bir ömür boyu latent enfeksiyon oluşturur. Zaman zaman, virüs gibi ateş, stres ve bağışıklık suppression1tekrarlayan herpes enfeksiyonu için önde gelen, çeşitli nedenlerle tarafından etkinleştirilebilir. Enfekte hücre proteindir 0 (ICP0) bir anahtar viral regülatörü litik ve gizli HSV-1 enfeksiyonu için çok önemli. Ana bilgisayar içsel/doğuştan gelen antiviral savunma2,3mücadele aşağı akım virüs genleri ile transactivates. ICP0 proteasome bağlı bozulma3için çeşitli hücre faktörler hedefleyen bir E3 Ubikuitin ligaz etkinlik vardır. Ayrıca çeşitli hücre yolları faaliyetlerini düzenleyen ve daha sonra ana bilgisayar antiviral kısıtlamaları3dengelemek için etkileşim kurar. ICP03,4,5enfeksiyon devam ederken farklı hücre altı bölmeleri bulmak için bilinir. Protein artıkları 500-5066' bulunan bir lisin/arginin-zengin nükleer yerelleştirme Uyarısı (NLS) vardır. Erken HSV-1 enfeksiyonu, de novo sentezi ICP0 hemen çekirdek alınır. Bu ilk yapısı olarak adlandırılan nükleer etki alanı 10 (ND10) bir dinamik nükleer tespit7. ICP0 E3 Ubikuitin ligaz etkinliği ND10 düzenleyici proteinler, promyelötik lösemi (PML) protein ve benekli protein 100 kDa (Sp100)8,9,10bozulması tetikler. Organizatör protein kaybı sonra ND10 nükleer ceset dağınık ve ICP0 tüm çekirdek4,11doldurmak için yayılmış.

İlginçtir, viral DNA ikileşmesi başlangıcı sonra ICP0 çekirdek kaybolur. Bu sadece bir nükleer-için-sitoplazmik translocation HSV-1 enfeksiyonu4,12içinde geçtiği öne sitoplazmada bulunur. DNA ikileşmesi şartı HSV-1 ICP04,12sitoplazmik translocation kolaylaştıran bir geç viral protein(s) potansiyel katılımı anlamına gelir. Görünüşe göre ICP0 farklı bölmeler arasında enfeksiyon sırasında kaçakçılığı ICP0 onun etkileşimlerine uzamsal-zamansal bir biçimde çeşitli hücresel yolları modüle güçlendirir ve bu nedenle koordinat ince ayar yapmak için birden fazla işlevleri arasındaki dengeyi ayarlama litik gizli HSV-1 enfeksiyonu ve13. ICP0 Çokişlevlilik ve ICP0 işlevsel etki alanları boyunca litik enfeksiyon koordinasyonu daha iyi anlamak için dikkatli bir şekilde dinamik ICP0 translocation12moleküler temeli kesmiştim. Mekanik çalışmaları daha önce bildirilen12yapmak için farklı enfeksiyon durumu confocal mikroskop altında ICP0 hücre altı yerelleştirme görselleştirmek için immünfloresan boyama yöntemi uyguladım. Ayrıca confocal yazılımını kullanarak nükleer vs. sitoplazmik dağıtımını ICP0 analiz için nicel bir protokol geliştirdik. HSV-1 enfekte hücreleri nüfusu enfeksiyon aşamaları sekmeli ve farklı biyokimyasal tedavilerin12altında ICP0 hareketinin eğilimleri analiz edildi. Burada detaylı iletişim kuralı bu belgeleri ICP0 translocation HSV-1 enfeksiyonu içinde açıklayın. Önerdiğimiz bu yöntem nükleer vs. sitoplazmik translocation canlı görüntüleme tekniği nedeniyle uygulanamaz olduğunu ne zaman canlı görüntüleme alternatif olarak hizmet verebilir diğer viral veya hücresel proteinler için eğitim için genel bir yöntem olarak kabul edilmesi yöntemi, sinyal şiddeti veya protein bereket etiketleme gibi sorunları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre tohum ve virüs enfeksiyonu

  1. Virüs enfeksiyonu önce 20-24 h 5 x 104 insan embriyonik akciğer (HEL) fibroblast hücreleri veya diğer hücreler büyüme orta (Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 ile fetal sığır takıma DMEM) 4-şey 11 mm sendeleyerek slayttaki incelenmesine tohum Serum (FBS)). %5 karbondioksit (CO2) ile 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    Not: Her şey enfeksiyon anda % 70-80 cep confluency olmalıdır.
  2. Ertesi gün, büyüme orta kaldırmak ve orta-199 virüsleri 4 – 10 pfu/hücre bir mesafeden hücrelerle bulaştırmak. Virüs bulaşan hücreleri 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Slayt kuluçka döneminde sallayarak tutun.
  3. 1 h kuluçka sonra orta-199 kaldırmak ve büyüme orta ile ek.
    Not: Bu adımda veya viral emme öncesinde farklı enfeksiyon aşamaları ile müdahale ilaç eklenebilir.
  4. Virüs bulaşan hücreleri ile çeşitli uzunluklarda enfeksiyon dönemi için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.

2. fiksasyon ve Permeabilization

  1. Uygun enfeksiyon zaman, hızlı bir şekilde enfekte hücreleri fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile 3 kez yıkayın ve taze PBS içinde hazırlanan %4 paraformaldehyde 200 μL ekleyin. Paraformaldehyde 8-10 dakika oda sıcaklığında hücreleri her kuyuya düzeltmek için hücrelerle kuluçkaya.
  2. Paraformaldehyde Aspire edin ve PBS 200 μL Wells'le için 3 kere yıkayın. Tamamen PBS 3rd yıkama sonra Aspire edin.
  3. Hücreler için 5-10 dk permeabilize için her şey için % 0,2 iyonik olmayan yüzey aktif 100 μL ekleyin.
  4. İyonik olmayan yüzey aktif Aspire edin ve PBS 200 μL Wells'le için 3 kere yıkayın.

3. immünfloresan boyama

  1. Tamamen PBS Aspire edin ve engelleme arabelleği (%1 sığır serum albumin (BSA) ve % 5 at serum PBS) 200 μL her kuyuya ekleyin ve 1 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
  2. Deneysel olarak belirlenen birincil antikor (tavşan anti-ICP0 poliklonal antikor12) konsantrasyon engelleme arabellekte ekleyin ve birincil antikor 2s için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
  3. 3 kez ile 10 dk kuluçka engelleme tampon ile yıkayın. Alexa 594 Birleşik keçi Anti-tavşan ikincil antikor (engelleme arabellekte seyreltilmiş 1: 400) ekleyin ve 1 h için oda sıcaklığında slaytlar kuluçkaya. Sonra 10 dk aralıklarla 3 kez ile engelleme arabellek slaytlar yıkayın.
  4. Son olarak bir kez PBS kalan BSA ve at serum kaldırmak için slaytla yıkayın.
  5. Antifade montaj orta ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI slayt monte ve şeffaf oje kullanarak coverslip ile mühür için) bir damla ekleyin.

4. confocal görüntüleme

  1. Confocal mikroskopla, dalga boyu 590-650 nm Alexa 594 ve 410-520 nm DAPI için ayarlayın. Resim biçimi 1024 x 1024 ve satır ortalama 8 yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için seçin.
  2. Her şey confocal mikroskop altında 4-şey slaytta analiz. 100 X amaç altında temsilcisi hücre görüntü resim 1 ve Şekil 2gösterildiği gibi kazanmak.
  3. Çok sayıda hücre sayım için ardışık alanlar'ın altında 40 X amaç görüntülerini alın.
    Not: Her enfeksiyon her zaman noktasından 200'den fazla enfekte hücreleri birikir için 5-10 görüntüleri gerekir.
  4. Her denemede karşılaştırılmak üzere tüm örnekleri ihtiyacı için sürekli confocal parametreleri ile fotoğraf çekmek.

5. analiz nükleer vs. sitoplazmik dağıtım

  1. Açık proje confocal uygulama yazılımı ile. Hücreleri nükleer vs. sitoplazmik dağıtımı ICP0 için sekmeli gereken bir görüntü seçin.
  2. Üst menüden "Miktar" sekmesini tıklatın ve "ROIs sıralamak" Araçlar menüsünden seçin.
  3. Üst menüden "çizgi çizmek" seçerek analiz edilecek hücre arasında boyuna bir çizgi çizin.
    Not: Hem ICP0 hem de DAPI için hattı boyunca floresan yoğunluğu gösteren çubuk grafik görüntülenir. Histogram, mavi çizgili DAPI pikselleri temsil eder ve kırmızı çizgi ICP0 piksel ise çekirdek sınırı işaretler.
  4. Arka plan boyama dayanarak, ICP0 yoğunluğu her denemede ICP0 hücre altı dağıtım analiz etmek için sürekli bir eşik ayarlayın.
    1. İçinde olarak ortalama kırmızı işaret edersem Şekil 2, nükleer bölgedeki eşiğin ama mavi sınır ötesinde eşiğin, kırmızı bir işaret olarak ağırlıklı olarak sitoplazmada bulunan kategorize.
    2. Kırmızı sinyal eşiğin çekirdeği ve mavi sinyal sınır ötesinde ise, kırmızı bir işaret olarak çekirdek artı sitoplazmik yerelleştirme grubu.
    3. Kırmızı sinyal çekirdeği eşiğin ama ortalama olarak mavi sinyal sınır dışında kırmızı sinyal nükleer yerelleştirme grubu.
  5. 200'den fazla enfekte hücreleri her örnekten farklı enfeksiyon zaman ve zaman (Şekil 3) göre ICP0 hareket göstermek için çubuk grafik mezarlığına çizelgeye geçirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Moleküler temeli ve ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında ticareti Biyolojik işlevleri anlamak için biz bir immünfloresan mikroskopi yöntemi farklı enfeksiyon aşamaları, ICP0 hücre altı dağılım çözümlemek için kullanın. Şekil 1 enfeksiyon ilerledikçe farklı ICP0 yerelleştirme temsilcisi bulunduğu hücreleri gösterir. ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation ölçmek, ICP0 dağıtım çekirdeği göre üç gruba enfekte hücreleri kategorize tarafından analiz için: nükleer yerelleştirme, sitoplazmik yerelleştirme ve nükleer artı sitoplazmik yerelleştirme () Şekil 2). ICP0 enfeksiyon sırasında kaçakçılığı için gerekli unsurları anlamak için biz farklı enfeksiyon aşamaları vahşi yazın veya mutant HSV-1 ICP0 hareketlerini takip. Şekil 3 ICP0 hücre altı dağıtım enfeksiyon farklı zamanda noktada çizelgeleme sonuçlarını bir örneği gösterilir.

Figure 1
Şekil 1: dinamik ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında kaçakçılığı. 4-iyi slaytlar üzerinde yetiştirilen HEL hücreleri prototip 10 pfu/hücre HSV-1 (zorlanma F) ile bulaşmış. 1, 5 ve 9 h sonrası enfeksiyon (HPI) hücreleri sabit, permeabilized, tavşan anti-ICP0 ve fare anti-PML birincil karşı antikorlar için tepki gösterdi ve anti-tavşan Alexa 594 Birleşik ve Alexa 488-cojugated Anti-fare ikincil antikorlar için tepki gösterdi Küçük 100 X hedefleri görüntüleme. Promyelötik lösemi (PML) protein ND10 nükleer organları için bir işaretleyici protein, 5 ve 9 HPI enfeksiyon PML bozulması nedeniyle kaybolur olarak hizmet vermektedir. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: ICP0 hücre altı dağıtım analizi. Sol kapı aynası: confocal bir mikroskopla temsilcisi hücreleri faiz (ROI) bölge tanımlar hücre boyunca çizilmiş boyuna çizgisini göstermek için büyütülmüş. Doğru kapı aynası: floresan piksel yoğunluklarda ROI içinde hem ICP0 hem de tek tek hücreleri içinde DAPI için sayısal ve çubuk grafikler gibi confocal uygulama yazılımı tarafından resimli. Rasgele bir eşik değeri (yeşil hat) arka plan boyama yansıtacak şekilde ayarlandı. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: vahşi-türü için hücre altı dağıtım yüzdesi ve C-terminal tamsayıya ICP0. HEL hücreleri vahşi tipli ICP0 içeren rekombinant virüsler tarafından enfekte (ICP0 WT) veya C-terminal kesildi ICP0 (ICP0 C-kesme) 4 pfu/hücre. Belirtilen süre noktalarda, hücreleri lekeli ve yukarıda açıklandığı gibi analiz. 200'den fazla hücreleri için ICP0 konum tablo. Nükleer, sitoplazmik içeren hücreleri veya nükleer + sitoplazmik ICP0 bir elektronik tablo hesaplama yazılımı ile çizilen. Bu yöntemi kullanarak, biz ICP0 C-terminus ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation için gereken etki alanı olarak belirledik olduğunu göstermek için örnek teşkil eden bir deneydir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı HSV-1 ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation çalışma kullanılmaya başlanmıştır. ICP0 hücre altı HSV-1 enfeksiyonu (Şekil 1) sırasında kaçakçılığı uğrar. Büyük olasılıkla, ICP0 farklı yerlerde farklı işlevleri gerçekleştirmek için çeşitli hücre yolları ile etkileşim kurar. Bu ICP0 birden çok fonksiyonları halat çekme insan konak13ile ince ayar sağlar. Ancak, ne kadar ICP0 birden fazla işlevi uzamsal-zamansal bir şekilde koordine eder iyi araştırılmamıştır. Yukarıda açıklanan floresan mikroskopi protokolüyle ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation moleküler temeli incelemeye başladık. Şu andan itibaren biz ICP0 C-terminal belirledik 35 amino asitler olarak gerekli bir öğe bu translocation için önemli. C-terminus yokluğunda, ICP0 enfeksiyon (Şekil 3) boyunca çekirdeği içinde hakim. Biz de U2OS hücreler12' Bu bir ICP0 E3 ligaz bağımlı nükleer saklama gücü gecikmeler nükleer-için-sitoplazmik translocation bulduk. Ayrıca, biz ICP0 C-terminus ve geç viral proteinlerin ifade nükleer saklama üstesinden gelmek ve sitoplazmik translocation12kolaylaştırmak için işbirliği keşfettim. Şu anda, geç viral proteinler ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation yer için ekran için bu iletişim kuralını kullanan.

Protokol başlangıçta dinamik ICP0 HSV-1 enfeksiyonu içinde kaçakçılık incelemek için geliştirilmiştir. HSV-1 enfeksiyonu erken, Şekil 1' de gösterildiği gibi ICP0 nerede birkaç anahtar bileşenleri hücresel kısıtlayıcı faktörler ve PML ve Sp1008gibi ND10 bileşenleri bozulmuş ND10 ile colocalized. ND10 anahtar bileşenlerinin aşağılayıcı sonra ICP0 çekirdeği boyunca ve geç enfeksiyon yayılır, ICP0 sonra sitoplazmaya translocated. ICP0 de novo sentezi üzerine enfeksiyon geçer çünkü ilk protein bolluğu çok düşüktür ve sonra sağlam bir viral sentez hızlı bir şekilde bir tek molekül aracılığıyla onların izini zorlaştırır herhangi bir bireysel moleküllerin hareketi karanlık olacak canlı görüntüleme teknolojisi. Bu nedenle, kasten canlı görüntüleme kullanmamayı seçti. Bunun yerine, bize de bir nüfus HSV-1 enfekte hücre ICP0 geçici hareketleri izleme içinde hizmet farklı enfeksiyon noktalarda kararlı duruma ICP0 yerelleştirme çalışmaya yukarıdaki Protokolü edindik.

Confocal analizde yüksek bir sinyal arka plan oranı için iki önemli adımlar bu protokolü ıslak-tezgah kısmında dikkati çeker. İlk olarak, 4-şey sendeleyerek slaytlar bir tek slaytta ele alınması gereken birden fazla örnekleri sağlar. Büyük ölçüde virüs ve antikorlar gibi değerli reaktifler kullanımını kaydeder. Ancak, her kuyuya tutulan birim çok küçük olduğundan, kalan arabellek arabellek değişiklikleri sırasında tamamen temizlenmiş ile sonraki reaktif engelleyebilir. Bu nedenle, her arabellek anahtarda yeni arabellek eklemeden önce kapsamlı bir aspirasyon gereklidir. İkinci olarak, bizim deneyimlerine dayanarak, hücre crosslinking ve membran geçirgenliği ölçüde floresan sinyallerini netlik için önemlidir. Biz 10 min paraformaldehyde ve noniyonik yüzey aktif tedavi ampirik bir dizi belirledik. O zaman çok uzun ya da kısa 10 dk sinyal arka plan oranını düşürebilir daha bulduk. Şekil 1 ve Şekil 2, hem de bir önceki çalışmada12gösterildiği gibi bizim deneylerde elde edilen kristal berraklığında görüntülerdir. Açıkça nükleer sınır özetliyor belirgin mavi sinyal ICP0 hücre altı dağılımını belirleyen anahtar buydu. Bu iletişim kuralı hesaplama bölümünde, arka plan ortadan kaldırmak için sabit bir eşik ayarlamak için önemli bir adım var. Yüksek sinyal arka plan oranı ile başarılı bir boyama bir daha düşük eşik satırı ve daha iyi sinyal kontrast anahtarıdır. Aynı deneyde, ancak, tüm örnekleri için sabit bir eşik tutmak olduğunu ICP0 nicel belgelenmesi için temel (Şekil 2 ve Şekil 3).

Protokolü de diğer viral veya hücresel proteinler için ne zaman uygun canlı görüntüleme yöntemi bulunmamaktadır hücre altı kaçakçılığı çalışma için genel bir araç olarak hizmet verebilir. Canlı görüntüleme tekniği, hücreleri hücre metabolik durum14,15korumak için en uygun fizyolojik ortamda tutulur. Canlı hücre görüntüleme için temel bir gereklilik fluorescently hedef protein flüoresan etiket16ile eritme tarafından elde edilebilir, hedef protein etiketlemek için ya da bir fluorophore teslim etmek için molekül özel hedef protein17 için Birleşik . Her iki durumda da, sorunlar floresan etiketi füzyonu hedef protein özelliği değiştirir veya fluorophore konjuge molekül hücre zarı geçmeye zorluk varsa artabilir. Bu süreç içinde hücre hasarı neden olur Photobleaching canlı görüntüleme18' ek bir konusudur. Bu nedenle, canlı görüntüleme sınırlamayı aşmak için yeni stratejiler teknoloji geliştirme sınır olmaya devam etmektedir. Biz burada açıklanan iletişim kuralı uygun canlı görüntüleme yöntemi kullanılamaz duruma geldiğinde hangi alternatif bir aracı olarak hizmet verebilir kararlı duruma confocal görüntüleri zamansal analizi sağlar. Kolay ve güvenilir yöntemdir. Protein hücre altı yerelleştirme en az arka plan ile net algılanmasını sağlar. Confocal yazılımını kullanarak, biz kantitatif hücre yüzdesi hedef proteinin hücre nüfus farklı dağıtımları ile analiz ve hedef protein hareketi farklı hücre aşamaları belge edebiliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

Biz mali desteği Haidong Gu için layık bir NIH hibe (RO1AI118992) teşekkür ederim. Wayne State Üniversitesi'nde mikroskobu, görüntüleme ve sitometresi kaynakları (MICR) çekirdek tesis teknik destek için teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and viruses
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS
HSV-1 viral Stock (Strain F) Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen  11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-500ml
Medium-199 (10x) Gibco 11825-015
Reagents
4- well 11 mm staggered slide Cel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Fisher reagents BP151-1C0
Bovine Serum Abumin (BSA) Calbiochem CAS 9048-46-8
Horse Serum Sigma H1270
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) Dr. Haidong Gu lab
NaCl       Fisher Bioreagent BP358-212
KH2PO4             Fisher Bioreagent BP362-500
KCl              Fisher Scientific  BP366-500
Na2HPO4              Fisher Bioreagent BP332-500
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 antibody Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG santa Cruz Biotechnology SC-966
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG invitrogen A11012
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG invitrogen A11001
Vectashield Mouting medium with DAPI Vector laboratories H-1200
Pasteur pipette Fisher Brand 13-678-20D
Nail Polish Sally Hansen
Equipment
Confocal Microscope Leica SP8
Confocal Software Leica LAS X Application suite
Excel software Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Scientific Order code 51026282

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5, (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75, (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71, (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68, (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75, (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18, (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90, (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3, (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89, (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92, (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13, (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122, (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23, (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300, (5616), 82-86 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics