Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biyolojik süreçlerin çeşitli genellikle komşu hücreler arasında arayüz etkileşim proteinler tarafından aracılı hücre-hücre arasındaki etkileşimleri içerir. İlgi, sadece birkaç deneyleri özellikle bu tür etkileşimlerde doğrudan canlı hücreler sondalama yeteneğine sahiptirler. Burada, proteinlerin komşu hücreleri, hücre-hücre kişiler yüzeyleri, bağlama ölçmek için bir tahlil mevcut. Bu tahlil iki adımdan oluşur: hücre proteinleri farklı floresan proteinler için erimiş ilgi ifade karıştırma, floresans mikroskobu tarama confocal lazer kullanarak hücre-hücre kişiler dalgalanma spektroskopisi ölçülerde ardından. Biz bu testin bir biyolojik ilgili bağlamda fizibilite hücre-hücre kavşak amiloid habercisi gibi protein 1 (APLP1) etkileşimleri ölçerek göstermek. Detaylı iletişim kuralları (floresan çapraz korelasyon spektroskopisi, çapraz korelasyon numarası ve parlaklık analiz tarama) Floresan tabanlı teknikleri ve gerekli araç Kalibrasyonlar kullanarak veri toplama sağlar. Ayrıca, veri analizi ve nasıl tanımlamak ve photobleaching veya hücre hareketi nedeniyle gibi dış, sahte sinyal çeşitleri düzeltmek kritik adımları tartışmak.

Genel olarak, sunulan tahlil herhangi bir homo veya hücreler aynı veya farklı türleri arasında hücre-hücre kişiler, heterotypic protein-protein etkileşim için geçerlidir ve üzerinde bir ticari confocal lazer mikroskobu tarama uygulanabilir. Birkaç dakika faiz proteinlerin diffusive dynamics soruşturma yeterli olması gerekir sisteminin istikrarı önemli bir gereksinimdir.

Introduction

Birçok biyolojik süreçlerin hücre-hücre etkileşimleri, Örneğin, hücre-hücre adezyon1,2,3, hücre-hücre füzyon4 ve hücresel tanıma5sitelerinde oluşur. Bu tür olayların çok hücreli organizmalar ve hücre-hücre iletişim, Örneğin, bağışıklık yanıtı sırasında için geliştirme sırasında özellikle önemlidir. Bu işlemler genellikle yüzeyde, Yani, komşu hücreler plazma zarı (PM), lokalize ve tam olarak düzenlenmiş uzay ve zamanın çoğu belirli etkileşimler hücre-hücre iletişim tabi proteinler tarafından aracılık. Birçok durumda, bu etkileşimler doğrudan homo - ya da heterotypic protein-protein trans etkileşimleri, ama da iyonları veya hücre dışı bağlayıcı1hareket ligandlar içerebilir. Temel öneme sahip olsa da, bu belirli protein-protein etkileşimler yaşayan hücrelerin doğal ortamda doğrudan sondalama deneyleri eksikliği vardır. Pek çok yöntem de hücre bozulması (Örneğin, biyokimyasal deneyleri co-immunoprecipitation6gibi), gerektiren fiksasyon (Örneğin, bazı süper çözümleme optik mikroskobu teknikleri ve hücre-hücre elektron mikroskobu rehber7), ya da non-spesifik, Örneğin, toplama / yapışma deneyi8,9. Bu sorunu aşmak için floresans teknikleri floresans rezonans enerji transferi (FRET)10 veya floresan uluslara11temel uygulanmıştır. Ancak, fluorophores arasında yeterince kısa mesafelerde elde etmek için potansiyel olarak trans etkileşimleri ile müdahale belgili tanımlık protein10, hücre dışı tarafındaki floresan etiketleri bu yöntemler gerektirir.

Burada, hücre-hücre kişiler bir alternatif floresans tabanlı tahlil protein-protein etkileşimleri için mevcut. Bu yaklaşım floresans çapraz korelasyon yaklaşımlar (tarama floresans çapraz korelasyon spektroskopisi (sFCCS), çapraz korelasyon numarası ve parlaklık (ccN ve B)) ve protein bir füzyon yapı ifade hücrelerinin karıştırma birleştirir faiz, Örneğin, bir yapışma reseptör. İncelenen reseptörleri iki etkileşen hücrelerde iki hayalice ayrılmış floresan proteinlerin (FPs) ile hücre içi etiketlenir ( Şekil 1A' ya bakınız) yan.

İstihdam yöntemleri, floresans mikroskobu tarama confocal lazer odak hacmi ile floresan füzyon proteinlerin diffusive hareket tarafından indüklenen dalgalanmaları istatistiksel analizi temel alır. Daha ayrıntılı olarak, proteinler, hücre-hücre kişiler her iki komşu PMs ilgi ortak difüzyon tahlil sondalar. Proteinler trans etkileşimleri tabi eğer bu trans komplekslerin spektral her iki kanal yayan, her iki yayıcılar ilişkili floresans dalgalanmalar neden floresan proteinler taşıyacak. Öte yandan, hiçbir bağlama ortaya çıkarsa, PMs bakan numara dalgalanmaları proteinlerin bağımsız, hiçbir ilişkili dalgalanmaları neden olacaktır. Satın iki yolla yapılabilir: 1) sFCCS bir çizgi şeklinde tarama hücre-hücre iletişim karşıdan karşıya dayanmaktadır ve etkili iletişim bölgesinde bulunan bir noktada etkileşimleri sondalar. Floresans dalgalanmaları zamansal analizi ile sFCCS dynamics bilgi, Yani, aynı zamanda protein kompleksleri difüzyon katsayıları sağlar; 2) ccN & B hücre-hücre iletişim bölgeler alınan görüntüleri bir dizi pixel-wise bir analizine dayalı. Soruşturma için yeteneği ve harita etkileşimler tüm boyunca bölgede (bir odak düzlemi) başvurun, ama bilgi dinamikleri üzerinde sağlamaz. Her iki yöntem ortalama floresans sinyal zaman biriminde tek akışkanın protein kompleksleri tarafından yayılan ve böylece, protein kompleksleri stoichiometry tahminleri sağlamak Yani, moleküler parlaklık analizi ile kombine edilebilir hücre-hücre kişiler.

Bu makalede sunulan tahlil üzerinde bir ticari confocal lazer mikroskobu tarama gerçekleştirmek numune hazırlama, aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi için detaylı iletişim kuralları sağlar. Deneyler foton sayma veya analog dedektörleri ve bir amacı ile yüksek sayısal diyafram ile donatılmış herhangi bir enstrüman üzerinde gerçekleştirilebilir. Biz daha fazla Protokolü'nün önemli adımlar ele ve neden artefactual sinyal dalgalanmaları, Örneğin, Dedektör gürültü, photobleaching veya hücre hareketi birkaç işlemleri için düzeltme düzenleri sağlar. Aslında yapışık hücreleri arasındaki etkileşimler soruşturma için geliştirilmiş, tahlil için süspansiyon hücreler değiştirilebilir veya modeli membran sistemleri, Örneğin, dev unilamellar veziküller (GUVs) veya dev plazma membran veziküller (GPMVs), izin adapte miktar etkileşimleri farklı lipid ortamlarda veya bir organize sitoiskeleti12,13yokluğunda.

Floresans çapraz korelasyon spektroskopisi tarama floresans spektroskopisi çapraz korelasyon14 değiştirilmiş bir versiyonu ve yavaş diffusive dynamics lipid membranlar15soruşturma için özel olarak tasarlanmıştır. Bir satır tarama satın alma ilgi floresan protein içeren PM dikey dayanmaktadır. İki farklı etiketli protein türlerin etkileşimleri soruşturma için satın alma iki spektral kanalları iki lazer satır ve iki algılama windows için hayalice ayrı fluorophores kullanarak gerçekleştirilir. Başbakanın proteinler yavaş difüzyon dinamikleri nedeniyle (D≤ ~ 1 µm2/s), çapraz konuşma ücretsiz ölçüm15hizalamak için satır uyarma düzeninden alternatif tarafından gerçekleştirilebilir. Analizi ile başlar: 1) bir hizalama algoritması yanal hücre hareketi için düzeltme dayalı block-wise ~ 1000 satır, 2) maksimum floresans sinyalYani, Başbakanın pozisyonda, her blok pozisyonla belirlenmesi ortalama ve 3) değişen üzerinde bir ortak kökenli12,15, ayrı ayrı her kanaldaki tüm blokları. Sonra bir otomatik seçim için PM karşılık gelen piksel, tüm hizalanmış çizgileri (Yani, Merkezi ± 2.5σ) toplamı Gauss uygun bir merkez bölgesi seçerek gerçekleştirilir. Entegrasyon-in her satırdaki sinyal verir her kanaldaki membran floresans saat serisi F(t) (g = yeşil kanal, r = kırmızı channel). Piksel boyutu kadar küçük Örneğin, olmak zorunda Not < 200 nm nokta şeklinde yeniden oluşturmak için işlev yaymak ve PM konumuna karşılık gelen merkezini bulmak. Önemli photobleaching huzurunda floresans saat serisi her kanaldaki olabilir çift Üstel fonksiyon ile örnek alınarak ve aşağıdaki formülü ile düzeltilmiş:16

Equation 1.    (1)

Bu formül etkili genlikleri ve korelasyon analizi F(t)cdüzeltilmeyen F(t)elde edilen parametre tahminleri karşılaştırıldığında, elde edilen difüzyon kez düzeltir unutmamak gerekir. O zaman, otomatik ve çapraz korelasyon fonksiyonları (ACFs / CCFs) Floresan sinyallerini hesaplanır:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

Burada δFben benF(t) - = Image 1 benF(t)Image 2 ve ben g, r=.

Bir iki boyutlu difüzyon model sonra tüm korelasyon fonksiyonları (CFs) için düzenlenmiştir:

Equation 4.   (4)

Burada, N gözlem birim ve τd floresan proteinlerin difüzyon zaman her kanal için gösterir. Bu model açıklanan Deneysel ortamda proteinlerin difüzyon PM içinde x-z düzlemde oluşur floresans korelasyon yaygın olarak kullanılan yapılandırma aksine spektroskopisi (FCS) sondalama membranlar üzerinde deneyler dikkate alır confocal cilt17difüzyon XY düzlemde. Bel w0 ve yapısı faktörü S, uzama açıklayan wz z, S odak hacmindeki = wz/w0, hayalice benzer boyalar ve aynı optik ayarları ile gerçekleştirilen bir nokta FCS kalibrasyon ölçüm elde edilir zaten kullanılabilir değerler için difüzyon katsayısı kullanarak Dboya:

Equation 5, (5).

τd, boya boya moleküllerin üç boyutlu difüzyon veri için bir model uygun elde ölçülen ortalama difüzyon zaman olduğu yerde hesap geçişleri için bir kısmı T tüm N moleküllerin, dikkate alarak bir bir süre sabit durumuyla üçlüsü ττ:

Equation 6.   (6)

Son olarak, difüzyon katsayısını (D), moleküler parlaklık değerlerini (ε) ve göreceli çapraz korelasyon sFCCS veri (rel.cc.) aşağıdaki gibi hesaplanır:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

çapraz korelasyon işlevi genliği nerede Gçapraz(0) ve Equation 14 ben-th kanal otokorelasyon işlevinde genliği olduğunu.

Göreli çapraz korelasyon, yani bu tanımı denklem 9, demek yerine max kullanma alır kompleksleri farklı konsantrasyonlarda mevcut iki protein türlerin sayısı sınırlıdır dikkate sayı ne kadar küçükse mevcut bir tür.

Çapraz korelasyon numarası ve parlaklık esas floresan yoğunluğu zamanla örnek sabit bir pozisyonda alınan görüntü yığını her piksel için bir an Analizi genellikle ~ 100-200 itibaren oluşan çerçeve, spektral iki kanal () g = yeşil kanal, r = kırmızı channel). Zamansal anlamına gelen Image 1 benImage 2ben ve varyans Equation 16 , moleküler parlaklık εi ve numara nben her piksel ve spektral kanal hesaplanır (ben g, r=)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

Verilen denklemler gerçek bir foton sayma dedektörü ideal durumda için geçerli olduğunu unutmamak gerekir. Analog tespit sistemleri, aşağıdaki denklemler19,20uygulanır:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

S algılanan fotonlar ve kaydedilen dijital sayıları arasında dönüştürme faktörünü işte Equation 24 okuma gürültü olduğunu ve ofset dedektörü yoğunluğu Ofset için başvurur. Genellikle, bu miktarlar, yoğunluğu sabit aydınlatma19, Örneğin, yansıtıcı metal bir yüzeye veya kuru boya çözüm için bir fonksiyonu olarak Dedektör farkı ölçme üzerinde dayalı herhangi bir dedektör türünün ayarlanması. Ofset için uyarma ışık olmadan bir örnek sayısı oranı ölçerek belirlenebilir. Bir doğrusal regresyon dedektörü ilişkili varyans yaparak Equation 25 karşı şiddeti (ben) Arsa, S ve Equation 24 belirlenen19olabilir:

Equation 14.   (14)

Son olarak, çapraz korelasyon parlaklık kümedeki her pikseli rasgele hesaplanır ve21 olarak genel olarak tanımlanır

Equation 15, (15).

nerede Equation 29 çapraz değişkenidir Equation 30 .

Uzun ömürlü dalgalanmaları filtre uygulamak için tüm ccN & B hesaplamalar filtreleme, bağımsız olarak her piksel22için bir yük vagonu takip gerçekleştirilir. Kısaca, ni, εben (ben g, r=) ve Bcc segmentlerinin Örneğin, 8-15 kare sürgülü hesaplanır. Böylece elde edilen değerler sonra son piksel sayısı ve parlaklık değerlerini elde etmek için Ortalama.

Stoichiometry Analizi
Protein kompleksleri stoichiometry hücre-hücre kişiler tahmin etmek için moleküler parlaklık ayrı olarak sFCCS veya ccN & B veri için spektral Her kanaldaki analiz edilebilir. SFCCS içinde her ölçüm için her kanaldaki bir parlaklık değeri elde edilir. CcN & B, hücre-hücre iletişim için karşılık gelen tüm piksellerin parlaklık çubuk grafik elde edilir ve ortalama (veya medyan) değeri temsilcisi Parlaklık ölçüm için kullanılabilir. Aynı analiz üzerinde monomeric bir başvuru yaparak, tüm parlaklık değerlerini doğrudan saptanan protein kompleksleri ortalama oligomeric durumunu elde etmek için normalleştirilmiş. Bu noktada, oligomeric devlet bir küçümseme içinde sonuçlanabilir floresan FPs varlığı için düzeltmek önemlidir. Bu genellikle tek renk sFCS veya numarasını kullanarak bir homo dimerik referans protein23,24 parlaklık ve parlaklık (Y & B) ölçme tarafından gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. örnek hazırlama: Hücre-hücre karıştırma tahlil

Not: Aşağıdaki protokol yapışık hücreleri için karıştırma yordamı açıklar. Süspansiyon kültürlü hücreler için değiştirilebilir.

  1. 6-şey plaka, Örneğin, 800.000 HEK 293T hücreleri (bir Neubauer odası sayma sayılır), bir gün önce transfection sayfasında bulunan bir hücreler uygun bir rakam tohum. Numarayı tohum ve transfection arasındaki süreye bağlı olarak değiştirilebilir ve diğer hücre türleri için ayarlanmış. Temel deney (Yani, faiz ve negatif kontrol proteinler) gerçekleştirmek için en az 4 kuyu hazırlayın. Kültür hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 ' Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) orta, fetal Sığır serum (% 10) ve L-glutamin (% 1) ile desteklenmiştir.
  2. Hücreleri üreticinin talimatlarına göre transfect (bkz. Tablo malzeme).
    1. Temel bir deney gerçekleştirmek için ayrı Wells, plazmid protein bir 'yeşil' (Örneğin, monomeric gelişmiş yeşil flüoresan protein (mEGFP) veya sarı floresan protein (mEYFP)) veya 'red' (Örneğin, mCherry, erimiş ilgi için transfect ya da mCardinal) Floresan protein.
      Not: Bu protokol için APLP1-mEYFP ve APLP1-mCardinal12ve karşılık gelen negatif kontrol, Örneğin, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (en düşük myr-palm-mEYFP) ve - mCardinal (en düşük myr-palm-mCardinal)12üzerinde odaklanıyoruz. Genel olarak, 200 ng - plazmid DNA 1 µg yeterli vardır. Yüksek transfection verimliliği 'kırmızı' ve 'green' hücreleri temas halinde bulmak için olasılığını artırır. Plazmid ve transfection reaktif transfection verimliliği optimize etmek için değiştirmek. Kritik: Hücre confluency civarında hücreleri transfecting % 70 olması gerekir. Hücreleri aşırı birleşmesi ise, transfection verimliliği azalır. Hücreleri yeterince konfluent değilseniz, transfection ve karıştırma stres neden ve karıştırma sonra uygun ek birçok hücrelerden önlemek.
  3. ~4 ± 2 h transfection sonra karıştırma hücre gerçekleştirin.
    1. Büyüme orta kaldırmak ve her 1 mL Mg2 + ve Ca2 +ile desteklenmiş PBS ile de nazikçe yıkayın. Ardından, PBS kaldırın. (Kritik) PBS yıkama sırasında hücre dekolmanı önlemek için iyi kenar üzerine bırakın.
    2. ~ 50 µL tripsin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm drop-wise dekolmanı hücre kolaylaştırmak için her şey için ekleyin. Daha sonra 2 dakika süreyle 37 ° C'de kuluçkaya, yanal hücreleri ayırmak için 6-şey plaka yavaş yavaş salla.
      Not: Genişletilmiş kuluçka kez bazı hücre türleri için gerekli olabilir.
    3. Her şey için büyüme ortamının 950 µL ekleyin ve hücreleri böylece iyi altındaki tüm hücreleri ayırma yukarı ve aşağı, bir kaç kez pipetting tarafından resuspend. (Kritik) Hücrelerin düzgün resuspended ve büyük hücreli agrega olmaması için resuspension sonra görsel olarak kontrol ederek birbirinden müstakil emin olun. Aksi halde birçok 'kırmızı'-'kırmızı' ya da 'yeşil'-'yeşil' kişiler karıştırdıktan sonra elde edilir.
    4. Şey, Yani, 'kırmızı' (Örneğin, APLP1-mCardinal transfected) 'yeşil' (Örneğin, APLP1-mEYFP transfected) karşılık gelen hücre çözümü bir iyi (protein faiz veya negatif kontrol) aktarım hücreleri. Yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından karıştırın. Sonra tohum 35-mm cam alt yemekleri (karma hücre çözüm çanak başına 1 mL), artı 1 mL büyüme ortamının ve kültür karma hücre hücreleri için başka gün 37 ° c, % 5 CO2numaralı seribaşı.

Figure 1
Resim 1 . Deneysel iş akışı ve floresan çapraz korelasyon spektroskopisi ve hücre-hücre kişiler çapraz korelasyon numarası ve parlaklık analiz tarama şematik Gösterim. Numune hazırlama düzeninin(a): iki hayalice farklı floresan proteinler için (Örneğin, mEYFP ve mCardinal) erimiş protein ilgi (Örneğin, APLP1) ile transfected iki hücre popülasyonlarının transfection sonra karıştırılır. Kişiler farklı transfected hücrelerinin mikroskopisi deneylerde seçilir. Hücre dışı bağlama etki alanları girişimi engellemek için floresan protein ilgi proteinin hücre içi terminus için erimiş. (B) FCCS (sFCCS) tarama ölçümleri gerçekleştirilen dikey olarak iki spektral kanal (Kanal 1, yeşil ve Kanal 2, kırmızı) hücre-hücre kişide vardır. Tarama çizgileri (kymographs temsil edilen) uyumlu ve membran piksel özetlenebilir. O zaman, ACFs ve CCFs yoğunluğu izler Fı(t)hesaplanır. ACFs kırmızı ve yeşil temsil edilir. CCF mavi renkle gösterilir. (C) çapraz korelasyon N & B (ccN & B) Alım üç boyutlu (x-y-time) görüntü yığınında sonuçlanır. Bir yatırım getirisi hücre-hücre kişi seçilir. Sonra kanal ve çapraz korelasyon parlaklık (ε1, ε2ve Bcc) her hücre-hücre iletişim piksel değerleri hesaplanır. Sonuçları daha sonra tüm seçili pikseller havuzu çubuk görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

2. numune hazırlama: Pozitif kontrol çapraz korelasyon deneyler ve Homo-Dimer yapı parlaklık analizi için

  1. Odası, 35 mm cam alt yemekleri transfection önce bir gün sayma bir hücre ile sayılır 600.000 HEK 293T hücreleri tohum. 37 ° c, % 5 CO2 tam DMEM Orta hücre kültür (bkz. Adım 1.1) başka bir gün için.
  2. Transfect ~ 250 içeren hücreleri ng plazmid DNA üretici yönergelerine uygun. Pozitif çapraz korelasyon kontrol için bir floresan protein membran bağlantılı hetero-dimer, faiz protein FPs için karşılık gelen Örneğin, en düşük myr-palm-mCherry-mEGFP veya en düşük myr-palm-mCardinal-mEYFP12 kodlama bir plazmid kullanın. Parlaklık analizini ayarlamak için hem bir membran bağlantılı FP monomer ve homo-dimer faiz, Örneğin, en düşük myr-palm-mEYFP ve en düşük myr-palm-mEYFP-mEYFP protein erimiş FPs karşılık gelen kodlama plazmid parlaklık ayarı için kullanmak APLP1-mEYFP12.
  3. Kültür hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 tam DMEM Orta (bkz. Adım 1.1) başka bir gün için.

3. confocal lazer mikroskobu tarama: Kurulum ve odak hacim kalibrasyon

Not: Aşağıdaki protokol ile mEGFP/mEYFP ve mCherry/mCardinal confocal mikroskop Bu çalışmada kullanılan tarama Lazer üzerinde yapılan deneyler için yazılmıştır. Optik Kurulum, yazılım ayarları (lazer çizgiler, Dikroik ayna, filtreler) ve kalibrasyon boya seçimi diğer FPs ve mikroskop kurulumları için değiştirilebilir.

  1. Mikroskop ve lazerler en az bir saat önce lazer istikrar ve sıcaklık denge sağlamak için deney açın.
  2. Su veya PBS 10-50 nM aralığında konsantrasyonları ile odak sesi ayarlamak için uygun suda çözünen floresan boya solüsyonu (örnekler için Malzemeler tablo görmek) 100-200 µL hazırlayın.
  3. Boya solüsyonu bir temiz 35 mm cam alt tabak üzerinde #1.5, 0.16-0,19 kalınlığına sahip Yani, yerleştirin mm.
    Not: İdeal olarak, yüksek performanslı bir düşük kalınlık toleransı, Örneğin, 0,170 ± 0.005 mm, en iyi yaka yüzük düzeltme (adım 3.6) izin sahip cam ile yemekler kullanın. Daha sonra aşağıdaki deneyler için kullanılan çanak aynı tür kullanmak önemlidir.
  4. Çözüm içine odaklama sağlamak için doğrudan amaç (tercihen, su daldırma, NA 1.2 ile) üzerinde boya solüsyon içeren çanak yerleştirin. Alternatif olarak, çanak içine (Örneğin, 10-20 µm çanak alt yukarıda) örnek örnek sahibi ve odak yerleştirin.
    Not: Biz petrol hedefleri nedeniyle derin sulu örnekleri netleme yaparken elde zayıf sinyal kullanma önerilmez.
  5. Uyarma ve emisyon yolu ayarla, Örneğin, seçmek 488 nm lazer, 488/561 nm Dikroik ayna, algılama penceresi 499-552 nm ve bir iğne deliği boyutu 1 havadar birimi (AU). İğne deliği boyutu çapraz korelasyon ölçümlerde kullanılan ile aynı olduğundan emin olun.
  6. İğne deliği (pinhole ayarlama) pozisyon ve sayısı oranı en üst düzeye çıkarmak için objektif yaka halka ayarlayın. En fazla sayısı oranı gelinceye bu amaç için yaka halka çevir.
    Not: Yaka yüzük düzeltme için kullanılan kapak cam kalınlığı belirli hesapları. Sayısı oranı, yanien üst düzeye çıkarma., mümkün olduğunca molekül başına kadar fotonlar toplama, ölçümlerin sinyal-gürültü oranı (SNR) en üst düzeye çıkarmak çok önemlidir.
  7. Aynı lazer gücü olarak çapraz korelasyon kullanılan nokta FCS ölçümleri (Örneğin, 6 farklı yerlerde, her 1 µs Işınma Zamanı veya daha az örnek 10 s, yani, 2.5 min Toplam süre, 15 tekrarına oluşan ölçüler) bir dizi yapmak ölçümleri (~ %1, Yani, ~ 1-2 µW).
  8. Bir üçlü katkısı (denklem 6) verileri de dahil olmak üzere üç boyutlu difüzyon modeli uygun.
    Not: Genellikle, elde edilen difüzyon kez 30 µs ve yapısı faktörü çevresinde 4-8.
  9. Bel hesaplamak w0 ölçülen ortalama difüzyon zaman ve oda sıcaklığı25 denklem 5 göre kullanılan boya difüzyon katsayısı için yayımlanmış değerleri ile. 200-250 nm tipik değerlerdir.
  10. Kalibrasyon rutin (adım 3.4-3,9) farklı bir floresan boya ile ikinci bir algılama kanalı için gerekirse tekrar (Örneğin, 561 nm uyarma ve algılama arasındaki 570 nm ve 695 nm). O was koymak için ilk algılama kanal ve iğne deliği pozisyon tutun.
  11. Moleküler parlaklık (denklem 8) üzerinden kalibrasyon ölçümleri hesaplamak ve elde edilen değerleri saklayın.
    Not: Kullanılan kurulum için tipik değerler şunlardır: ~8-10 kHz/molekül (MOL) 1.8 µW 488 nm uyarma güç için. Her zamanki gibi değerleri amacı, hatalı kurulum veya azaltılmış lazer çıktı hizalaması üzerinde kir gösteriyor olabilir daha düşük. Kontrol ve lazer çıkış güçleri düzenli olarak bir güç ölçeri kullanmayı amaç, saklayın. Farklı kurulumları karşılaştırma için moleküler parlaklık uyarma lazer gücü ile normalleştirilmiş mikroskop performansını değerlendirmek için en anlamlı parametresidir.

4. tarama floresans çapraz korelasyon spektroskopisi: satın alma

Not: Aşağıdaki protokol için ('yeşil') mEGFP/mEYFP ile gerçekleştirilen deneyler ve mCherry/Bu çalışmada kullanılan mCardinal ('kırmızı') lazer tarama confocal mikroskop üzerinde bulunmakta. Optik Kurulum ve yazılım ayarları (lazer çizgiler, Dikroik ayna, filtreler) diğer FPs ya da mikroskop kurulumları için farklı olabilir.

  1. Optik yol, Örneğin, 488 nm ve 561 nm uyarma ve 488/561 nm Dikroik ayna, 1 iğne deliği kurmak AU 488 nm uyarma için. Spektral çapraz-hadis önlemek için heyecanlandırmak ve mEGFP/mEYFP (488 nm uyarma, yeşil kanal) ve mCherry tespit için iki ayrı parça seçin / mCardinal (561 nm uyarma, kırmızı kanal) sırayla ve seçmek her satırı anahtarı izler. Algılama için uygun filtreler kanalları, Örneğin, 499-552 nm yeşil kanal ve 570-695 nm kırmızı kanal için kullanın.
  2. Alternanslı uyarma mümkün değilse, uygun filtre ayarları kırmızı kanalı için spektral çapraz-hadis en aza indirmek için kullanın (yani tespit mCherry/mCardinal floresan değil aşağıda 600 nm). Bu kırmızı kanalı tespit fotonlar azaltmak ve böylece SNR azaltmak.
  3. Örnek kutusunda karışık hücreleri içeren çanak yerleştirin. Sıcaklık denge sağlamak ve odak kayması azaltmak için en az 10 dakika bekleyin.
  4. İletim bulun menüde ışık kullanarak hücreleri üzerinde odaklanın.
  5. Bir çift bir 'red' ve 'yeşil' hücre birbirine temas arayın. Pozitif çapraz korelasyon veya homo-dimer için parlaklık kontrolü (bakınız Bölüm 2), at PM kanalları veya ilgili homo-dimer sinyal floresans yayan bir izole hücre için arama yapın.
    Not: hangi çapraz korelasyon26azaltabilir hücreler için önceden beyazlatma, önlemek arama sırasında (kritik) simge durumuna küçült örnek pozlama. Bu nedenle, en hızlı inceden inceye gözden geçirmek hız ve düşük lazer gücü inceden inceye gözden geçirmek. Dedektör doygunluk kuvvetle ifade hücreleri görüntüleme sırasında önlemek için tümleştirme moduarayın. Ancak, pozlandırmayı en aza indirmek için daha düşük lazer gücü tarama foton sayma modunda mümkündür.
  6. Bir tarama yolu dikey hücre-hücre ilgili kişi (veya tek bir hücre PM pozitif çapraz korelasyon veya homo-dimer parlaklık kontrolü için) seçin rakamlar 1B ve 2Agösterildiği gibi Kırp düğmesini kullanarak.
    Not: Bazı büyük mikroskoplar rasgele tarama yön izin vermez. Bu durumda, bir yönlendirme tarama yönü dikey hücre-hücre kişilerle yer olmak zorunda.
  7. Bir piksel boyutu 50-200 nm ve Tarama moduseçin satır elde etmek için zoom . Çerçeve boyutu 128 × 1 piksel olarak ayarlayın.
    Not: Tipik piksel boyutudur 160 nm, yaklaşık 20 µm tarama uzunluğa karşılık gelen.
  8. Hızlı tarama maksimum izin verilen, Örneğin, her satırda 472.73 µs ayarlanmış.@değeri uygun biçimde.
    Not: bir alternatif uyarma düzeni için bu 954.45 µs inceden inceye gözden geçirmek zaman, yani ~ 1000 taramalar/s kullanılan kurulumunu karşılık gelir. İnceden inceye gözden geçirmek hız faiz protein difüzyon katsayısı bağlı olarak ayarlanabilir. Membran bağlantılı proteinler için tipik difüzyon kere are çevrede 10-20 Bayan inceden inceye gözden geçirmek zaman difüzyon kez en az on kat daha küçük olmalıdır. Alt tarama hızları daha güçlü photobleaching neden ve daha düşük aydınlatma gücü gerektirir. Alternatif olarak, bir 5 ms, her tarama aralığı Saat serisi alt menüde kullanarak çok yavaş akışkanın kompleksleri için arasında bir duraklama, Örneğin, empoze edebilirsiniz.
  9. Uygun lazer gücü, Örneğin, ~ 1-2 µW 488 için seçin nm ve ~ 5-10 µW 561 nm uyarma için.
    Not: Daha yüksek lazer gücü SNR artırmak, ancak photobleaching artırır. Bu nedenle, öyle ki photobleaching ilk sayımı oranı % 50'den az lazer güçler seçilmelidir.
  10. Döngüleri 100.000-500, 000'e ayarlayın.
    Not: Sayı taranmasını, Yani, ölçüm süresi farklı olabilir: uzun ölçüm süreleri SNR artıracak ve yavaş yavaş moleküllerin difüzyon için daha uygun olabilir, ancak, hareket hücreleri ve photobleaching sınırı maksimal ölçüm zaman. Burada sunulan verileri düzenli olarak ~ 3-6 için elde min, Yani, 200.000-400.000 satırı tarar.
  11. Dedektörleri foton sayma moduna ayarlayın. Deney başlamak satın başlatmak için tuşuna basın. Başka bir hücreye ölçmek için 4.5-4.11 adımları yineleyin.
    Not: Bu örnek, farklı ifade düzeyde başına 10-15 hücre ölçmek için tavsiye edilir. (Kritik) Dedektör doygunluğu yüksek ifade düzeylerde kaçının. En fazla sayısı oranı ~ 1 MHz aşmaması gerekir.
  12. Parlaklık analiz oligomeric Birleşik belirlemek için yapılır, homo-dimer Parlaklık kalibrasyon ölçümlerine göre değiştirilmiş adımları 4.1-4.11 gerçekleştirin: her floresan protein homo-dimer (içinde ayrı olarak izole hücreler kullanılarak hazırlanan, ölçmek Bölüm 2 iletişim kuralı) ve sadece bir spektral kanalda ölçümleri gerçekleştirmek.

5. tarama floresans çapraz korelasyon spektroskopisi: Veri analizi

Not: Ayrıntılı önceki makaleler12,15olarak tanımlanan çözümleme yordamı uygulaması aşağıdaki iletişim kuralı izler. Yazılım kodu yazarlar için istek üzerine mevcuttur.

  1. Ham veri (Örneğin, Chi) dosyalarını bir RGB TIFF görüntü ham veri formatında dışa aktarın. Bu dosya bir kymograph yeşil ile içerir ve kırmızı kanal verilerini, kanalda G ve R görüntü, sırasıyla olarak adlandırdığı.
  2. TIFF dosyasının uygun analiz yazılımı ile almak ve çözümlemeyi gerçekleştirmek için devam edin.
    Not: Aşağıdaki adımları (adım 5.3-5.7) her kanal için ayrı ayrı uygulanır:
  3. Satırları bir segment-wise veya hareketli ortalama ile 500-1000 satır bloklarını gerçekleştirerek hizalayın. Yani, her blok maksimum sayısı oranı, piksel bulunduğu membran konumu belirlemek. Tüm blokları aynı yanal konumuna kaydırmak. Bu yordamı hücre-hücre kişinin, Örneğin, hücre hareketi nedeniyle yanal öteleme düzeltir.
  4. Zaman ekseni boyunca tüm hizalanmış satırları toplamak ve Gauss fonksiyonu ortalama yoğunluğu profile uyuyor. Varlığında önemli hücre içi arka plan, bir Gauss ile sigmoid işlevini kullanın. Membran için ±2.5σ membran konumu ve her satırdaki her zaman noktası (Yani, her satır tarama için) bir tek floresans sinyal değerini elde etme bu piksel yoğunluğu toplamı içinde tüm pikseller olarak karşılık gelen piksel tanımlayın.
  5. Gerekirse (Örneğin, arka plan > membran sinyal yüzde 10'u), 1000 satırları bloklar halinde membran floresans üzerinden (piksel biriminde) 2.5σ çarpımı sitoplazma içinde ortalama piksel yoğunluğu çıkararak arka plan düzeltme uygulama. Parlak hücre içi veziküller artalan pikselleri seçerken kaçının.
  6. Photobleaching gözlem yapılırsa, beyazlatma düzeltme uygulama. Bu nedenle, membran floresans zaman serisi bir çift Üstel fonksiyon ile uygun ve uygun düzeltmeyi formül, denklem 116uygulayın.
    Not: Alternatif olarak, uygulanan27Fourier dayalı spektrum düzeltme düzenleri olabilir. (Kritik) İçin düzeltilmiş değil ama photobleaching varsa, CFs ciddi biçimde bozulabilir ve parametre tahminleri kesinlikle önyargılı (Örneğin, Şekil 5Ebakın).
  7. ACFs ve CCFs denklemler 2 ve 3 kullanımı, Örneğin, bir çoklu-tau algoritması28göre hesaplar. Analiz'in güvenilirliğini artırmak ve eserler önlemek için 10-20 eşit segmentler toplam ölçüm için hesaplamalar yapın. Floresans saat serisi ve CFs her segmentte incelemek ve açıkça bozuk kesimleri ( Şekil 4A- 4 Dörneklere bakın) kaldırın. Tüm kesimleri uğramayan ortalama.
    Not: Bu yordam veri29öznel bir önyargı önlemek için otomatik olarak. Çok kararsız ölçülerini birçok kısa segmentleri olmasına yardımcı olabilir. Ancak, bir kesimin uzunluğu hala en az üç büyüklük önlemek için difüzyon zaman yukarıda olmalıdır istatistiksel hataları29,30,17undersampling.
  8. Bir iki boyutlu difüzyon modeli, denklem 4, elde edilen CFs için uygun. Bu nedenle, yapı faktör kalibrasyon ölçüm (iletişim kuralı Bölüm 3) elde edilen değere düzeltmek. Uygun doğruluğunu ağırlıklı bir uyum birden çok tau algoritma elde edilen her veri noktasının istatistiksel ağırlık kullanarak gerçekleştirerek geliştirilebilir.
  9. Denklem 7 göre kalibre edilmiş bel kullanarak difüzyon katsayısını hesaplar.
  10. Moleküler parlaklık ortalama floresans yoğunluğu her kanaldaki parçacıklar, denklem 8 ilgili sayısına bölünmesi ile hesaplayın. Her kanaldaki kararlı parlaklık değeri karşılık gelen monomeric başvuru hesabı olmayan floresan FPs23alarak oligomeric durumu elde etmek için Ortalama parlaklık tarafından normalleştirmek. Bu amaçla, floresan FPs23kısmını hesaplamak için tek renk analiz ortalama homo-dimer parlaklık değerlerini belirler.
  11. Göreli çapraz korelasyon denklem 9 göre hesaplar.

6. çapraz korelasyon numarası ve parlaklık: Dedektör kalibrasyon

Not: Aşağıdaki iletişim kuralı ile ilgili nasıl algılama sistemi kalibre için genel bir kılavuz sağlar. Bu yordamı analog algılama sistemleri için zorunludur, ancak gerçek foton sayım dedektörleri kullanıldığında kesinlikle gerekli değildir.

  1. 35-mm cam alt çanak üzerinde uygun suda çözünen boya solüsyonu (örnekler için bkz: Tablo reçetesi ) kuru. Buna göre optik yol ayarla Yani, 488 veya 561 nm uyarma ve algılama 499-552 nm veya 570-695 nm, anılan sıraya göre.
    Not: Alternatif olarak, bir yansıtıcı metal yüzey kuru boya solüsyonu yerine doğrudan hedefi üzerine metal parçası yerleştirerek kullanılabilir.
  2. Bölgelerde farklı boya konsantrasyonları ile veya farklı lazer gücü, tek renk N & B ölçümleri gerçekleştirmek. Bu nedenle, 300 piksel boyutunu elde etmek için Zoom kullanın nm, uygun piksel Işınma Zamanı, Örneğin, 25 µs ve döngüleri için 100-200 kare ayarlanmasý hız inceden inceye gözden geçirmek .
  3. Foton sayma (veya ölçümleri ile analog algılama gerçekleştirilirse analog moda ) dedektörleri getirin ve Deney başlamak satın başlatmak için basın. Ölçüm sıfır uyarma güç yoğunluğu uzaklığı belirlemek için gerçekleştirin.
  4. Piksel varyans için tüm ölçülen piksel piksel yoğunluğu bir fonksiyonu olarak arsa ve bu veri doğrusal bir uyum gerçekleştirmek. Belirlemek olarak doğrusal Sığdır yamaç S. Y-S ve Denklem 14 göre belirlenen yoğunluğu ofset kullanarak kesme noktası, üzerinden okuma gürültü hesaplayın.

7. çapraz korelasyon numarası ve parlaklık: satın alma

  1. SFCCS Alım Protokolü 4.1-4.4 adımlarını izleyin.
  2. Kırpma 512 × 128 piksel hücre-hücre kişi (veya homo-dimer parlaklık kontrolü için izole PM) etrafında bir çerçeve seçmek için kullanın ve bir piksel boyutu 50-100 Nm elde etmek için Zoom .
  3. Tarama hızı uygun piksel Işınma Zamanı, Örneğin, 6.3 µs ayarlamak için kullanın.
    Not: N & B, piksel Işınma Zamanı faiz protein difüzyon zaman daha çok daha küçük olmalıdır. Bir alternatif uyarma düzeni tercih edilirse, Örneğin, geçiş her çizgi parçaları, iki parça arasındaki zaman protein ilgi difüzyon zaman daha küçük olmalıdır. Aksi takdirde tespit çapraz korelasyon azalır.
  4. Döngüleri 100-200 kare için ayarlayın.
    Not: Daha yüksek bir kare numarası SNR artıracak, ancak, toplam ölçüm süresi hücre hareketi sınırlayabilir. İnceden inceye gözden geçirmek zaman kare başına faiz protein difüzyon zaman daha yüksek olmalıdır. Aksi takdirde belirgin parlaklık azalır, Yani, parçacıklar hareketsiz olarak görünmektedir. Çok yavaş akışkanın kompleksleri için Duraklat, Örneğin, 2 s, arasında çerçeve aralığı Saat serisi alt kullanma empoze.
  5. Lazer gücü uygun değerlere ayarla (tipik değerlerdir ~ 1-2 µW 488 için nm ve ~ 5-10 µW 561 nm uyarma için).
    Not: Daha yüksek lazer gücü daha yüksek parlaklık ve geliştirilmiş SNR, aynı zamanda gelişmiş photobleaching yol açar. Lazer gücü en az ~ 1 kHz algılanan bir parlaklık elde etmek için yüksek olmalıdır/MOL ama daha fazla % 10-20 photobleaching önlemek için düşük tutulur. MEGFP/mEYFP veya mCherry/mCardinal, daha az % 10 photobleaching için genellikle elde edilir.
  6. Dedektörleri foton sayma (veya ölçümleri ile analog algılama gerçekleştirilirse örneksel modu ) olarak ayarlayın. Deney başlamak satın başlatmak için tuşuna basın.
  7. Foton sayısı oranı değerlendirin. Hücre-hücre iletişim piksel sayısı oranları 1 MHz aşarsa, lazer güç veya select ifade düzeyi düşük hücrelerle azaltın. 7.2-7,7 adımları yineleyin. hücreleri sonraki çift ölçmek için. Bu deney farklı ifade düzeylerde başına 10-15 hücre ölçmek için tavsiye edilir.
  8. Parlaklık çözümleme Oligomerizasyonda ölçmek için yapılır, homo-dimer Parlaklık kalibrasyon ölçümlerine göre değiştirilmiş adımları 7.1-7,7 gerçekleştirin: her floresan protein homo-dimer (içinde ayrı olarak izole hücreler kullanılarak hazırlanan, ölçmek Bölüm 2 iletişim kuralı) ve sadece bir spektral kanalda ölçümleri gerçekleştirmek.

8. çapraz korelasyon numarası ve parlaklık: veri analizi

Not: Aşağıdaki iletişim kuralı yukarıda açıklanan çözümleme yordamı12,31izler. Yazılım kodu istek üzerine yazarlardan da.

  1. Ham veri alma (Örneğin, Chi dosyaları ithal Bioformats32 paketi kullanarak). Tüm çerçeveleri ortalama ve hücre-hücre kişi ilgi (ROI) bir bölge seçin.
  2. Bir resim hizalama algoritması33, kayma korelasyon ROIs her iki kanal ortalama olarak rasgele yanal çeviriler için sonraki kare arasında en üst düzeye çıkarma tarafından Örneğin, gerçekleştirin. Bu yordamı hücrelerin yanal hareketi doğru olacaktır.
  3. Örneğin, artık cep hareketi ve arka plan ağartma ', yabancı uzun ömürlü dalgalanmaları azaltmak için bir yük vagonu filtre22 uygulanır. Alternatif olarak, detrending yöntemi photobleaching34için düzeltmek için uygulanabilir.
    Not: Eğer hiçbir segment-wise analiz veya detrending uygulanır, belirgin parlaklık büyük ölçüde fazla hesaplamış olabilir.
    1. Denklemler 10, 11 ve 15 her segmentte pixel-wise göre kanal ve çapraz korelasyon parlaklık değerlerini hesaplamak ve sürgülü kesimleri, Örneğin, 8-15 kare (Örneğin, kare 1-8, 2 ile 9 ve benzeri) tanımlayın. Dedektörleri gerçek foton dedektörler sayma değilseniz, kalibre edilmiş dedektörü parametreleri parlaklık, Yani, kullanım denklemler 12 ve 13 yerine hesaplanırken dikkate alın.
      Not: 8-15 kare kesimleri içinde parlaklık değer hesaplama % 10-20 küçümseme mutlak parlaklık ve parçacık sayı % 10-20 tahmindi yol açar. Yine de, parlaklık oranları (Örneğin, monomer parlaklık dimer) etkilenmez, kesim uzunluğu Analizi (veri gösterilmez) sabit tutulur sürece. İstatistiksel hata için belirli segment uzunluğu simülasyonları ile belirlenecek ve böylece için düzeltilmiş.
    2. Elde edilen parlaklık değerlerini pixel-wise üzerinden tüm kesimleri ortalama. Bu adımda, bir ortalama en yüksek ve en düşük % 5 segment parlaklık değerleri kaldırmak veya bir hücre içi vezikül veya toplamak bu geçici mevcut yoğunluğu nedeniyle, Örneğin, içinde açık bir bozulma göstermek kesimleri hariç piksel.
  4. Piksel parlaklık değerlerini piksel yoğunluğu bir fonksiyonu olarak arsa ve hücre-hücre iletişim için karşılık gelen nüfus piksel seçin. Arka plan pikseller çok düşük yoğunluk değerleri olacaktır. Bu noktada, en yüksek sayımı oranı yeniden değerlendirmek. Piksel sayısı oranları birbirine etkileri önlemek için 1 MHz yukarıda ile hariç.
  5. Kanal ve çapraz korelasyon parlaklık çubuk grafikler seçilen hücre-hücre iletişim piksel oluşturun ve yatırım getirisi ortalama parlaklık değerlerini elde etmek. Ortalama kanal parlaklık değerine karşılık gelen monomeric başvuru hesabı olmayan floresan FPs23alarak oligomeric durumu elde etmek için Ortalama parlaklık tarafından normalleştirmek. Bu nedenle, tek renk analiz floresan FPs23kısmını hesaplamak için Ortalama homo-dimer parlaklık değerlerini belirler.
  6. Gösterim amacıyla, kanal ve çapraz korelasyon parlaklık haritalar çizmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İlk test protein-protein etkileşim tahlil için Yani, hücre sFCCS/ccN & B ölçümleri (Şekil 1) tarafından takip hayalice farklı floresan proteinler ifade karıştırma gerçekleştirilmesi beklenen değil protein üzerinde (Yani, bir negatif kontrol) hücre-hücre iletişim etkileşim. Bu nedenle, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (en düşük myr-palm-mEYFP) veya - mCardinal ifade HEK 293T hücreleri karıştırıldı ve sFCCS hücre-hücre iletişim (Şekil 2A) arasında gerçekleştirildi. İdeal bir durumda, floresans sinyal her kanaldaki PM proteinlerin diffusive hareket sonucu olarak istikrarlı bir ortalaması etrafındaki dalgalanma gerekiyordu ve proteinler arasında odak birim sayısı istatistiksel varyasyonları. Proteinler, değil etkileşim için her iki kanal dalgalanmalar birbirinden bağımsızdır ve böylece, spektral çapraz korelasyon sıfır dalgalanma bekleniyor. Gerçekten de sıfıra yakın göreli bir çapraz korelasyon tipik ölçümlerde (Şekil 2C) gözlenmiştir. ACFs ~ 10-20 karakteristik çürüme zamanlarını göster ms (Dmyr-palm , ortalama olarak, karşılık gelen 1.3 ± 0,3 µm2/s = (± SD, yani n = 20 hücre)), difüzyon myr-palm-mEYFP ve - mCardinal için pm, Örneğin, Dbeklendiği gibi en düşük myr-palm photobleaching (sıkı bağlamak)35deneyler sonra floresans kurtarma üzerinde dayalı 0,88 ± 0,11 µm2/s (ortalama ± SEM) =. Özellikle, bu oldukça yavaş dinamiklerin bir alternatif uyarma düzeni, her satır, her iki kanal sinyalleri arasındaki ~0.5 ms gecikme neden ama baskılayarak sadece yeşil ve sadece kırmızı uyarma ve algılama geçiş Yani, kullanılsın Spektral çapraz-hadis. Üstünde ortalama, bir çok düşük ortalama çapraz korelasyon 0,08 ± 0.10 (± SD, yani n = 17 hücre) (Şekil 3E), negatif kontrol için beklendiği gibi elde edildi.

Ardından, pozitif çapraz korelasyon denetim optik Kurulumu'ndaki maksimum olası çapraz-korelasyon ayarlamak için kullanıldı. Bu nedenle, HEK 293T hücrelerde membran bağlantılı hetero-dimer en düşük myr-palm-mCardinal-mEYFP ifade edildi ve sFCCS ölçümleri tek hücreleri (Şekil 2B) gerçekleştirilmiştir. Elde edilen CCFs olumlu genlikleri vardı ve ACFs, yine ~ 10-20 gibi benzer çürüme kez gösterdi ms (Şekil 2D). Üstünde ortalama göreli çapraz korelasyon 0,96 ± 0.18 (± SD, yani n = 14 hücre) için pozitif denetimi (Şekil 3E) ölçüldü.

Figure 2
Resim 2 . Floresans spektroskopisi çapraz korelasyon kontrol ölçümleri tarama. (A)karışık HEK 293T temsilcisi görüntülerini trans etkileşimler için negatif kontrol olarak ifade en düşük myr-palm-mEYFP /-mCardinal hücreleri. Sarý ok sFCCS yolu tarama gösterir. Ölçek çubukları görüntülerdir 5 µm. (B) temsilcisi en düşük myr-palm-mCardinal-mEYFP heteroseksüel-dimer ifade HEK 293T hücrelerinin (sol: yeşil kanal: kırmızı kanalı) pozitif çapraz korelasyon kontrol olarak. Sarý ok sFCCS yolu tarama gösterir. Ölçek çubukları var. 5 µm (C) temsilcisi CFs (yeşil: ACF yeşil kanal (mEYFP), kırmızı: kırmızı kanalı (mCardinal), mavi ACF: CCF) negatif kontrol için sFCCS ölçümlerde elde edilen. Düz çizgiler göster uygun bir iki boyutlu difüzyon modelinin CFs. için (D) temsilcisi CFs (yeşil: ACF yeşil kanal (mEYFP), kırmızı: kırmızı kanalı (mCardinal), mavi ACF: CCF) pozitif kontrol sFCCS ölçümü elde. Düz çizgiler göstermek uygun bir iki boyutlu difüzyon modelinin CFs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu tahlil uygunluğu sonra biyolojik olarak uygun bir bağlamda amiloid habercisi gibi protein 1 (APLP1), bir tür trans etkileşimleri sondalama tarafından araştırıldı ben nöronal yapışma hareket için önerilen transmembran protein reseptör. Bu amaç için APLP1 mEYFP için erimiş veya mCardinal HEK 293T hücrelerde ifade edildi. Parazit ekstraselüler bağlayıcı etki alanlarıyla dışlamak için FPs erimiş C-terminus, APLP1, Yani, hücre içi etki için (bkz. Şekil 1A). Sonra sFCCS ölçümleri hücre-hücre kişiler arasında APLP1-mEYFP ve APLP1-mCardinal hücreleri (Şekil 3A) ifade, ACFs ve CCFs (Şekil 3C) APLP1 difüzyon hakkında bilgi sağlayan sonuçlanan üzerinde gerçekleştirilen ve etkileşimleri. Bir pozitif göreli çapraz korelasyon 0,45 ± 0.21 (± SD, yani n = 17 hücre) gözlenen, Yani, önemli ölçüde olumsuz kontrol (Şekil 3E) daha büyük bir değer. İlginçtir, ortalama göreli çapraz korelasyon yalnızca kısmi trans bağlama gösteren pozitif kontrol (Şekil 3E), daha düşük.

Son olarak, tahlil çinko iyonları12,31bağlama gelişmiş APLP1 trans kolaylaştırmak göstermek için kullanıldı. SFCCS APLP1 kümeleri, (APLP1-mEYFP ve APLP1-mCardinal ve hızla çinko iyonlarının varlığında, Şekil 3Boluşturan güçlü bir ortak yerelleştirme ile karakterize) hücre-hücre kişiler arasında ölçümler elde CFs güçlü gösterdi büyük çürüme kez ve titreşimler büyük lag (Şekil 3D) kere, belirgin olarak azaltılmış dinamiği. Yine de, kısa gecikme zamanlarda genlikleri analizini göreli çapraz korelasyon 0,8 ± 0,3 önemli bir artış ortaya (± SD, yani n = 17 hücre), Yani, kalibre edilmiş maksimum (Şekil 3E) ~ %80. Bu böyle yavaş dynamics (bkz. Şekil 3D) korelasyon eğriler sonlu ölçüm süresi sırasında sözde parçacık inducing tespit edilebilir diffusive olayları sınırlı sayıda nedeniyle şiddetli çarpıtmalar neden beklenen bir şey gürültü30. Doğru bir miktar için maksimum gecikme süresini (30,17 daha fazla bilgi için bkz: önceki gözden geçirme) difüzyon zaman en az 3 büyüklük yukarıda olmalıdır.

SFCCS APLP1 veri üzerinden moleküler parlaklık daha fazla, monomeric başvuru her kanal olarak en düşük myr-palm negatif kontrol kullanarak ve floresan proteinler23miktarı için düzeltme analiz edildi. Çinko iyon Ayrıca, moleküler parlaklık önemli ölçüde arttı küçük reaksiyonlar (~ dimer) ~ 10-50 / oluşan daha büyük multimers için monomerleri her hücreyi (Şekil 3F). Böylece, ortalama olarak, ~ 100 APLP1 kadar monomerleri hücre-hücre kavşak tüm protein küme içinde bulunur.

Figure 3
Şekil 3 . Floresans çapraz korelasyon spektroskopisi ölçümleri hücre-hücre kişiler, APLP1 etkileşimlerin tarama. (A, B) APLP1-mEYFP (yeşil) ifade HEK 293T hücrelerinin temsilcisi görüntüleri / APLP1-mCardinal (kırmızı)(a)önce ve sonra 30 dk çinko iyon tedavi (B, farklı hücre). Sarı oklar sFCCS yolları tarama gösterir. Ölçek çubukları var. 5 µm (C, D) temsilcisi CFs (yeşil: ACFs yeşil kanal (mEYFP), kırmızı: kırmızı kanalı (mCardinal), mavi ACFs: CCFs) (C) APLP1 çinko iyon tedavi öncesi ve (D) sFCCS ölçülerini sonra elde Çinko iyon tedavi. Devamsızlık ve varlığı çinko iyonları ve pozitif negatif kontrol ("olumsuz"), sFCCS analizinden uygun göreli çapraz korelasyon CFs. (E) kutu araziler için bir iki boyutlu difüzyon modelinin APLP1 elde sağlam satırları göster çapraz korelasyon denetim ("true"). Medyan değerleri ve en az ve en fazla değerler arasında değişen bıyık araziler göster. Devamsızlık ve varlığı çinko iyonları APLP1 sFCCS Analizi hücre-hücre kişiler, elde edilen normalleştirilmiş moleküler parlaklık yeşil kanal (mEYFP) (F) kutu çizer. En düşük myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-HEK 293T hücrelerde ifade altında aynı koşullar23ölçülen dimer sFCS ölçümleri dayalı olmayan floresan mEYFP için parlaklık değerlerini düzeltildi. Medyan değerleri ve en az ve en fazla değerler arasında değişen bıyık araziler göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Defa gösterilen tüm ölçümler için ek, sahte dalgalanmalar meydana gelen düzeltildi, göz önünde değil sFCCS çözümlemesi zorlu cekti yapmak hücreleri içinde. Hiçbir düzeltme düzenleri uygulandığında negatif kontrol için örneğin, bunlar bir yanlış pozitif çapraz korelasyon, neden olabilir. Ciddi CFs deforme edebilirsiniz iki önemli işlem vardır: 1) bazı kaydedilmiş floresans içinde sinyal geçici fokal birimi girin veya membran dinamikleri, Örneğin, z-yönde drift ve 2 yavaş hücre içi veziküller nedeniyle) photobleaching. Geçici kararsızlıklara tanımlamak için 10-20 eşit büyüklükte kesimleri tam ölçümlerde bölmek ve yoğunluğu zaman serisi ve CFs her segmentte kontrol edin için önerilir. Bu yordamı bir negatif kontrol ölçüm analizinde elde açıkça bozuk kesimleri örneği veren Şekil 4, gösterilmektedir. Geçici PDFMaker (Şekil 4A, yoğunluk izlemeler parçalar 1 ve 2) negatif değerler (Şekil 4B, segment 1) sahip bir CCF neden olabilir veya bir yüksek yanlış pozitif çapraz korelasyon (Şekil 4B, Segment 2). Genellikle, bu tür kararsızlıklara yavaş sinyal varyasyon (Şekil 4A) olarak yoğunluk serisinde görülebilir. Karşılık gelen CFs genellikle sapma güçlü gösteren, Örneğin, daha yüksek genlik ve çok daha yavaş çürüme kez CFs kesimleri, çoğunluğunun gelen ~ ikinci ölçek (bkz. Şekil 4B-4 D). Bu tür parçaları analiz kaldırmak için tavsiye edilir ve ortalama tüm kesimleri uğramayan, Yani, kesimleri tarafından son CFs CFs. çoğu genellikle, sapma değil CFs tarafından bu karakterize hesaplamak için bir grafik görünümde yapılır segmentleri, 2 1) yinelemeli olarak inceleyerek arabirimi) kaldırma açıkça bozuk kesimleri ortalama ve 3) kalan CFs teftiş kesimleri değil kaldırıldı kesimleri Güncellenme Zamanı ortalama CFs ile ilgili. Kısmen bozuk uzun ölçümleri (Şekil 5A), bu yordamı uygulayarak yavaşça (bozuk) çürüyen CFs (Şekil 5B) başarılı bir şekilde düzeltilmiş ve anlamlı korelasyon eğrileri olduğunu gösteren (Şekil 5C) kurtarıldı. Genel olarak, bu düzeltme yordamı automatized29öznel önyargı eğilimli olabilir Kullanıcı tarafından bir görsel denetim kaçınarak, olabilir. Yoğunluğu ile karşılaştırıldığında açıklanan bir eşik parametresi aşan kaldırılır ve tam ölçüm ortalama yoğunluğu karşılaştırıldığında onların yoğunluk dayalı ölçüm küçük depo gözleri değerlendirilme filtreleme yöntemleri36, temel yordam dış parametrelere dayanmaz ve ayrıca küçük kararsızlıklara duyarlıdır.

Photobleaching için telafi etmek için açıklanan matematiksel düzeltme, denklem 1, uygulandı. Genellikle, photobleaching CFs hakim bir üstel çürüme floresan sinyallerini (Şekil 5D), tarafından hangi sonra yanlış pozitif çapraz korelasyon göstermek ve çürüme kez belirlenebilir ~ dk ölçek (tipik eğrisi şekil bkz. Şekil 5'E). Düzeltme yordamı uğramayan CFs (Şekil 5F) kurtarıldı. Belirtildiği, benzer yoğunlukta varyasyonlar tek ölçüler içinde ayrıca PM hareketi, Örneğin, z-drift veya büyük yavaş yavaş hareketli yapılar tarafından kaynaklanabilir. Ancak, benzer üstel bozunmaları tüm ölçüleri görünüyorsa, photobleaching en olası kaynağı olacak. Genel olarak, düzeltme düzenleri birleştirilebilir, Fourier dönüşümü Örneğin, yoğunluk filtresi, CF tabanlı filtreleme ve daha fazla yöntemleri frekans alanı27değişimler yavaş sinyal filtreleme bazlı.

Figure 4
Şekil 4 . Floresans çapraz korelasyon spektroskopisi ölçümleri negatif çapraz korelasyon kontrol tarama segment-wise analizi. (A)floresan yoğunluğu yeşil (F1) ve kırmızı kanal (F2) iki farklı zaman kesimi (her ölçüm ~ 20 20 segmentlerinde analiz edildi s her) olarak elde edilen negatif kontrol ölçümü sFCCS üzerinden. (B) CCFs her birinin 20 parça. CCFs parçalar 1 ve 2 için kırmızı ve turuncu, sırasıyla vurgulanır. (C, D) ACFs her bir segmentin yeşil (C) ve kırmızı (D) Kanal. ACFs parçalar 1 ve 2 için kırmızı ve turuncu, sırasıyla vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Hücre-hücre kişiler için negatif çapraz korelasyon kontrol örneği, floresans çapraz korelasyon spektroskopisi ölçülerde tarama tedirginlikler. (A)tam floresans zaman serisi bir suret ölçüm yeşil (F1) ve kırmızı kanal (F2) için. Katı kırmızı çizgiler her kanaldaki saat serisi çift üstel bir uyum gösterir. (B, C) CFs (yeşil: ACFs yeşil kanal, kırmızı: kırmızı kanal, mavi ACFs: CCFs) 20 parçaları ayrı ayrı birleştiriliyor ve az çarpık ortalama tüm ölçüm veya (C) birleştiriliyor A, (B) hesaplanan gösterilen floresans zaman serisi CFs ~ %80 (yeşil kanal) ve parçaların ~ %50 (kırmızı kanalı). Düz çizgiler uygun bir iki boyutlu difüzyon modeli için verileri temsil eder. (D) tam floresans saat serisi ve çift üstel fit (Kesintisiz kırmızı çizgiler) yeşil (F1) ve kırmızı kanal (F2) önemli ağartma tarafından karakterize ölçü. (E, F) CFs (yeşil: ACFs yeşil kanal, kırmızı: kırmızı kanal, mavi ACFs: CCFs) 20 beyazlatma düzeltme, denklem 1, uygulama tüm ölçüm ve (F) birleştiriliyor D, (E) hesaplanan gösterilen floresans zaman dizi birleştiriliyor ayrı ayrı kesimleri ve ~ % 90'ı (her iki kanal) segmentlerin en azından çarpık CFs ortalama. Düz çizgiler uygun bir iki boyutlu difüzyon modeli için verileri temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

SFCCS tamamlayıcı bir yaklaşım, ccN & B (Şekil 1C) hücre karıştırdıktan sonra protein-protein etkileşimleri algılamak için kullanılabilir. SFCCS, aksine ccN & B protein dinamikleri üzerinde herhangi bir bilgi sağlar, ancak trans etkileşimleri bütün hücre-hücre kişiyle birlikte bir odak düzlem boyunca ölçüm sağlar. APLP1 örnekleri üzerinde ölçümler negatif myr-palm kontrolü yanı sıra, 50 µM ZnCl2işlemden önce ve sonra yapıldı. Bu ölçümler için uzun süreli edinme kez APLP1 kümeleri yavaş dynamics için hesap gerektiren özellikle çinko tedavi iyon örnekleri, hücre hareketleri duyarlıdır. Bu nedenle, bir resim hizalama algoritma hücreleri33yanal hareketi için düzeltmek için uygulanmıştır. Ayrıca, bir yük vagonu filtre22 (8 kare kutu ~ 5 numara s) düşük frekans dalgalanmaları ölçülen sinyallerin kaldırmak için uygulandı. Bu yordamı yerel37 ortalama veya18,34detrending içeren N & B analizinde kullanılan diğer filtreler çok benzer, ancak değiştirilmemiş özgün veriyi saklar, Yani, piksel bağımsız olarak kabul edilir ve hiçbir Ortalama veya çıkarma sinyallerin gerçekleştirilir. Bu yordamı etkili zaman ölçeklerde kutu boyutu22uzun uzun ömürlü dalgalanmaları bastırır. Bu tür veri analizi tüm hücre-hücre iletişim piksel bir çapraz korelasyon parlaklık histogram havuzu tarafından tüm örnekleri için çapraz korelasyon parlaklık değerleri karşılaştırıldı. Çinko iyonları (Şekil 6A ve 6 D), yokluğunda APLP1 için 0.068 ± 0,004 olumlu ortalama Bcc (± SEM, yani n = 18 hücre) gözlenmiştir. (Şekil 6B ve 6E) Çinko iyon eklenmesinden sonra Bcc değeri artış 0,266 ± 0.006 (± SEM, yani n = 19 hücre). Negatif kontrol için (Şekil 6C ve 6F), daha düşük bir ortalama çapraz korelasyon parlaklık algılandı (Bcc 0,022 ± 0,002, ± SEM, demek = n = 26 hücre). APLP1 kompleksleri stoichiometry hücre-hücre kişiler tahmin etmek için APLP1-mEYFP parlaklığını en düşük myr-palm-mEYFP için alınan ortalama değeri kullanarak normalleştirilmiş (i.e., negatif kontrol) ve sigara-floresan miktarına göre düzeltilmiş proteinler23. SFCCS veri ile anlaşma parlaklık dağıtım dimer (Şekil 6G), çinko iyonları, ortalama 2:2 stoichiometry düşündüren yokluğunda karşılık gelen değer etrafında merkezli. Çinko iyon tedaviden sonra normalleştirilmiş parlaklık şiddetle ~ 10'a kadar daha büyük değerler için kaymıştır ~ 60 (Şekil 6H), yani, bir stoichiometries, en az 10:10 veya daha büyük, daha iyi anlaşma ile sFCCS veri.

Figure 6
Şekil 6 . Hücre-hücre kişiler, APLP1 etkileşimlerin çapraz korelasyon numarası ve parlaklık ölçümleri. (A-C) Temsilcisi ccN & B hücre-hücre kişiler olmadan(a)APLP1-mEYFP ve APLP1-mCardinal ifade HEK 293T hücreler arasında kare görüntü ve çinko ile iyonları (B) en düşük myr-palm-mEYFP ve en düşük myr-palm-mCardinal ifade negatif olarak hücreleri çapraz korelasyon denetim (C). Ölçek çubukları var. 5 µm (D-F) çapraz korelasyon parlaklık (Bcc) çubuk grafikler tüm muayene piksel ve hücreleri elde ccN ve hücre-hücre kişiler APLP1 örnekleri (D), çinko-tedavi APLP1'b Analizi örnekleri () E) ve en düşük myr-palm-mEYFP ve en düşük myr-palm-mCardinal (F) içeren örnekler. (G, H) Normalleştirilmiş parlaklık histogramlar APLP1 örnekleri (G: çinko iyonları, Holmadan: çinko iyonları ile) aynı hücre ve Bcchesaplanmasında kullanılan ROIs parlaklık analizinden elde edilen yeşil kanal (mEYFP) için. İç metin g bir büyütme -2 10 için normalleştirilmiş parlaklık aralığını gösterir. En düşük myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-HEK 293T hücrelerde ifade altında aynı koşullar23ölçülen dimer N & B ölçümleri dayalı olmayan floresan mEYFP için parlaklık değerlerini düzeltildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

CcN & B analizi gerçekleştirmek için dedektörler dikkatli kalibrasyonu yapılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan deneysel kurulum için moleküler parlaklık sabit örnekleri (Yani, sayı dalgalanmaları yokluğu) analiz ne zaman böyle bir kalibrasyon için ihtiyaç belirginleşti. Bu durumda, moleküler parlaklık farkı sadece dedektörü gürültüden kaynaklanan beri sıfır denklem 10 göre olacağı tahmin edilmektedir. Ancak, zaman sadece (hareketsiz) arka plan pikseller içeren bir yatırım getirisi analiz (Şekil 7A ve 7B), ~0.1 cts./(MOL x dwell time) olumlu parlaklığını belirlendi. Benzer bir değer gerçekleştirme N elde edildi & B ölçümleri HEK 293T hücre glycosylphosphatidylinositol-değişen mCherry (GPI-mCherry, Şekil 7C) ifade yetki ve ölçülen moleküler parlaklık için extrapolating lazer sıfır lazer güç. Bu etkisi için düzeltmek için dedektör, sistematik bir kalibrasyon daha önce raporlanmış (bkz: Denklem 12)19,20olarak gerçekleştirilen. Bu nedenle varyans dedektör sayısı oranı kurutulmuş floresan boya çözeltisi oluşan bir örneğe bir fonksiyonu olarak ölçülen ve tespit parametrelerden S, Equation 24 ve karanlık sayısı oranı ofset. İkinci sıfır lazer güç yoğunluğu ölçme elde edildi ve oldu, bizim durumumuzda, ihmal edilebilir. Varyans yoğunluğu Arsa karşı doğrusal bir uyum, biz kararlı, denklem 14, bir yamaç S göre 1.1 ve ihmal edilebilir okuma gürültü =. Belirlenen değerleri (S = 1.1, Equation 24 = 0, uzaklık = 0) sonra doğru olarak moleküler parlaklık ve denklemler 12 ve 1319göre sayı hesaplamak için kullanılan. Bir superpoissonian dedektörü gürültü, Yani, ~ %10 daha büyük gürültü gürültü, ateş Poissonian daha da olumlu bir moleküler parlaklık gözlenmesi açıklıyor gerçeğine dayanarak daha ampirik bir düzeltme düzeni alternatif olarak, uygulanabilir sayı dalgalanmaları piksel. Gibi sabit bir parlaklık ofset ve böylece denklem 10 ile hesaplanan tüm parlaklık değerlerden çıkartılır Bu varsayım kullanarak, ~0.1 cts./(MOL x dwell time) böyle piksel cinsinden belirlenen parlaklığını kabul edilebilir. En önemlisi, her ikisi de aynı sonuçları yaklaşımlar yol parlaklık oranları, olabildiğince uzun bir süre hesaplanırken açıklanan Equation 24 ve ofset ihmal edilebilir. Aynı farklı mikroskoplar arasında kayda değer olduğunu dikkatli dedektörü kalibrasyon bireysel her kurulum için gerekliliğini vurgulayarak türü (aynı satıcı, aynı model, GaAsP dedektörleri foton sayım modunda) farklı S değerleri gözlendi.

Parlaklık ölçümlerde dedektörü performansını etkileyen bir başka önemli parametre dedektörü ölü zamanı geldi. Daha önce gösterdiği gibi dedektör ölü zaman algılanan moleküler parlaklık, orta sayısı hızlarında bile önemli ölçüde azaltabilir (yukarıda 102-103 kHz)38. Bu yapay doku önlemek için ölçümler de düşük sayısı oranları gerçekleştirilmesi gereken veya ölü zaman bir seyreltme dizi, Örneğin, EGFP tampon çözelti içinde N & B veya FCS Performans göre ayarlanması. Sonra ölçülen sayısı oranları38kalibre edilmiş ölü zaman kullanılarak düzeltilebilir. Bu çalışmada kullanılan kurulum için N & B sulandırılmış boya solüsyonu kullanarak böyle bir kalibrasyon ~0.5 MHz sayısı oranları ve karşılık gelen bir ölü zaman ~ 6 kadar istikrarlı moleküler parlaklık değerlerini ortaya ns (Şekil 7E). Daha yüksek sayısı hızlarında azalma Böylece ~ 8 kHz sabit parlaklık değerini sonucu önceden yayınlanmış düzeltme formül38, kullanılarak düzeltilebilir/MOL.

Figure 7
Şekil 7 . Dedektör kalibrasyon numarası ve parlaklık analizi için. (A)N & B ölçümleri GPI-mCherry ifade HEK 293T hücrelerinin temsilcisi görüntüden. Bir yatırım getirisi (mavi kesik dikdörtgen) arka planda seçildi. (B) Agösterilen ROI karşılık gelen tüm pikseller piksel parlaklık histogramını. Piksel parlaklık histogram Gauss fonksiyonu ile uygun elde edilen ortalama piksel parlaklık ~0.1 cts./(MOL x dwell time) olduğunu. Veri 25 µs piksel Işınma Zamanı satın alınan. (C) moleküler parlaklık GPI-mCherry HEK 293T hücrelerde ifade N & B analizini elde edilen üç farklı lazer güç (6 hücreler, 561 nm uyarma, 25 µs piksel Işınma Zamanı) ölçülen. Veri ± SD demek gibi görüntülenir Doğrusal regresyon (kırmızı çizgi) 0,11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time) mahsup bir değer sağlar. Bir fonksiyonu olarak piksel varyansını piksel yoğunluğu floresan bir boya kuru bir çözüm N & B ölçümleri dan (D) Arsa (561 heyecanlı nm), havuza alınan örnek farklı bölgelerde birden fazla ölçümlerin tüm piksel. Düz kırmızı çizgiyi 1.1, dedektör kalibrasyon S faktör sağlayan bir eğimi kaynaklanan veri doğrusal bir uyum gösterir. (E) moleküler parlaklık dedektör sayısı oranı, bir fonksiyonu olarak elde edilen seyreltilmiş fluorophore çözümleri N & B ölçümleri (488 heyecanlı nm). Önceden yayınlanmış düzeltme düzeni38 farklı olası değerler dedektörü ölü süre kullanarak uygulandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan deneysel işlemin protein-protein incelenmesi trans etkileşimleri floresans dalgalanma Spektroskopi teknikleri, yani sFCCS ve ccN & b hücre-hücre kişiler sağlar Bu yöntemler floresans dalgalanmaları iki komşu hücrelerin bir ilgili kişi her birini veya diğer füzyon protein ifade faiz protein(s) için erimiş iki hayalice ayrılmış FPs tarafından yayılan bir istatistiksel analize dahil. Trans kompleksleri varlığı içinde komşu PMs proteinlerin Co difüzyon derecesini sondalama tarafından sayılabilir. Numune hazırlama, veri toplama ve Analizi detaylı protokol ek olarak, bu makalede nöronal yapışma protein APLP1 testin başarılı uygulamanın deneysel kanıt sağlar. APLP1 özel, homotipik trans etkileşimleri hücre-hücre kişiler de uğrar göster. Daha fazla, çinko iyonları APLP1 kümeleri için trans etkileşimler multivalent bir platform sağlamak ve böylece, Gelişmiş trans bağlama teşvik hücre-hücre kişileri, oluşumunu desteklemek.

Üzerinde yıkıcı biyokimyasal Yöntemler6dayalı bu tür etkileşimler algılamak için önceki deneyleri aksine sunulan yaklaşım doğrudan canlı hücreler, gerek fiksasyon veya izolasyon-in protein kompleksleri ile gerçekleştirilebilir. Ayrıca, tarafından algılama genetik olarak faiz, aksine önceki nitel deneyleri8,9protein erimiş floresan Proteinlerin moleküler özgüllük ve bilgi sağlar. Farklı perde10 ve floresan uluslara11gibi diğer temel floresans yaklaşımlardan (potansiyel olarak engel ekstraselüler tarafında Yerelleştirilecek floresan etiketleri için bir gereksinim yoktur protein-protein etkileşimleri). Yine de, bu C-terminal FPs hala hücre içi bileşenleri, Örneğin, etkileşimleri sitoiskeleti ile aracılık adaptör protein bağlamaya değiştirebilir belirtmek zorunda. Özellikle, tahlil homo - hem heterotypic etkileşimleri için geçerlidir.

Sunulan testin başarılı bir uygulama birkaç gereksinimleri kayda değer bulunmaktadır. Gerçekleştirilen floresans dalgalanma yöntemleri parlak gerektiren geçici ölçümler ve photostable göre monomeric FPs, hangi birçok kırmızı FPs23için büyük bir sınırlamadır. Sunulan tarama düzeni özellikle uygundur genellikle hücre-hücre etkileşimler söz konusu, transmembran proteinler yavaş dinamikleri soruşturma için olsa bile artık photobleaching hala oluşabilir. Bu nedenle, beyazlatma düzeltmeleri ccN & B, bu tür tedirginlikler en aza indirmek için sFCCS ve yük vagonu filtre için düzeltme düzenleri, Yani, ayrıntılı bir açıklama mevcut. Ayrıca, etkin hücre, yanal hareket gibi diğer sistematik tedirginlikler için düzeltmek sayısal hizalama algoritmaları ele ve geçici kararsızlıklara kaldırmak için yönergeleri sağlar. Büyük böyle kararsızlıklara veziküler taşıma, geçici fokal birimin girdiğiniz faiz protein taşıyan Yani, hücre içi veziküller kaynağıdır. Dava durumda değişen rağmen bu olay genel olarak ciddi veri toplama ve Analizi rahatsız edemez. Ancak, düzeltme algoritmaları uygulama yavaş özellikle diffusive dynamics soruşturma Genişletilmiş ölçüm vardır kez gerekli izin satın alma, kararlılığını geliştirir. Bu bağlamda, diffusive dynamics varlığı yöntemin işe yaraması gerekli bir durumdur çizilmesini olmalı. Çinko iyon örneği APLP1 kümeleme gösterir teknik limitlerini itmek ve doğru bir miktar büyük gürültü nedeniyle temel dinamiklerinin engellemek büyük, çok yavaş protein kompleksleri (D ≈ 0,001 µm2/s) ciddi bir örneği aracılı sınırlı alma zamanı30,17tarafından indüklenen.

Bu bağlamda, sFCS ve süper çözüm yaklaşımları, Örneğin, tarama uyarılmış emisyonu tükenmesi FCS (STED-FCS),-ebilmek var olmak faydalı bir daha küçük odak hacmi ve böylece daha küçük etkili difüzyon sağlayarak penye üzerinde son gelişmeler39 kez ,40. Bu da APLP1 için çinko huzurunda gözlemlediği gibi protein kümeler halinde hücre-hücre kişiler, faiz protein inhomogeneous bir yerelleştirme gidermek için yardımcı. Ne yazık ki, STED-FCS, Yani, STED-FCCS, tarama doğrudan burada uygulanabilir, bir çapraz korelasyon uygulama başarıyla henüz uyumlu boyalar iki renkli STED-FCS için bulma zorluk nedeniyle kanıtlanmıştır değil. (D ≥ ~0.05 µm2/s) yeterince hızlı dinamikleri söz konusu olduğunda, difüzyon proteinlerin hücre-hücre kişiler veya PM12diğer bölgelerinde ölçmek için sFCCS analiz sağlar.

Ayrıca, tüm verileri (sFCCS ve ccN & B), bir parlaklık Analizi gerçekleştirilebilir trans stoichiometry tahmini protein kompleksleri sağlayan. Stoichiometry miktar doğruluğunu trans içinde (, aynı zamanda parlaklık belirlenmesi etkileyebilecek sadece birkaç CIS kompleksleri isenizYani, ) bağlayan protein miktarı ile artar belirtilmelidir. Parlaklık analiz karışımları farklı oligomeric Birleşik, e.g.,cis monomer ve trans tetramers çözme izin vermez. Daha genel olarak, bu y & B karışımları farklı oligomeric türlerin homojen bir örnek dağıtılan çözümlenemiyor olması gerekmektedir. Bir piksel içinde birden çok tür yoksa, bir tek değer parlaklık ölçülen (Yani, ağırlıklı ortalama oligomeric her tür parlaklık) olacaktır. Gözlenen parlaklık değerleri (Örneğin, farklı piksel) istatistiksel dağıtım doğrudan oligomeric türler göreli miktarda bağlı değil. Böyle karışımlar gidermek için diğer yöntemleri kullanılmalıdır (Örneğin, mekansal yoğunluk dağıtım Analizi (SpIDA)41, çubuk grafik (PCH)42sayma foton). Benzer şekilde, spektral çapraz korelasyon sFCCS içinde miktar sadece için basit, bilinen stoichiometries, ilişkili ve ilişkisiz proteinler fraksiyonunun Örneğin, 1:1 doğru bir miktar sağlar. Daha karmaşık bir stoichiometry için daha fazla varsayımlar43yapılmalı. Genel olarak, dedektör sistemi ve floresan FPs kısmını iletişim kuralları'nda açıklandığı gibi kalibre edilmiş23 ise parlaklık Analizi deneysel bir araçtır, kalır.

Her ne kadar burada sunulan uygulama yapisan hücrelerdeki protein-protein etkileşimleri üzerinde duruldu, tahlil örnekleri, Örneğin, süspansiyon hücreleri daha geniş bir aralığı için uygulanabilir. Bu tür sistemlerde, düzeltme yanal hücre hareketi için özellikle önemli olabilir. Buna ek olarak, bu kolayca GUVs veya GPMVs, moleküler etkileşimler de kontrollü koşullar altında Örneğin, farklı lipit kompozisyonları veya membranlar organize bir eksik miktar izin gibi membran sistemleri modellemek için uygulanabilir sitoiskeleti. SFCCS böyle veziküller gerçekleştirirken, dikey hareket İlave sinyal dalgalanmaları neden olabilir, ancak zaman büyük veziküller üzerinde odaklanarak en aza indirilebilir. Bu bağlamda, birden fazla kombinasyon umut verici, Örneğin, Şef- / GPMV-hücre12karıştırma. Son yayında görüldüğü gibi bağışıklık sinapslarda oluşumu böyle sistemleri44tarafından başarıyla modellenebilir. Böylece, sunulan tahlil kesinlikle büyük bir çeşitlilik hücre-hücre etkileşimlerin incelenmesi için faydalı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

Bu eser kısmen Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenen 254850309 verin. Yazarlar Madlen Luckner el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1, (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144, (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3, (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401, (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24, (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28, (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28, (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3, (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91, (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96, (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788, (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94, (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71, (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95, (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8, (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102, (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80, (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18, (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10, (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137, (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189, (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76, (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33, (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184, (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111, (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210, (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105, (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8, (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78, (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88, (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132, (4), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics