تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويصف هذا البروتوكول اتباع نهج قائم على التحليل الطيفي تقلب الأسفار للتحقيق في التفاعلات بين البروتينات بوساطة التفاعلات خلية خلية، أي البروتينات المترجمة في تقاطعات الخلية، مباشرة في الخلايا الحية. نحن توفير مبادئ توجيهية مفصلة على صك المعايرة والحصول على البيانات وتحليلها، بما في ذلك تصحيحات لمصادر الحرفية الممكنة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ينطوي على التفاعل خلية خلية، عادة بوساطة من البروتينات التي تتفاعل في التفاعل بين الخلايا المجاورة. للفائدة، قادرون فقط بضعة فحوصات على وجه التحديد سبر هذه التفاعلات مباشرة في الخلايا الحية. نقدم هنا، فحص لقياس ربط البروتينات التي أعربت في سطوح الخلايا المجاورة، وفي الاتصالات خلية خلية. هذا الإنزيم يتكون من خطوتين: خلط الخلايا معربا عن البروتينات التي تهم تنصهر فيها مختلف البروتينات الفلورية، تليها fluorescence تقلب التحليل الطيفي القياسات في خلية خلية جهات الاتصال باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر. نحن إثبات جدوى هذا التحليل في سياق بيولوجيا ذات صلة بقياس تفاعلات البروتين اميلويد السلائف مثل 1 (APLP1) عبر تقاطعات خلية خلية. نحن توفير بروتوكولات مفصلة في الحصول على البيانات باستخدام التقنيات المستندة إلى الأسفار (المسح الأسفار عبر ارتباط التحليل الطيفي، وعدد عبر الارتباط وتحليل السطوع) ومعايرات الصك المطلوب. علاوة على ذلك، فإننا نناقش الخطوات الحاسمة في تحليل البيانات، وكيفية تحديد وتصحيح التباينات الإشارات الخارجية، زائفة، مثل تلك التي تعزى إلى حركة فوتوبليتشينج أو الخلية.

وبصفة عامة، المقايسة المقدمة تنطبق على أي إنسان-أو التفاعل الغيروية البروتين-بروتين في خلية خلية الاتصالات، بين الخلايا بأنواع مختلفة أو نفسها ويمكن تنفيذها على ليزر [كنفوكل] تجارية المسح مجهر. هو شرط هام استقرار النظام، الذي ينبغي أن يكون كافياً للتحقيق ديناميات انتشارية البروتينات ذات الاهتمام خلال عدة دقائق.

Introduction

العديد من العمليات البيولوجية التي تحدث في مواقع التفاعلات خلية خلية، مثل خلية خلية التصاق1،2،3، خلية خلية الانصهار4 والاعتراف الخلوية5. هذه الأحداث تمثل أهمية خاصة أثناء تطوير الكائنات الحية متعددة الخلايا، وخلية خلية الاتصالات، مثلاً، أثناء الاستجابات المناعية. وساطة هذه العمليات عادة من البروتينات التي تكون مترجمة على السطح، أي في غشاء البلازما (م) من الخلايا المجاورة وتخضع لتفاعلات معينة في خلية خلية الاتصال التي هي على وجه التحديد الخاضعة للتنظيم في المكان والزمان. في كثير من الحالات، هذه التفاعلات المباشرة هومو-أو التفاعلات عبر الغيروية البروتين-بروتين، ولكن قد ينطوي أيضا على أيونات أو يغاندس بوصفها linkers خارج الخلية1. على الرغم من أهمية أساسية، وهناك نقص في فحوصات سبر هذه تفاعلات البروتين البروتين محددة مباشرة في البيئة الأصلية للخلايا الحية. تتطلب العديد من الأساليب أما تعطيل الخلية (مثل فحوصات الكيمياء الحيوية مثل شركة إيمونوبريسيبيتيشن6)، التثبيت (مثلاً، بعض تقنيات بصرية مجهرية فائقة القرار والمجهر الإلكتروني لخلية خلية اتصالات7)، أو هي غير محددة، مثل التجميع/التصاق فحوصات8،9. للتغلب على هذه المشكلة، تم تنفيذ fluorescence تقنيات استناداً إلى الأسفار الرنين الطاقة نقل (الحنق)10 أو الأسفار التكامل11. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق تحقيقا لمسافات صغيرة بما فيه الكفاية بين فلوروفوريس، تسميات الفلورسنت على الجانب خارج الخلية البروتينات10، يحتمل أن تتداخل مع التفاعلات عبر .

نقدم هنا، تحليل القائم على الأسفار بديلة لتفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال. هذا النهج يجمع بين النهج عبر الارتباط الأسفار (الأسفار المسح الضوئي عبر ارتباط مطيافية (سفككس)، وعدد عبر الارتباط والسطوع (ccN & ب)) وخلط الخلايا معربا عن بناء انصهار من البروتين من الفائدة، مثلاً، مستقبلات التصاق. تتم تسمية مستقبلات التحقيق في الخليتين التفاعل مع البروتينات الفلورية طيفيا فصل اثنين (FPs)، من داخل الخلايا الجانب (انظر الشكل 1A).

أساليب العاملين تقوم على التحليل الإحصائي للأسفار التقلبات الناجمة عن الحركة انتشارية البروتينات الفلورية الانصهار من خلال حجم ليزر [كنفوكل] مجهر مسح التنسيق. أكثر في التفاصيل، ويَسْبِر المقايسة نشر المشارك من البروتينات ذات الاهتمام في كلا PMs المجاورة في خلية خلية الاتصالات. إذا البروتينات الخضوع عبر التفاعلات، سيحمل هذه المجمعات عبر البروتينات الفلورية التي تنبعث منها في كل القنوات الطيفية، تسبب تقلبات fluorescence مرتبطة من بواعث كلا. من ناحية أخرى، في حالة حدوث لا ملزمة، تقلبات عدد من البروتينات التي تواجه الدورة الشهرية ستكون مستقلة، مما تسبب في لا تقلبات مرتبطة. اكتساب يمكن أن يؤديها بطريقتين: 1) سفككس يستند على شكل خط المسح الضوئي عبر الاتصال خلية خلية ويَسْبِر فعالية التفاعلات في بقعة تقع في منطقة الاتصال. من خلال تحليل الزمانية لتقلبات الأسفار، سفككس يوفر أيضا معلومات حيوية، أي معاملات نشر مجمعات البروتين؛ 2) ccN & ب يستند إلى إجراء تحليل بيكسيلويسي لسلسلة من الصور التي حصلت في مناطق الاتصال خلية خلية. قد القدرة على التحقيق وخريطة التفاعلات على طول كامل الاتصال بالمنطقة (في المستوى البؤري واحد)، ولكن لا يقدم معلومات عن ديناميات. يمكن الجمع بين كلا الأسلوبين مع تحليل للسطوع الجزيئية، أي إشارة fluorescence متوسط المنبعثة في الوحدة الزمنية من مجمعات البروتين نشرها مفردة، وهكذا، تقديم تقديرات ل stoichiometry مجمعات البروتين في خلية الاتصالات.

في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لإعداد عينة وأداة المعايرة، الحصول على البيانات وتحليلها لإجراء التحليل المقدم على ليزر [كنفوكل] تجارية المسح مجهر. يمكن إجراء هذه التجارب على أي صك مجهزة بالعد فوتون أو كاشفات التناظرية وموضوعي مع ارتفاع الفتحة العددية. علينا مواصلة مناقشة الخطوات الحاسمة للبروتوكول وتقديم مخططات تصحيح للعديد من العمليات التي تسبب تقلبات إشارة أرتيفاكتوال، مثلاً، للكشف عن الضوضاء، وحركة فوتوبليتشينج أو الخلية. وضعت أصلاً للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا ملتصقة، التحليل يمكن تعديلها لتعليق الخلايا، أو تكييفها لنظم الغشاء النموذجي، مثلاً، أونيلاميلار العملاقة حويصلات (جوفس) أو البلازما العملاقة غشاء الحويصلات (جبمفس)، مما يسمح التحديد الكمي للتفاعل في البيئات المختلفة الدهن، أو في حالة عدم12،سيتوسكيليتون المنظمة13.

المسح الضوئي الطيفي الارتباط عبر الأسفار هو نسخة معدلة من الأسفار عبر ارتباط مطيافية14 وتم تصميمه خصيصا للتحقيق في ديناميات انتشارية بطيئة في الأغشية الدهنية15. أنه يستند إلى عملية شراء مسح خط عمودي إلى الساعة التي تحتوي على بروتينات الفلورسنت للفائدة. للتحقيق في التفاعلات بين نوعين من أنواع البروتين المسمى بشكل مختلف، يتم اكتساب في قناتين طيفية استخدام اثنين من خطوط الليزر وهما كشف windows ل fluorophores طيفيا المنفصلين عن ذويهم. سبب ديناميات نشر بطيئة من البروتينات في الساعة (D≤ ~ 1/ق2ميكرومتر)، يمكن أن يؤديها قياس خالية من الحديث عبر مخطط الإثارة من سطر إلى سطر15بالتناوب. يبدأ التحليل: 1) محاذاة خوارزمية تصحيح لحركة الخلية الجانبية استناداً إلى بلوكويسي في المتوسط من خطوط ~ 1000، 2) تحديد الموقف مع الموقف، أي الساعة fluorescence أقصى إشارة، في كل كتلة و 3) تحويل جميع القطع لمشترك منشأ12،15، كل على حدة في كل قناة. ثم، يتم تحديد تلقائي لتناظر الساعة بكسل بتحديد المنطقة الوسطى من نوبة ضبابي من مجموع كافة الأسطر الانحياز (أي، مركز ± 2.5σ). تكامل الإشارة في كل سطر غلة السلسلة الزمنية fluorescence غشاء F(t) في كل قناة (ز = الأخضر قناة، r = القناة الحمراء). علما بأن حجم بكسل يجب أن تكون صغيرة بما يكفي، مثلاً، < 200 نانومتر، إعادة بناء شكل النقطة نشر وظيفة والعثور على مركزها، المقابلة لموقف رئيس الوزراء. حضور فوتوبليتشينج كبيرة، قد يكون على غرار مع دالة آسيه مزدوجة السلسلة الزمنية الأسفار في كل قناة وثم تم تصحيحها بالصيغة التالية:16

Equation 1.    (1)

من المهم ملاحظة أن هذه الصيغة بفعالية تصحيح كلا من الاتساع ونشر الأوقات التي تم الحصول عليها من تحليل الارتباط F(t)ج، مقارنة بتقديرات المعلمة التي يمكن الحصول على من غير المصححة F(t). ثم، مهام الارتباط التلقائي والصليب (أكفس/أطر التعاون القطري) وتحسب للأسفار إشارات:

Equation 2، (2).

Equation 3، (3).

حيث δوأنا = وأنا(t)- Image 1 وأنا(t)Image 2 و أنا = ز، والبحث والتطوير.

نموذج نشر ثنائي الأبعاد ثم مزودة بجميع مهام الارتباط (لجنة الأمن الغذائي العالمي):

Equation 4.   (4)

هنا، تشير N إلى عدد البروتينات الفلورية في حجم المراقبة و τد وقت نشرها لكل قناة. هذا النموذج يأخذ في الاعتبار أن في وصف الإعداد التجريبية، يحدث انتشار البروتينات في الساعة في الطائرة x-z، خلافا لتكوين علاقة الفلورية استخداماً التحليل الطيفي (FCS) تجارب على الأغشية السبر نشر في الطائرة x-y من حجم [كنفوكل]17. الخصر ث0 وعامل البنية S، واصفاً الإطالة wض حجم التنسيق في z, S = ثضث0، يتم الحصول عليها من قياس معايرة FCS نقطة أدوا بالأصباغ طيفيا مماثلة ونفس إعدادات البصرية استخدام القيم الموجودة بالفعل لأن معامل نشر دصبغ:

Equation 5، (5).

حيث τد، وصبغ هو وقت نشر متوسط قياس جزيئات الصبغة، التي تم الحصول عليها من تركيب نموذج لنشر ثلاثية الأبعاد للبيانات، ومراعاة التحولات حساب الكسر ر كل ن الجزيئات إلى الدولة الثلاثي مع ثابت وقت ττ:

Equation 6.   (6)

وأخيراً، نشر معاملات (د) وقيم السطوع الجزيئية (اليورو) والصليب-الارتباط النسبي للبيانات سفككس (rel.cc.) يتم حساب كما يلي:

Equation 7، (7).

Equation 8، (8).

Equation 9، (9).

زالصليب(0) من حيث السعة للدالة عبر الارتباط و Equation 14 هو السعة للدالة ترابط تلقائي في القناة-ال أنا.

هذا التعريف نسبي الصليب-العلاقة المتبادلة، أي استخدام كحد أقصى بدلاً من يعني في المعادلة 9، يأخذ في الاعتبار أن يقتصر الحد الأقصى لعدد من المجمعات من نوعين من أنواع البروتين الحالية بتركيزات مختلفة الأنواع الموجودة في عدد أقل.

عدد عبر الارتباط وسطوع يستند إلى تحليل هذه لحظة لشدة الأسفار لكل بكسل من رصة صور اكتسبت على مر الزمن في موقع ثابت في العينة، تتألف عادة من ~ 100-200 الإطارات، مع اثنين الطيفية القنوات ( g = أخضر القناة، r = القناة الحمراء). من الوسط الزماني Image 1 أناImage 2أنا والفرق Equation 16 ، وتحسب سطوع الجزيئية اليوروi وعدد نأنا في كل بكسل وقناة الأطياف (أنا = g, r)18:

Equation 10، (10).

Equation 11. (11)

من المهم ملاحظة أن معادلات معينة تنطبق على الحالة المثالية لكاشف فوتون العد الحقيقي. لأنظمة الكشف التناظرية، تطبيق المعادلات التالية19،20:

Equation 12، (12).

Equation 13.   (13)

هنا، هو S معامل التحويل بين الفوتونات المكتشفة والتهم الرقمية المسجلة، Equation 24 ضجيج قراءات و إزاحة يشير إلى الكشف عن كثافة الإزاحة. عموما، يجب معايرة هذه الكميات، لأي نوع الكاشف، استناداً إلى قياس الفرق كاشف كدالة كثافة لإنارة مطرد19، مثلاً، سطح معدني عاكس أو حل صبغ المجففة. يمكن تحديد الإزاحة عن طريق قياس معدل العد في عينة دون ضوء الإثارة. عن طريق إجراء انحدار خطي للفرق المرتبطة بالكشف عن Equation 25 مقابل الأرض كثافة (أنا), S و Equation 24 يمكن أن تكون حازمة19:

Equation 14.   (14)

وأخيراً، يحسب في كل بكسل سطوع عبر الارتباط ويتم تعريفها بشكل عام21

Equation 15، (15).

حيث Equation 29 هو الصليب-الفرق Equation 30 .

من أجل تصفية تقلبات المعمرة، تتم جميع ccN & حسابات ب بعد النقل التصفية، بشكل مستقل لكل بكسل22. بإيجاز، ni, اليوروأنا (أنا = g, r) وتحسب بcc في انزلاق قطاعات مثل إطارات 8-15. يمكن أن متوسط القيم التي تم الحصول عليها ومن ثم ثم الحصول على بكسل النهائي القيم عدد والسطوع.

تحليل ستويتشيوميتري
بغية تقدير stoichiometry مجمعات البروتين في الخلية جهات الاتصال، يمكن تحليل سطوع الجزيئية بشكل منفصل في كل قناة طيفية سفككس أو ccN & ب البيانات. في سفككس، يتم الحصول على قيمة سطوع واحدة كل قياس في كل قناة. في ccN & B، يتم الحصول على الرسم بياني سطوع لكل بكسل المقابلة لجهة الاتصال خلية خلية وقيمة متوسط (أو الوسيط) يمكن استخدامها سطوع الممثل للقياس. عن طريق إجراء نفس التحليل على مرجع أحادي، يمكن تطبيع جميع قيم السطوع مباشرة الحصول على الدولة oligomeric متوسط مجمعات البروتين تم الكشف عنها. في هذه المرحلة، من المهم تصحيح لوجود FPs غير الفلورية قد يؤدي التقليل من الدولة أوليجوميريك. وهذا عادة ما يقوم بقياس سطوع23،البروتين مرجع هومو dimeric24 استخدام سفكس لون واحد أو عدد والسطوع (ن وب).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-نموذج إعداد: خلية خلية خلط الإنزيم

ملاحظة: بروتوكول التالية وصف الإجراء خلط للخلايا ملتصقة. فإنه يمكن تعديله للخلايا المزروعة في التعليق.

  1. عدد مناسب من الخلايا على لوحة 6، حسنا، مثلاً، 800,000 الخلايا HEK 293T (عد مع نويباور العد الدائرة)، يوميا قبل تعداء البذور. العدد يمكن تعديلها تبعاً للوقت بين البذر وتعداء وتعديلها لأنواع الخلايا الأخرى. لإجراء تجربة أساسية (أي، البروتينات ذات الاهتمام والمراقبة السلبية)، إعداد على الأقل 4 آبار. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في المتوسطة المتوسطة ايجل تعديل (دميم) في دولبيكو، تستكمل بالمصل البقري الجنين (10 في المائة) ولام الجلوتامين (1%).
  2. ترانسفيكت الخلايا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
    1. لإجراء تجربة أساسية، ترانسفيكت، في آبار منفصلة، والبلازميدات لبروتين الفائدة التي تنصهر فيها إلى 'الأخضر' (مثلاً، أحادي المحسن أخضر نيون البروتين (ميجفب)، أو بروتين فلوري الصفراء (مييفب)) أو 'الأحمر' (مثلاً، مشري، أو مكاردينال) البروتين الفلورسنت.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونركز على APLP1-مييفب و APLP1-مكاردينال12، والمراقبة السلبية المقابلة، مثلاً، ميريستويلاتيد-بالميتويلاتيد-مييفب (myr-النخيل-مييفب) ومكاردينال (myr-النخيل-مكاردينال)12. وبصفة عامة، 200 نانوغرام-1 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي تكفي. تعداء عالية الكفاءة يزيد من فرصة للبحث عن الخلايا 'الأحمر' و 'الأخضر' في جهة الاتصال. قم بتعديل مقدار كاشف بلازميد وتعداء لتحسين كفاءة تعداء. الحاسمة: خلية كونفلوينسي ينبغي أن يكون حوالي 70% عند ترانسفيكتينج الخلايا. إذا كانت الخلايا روافد الإفراط، سيتم تقليل كفاءة تعداء. إذا كانت الخلايا غير المتلاقية كافية، قد حمل الإجهاد تعداء والاختلاط ومنع العديد من الخلايا من مرفق مناسب بعد خلط.
  3. أداء الخلية خلط ~4 ± 2 ح بعد تعداء.
    1. إزالة النمو المتوسطة وتغسل جيدا برفق مع برنامج تلفزيوني تستكمل بملغ2 + و Ca2 +1 مل كل. ثم، قم بإزالة برنامج تلفزيوني. (الحرجة) إسقاط برنامج تلفزيوني على الحافة جيدا لمنع انفصال الخلايا أثناء الغسيل.
    2. إضافة ~ 50 ميليلتر التربسين الإيثيلين حمض (يدتا) حل دروبويسي لكل بئر لتسهيل المفرزة من الخلايا. احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 2 بعد ذلك، يهز لوحة 6-جيدا جانبياً لفصل الخلايا ببطء.
      ملاحظة: قد تكون أوقات الاحتضان الموسعة المطلوبة لبعض أنواع الخلايا.
    3. إضافة 950 ميليلتر من متوسط النمو لكل بئر وريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج عدة مرات صعودا وهبوطاً، وبالتالي فصل كافة الخلايا من أسفل جيدا. (الحرجة) التأكد من أن الخلايا حراكه بشكل صحيح ومنفصلة عن بعضها البعض عن طريق التحقق بصريا لغياب المجاميع خلية كبيرة بعد استثارة. وإلا سوف يتم الحصول على العديد من الاتصالات 'الأخضر'-'الأحمر' أو 'الأخضر'-'الأحمر' بعد الاختلاط.
    4. نقل الحل خلية من بئر واحدة (البروتين الفائدة أو المراقبة السلبية) للمقابلة أيضا، أي 'الأحمر' (مثلاً، APLP1-مكاردينال ترانسفيكتيد) إلى 'الأخضر' (مثلاً، APLP1-مييفب ترانسفيكتيد) الخلايا. مزيج من بيبيتينج بلطف عدة مرات صعودا وهبوطاً. ثم، بذور الخلايا المختلطة على الأطباق أسفل الزجاج 35 ملم (1 مل من محلول الخلايا المختلطة للطبق الواحد)، بالإضافة إلى 1 مل من متوسط النمو والثقافة المصنف الخلايا ليوم آخر على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.

Figure 1
الشكل 1 . سير العمل التجريبي والتمثيل التخطيطي للمسح الطيفي الارتباط عبر الأسفار والارتباط عبر تحليل عدد والسطوع في خلية خلية الاتصالات- (أ) نظام لإعداد نموذج: اختلاط الشعبين الخلية transfected مع البروتين للفائدة (مثلاً، APLP1) تنصهر فيها هما البروتينات الفلورية طيفيا متميزة (مثل مييفب ومكاردينال) بعد تعداء. يتم تحديد جهات اتصال خلايا ترانسفيكتيد بشكل مختلف في تجارب الفحص المجهري. لتجنب التداخل مع المجالات ملزم خارج الخلية، يجب أن تنصهر بروتين فلوري إلى المحطة داخل الخلايا من بروتين الفائدة. (ب) قياسات "المسح فككس" (سفككس) عمودي المنجز لجهة الاتصال خلية في قناتين الطيفية (القناة 1، الأخضر والقناة 2، أحمر). يتم محاذاة خطوط المسح (ممثلة كيموجرافس) وقد لخص الغشاء بكسل. ثم، يتم حساب أكفس وأطر التعاون القطري من آثار كثافة وأنا(t). يتم تمثيل أكفس بلون أحمر وأخضر. إطار التعاون القطري يمثل باللون الأزرق. (ج) ن عبر ارتباط & ب (ccN & ب) اكتساب النتائج في تكديس ثلاثي الأبعاد (x-y-الوقت) صورة. يتم تحديد عائد حول جهة الاتصال خلية خلية. ثم سطوع القناة وعبر الارتباط (اليورو1واليورو2بcc) يتم حساب القيم في كل خلية-خلية الاتصال وحدة بكسل. ثم يتم تصور النتائج كرسوم بيانية، تجمع كل بكسل المحدد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

2-نموذج إعداد: السيطرة الإيجابية للتجارب عبر الارتباط وبناء هومو-ديمر لتحليل السطوع

  1. البذور 600,000 HEK 293T الخلايا، عد مع خلية العد الدائرة، على الزجاج 35 ملم أسفل الأطباق قبل تعداء بيوم واحد. الثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 في إكمال دميم المتوسطة (راجع الخطوة 1، 1) ليوم آخر.
  2. ترانسفيكت الخلايا مع ~ 250 نانوغرام بلازميد الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. للمراقبة عبر الارتباط الإيجابي، استخدام بلازميد ترميز ترتكز على غشاء بروتين فلوري هترو-ديمر، مثلاً، myr-النخيل-مشري-ميجفب أو myr-النخيل--مكاردينال--مييفب12 المقابلة لقوة حماية المنشآت بروتين الفائدة. لمعايرة سطوع، استخدام البلازميدات ترميز ترتكز على غشاء مونومر FP ومعا هومو-ديمر المقابلة لل FPs تنصهر للبروتين الفائدة، مثلاً، myr-النخيل-مييفب و myr-النخيل-مييفب-مييفب لمعايرة تحليل السطوع APLP1-مييفب12.
  3. الثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 في إكمال دميم المتوسطة (راجع الخطوة 1، 1) ليوم آخر.

3-[كنفوكل] ليزر المسح المجهري: إعداد ومعايرة تركيز وحدة التخزين

ملاحظة: يتم كتابة البروتوكول التالي للتجارب التي يؤديها مع ميجفب/مييفب ومتشيري/مكاردينال في ليزر المسح مجهر [كنفوكل] المستخدمة في هذه الدراسة. قد يتم تعديل الإعداد الضوئية وإعدادات البرامج (خطوط الليزر، مرايا مزدوج اللون، والمرشحات) واختيار الأصباغ المعايرة للأجهزة الأخرى في الثانية والمجهر.

  1. بدوره على المجهر وأشعة الليزر على الأقل ساعة قبل التجربة لضمان الاستقرار الليزر والموازنة لدرجة الحرارة.
  2. إعداد 100-200 ميليلتر من الحلول المناسبة صبغة الفلورسنت للذوبان في الماء (انظر الجدول للمواد للحصول على أمثلة) في الماء أو في برنامج تلفزيوني لمعايرة حجم التنسيق، مع تركيزات في مدى 10-50 نانومتر.
  3. ضع الحلول صبغ على زجاج نظيف 35 ملم أسفل طبق #1.5، أي وجود سماكة 0.16-0.19 ملم.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، استخدام الأطباق مع الزجاج غطاء عالية الأداء بعد تسامح سمك منخفضة، مثلاً، 0.170 ± 0.005 مم، مما يسمح بتصويب الطوق طوق أمثل (الخطوة 3، 6). من المهم أن تستخدم نفس النوع من الطبق كما هو مستخدم في وقت لاحق للتجارب التالية.
  4. ضع الطبق يتضمن الحل الصبغ مباشرة على الهدف (ويفضل الماء الغمر، مع 1.2 غ) لضمان التركيز في الحل. بدلاً من ذلك، ضع الطبق على صاحب العينة والتركيز في العينة (مثلاً، 10-20 ميكرون فوق الجزء السفلي من الطبق).
    ملاحظة: لا ننصح باستخدام أهداف النفط بسبب ضعف الإشارة التي تم الحصول عليها عند التركيز العميق في العينات المائية.
  5. قم بإعداد مسار الإثارة والانبعاثات، مثلاً، اختر 488 نانومتر الليزر، ومرآة مزدوج اللون نانومتر 488/561، الكشف عن الإطار 499-552 نانومتر وحجم ثقب 1 وحدة مهواة (الاتحاد الأفريقي). تأكد من أن حجم الثقب هو نفسه كتلك التي سيتم استخدامها في القياسات عبر الارتباط.
  6. ضبط موضع الثقب (التكيف الثقب) والطوق طوق موضوعية لتعظيم معدل العد. لتحقيق هذا الهدف، بدوره حلقة ذوي الياقات البيضاء حتى يتم الكشف عن معدل الحد الأقصى للعدد.
    ملاحظة: تصحيح الطوق طوق تستأثر بسماكة محددة من الزجاج غطاء المستخدمة. تحقيق الحد الأقصى من معدل العد، أي.، جمع الفوتونات العديد من كل جزيء قدر الإمكان، من المهم إلى أقصى حد نسبة الإشارة إلى الضوضاء (الاستخبارات) القياسات.
  7. تنفيذ سلسلة من القياسات FCS نقطة (مثلاً 6 قياسات في مواقع مختلفة، كل منها يتألف من 15 من التكرار من 10 s، أي 2.5 دقيقة مجموع الوقت، أخذ عينات مع الوقت يسكن المايكروثانيه 1 أو أقل) في نفس السلطة الليزر المستخدمة في العلاقة عبر القياسات (عادة ~ 1%، µW أي ~ 1-2).
  8. تناسب نموذج نشر ثلاثية الأبعاد بما في ذلك مساهمة الثلاثي (6 المعادلة) للبيانات.
    ملاحظة: عادة، هي الأوقات التي تم الحصول عليها من نشر المايكروثانيه حوالي 30 وعامل الهيكل حول 4-8.
  9. حساب الخصر ث0 من وقت نشر متوسط قياس ونشر قيم معامل نشر الصبغة المستخدمة في درجة حرارة الغرفة25 طبقاً للمعادلة 5. القيم النموذجية 200-250 نيوتن متر.
  10. كرر روتين المعايرة (خطوات 3.4-3.9) مع صبغة فلورسنت مختلفة للكشف عن قناة ثانية إذا لزم الأمر (مثلاً، 561 نانومتر الإثارة والكشف بين 570 نانومتر و 695 nm). تبقى موضع الثقب وحجم كما تم تعيينها للكشف عن القناة الأولى.
  11. حساب سطوع الجزيئية (المعادلة 8) من القياسات المعايرة، وتخزين القيم التي تم الحصول عليها.
    ملاحظة: القيم النموذجية للإعداد المستخدمة هي ~8-10 كيلو هرتز/جزيء (MOL) 1.8 µW 488 نانومتر الإثارة السلطة. أقل من القيم المعتاد قد تشير إلى التراب على الهدف، واختلال الإعداد أو ليزر انخفاض ناتج. التحقق من وتخزين الليزر الناتج القوى في الهدف بشكل منتظم باستخدام مقياس طاقة. للمقارنة بين الأجهزة المختلفة، هو سطوع الجزيئية التي طبعت بقوة الليزر الإثارة المعلمة الأكثر وضوحاً لتقييم الأداء المجهر.

4-المسح الطيفي عبر الارتباط Fluorescence: اقتناء

ملاحظة: بروتوكول التالية مكتوبة للتجارب التي يؤديها مع ميجفب/مييفب (الأخضر) ومشري/مكاردينال ('الأحمر') في المجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر المستخدمة في هذه الدراسة. الإعداد الضوئية وإعدادات البرامج (خطوط الليزر، ومرايا مزدوج اللون، مرشحات) قد تكون مختلفة بالنسبة للأجهزة الأخرى في الثانية أو المجهر.

  1. إعداد المسار البصري، مثلاً، 488 نانومتر و 561 نانومتر الإثارة ومرآة مزدوج اللون نانومتر 488/561، والثقب في 1 الاتحاد الأفريقي ل 488 نانومتر الإثارة. تجنب التحدث عبر الطيفية، حدد مسارين منفصلين لإثارة والكشف عن ميجفب/مييفب (488 نانومتر الإثارة، قناة الأخضر) ومشري/مكاردينال (561 الإثارة نانومتر، القناة الحمراء) تسلسلياً وتحديد المسارات تبديل كل سطر. للكشف عن، استخدام عوامل التصفية المناسبة للقنوات، مثلاً، 499-552 نانومتر في قناة الأخضر و 570 695 نانومتر في القناة الحمراء.
  2. إذا لم يكن ممكناً الإثارة مختلفة، استخدم إعدادات عامل التصفية المناسب للقناة الحمراء لتقليل الطيفية عبر الحديث (أي الكشف عن الأسفار مشري/مكاردينال لا تقل 600 nm). هذا قد تقلل من كمية الفوتونات التي اكتشفت في القناة الحمراء وتخفض بالتالي من دائرة الاستخبارات الوطنية.
  3. ضع الطبق الذي يحتوي على الخلايا المختلطة على صاحب العينة. انتظر 10 دقائق على الأقل لضمان درجة حرارة الموازنة والحد من الانجراف التركيز.
  4. وتركز على الخلايا باستخدام نقل الضوء في القائمة تحديد موقع .
  5. البحث عن زوج من 'أحمر' وخلية 'أخضر' على اتصال ببعضهم البعض. عبر وجود ارتباط إيجابي أو ديمر هومو التحكم بالسطوع (انظر القسم 2)، البحث عن خلية معزولة التي تنبعث منها الأسفار في القنوات أو إشارة كل إنسان-ديمر في الساعة.
    ملاحظة: (حرجة) تصغير عينة التعرض أثناء البحث عن الخلايا لتجنب ما قبل التبييض، مما قد يقلل من الارتباط عبر26. لذلك، تفحص في أسرع سرعة المسح الضوئي والليزر المنخفض القوى. لتجنب التشبع الكاشف أثناء التصوير بقوة الإعراب عن الخلايا، البحث في وضع التكامل. لتقليل التعرض، المسح الضوئي بانخفاض الليزر القوى غير ممكن في وضع فوتون العد .
  6. حدد خط عمودي مسار المسح الضوئي إلى خلية خلية الاتصال (أو بعد الظهر من خلية واحدة لمراقبة السطوع إيجابية عبر الارتباط أو هومو-ديمر) باستخدام الزر المحاصيل كما هو مبين في الأرقام 1 باء و 2 ألف.
    ملاحظة: لا تسمح بعض المجاهر أقدم الاتجاهات تفحص التعسفي. في هذه الحالة، خلية خلية الاتصالات مع اتجاه عمودي على اتجاه المسح يجب أن تكون موجودة.
  7. تكبير/تصغير إلى تحقيق حجم بكسل من 50-200 نانومتر وتحديد خط في وضع المسح الضوئي. تعيين حجم الإطار إلى 128 × 1 بكسل.
    ملاحظة: حجم بكسل نموذجي هو 160 نانومتر، المقابلة لمدة المسح الضوئي من حوالي 20 ميكرومتر.
  8. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى قيمة الحد الأقصى المسموح به، و مثلاً المايكروثانيه 472.73 كل سطر.
    ملاحظة: لمخطط بديل إثارة، وهذا يناظر المايكروثانيه 954.45 المسح الضوئي الوقت، أي ~ 1000 فحص/s على الإعداد المستخدمة. ويمكن تعديل سرعة المسح الضوئي تبعاً لمعامل نشر من بروتين الفائدة. للبروتينات الغشاء الرأسية، أوقات نشر نموذجية حول السيدة 10-20 ينبغي أن يكون المسح الضوئي الوقت أصغر عشر مرات على الأقل من مرات نشرها. السفلي بسرعة المسح الضوئي قد حمل فوتوبليتشينج أقوى وتتطلب أقل الإضاءة القوى. بدلاً من ذلك، واحد يمكن أن تفرض وقفه، مثلاً، يبلغ 5 مللي ثانية، الفترات الفاصلة بين كل عملية مسح للمجمعات نشرها ببطء شديد باستخدام الفاصل الزمني في القائمة الفرعية السلسلة الزمنية .
  9. اختر صلاحيات الليزر المناسبة، مثلاً، ~ 1-2 µW ل 488 نانومتر و ~ 5-10 µW ل 561 نانومتر الإثارة.
    ملاحظة: ارتفاع الليزر القوى تحسين دائرة الاستخبارات الوطنية، ولكن زيادة فوتوبليتشينج. ولذلك، ينبغي أن تختار القوى الليزر يكون فوتوبليتشينج أقل من 50% معدل العد الأولى.
  10. تعيين دورات 100,000-500، 000.
    ملاحظة: عدد من عمليات المسح، أي مدة القياس، وقد تختلف: أوقات أطول في قياس سيحسن دائرة الاستخبارات الوطنية وقد يكون من الأنسب لنشرها الجزيئات ببطء، غير أن تحد من حركة الخلايا وفوتوبليتشينج قياس القصوى الوقت. البيانات المقدمة هنا تم الحصول عليها بشكل روتيني ل ~ 3-6 دقيقة، أي فحص خط 200,000-400,000.
  11. تعيين للكشف عن وضع فوتون العد . اضغط على بدء التجربة لبدء اكتساب. كرر الخطوات من 4.5-4.11 لقياس خلية أخرى.
    ملاحظة: من المستحسن لقياس الخلايا 10-15 كل عينة على مستويات مختلفة من التعبير. (الحرجة) تجنب التشبع للكشف عن مستويات عالية من التعبير. معدل الحد الأقصى للعدد ينبغي أن لا تتجاوز ~ 1 ميغاهرتز.
  12. إذا كان يجري تحليل سطوع لتحديد الدول أوليجوميريك، إجراء القياسات معايرة سطوع هومو-ديمر وفقا لتعديل الخطوات 4.1-4.11: قياس كل بروتين فلوري هومو ديمر كل على حدة (في الخلايا المعزولة، أعدت باستخدام بروتوكول القسم 2) وإجراء القياسات فقط في إحدى القنوات الطيفية.

5-المسح الطيفي عبر الارتباط Fluorescence: تحليل البيانات

ملاحظة: يتبع البروتوكول التالية تنفيذ إجراء تحليل ووصف بالتفصيل في المقالات السابقة12،15. رمز البرنامج متاح عند الطلب للكتاب.

  1. تصدير ملفات البيانات الخام (مثلاً، الاتحاد) إلى صورة RGB TIFF بتنسيق البيانات الخام. سوف يحتوي هذا الملف على كيموجراف مع الأخضر وبيانات القناة الحمراء، في القناة تسمى G و R للصورة، على التوالي.
  2. استيراد ملف TIFF مع برمجيات التحليل المناسب والمضي قدما لإجراء التحليل.
    ملاحظة: يتم تطبيق الخطوات التالية (خطوات 5.3-5.7) بشكل منفصل لكل قناة:
  3. محاذاة الأسطر عن طريق إجراء يكون متوسط وقت سيجمينتويسي أو تتحرك مع كتل من خطوط 500-1000. تحديد موضع غشاء، أي موضع بكسل مع معدل الحد الأقصى للعدد، في كل كتلة. تحول جميع الكتل إلى نفس الموضع الأفقي. بتصحيح هذا الإجراء للتشريد الأفقي للاتصال خلية خلية، مثلاً، بسبب حركة الخلية.
  4. تلخيص جميع خطوط متحاذية على طول محور الوقت وتناسب الشخصية متوسط كثافة استخدام دالة ضبابي. حضور كبير الخلفية داخل الخلايا، استخدم ضبابي بالإضافة إلى دالة سينية. تعريف بكسل المقابلة للغشاء ككل بكسل داخل ±2.5σ موقف الغشاء ونلخص الكثافة هذه بكسل في كل سطر، الحصول على قيمة إشارة صف واحد لكل نقطة مرة (أي، لكل خط المسح الضوئي).
  5. إذا لزم الأمر (مثلاً خلفية > 10% إشارة غشاء)، تطبيق تصحيح خلفية عن طريق طرح كثافة بكسل المتوسط في السيتوبلازم مضروباً في 2.5σ (في وحدات بكسل) من الأسفار غشاء، في كتل من خطوط 1000. تجنب مشرق حويصلات داخل الخلايا عند اختيار خلفية بكسل.
  6. إذا كان يتم ملاحظة فوتوبليتشينج، تطبيق تصحيح تبيض. ولذلك، تناسب السلسلة الزمنية fluorescence الغشاء مع دالة آسيه مزدوجة وتطبيق التصحيح المناسب 1 معادلة الصيغة،16.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، فورييه الطيف على أساس مخططات تصحيح قد يكون تطبيق27. (الحرجة) إذا كان هناك فوتوبليتشينج لكن لا المصوبة ل، قد تكون مشوهة لجنة الأمن الغذائي العالمي شدة وتقديرات المعلمة قد تكون متحيزة بشدة (مثلاً، انظر الشكل 5ه).
  7. حساب أكفس وأطر التعاون القطري وفقا للمعادلات 2 و 3 باستخدام، مثلاً، خوارزمية متعددة-تاو28. لتحسين موثوقية التحليل وتجنب المصنوعات اليدوية، وإجراء العمليات الحسابية لشرائح قياس إجمالي تساوي 10-20. فحص سلسلة زمنية الأسفار ولجنة الأمن الغذائي العالمي في كل قطعة وإزالة شرائح مشوهة وضوح (انظر الأمثلة في الشكل 4A-4 د). متوسط جميع قطاعات غير مشوهة.
    ملاحظة: هذا الإجراء يمكن أن يكون آليا لتجنب تحيز ذاتي ل البيانات29. لقياسات غير مستقرة جداً وجود العديد من مقاطع قصيرة قد تكون مفيدة. غير أن طول الجزء ينبغي أن يظل على الأقل ثلاثة أوامر من حجم أعلاه وقت نشرها لتجنب الإحصائية أونديرسامبلينج أخطاء29،30،17.
  8. تناسب نموذج نشر ثنائي الأبعاد، 4 المعادلة، إلى لجنة الأمن الغذائي التي تم الحصول عليها. ولذلك، إصلاح هيكل عامل إلى القيمة التي تم الحصول عليها في قياس المعايرة (القسم 3 من البروتوكول). يمكن تحسين دقة تناسب بأداء نوبة مرجح استخدام الأوزان الإحصائية لكل نقطة بيانات تم الحصول عليها من خوارزمية تاو متعددة.
  9. حساب معامل نشر استخدام الخصر محسوبة وفقا للمعادلة 7.
  10. حساب سطوع الجزيئية بتقسيم الأسفار متوسط الكثافة في كل قناة بالمقابل عدد الجسيمات، 8 المعادلة. تطبيع قيمة سطوع العزم في كل قناة بسطوع متوسط مرجع أحادي مقابل الحصول على الدولة أوليجوميريك، وأخذا في الاعتبار غير الفلورية في الثانية23. لتحقيق هذا الهدف، تحديد قيم السطوع ديمر هومو متوسط من تحليل لون واحد لحساب الكسر من غير الفلورية في الثانية23.
  11. حساب الصليب-الارتباط النسبي وفقا للمعادلة 9.

6-عدد عبر الارتباط والسطوع: معايرة الكاشف

ملاحظة: يوفر البروتوكول التالية إرشادات عامة بشأن كيفية معايرة نظام الكشف. هذا الإجراء إلزامي لنظم الكشف التناظرية، ولكن غير مطلوب تماما عندما تستخدم فوتون الحقيقي للكشف عن العد.

  1. الجاف للحلول المناسبة صبغ للذوبان في الماء (انظر الجدول للمواد للحصول على أمثلة) على طبق أسفل زجاج 35 ملم. تعيين مسار بصري تبعاً لذلك، أي 488 أو 561 الإثارة نانومتر والكشف في شمال البحر الأبيض المتوسط 499-552 أو 570 695 نانومتر، على التوالي.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، سطح معدني عاكس يمكن استخدام بدلاً من الحلول صبغ المجففة عن طريق وضع قطعة معدنية مباشرة فوق الهدف.
  2. إجراء قياسات N & ب لون واحد في المناطق ذات التركيزات صبغة مختلفة أو ليزر مختلف القوى. ولذلك، استخدام التكبير/التصغير لتحقيق حجم بكسل من 300 نانومتر، سرعة المسح الضوئي الوقت يسكن بكسل المناسبة، مثلاً، المايكروثانيه 25 وتحديد دورات لإطارات 100-200.
  3. تعيين كاشفات عد فوتون (أو الوضع التمثيلي إذا هي القيام بقياسات مع التناظرية الكشف) واضغط على بدء التجربة لبدء اكتساب. إجراء القياس في صفر طاقة الإثارة لتحديد كثافة الإزاحة.
  4. مؤامرة الفرق بكسل كدالة كثافة بكسل لكل بكسل المقاسة وأداء نوبة خطي لهذه البيانات. تحديد S كمنحدر احتواء الخطي. حساب ضجيج قراءات من التقاطع y، استخدام S والإزاحة كثافة مصممة وفقا لمعادلة 14.

7-رقم عبر الارتباط والسطوع: اقتناء

  1. اتبع الخطوات 4.1-4.4 بروتوكول اكتساب سفككس.
  2. استخدام المحاصيل لتحديد إطار 512 × 128 بكسل حول خلية خلية الاتصال (أو الساعة معزولة للتحكم بالسطوع هومو-ديمر)، و التكبير لتحقيق حجم بكسل من 50-100 نانومتر.
  3. استخدام سرعة المسح الضوئي لتعيين الوقت المناسب بكسل يسكن، مثلاً، المايكروثانيه 6.3.
    ملاحظة: في ن & ب، ينبغي أن يكون الوقت يسكن بكسل أصغر بكثير من وقت نشر بروتين الفائدة. إذا تم اختيار مخطط بديل إثارة، على سبيل المثال، التبديل بين المسارات كل سطر، ينبغي أن يكون الوقت بين المسارين أصغر من وقت نشر بروتين الفائدة. وإلا يتم تقليل عبر كشفها-العلاقة المتبادلة.
  4. مجموعة دورات لإطارات 100-200.
    ملاحظة: سيؤدي إلى تحسين عدد إطار أعلى دائرة الاستخبارات الوطنية، ومع ذلك، قد تحد من حركة الخلية قياس مجموع الوقت. المسح الضوئي الوقت لكل إطار ينبغي أن يكون أعلى بكثير من وقت نشر بروتين الفائدة. خلاف ذلك هو تقليل سطوع واضح، يبدو أن أي من الجزيئات غير متحرك. للمجمعات نشرها ببطء شديد، وفرض وقفه، مثلاً، 2 ق، في ما بين الإطارات باستخدام الفاصل الزمني في القائمة الفرعية السلسلة الزمنية .
  5. تعيين سلطات الليزر إلى القيم المناسبة (القيم النموذجية هي ~ 1-2 µW ل 488 نانومتر و ~ 5-10 µW للإثارة نانومتر 561).
    ملاحظة: العالي للطاقة الليزر يؤدي إلى سطوع أعلى وتحسين دائرة الاستخبارات الوطنية، ولكن أيضا فوتوبليتشينج المحسن. الليزر القوى يجب أن تكون مرتفعة بما يكفي لتحقيق سطوع تم الكشف عنها على الأقل ~ 1 كيلو هرتز/MOL لكن تظل منخفضة بما يكفي لتجنب أكثر من 10-20% فوتوبليتشينج. عادة ما يتم الحصول على فوتوبليتشينج ميجفب/مييفب أو مكاردينال/مشري، أقل من 10%.
  6. تعيين كاشفات عد فوتون (أو الوضع التمثيلي إذا هي القيام بقياسات مع التناظرية الكشف). اضغط على بدء التجربة لبدء اكتساب.
  7. تقييم معدل العد فوتون. إذا تجاوزت معدلات العد بكسل خلية الاتصال 1 ميغاهرتز، تقليل قوة الليزر أو حدد الخلايا التي تنخفض فيها مستويات التعبير. كرر الخطوات من 7، 2-7.7. لقياس هذا الزوج القادم من الخلايا. من المستحسن لقياس الخلايا 10-15 كل تجربة على مستويات مختلفة من التعبير.
  8. إذا كان يتم إجراء تحليل سطوع لقياس أوليجوميريزيشن، إجراء القياسات معايرة سطوع هومو-ديمر وفقا للخطوات معدلة 7.1 7.7: قياس كل بروتين فلوري هومو ديمر كل على حدة (في الخلايا المعزولة، أعدت باستخدام بروتوكول القسم 2) وإجراء القياسات فقط في إحدى القنوات الطيفية.

8-رقم عبر الارتباط والسطوع: تحليل البيانات

ملاحظة: ويتبع البروتوكول التالي إجراء تحليل هو موضح سابقا12،31. تتوفر التعليمات البرمجية البرمجيات من المؤلفين عند الطلب.

  1. استيراد البيانات الخام (مثل الاتحاد ملفات يمكن استيرادها باستخدام الحزمة32 بيوفورماتس). متوسط كافة الإطارات وتحديد منطقة للفائدة (ROI) حول جهة الاتصال خلية خلية.
  2. القيام صورة محاذاة خوارزمية33، مثلاً، بتعظيم العلاقة المكانية بين رويس في الإطارات التالية لترجمة الأفقي التعسفي، بلغ في المتوسط عبر كل القنوات. سيتم تصحيح هذا الإجراء للتنقل الأفقي للخلايا.
  3. تنطبق تصفية boxcar22 للحد من تقلبات المعمرة دخيلة، منشؤها، مثلاً، حركة الخلايا المتبقية أو تبييض الخلفية. وبدلاً من ذلك، قد يتم تطبيق أسلوب ديتريندينج لتصحيح فوتوبليتشينج34.
    ملاحظة: إذا كان لا يوجد تحليل سيجمينتويسي أو ديتريندينج يتم تطبيقها، وقد يكون السطوع الظاهر يبالغ إلى حد كبير.
    1. تعريف القطع المنزلقة من، مثلاً، 8 إلى 15 الإطارات (مثلاً، إطارات 1 إلى 8، 2 إلى 9، وهلم جرا) وحساب قيم السطوع القناة وعبر الارتباط وفقا لمعادلات 10، 11 و 15 بيكسيلويسي في كل مقطع. إذا لم تكن كاشفات فوتون الحقيقي العد، للكشف عن تأخذ المعلمات كاشف معايرة في الاعتبار عند حساب السطوع، أي استخدام المعادلات 12 و 13 بدلاً من ذلك.
      ملاحظة: حساب قيم السطوع في قطاعات معينة من 8 إلى 15 الإطارات يؤدي إلى تقدير 10-20 ٪ من السطوع المطلق والمبالغة في تقدير 10-20% من إعداد الجسيمات. ومع ذلك، نسب السطوع (مثلاً، ديمر للسطوع مونومر) لا تتأثر، طالما أن طول الجزء تظل ثابتة طوال التحليل (البيانات لا تظهر). يمكن تحديدها عن طريق المحاكاة أن الخطأ الإحصائي لطول قطاع معين وتصحيحها وبالتالي ل.
    2. متوسط قيم الإضاءة التي يتم الحصول عليها بيكسيلويسي عبر جميع القطاعات. في هذه الخطوة، قد إزالة 5% أعلى وأدنى قيم السطوع الجزء من المتوسط أو استبعاد الأجزاء التي تظهر تشويها واضحا في الكثافة، بسبب، مثلاً، حويصلة داخل الخلايا أو تجميع عابر موجودة في هذه بكسل.
  4. رسم قيم السطوع بكسل كدالة كثافة بكسل وحدد السكان بكسل يتوافق مع جهة الاتصال خلية خلية. وسيكون بكسل خلفية قيم كثافة منخفضة جداً. عند هذه النقطة، إعادة تقييم معدل الحد الأقصى للعدد. استبعاد بكسل مع معدلات العد أعلاه 1 ميغاهرتز الحيلولة دون حدوث تصادم بين آثار.
  5. إنشاء رسوم بيانية سطوع القناة وعبر ارتباط الخلية الخلية المحددة بكسل الاتصال والحصول على قيم السطوع بلغ متوسط العائد على الاستثمار. تطبيع قيمة سطوع القناة متوسط بمتوسط سطوع مرجع أحادي مقابل الحصول على الدولة أوليجوميريك، وأخذا في الاعتبار غير الفلورية في الثانية23. ولذلك، تحديد قيم السطوع ديمر هومو متوسط من تحليل لون واحد لحساب الكسر من غير الفلورية في الثانية23.
  6. للتوضيح، رسم خرائط سطوع القناة وعبر الارتباط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أول اختبار لتحليل التفاعل البروتين البروتين، أي خلط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية طيفيا متميزة متبوعاً سفككس/ccN & ب القياسات (الشكل 1)، ينبغي أن يقوم على البروتينات التي لا يتوقع أن التفاعل في الخلية جهة الاتصال (أي، عنصر تحكم سلبية). ولذلك كانت مختلطة الخلايا HEK 293T يعبر عن ميريستويلاتيد-بالميتويلاتيد-مييفب (myr-النخيل-مييفب) أو مكاردينال-وأنجز سفككس عبر الاتصال خلية خلية (الشكل 2أ). في حالة مثالية، إشارة الأسفار في كل قناة من المفترض أن تتقلب حول يعني مستقرة، ونتيجة للحركة انتشارية البروتينات في الساعة والاختلافات الإحصائية عدد من البروتينات في وحدة التنسيق. للبروتينات التي لا تتفاعل، التقلبات في كلتا القناتين مستقلة عن بعضها البعض، وهكذا، عبر-الترابط الطيفي من المتوقع أن تتقلب حول الصفر. وفي الواقع، كان ملاحظة ارتباط عبر نسبية قريبة من الصفر في قياسات نموذجية (الشكل 2-ج). أكفس إظهار أوقات الاضمحلال المميزة ~ 10-20 ms (المقابلة، في المتوسط، دألم myr = 1.3 ± 0.3 ميكرومتر2/ق (يعني ± التنمية المستدامة، n = 20 زنزانة))، كما هو متوقع لنشر myr-النخيل-مييفب ومكاردينال في الساعة، مثلاً، دmyr-النخيل = 0.88 ± 0.11 ميكرومتر2/ق (يعني ± ووزارة شؤون المرأة) استناداً إلى الأسفار الانتعاش بعد تجارب فوتوبليتشينج (فراب)35. جدير بالذكر أن هذه الديناميات بطيئا إلى حد يسمح باستخدام نظام الإثارة التناوب، أي، التبديل بين فقط الإثارة الأحمر الأخضر وفقط والكشف عن كل سطر، مما تسبب في تأخير ms ~0.5 بين الإشارات في كل القنوات ولكن قمع الطيفية عبر الحديث. متوسط، علاقة متبادلة عبر متوسط منخفض جداً إلى 0.08 ± 0.10 (يعني ± التنمية المستدامة، n = خلايا 17) تم الحصول عليها لمراقبة سلبية (الشكل 3ه)، كما هو متوقع.

المقبل، كان استخدام عنصر تحكم عبر الارتباط إيجابي لمعايرة الحد الأقصى ممكن عبر الارتباط في إعداد البصرية. ولذلك، مفاده ترتكز على غشاء هترو-ديمر myr-النخيل-مكاردينال-مييفب في الخلايا 293T HEK وأجريت قياسات سفككس في الخلايا المفردة (الشكل 2ب). أطر التعاون القطري التي تم الحصول عليها قد ستريك إيجابية وأظهرت مرات تسوس مماثلة أكفس، مرة أخرى ~ 10-20 مللي ثانية (الشكل 2د). متوسط، عبر ارتباط نسبي من 0.96 ± 0.18 (يعني ± التنمية المستدامة، n = 14 الخلايا) وتم قياس لمراقبة إيجابية (الشكل 3ه).

Figure 2
الشكل 2 . المسح قياسات التحكم عبر ارتباط مطيافية الأسفار. (A) صور الممثل مختلطة HEK 293T الخلايا إذ تعرب عن myr-النخيل-مييفب/-مكاردينال كمراقبة سلبية للتفاعلات عبر . السهم الأصفر يشير إلى سفككس مسح المسار. أشرطة مقياس صور الممثل 5 ميكرومتر. (ب) خلايا HEK 293T الإعراب عن هترو myr-النخيل-مكاردينال-مييفب-ديمر (اليسار: قناة الأخضر، الحق: القناة الحمراء) كعنصر تحكم عبر علاقة إيجابية. السهم الأصفر يشير إلى سفككس مسح المسار. هي أشرطة مقياس 5 ميكرومتر. (ج) ممثل لجنة الأمن الغذائي العالمي (الأخضر: الجوع في قناة الأخضر (مييفب)، أحمر: ACF في القناة الحمراء (مكاردينال)، الأزرق: CCF) التي تم الحصول عليها في القياسات سفككس لمراقبة سلبية. إظهار خطوط صلبة يناسب نموذج نشر ثنائي الأبعاد إلى لجنة الأمن الغذائي العالمي-(د) ممثل لجنة الأمن الغذائي العالمي (الأخضر: الجوع في قناة الأخضر (مييفب)، أحمر: ACF في القناة الحمراء (مكاردينال)، الأزرق: CCF) التي تم الحصول عليها في القياس سفككس لعنصر التحكم الإيجابي. إظهار خطوط صلبة يناسب نموذج نشر ثنائي الأبعاد إلى لجنة الأمن الغذائي العالمي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مدى ملاءمة هذا التحليل ثم تم التحقيق في سياق ذات صلة بيولوجيا السبر التفاعلات ترانس اميلويد السلائف مثل البروتين 1 (APLP1)، نوع أنا البروتين transmembrane المقترح بمثابة التصاق الخلايا العصبية مستقبلات. لتحقيق هذا الهدف، تنصهر فيها APLP1 إلى مييفب أو مكاردينال أعرب في الخلايا 293T HEK. لاستبعاد التدخل في مجالات الربط خارج الخلية، كانت تنصهر FPs إلى ج-محطة APLP1، أي في المجال داخل الخلايا (انظر الشكل 1ألف). بعد ذلك، أجريت قياسات سفككس في خلية خلية الاتصالات بين APLP1-مييفب و APLP1-مكاردينال التعبير عن الخلايا (الشكل 3أ)، مما أدى إلى أكفس وأطر التعاون القطري (الشكل 3ج) التي توفر معلومات حول نشر APLP1 والتفاعلات. نسبي عبر-ارتباط إيجابي من 0.45 ± 0.21 (يعني ± التنمية المستدامة، n = خلايا 17) لوحظ، أي قيمة أكبر بكثير من أن عنصر التحكم السلبي (الشكل 3ه). من المثير للاهتمام، متوسط النسبي عبر الارتباط كان أقل من مراقبة إيجابية (الشكل 3ه)، التي تشير إلى ربط جزئي فقط عبر .

وأخيراً، استخدمت الفحص لإظهار أن أيونات الزنك تيسير تعزيز APLP1 عبر ربط12،31. سفككس لجنة الأمن الغذائي التي تم الحصول عليها من القياسات عبر مجموعات APLP1 في خلية خلية الاتصالات (التي تميزت تعريب المشارك قوية APLP1-مييفب APLP1-مكاردينال وتشكيل سرعة حضور أيونات الزنك، الشكل 3ب) أظهرت بقوة انخفاض حيوية، كما يتضح من تسوس كبير مرات والتذبذبات في تأخر كبير مرات (الشكل 3د). ومع ذلك، كشف تحليل للاتساع في أوقات تأخير قصيرة زيادة كبيرة في العلاقة عبر النسبية إلى 0.8 ± 0.3 (يعني ± التنمية المستدامة، n = خلايا 17)، أي ~ 80% من الحد الأقصى لمعايرة (الشكل 3ه). فمن المتوقع أن هذه الديناميات بطيء حمل تشوهات شديدة الارتباط منحنيات (انظر الشكل 3د) سبب العدد المحدود من الأحداث انتشارية يمكن الكشف عنها خلال فترة القياس المحدودة، حمل الجسيمات ما يسمى 30من الضوضاء. التقدير الكمي دقيق، المدة القصوى ينبغي أن يكون على الأقل 3 أوامر من حجم أعلاه وقت نشرها (انظر السابقة ويستعرض30،17 لمزيد من التفاصيل).

وقد تم تحليل سطوع الجزيئية من سفككس بيانات APLP1 المزيد باستخدام عنصر التحكم السلبية myr-ألم كمرجع أحادي في كل قناة وتصحيح مقدار البروتينات الفلورية غير23. عند إضافة أيون الزنك، زيادة سطوع الجزيئية كبيرة من ليغومرات الصغيرة (~ dimers) إلى مولتيميرس أكبر تتكون من ~ 10-50 مونومرات في كل خلية (الشكل 3و). وهكذا، في المتوسط، تصل إلى ~ 100 APLP1 مونومرات موجودة في كتلة بروتين كله عبر تقاطع خلية خلية.

Figure 3
الشكل 3 . مسح الأسفار عبر ارتباط مطيافية القياسات APLP1 التفاعلات في خلية خلية الاتصالات- (أ، ب) صور الممثل من الخلايا HEK 293T الإعراب عن APLP1-مييفب (الأخضر)/APLP1-مكاردينال (أحمر) قبل (A) و 30 دقيقة بعد زنك أيون المعاملة (ب، خلايا مختلفة). الأسهم الصفراء تشير إلى سفككس مسح المسارات. هي أشرطة مقياس 5 ميكرومتر. (ج، د) ممثل لجنة الأمن الغذائي العالمي (الأخضر: أكفس في قناة الأخضر (مييفب)، أحمر: أكفس في القناة الحمراء (مكاردينال)، الأزرق: أطر التعاون القطري) التي تم الحصول عليها في القياسات سفككس ل APLP1 (ج) قبل العلاج أيون الزنك و (د) بعد العلاج أيون الزنك. إظهار خطوط صلبة يناسب نموذج نشر ثنائي الأبعاد إلى لجنة الأمن الغذائي العالمي-(ه) مربع قطع الارتباط عبر النسبية الحصول عليها من تحليل سفككس لمراقبة سلبية ("السلبية")، APLP1 في غياب ووجود أيونات الزنك، والإيجابية عبر ارتباط التحكم ("الإيجابية"). وتظهر قطع متوسط القيم وشعرات بدءاً من الحد الأدنى إلى الحد الأقصى للقيم. يرسم مربع (F) تطبيع السطوع الجزيئية في قناة الأخضر (مييفب) التي تم الحصول عليها من تحليل سفككس من APLP1 في خلية خلية الاتصالات في غياب ووجود أيونات الزنك. كانت تصحيح قيم الإضاءة الفلورية غير مييفب استناداً إلى قياسات سفكس myr-النخيل-مييفب-مييفب هومو-dimers المعرب عنها في الخلايا 293T HEK، تقاس تحت ظروف نفس23. وتظهر قطع متوسط القيم وشعرات بدءاً من الحد الأدنى إلى الحد الأقصى للقيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تم تصحيح جميع القياسات أظهرت حتى الآن فيما يتعلق بتقلبات إضافية، الزائفة التي تحدث في الخلايا، إذا لم تؤخذ في الحسبان، من شأنه أن يجعل التحليل سفككس الصعبة. لمراقبة سلبية، على سبيل المثال، هذه قد يسبب الصليب-علاقة إيجابية كاذبة، إذا تم تطبيق لا مخططات تصحيح. اثنين من العمليات الرئيسية التي يمكن أن تشوه شديد في لجنة الأمن الغذائي العالمي: 1) القلاقل في الأسفار مسجل إشارة سبب حويصلات داخل الخلايا التي أدخل حجم التنسيق عابر أو بطء ديناميات الغشاء، مثلاً، من الانجراف في اتجاه z-، و 2) فوتوبليتشينج. تحديد تقلبات عابرة، من المستحسن تقسيم القياسات الكاملة في قطاعات متساوية الحجم 10-20 وبصريا فحص كثافة السلاسل الزمنية ولجنة الأمن الغذائي العالمي في كل قطاع. ويتضح هذا الإجراء في الشكل 4، الذي يعطي مثالاً على شرائح وضوح المشوهة التي تم الحصول عليها في تحليل قياس السيطرة السلبية. قد يؤدي القلاقل عابرة (الشكل 4أ، آثار كثافة الأجزاء 1 و 2) في إطار التعاون القطري وجود قيم سالبة (الشكل 4باء، الجزء 1) أو إيجابية كاذبة عبر-ارتباط (الشكل 4ب، الجزء 2). عادة، تكون مرئية في سلسلة كثافة هذه القلاقل كإشارة بطيئة الاختلافات (الشكل 4أ). لجنة الأمن الغذائي المقابلة عادة تنحرف بشدة من لجنة الأمن الغذائي العالمي لغالبية شرائح، عرض، مثلاً، زيادة السعة وأبطأ بكثير تسوس مرات على ~ الثانية مقياس (انظر الشكل 4 باء-4 د). يوصي بإزالة هذه الأجزاء من التحليل و لحساب لجنة الأمن الغذائي النهائي بحساب متوسط جميع قطاعات غير مشوهة، أي قطاعات تتسم بلجنة الأمن الغذائي العالمي لا تحيد عن غالبية المدارس الصديقة للأطفال. بشكل عام، هذا هو الحال في رسومية إزالة واجهة بفحص الشرائح، 2 1) تكراري) وضوح مشوهة الأجزاء من المتوسط و 3) تفتيش لجنة الأمن الغذائي العالمي لا تزال قطاعات فيما يتعلق بلجنة الأمن الغذائي العالمي المتوسط محدثة من الأجزاء التي لم يتم إزالتها. عن طريق تطبيق هذا الإجراء، قياسات طويلة مشوهة جزئيا (الشكل 5A)، عرض ببطء المتحللة (تالف) لجنة الأمن الغذائي العالمي (الشكل 5ب) تم تصحيحها بنجاح وكانت علاقة هادفة المنحنيات المستردة (الشكل 5ج). وبصفة عامة، يمكن أن يكون هذا الإجراء تصحيح الخاص29، تجنب عملية تفتيش بصرية بالمستخدم، والتي قد تكون عرضه للتحيز ذاتي. مقارنة بكثافة على أساس تصفية أساليب36، الذي يتم من خلاله تقييم صناديق صغيرة للقياس استناداً إلى قوتها مقارنة بمتوسط كثافة قياس كامل وإزالتها إذا كانت تتجاوز عتبة معلمة، وصف الإجراء لا تعتمد على المعلمات الخارجية وحساسة أيضا لتقلبات طفيفة.

من أجل التعويض عن فوتوبليتشينج، تم تطبيق المعادلة 1، تصحيح رياضي وصف. عادة، يمكن التعرف فوتوبليتشينج من تحلل أسي من إشارات الفلورية (الشكل 5د)، تسيطر على لجنة الأمن الغذائي العالمي، الذي ثم إظهار إيجابية كاذبة عبر الارتباط وتسوس مرات على ~ مقياس دقيقة (انظر الشكل منحنى نموذجي في الشكل 5ه). إجراء تصحيح على انتشال الغذائي غير مشوهة (الشكل 5واو). ككثافة مماثلة سبق ذكره، والاختلافات ضمن القياسات واحد قد يكون أيضا سبب حركة الساعة، مثلاً z-الانجراف أو هياكل تتحرك ببطء كبير. ومع ذلك، إذا اضمحلال أسي مماثلة تظهر في كل القياسات، فوتوبليتشينج سيكون المصدر الأكثر احتمالاً. عموما، يمكن الجمع بين مخططات تصحيح، مثلاً، تصفية كثافة قوات التحالف على أساس التصفية وكذلك أساليب مثل تحويل فورييه على أساس تصفية إشارة بطيئة التغيرات في تواتر مساحة27.

Figure 4
الشكل 4 . تحليل سيجمينتويسي لمسح الأسفار عبر ارتباط مطيافية القياسات السلبية عبر ارتباط التحكم. (أ) كثافة الفلورية الخضراء (و1) والقناة الحمراء (و2) لاثنين من قطاعات مختلفة من الوقت (وقد تم تحليل كل قياس في قطاعات 20 ~ 20 s كل)، والتي تم الحصول عليها من قياس سفككس للمراقبة السلبية. (ب) أطر التعاون القطري لكل جزء من أجزاء 20. يتم تمييز أطر التعاون القطري للجزأين 1 و 2 بالأحمر والبرتقالي، على التوالي. (ج، د) أكفس لكل مقطع في قناة (د) الأحمر والأخضر (ج). يتم تمييز أكفس للأجزاء 1 و 2 بالأحمر والبرتقالي، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . اضطرابات في المسح الأسفار عبر ارتباط مطيافية القياسات في الاتصالات خلية خلية، مثالاً للتحكم عبر الارتباط السلبي. (أ) الأسفار كامل السلسلة الزمنية لمقياس أنموذج بالأخضر (و1) والقناة الحمراء (و2). وتمثل الخطوط الحمراء الصلبة نوبة مزدوجة أسي للسلاسل الزمنية في كل قناة. (ب، ج) لجنة الأمن الغذائي العالمي (الأخضر: أكفس في قناة الأخضر، والأحمر: أكفس في القناة الحمراء، الزرقاء: أطر التعاون القطري) الأسفار السلسلة الزمنية هو موضح في A، تحسب من (ب) ربط قياس كامل أو (ج) ربط شرائح 20 كل على حدة وفي المتوسط الأقل مشوهة لجنة الأمن الغذائي العالمي ~ 80% (قناة الأخضر) و ~ 50% (القناة الحمراء) شرائح. تمثل خطوط صلبة تناسب نموذج نشر ثنائي الأبعاد للبيانات. (د) الأسفار كامل السلسلة الزمنية واحتواء مزدوج-أسي (خطوط حمراء خالصة) القياس تتميز بتبييض كبيرة في القناة الحمراء (و2) والأخضر (و1). (ه، و) لجنة الأمن الغذائي العالمي (الأخضر: أكفس في قناة الأخضر، والأحمر: أكفس في القناة الحمراء، الزرقاء: أطر التعاون القطري) ربط الأسفار السلاسل الزمنية، سيظهر في د، حسبتها () ربط قياس كامل أو (و) تطبيق تصحيح تبيض، معادلة 1، 20 شرائح منفصلة والمتوسط في المدارس الصديقة للأطفال الأقل مشوهة ~ 90% (كل القنوات) شرائح. تمثل خطوط صلبة تناسب نموذج نشر ثنائي الأبعاد للبيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كنهج تكميلية سفككس، ccN & ب (الشكل 1ج) يمكن استخدامها للكشف عن تفاعلات البروتين البروتين بعد خلط الخلية. على النقيض من سفككس، ccN & ب لا يقدم أي معلومات عن ديناميات البروتين، ولكن يسمح لقياس التفاعلات العابر على طول كل خلية-خلية بجهة الاتصال في المستوى البؤري واحد. وأجريت القياسات على عينات APLP1 قبل وبعد العلاج مع 50 ميكرومتر زنكل2، فضلا عن مراقبة النخيل myr السلبية. هذه القياسات حساسة لتحركات الخلية، خاصة بالنسبة للزنك أيون تعامل العينات، التي تتطلب أوقات اكتساب المطول لمراعاة ديناميات المجموعات APLP1 بطيئة. ولذلك، تم تنفيذ خوارزمية محاذاة صورة لتصحيح الحركة الجانبية ل خلايا33. أيضا، النقل تصفية22 (8 إطارات مربع الحجم، ~ 5 s) تم تطبيقها على إزالة تقلبات منخفضة التردد للإشارات المقاسة. هذا الإجراء مشابه جداً لعوامل التصفية الأخرى المستخدمة في تحليل ن & ب تنطوي في المتوسط37 المحلية أو ديتريندينج18،34، ولكن تبقى البيانات الأصلية دون أي تعديل، ويتم التعامل مع أي بكسل بشكل مستقل ولا ويتم حساب متوسط أو الطرح من إشارات. فعالية هذا الإجراء يمنع التقلبات المعمرة على مقاييس زمنية أطول من حجم مربع22. وبعد تحليل هذه البيانات، كانت مقارنة قيم السطوع عبر الارتباط لجميع العينات بتجميع كل بكسل خلية الاتصال في الرسم بياني سطوع عبر الارتباط. ل APLP1 في حالة عدم وجود أيونات الزنك (الشكل 6 ألف و 6 د)، إيجابية في متوسط بcc 0.068 ± 0.004 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = خلايا 18) لوحظ. بعد إضافة أيون الزنك (الشكل 6ب و 6E)، زادت قيمةcc ب إلى 0.266 ± 0.006 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = خلايا 19). لمراقبة سلبية (الشكل 6ج و 6F)، تم الكشف عن سطوع عبر الارتباط انخفاض متوسط (بج ج = 0.022 ± 0.002، يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 26 الخلايا). لتقدير stoichiometry مجمعات APLP1 في خلية خلية جهات الاتصال، سطوع APLP1-مييفب كان تطبيع استخدام متوسط القيمة التي تم الحصول عليها ل myr-النخيل-مييفب (أي.، مراقبة سلبية) وتصحيح مبلغ غير فلوري 23من البروتينات. باﻻتفاق مع البيانات سفككس، وكان مركزة توزيع الإضاءة حول قيمة المقابلة ل dimers (الشكل 6ز)، في حالة عدم وجود أيونات الزنك، مما يشير إلى متوسط ستويتشيوميتري 2:2. بعد العلاج أيون الزنك، سطوع تم تسويتها بشدة تحول إلى قيم أكبر، بدءاً من ~ 10 إلى ~ 60 (الشكل 6حأيستويتشيوميتريس من على الأقل 10:10 أو أكبر، مرة أخرى في اتفاق جيد مع البيانات سفككس.

Figure 6
الرقم 6 . عبر ارتباط عدد وسطوع قياسات APLP1 التفاعلات في خلية خلية الاتصالات- (أ-ج) CcN الممثل & ب صورة إطارات خلية خلية الاتصالات بين الخلايا HEK 293T تعرب عن APLP1-مييفب و APLP1-مكاردينال دون (A) ومع الزنك أيونات (ب) أو myr-النخيل-مييفب و myr-النخيل-مكاردينال التعبير عن الخلايا سلبية عبر ارتباط التحكم (ج). هي أشرطة مقياس 5 ميكرومتر. (د-و) عبر ارتباط السطوع (بج ج) رسوم بيانية لكل درس بكسل والخلايا التي تم الحصول عليها من ccN والتحليل ب خلية خلية الاتصالات في عينات APLP1 (د)، APLP1 الزنك تعامل العينات ( ) والعينات التي تحتوي على myr-النخيل-مييفب و myr-النخيل-مكاردينال (F). (ز، ح) تطبيع سطوع المدرج الإحصائي من العينات APLP1 (ز: دون أيونات الزنك، ح: مع أيونات الزنك) لقناة الأخضر (مييفب) التي تم الحصول عليها من تحليل السطوع من نفس الخلايا ورويس المستخدمة لحساب بcc. اقحم في ز يظهر تكبير في نطاق السطوع طبيعية-2 إلى 10. تم تصحيح قيم السطوع غير الفلورية مييفب استناداً إلى قياسات myr-النخيل-مييفب-مييفب هومو-dimers المعرب عنها في الخلايا 293T HEK، تقاس تحت ظروف نفس23N & ب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كي يؤدوا ccN & ب التحليل، يجب أن تقوم بمعايرة حذراً من أجهزة كشف. للإعداد التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة، اتضحت الحاجة إلى مثل هذه معايرة عندما تم تحليل سطوع الجزيئية في عينات الثابتة (أي، نظراً لعدم وجود تقلبات رقم). في هذه الحالة، يتوقع سطوع الجزيئية تكون صفراً طبقاً للمعادلة 10، نظراً للفرق ينبغي أن تنشأ فقط من الضوضاء كاشف. ومع ذلك، عندما كان عائد يحتوي على كسل الخلفية (غير متحرك) فقط تم تحليلها (الشكل 7ألف و 7B)، مصممة سطوع إيجابية من ~0.1 cts./(MOL x dwell time). تم الحصول على قيمة مماثلة ن المنفذ & الليزر ب القياسات من الخلايا 293T HEK معربا عن جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول-مشري (GPI-مشري، الرقم 7ج) مع اختلاف القوى واستقراء يقاس سطوع الجزيئية صفر طاقة الليزر. لتصحيح هذا التأثير، أجرينا بمعايرة منتظمة كاشف، كما ذكر سابقا (انظر المعادلة 12)19،20. ولذلك يقاس الفرق كدالة لكاشف معدل العد في عينة تتكون من حل صبغة الفلورسنت المجففة وتحديد المعلمات S، Equation 24 والإزاحة معدل العد الظلام. هذه الأخيرة تم الحصول عليها من قياس الكثافة في صفر طاقة الليزر وكان، في حالتنا، لا يعتد بها. من نوبة خطي للفرق مقابل كثافة الأرض، عقدنا العزم، وفقا لمعادلة 14، منحدر S = 1.1، وضجيج قراءات لا يعتد بها. القيم المحددة (S = 1-1، Equation 24 = 0، الإزاحة = 0) ثم استخدمت بشكل صحيح حساب السطوع الجزيئية والعدد وفقا لمعادلات 12 و 1319. بدلاً من ذلك، يمكن تطبيق مخطط تصحيح أكثر تجريبية على أساس حقيقة أن سوبيربويسونيان للكشف عن ضوضاء، أي ضجيج ~ 10% أكبر من بويسونيان النار الضوضاء، يفسر أيضا مراقبة السطوع الجزيئية إيجابية في بكسل دون تقلبات رقم. استخدام هذا الافتراض، يمكن اعتبار سطوع العزم من cts./(MOL x dwell time) ~0.1 في هذه بكسل سطوع ثابت الإزاحة وينبغي طرح ذلك من كافة قيم السطوع المحسوبة بمعادلة 10. الأهم من ذلك، على حد سواء ووصف نهج تؤدي إلى نفس النتائج عند حساب نسب السطوع، ما دام Equation 24 و الإزاحة لا يعتد بها. تجدر الإشارة إلى أن من بين المجاهر المختلفة من نفس قيم S مختلفة النوع (المورد نفسه، نفس النموذج، كاشفات جاسب في وضع العد فوتون) لوحظت، تسليط الضوء على ضرورة إجراء معايرة دقيقة للكشف عن كل الإعداد الفردية.

كذلك معلمة هامة التي تؤثر على أداء الكاشف في القياسات سطوع الوقت للكشف عن قتلى. كما قد تبين سابقا، الوقت الميت كاشف يمكن أن تقلل إلى حد كبير سطوع الجزيئية تم الكشف عنها، حتى على حساب متوسط معدلات (أعلاه 102-103 كيلو هرتز)38. لتجنب هذه الحرفية، ينبغي أما إجراء قياسات معدلات عدد أقل، أو يجب معايرة الوقت الميت استناداً إلى أداء N & ب أو السفح في سلسلة تخفيف من، مثلاً، اجفب في المخزن المؤقت للحل. ثم، يمكن تصحيح معدلات العد المقاسة باستخدام معايرة وقت ميت من38. كشف هذه معايرة استخدام N & ب على الحلول صبغ المخفف للإعداد المستخدمة في هذه الدراسة، قيم السطوع الجزيئية مستقرة تصل إلى معدلات العد ~0.5 ميجاهرتز ووقت مقابلة ميت ~ 6 ns (الشكل 7ه). يمكن تصحيح هذا الانخفاض في معدلات العد وبالتالي باستخدام منشورة سابقا تصحيح صيغة38، أسفر عن قيمة سطوع ثابت ~ 8 كيلو هرتز/MOL.

Figure 7
الشكل 7 . معايرة جهاز كشف لتحليل عدد والسطوع. (أ) صورة الممثل من القياسات N & ب من الخلايا HEK 293T الإعراب عن GPI-مشري. واختير عائد (مستطيل منقط أزرق) في الخلفية. (ب) الرسم البياني السطوع بكسل لكل بكسل المقابلة للعائد على الاستثمار هو موضح في أ. سطوع متوسط بكسل، التي تم الحصول عليها من المناسب على الرسم البياني السطوع بكسل مع وظيفة غاوسي، هو ~0.1 cts./(MOL x dwell time). تم الحصول على بيانات الوقت يسكن المايكروثانيه 25 بكسل. السطوع (ج) الجزيئية التي تم الحصول عليها من تحليل ن & ب GPI-مشري، التي أعرب عنها في الخلايا HEK 293T، ويقاس على ثلاث سلطات ليزر مختلفة (كل 6 خلايا، 561 الإثارة نانومتر، المايكروثانيه 25 بكسل يسكن الوقت). يتم عرض البيانات يعني ± التنمية المستدامة. انحدار خطي (الخط الأحمر) يوفر قيمة إزاحة من 0.11 ± 0.02 cts./(MOL x dwell time). (د) الأرض من الفرق بكسل كدالة كثافة بكسل من القياسات N & ب حل المجفف من صبغة الفلورسنت (متحمس في 561 nm)، المجمعة من كل بكسل من قياسات متعددة في مناطق مختلفة من العينة. ويبين الخط الأحمر الخالص نوبة خطي للبيانات، وأسفر عن منحدر 1.1، توفير عامل S لمعايرة جهاز كشف. السطوع () الجزيئية كدالة للكشف عن معدل العد، تم الحصول عليها من القياسات N & ب الحلول fluorophore المخفف (متحمس في 488 نانومتر). تم تطبيق نظام تصحيح منشورة سابقا38 استخدام قيم مختلفة ممكنة للوقت الميت للكشف عن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الإجراء التجريبي الموضح هنا يسمح التحقيق في البروتين-بروتين التفاعلات عبر جهات الاتصال خلية خلية، تستخدم تقنيات التحليل الطيفي تقلب الأسفار، إلا وهي سفككس و ccN & b تشمل هذه الأساليب تحليل إحصائي لتقلبات fluorescence المنبعثة من اثنين FPs طيفيا المنفصلين تنصهر فيها protein(s) للفائدة في جهة اتصال خلايا المجاورة اثنين، كل يعبر عن أحد أو البروتين الانصهار الأخرى. هو وجود مجمعات عبر كمياً بسبر درجة انتشار البروتينات المشارك في الدورة الشهرية المجاورة. بالإضافة إلى بروتوكولات مفصلة بشأن إعداد العينة والحصول على البيانات وتحليلها، توفر هذه المقالة أدلة تجريبية للتطبيق الناجح للفحص على بروتين التصاق الخلايا العصبية APLP1. نظهر أن يخضع APLP1 محددة، هوموتيبيك عبر التفاعلات في خلية خلية الاتصالات. علاوة على ذلك، تشجع أيونات الزنك تشكيل التكتلات APLP1 في خلية خلية الاتصالات منبرا متعددي التفاعلات العابر ، وهكذا، حمل ملزمة المحسنة عبر .

على عكس السابق فحوصات للكشف عن مثل هذه التفاعلات التي تستند إلى أساليب البيوكيميائية التخريبية6، يمكن أن يؤديها النهج المقدمة مباشرة على الخلايا الحية، مع عدم وجود حاجة للتثبيت أو عزل البروتين المجمعات. علاوة على ذلك، فإنه يوفر خصوصية الجزيئية والمعلومات بالكشف عن البروتينات الفلورية تنصهر وراثيا لبروتين الفائدة، على النقيض من فحوصات النوعية السابقة8،9. بطريقة مختلفة من الأسفار على أساس النهج الأخرى مثل الحنق10 والأسفار التكامل11، ليس هناك اشتراط للتسميات الفلورسنت تكون مترجمة على الجانب خارج الخلية (يحتمل أن تتدخل في تفاعلات البروتين البروتين). ومع ذلك، فلا تجدر الإشارة إلى أن ج-المحطة الثانية قد يغير لا يزال الربط للمكونات داخل الخلايا، مثل محول البروتينات التي تتوسط التفاعلات مع سيتوسكيليتون. جدير بالذكر أن المقايسة تنطبق على كل إنسان-والتفاعلات الغيروية.

متطلبات قليلة لتطبيق ناجح للمقايسة المقدمة يستحق الذكر. وتستند أساليب تقلب المنجزة الفلورية القياسات الزمنية التي تتطلب مشرقة وفوتوستابل أحادي إطارا في الثانية، وعقبة رئيسية لكثير من الأحمر في الثانية23. على الرغم من أن نظام المسح قدم مناسبة خاصة للتحقيق في ديناميات بطيئة من البروتينات transmembrane، التي تشارك عادة في التفاعلات خلية خلية، قد لا يزال تحدث فوتوبليتشينج المتبقية. ولذلك، نقدم وصفاً مفصلاً لمخططات تصحيح، أي تصحيح تبيض لتصفية سفككس والنقل ل ccN & B، والتقليل من هذه الاضطرابات. علاوة على ذلك، نحن مناقشة خوارزميات العددية المحاذاة التي تصحيح فعالة لاضطرابات منهجية أخرى، مثل حركة أفقي من الخلايا، وتوفير مبادئ توجيهية لإزالة عدم الاستقرار عابرة. مصدرا رئيسيا لعدم الاستقرار هذا هو حويصلية النقل، أي داخل الخلايا حويصلات تحمل بروتين الفائدة التي عابر أدخل حجم التنسيق. بصورة عامة شديدة على الرغم من أن تختلف من حالة إلى أخرى، يمكن أن يعكر هذه الظاهرة الحصول على البيانات وتحليلها. ومع ذلك، تطبيق تصحيح الخوارزميات يحسن استقرار حيازة، مما يتيح قياس موسعة الأوقات التي هي بحاجة للتحقيق لا سيما ديناميات انتشارية بطيئة. وفي هذا الصدد، قد ينبغي التأكيد على أن وجود ديناميات انتشارية شرط أساسي لأسلوب العمل. على سبيل المثال أيون الزنك بوساطة يظهر التجميع APLP1 مثال جذرية لمجمعات البروتين الكبيرة، بطيئة جداً (/s2ميكرومتر 0.001 ≈ د) دفع هذه التقنية إلى حدودها وتمنع القياس الكمي دقيق الديناميات الأساسية، بسبب الضوضاء الكبيرة الناجمة عن حيازة محدودة الوقت30،17.

وفي هذا السياق، أوقات التقدم الذي أحرز مؤخرا في تمشيط سفكس وفائقة القرار النهج، مثل المسح الضوئي الانبعاث تحفز استنفاد FCS (STED-سفح المنحدر القاري)، قد يكون من المفيد بتوفير التنسيق حجم أصغر وأصغر وبالتالي نشر فعالة39 ،40. هذا يمكن أن يساعد أيضا لحل المجموعات البروتين في حالة تعريب متنافرة من بروتين اهتمام في الاتصالات خلية خلية، كما لوحظت بالنسبة APLP1 حضور الزنك. ولسوء الحظ، تنفيذ الارتباط عبر المسح الضوئي FCS STED، أي، STED-فككس، التي يمكن أن تطبق مباشرة هنا، لم بنجاح يثبت بعد بسبب صعوبة العثور على الأصباغ متوافقة للون STED-FCS. في حالة ديناميات سريع بما فيه الكفاية (د ≥ ~0.05/s2ميكرومتر)، يسمح تحليل سفككس التحديد الكمي لنشر البروتينات في خلية خلية الاتصالات أو في مناطق أخرى من الساعة12.

علاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل سطوع لكافة البيانات (سفككس و ccN & B)، يوفر تقديراً ستويتشيوميتري من عبر مجمعات البروتين. تجدر الإشارة إلى أن يزيد من دقة التحديد الكمي ستويتشيوميتري مع كمية البروتينات التي تربط في ترانس (أي، إذا كان هناك عدد قليل من المجمعات كومنولث الدول المستقلة التي يمكن أن تؤثر أيضا على تحديد السطوع). لا يسمح تحليل سطوع حل خليط من مختلف الدول أوليجوميريك، مونومرات e.g.,cis و عبر تيتراميرس. أكثر عموما، من الجدير أن ن وب لا يمكن حل خليط من مختلف الأنواع oligomeric البلوتينيوم الموزعة في عينة. إذا كانت متعددة الأنواع موجودة داخل بكسل، ستكون قيمة مفردة واحدة من السطوع يقاس (أي متوسط مرجح للسطوع من كل الأنواع أوليجوميريك). إحصائية توزيع القيم سطوع ملاحظتها (مثلاً، في مختلف بكسل) غير متصل مباشرة إلى مبالغ النسبية للأنواع oligomeric. لحل هذه المخاليط، ينبغي أن تستخدم أساليب أخرى (مثل الكثافة المكانية توزيع التحليل (سبيدى)41، فوتون عد الرسم البياني (برستيج)42). وبالمثل، يوفر التقدير الكمي للصليب-الترابط الطيفي في سفككس التحديد الكمي دقيقة لجزء صغير البروتينات المنضمة وغير المنضمة فقط من أجل ستويتشيوميتريس بسيطة ومعروفة، مثلاً، 1:1. ستويتشيوميتري أكثر تعقيداً، كذلك الافتراضات يجب أن تتم43. عموما، يبقى تحليل سطوع أداة تجريبية قوية، إذا كان النظام الكاشف والكسر من غير الفلورية في الثانية هي معايرة23 كما هو موضح في البروتوكولات.

على الرغم من أن التطبيق المعروضة هنا تركز على تفاعلات البروتين البروتين في خلايا ملتصقة، يمكن تطبيقها التحليل لنطاق أوسع من العينات، مثل تعليق الخلايا. لمثل هذه النظم، تصحيح لحركة الخلية الجانبية قد تكون حاسمة بوجه خاص. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيقها بسهولة إلى نظم غشاء نموذجية مثل جوفس أو جبمفس، مما يتيح التحديد الكمي للتفاعلات الجزيئية تحت ظروف خاضعة للرقابة أيضا، مثلاً، المادة الدهنية مختلفة التراكيب أو الأغشية التي تفتقر إلى منظمة cytoskeleton. عند تنفيذ سفككس على هذه الحويصلات، الحركة الرأسية قد يسبب تقلبات إشارة إضافية، ولكن يمكن التقليل من عند التركيز على حويصلات كبيرة. وفي هذا السياق، تركيبات متعددة واعدة، مثلاً، جيوف-/جبمف-خلية خلط12. كما هو موضح في منشور صدر مؤخرا، يمكن بنجاح غرار تشكيل نهايات محصنة من مثل هذه النظم44. وهكذا، المقايسة المقدمة ستكون بلا شك مفيدة للتحقيق في مجموعة كبيرة ومتنوعة من التفاعلات خلية خلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

بتأييد هذا العمل جزئيا الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) منح 254850309. يشكر المؤلفون لوكنر مادلين لقراءة نقدية من المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1, (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144, (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3, (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401, (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24, (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28, (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28, (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3, (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91, (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96, (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788, (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94, (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71, (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95, (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8, (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102, (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80, (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18, (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10, (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137, (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189, (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76, (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33, (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184, (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111, (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210, (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105, (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8, (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78, (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88, (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132, (4), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics