Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een scala aan biologische processen omvat cel interacties, meestal gemedieerd door eiwitten die op het raakvlak tussen naburige cellen samenwerken. Van belang zijn slechts weinig testen staat specifiek indringende dergelijke interacties rechtstreeks in levende cellen. Hier presenteren we een test voor het meten van de binding van eiwitten geeft uiting aan de oppervlakken van naburige cellen, op cel contacten. Deze test bestaat uit twee stappen: vermenging van cellen uiten van de proteïnen van belang gesmolten aan verschillende fluorescente proteïnen, gevolgd door fluorescentie schommelingen spectroscopie metingen op cel-cel contacten met behulp van een confocale laser scanning microscoop. We aantonen de haalbaarheid van deze test in een biologisch relevante context door het meten van de interacties van de amyloïde precursor-achtige eiwitten 1 (APLP1) over de cel-cel kruispunten. Wij bieden gedetailleerde protocollen op de data-acquisitie met behulp van fluorescentie gebaseerde technieken (scannen van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie, cross-correlatie nummer en helderheid analyse) en het vereiste instrument kalibraties. Verder bespreken we kritische stappen in de data-analyse en hoe te identificeren en corrigeren van externe, vals signaal variaties, zoals die als gevolg van photobleaching of cel verkeer.

In het algemeen, de voorgestelde bepaling is van toepassing op elke homo- of heterotypic eiwit-eiwit interactie op cel contacten, tussen de cellen van de dezelfde of verschillende typen en op een commerciële confocale laser scanning microscoop kan worden uitgevoerd. Een belangrijke voorwaarde is de stabiliteit van het systeem, dat volstaan moet om de sonde diffusive dynamiek van de proteïnen van belang over enkele minuten.

Introduction

Veel biologische processen zich voordoen op de sites van cel-cel interacties, bijvoorbeeld cel-cel adhesie1,2,3, cel-cel fusion4 en cellulaire erkenning5. Dergelijke gebeurtenissen zijn vooral belangrijk bij de ontwikkeling van meercellige organismen en voor cel-cel communicatie, bijvoorbeeld tijdens de immuunrespons. Deze processen zijn meestal gemedieerd door eiwitten die zijn gelokaliseerd aan het oppervlak, dat wil zeggen, op het plasma-membraan (PM) van naburige cellen en specifieke interacties op de cel-cel-contactpersoon die precies geregeld in ruimte en tijd te ondergaan. In veel gevallen deze interacties zijn directe homo- of heterotypic eiwit-eiwitinteractie trans interacties, maar mogelijk ook ionen of liganden hoedanigheid van extracellulaire linkers1. Hoewel het van fundamenteel belang, is er een gebrek assays indringende deze specifieke eiwit-eiwitinteractie rechtstreeks in de eigen omgeving van levende cellen. Veel methoden vereisen of verstoring van de cel (bijvoorbeeld biochemische tests zoals co-immunoprecipitation6), fixatie (bijvoorbeeld aantal super resolutie optische microscopie technieken en elektronenmicroscopie van cel-cel contact op met7), of zijn niet-specifieke, bijvoorbeeld aggregatie / hechting testen8,9. Om dit probleem te overwinnen, zijn fluorescentie technieken doorgevoerd op basis van fluorescentie resonance energy transfer (FRET)10 of fluorescentie complementatie11. Deze methoden vereisen echter om voldoende kleine afstanden tussen fluorophores, fluorescerende etiketten aan de extracellulaire kant van de eiwitten10, mogelijk verstoren trans interacties.

Hier presenteren we een alternatieve fluorescentie gebaseerde assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten. Deze aanpak combineert fluorescentie cross-correlatie benaderingen (scannen fluorescentie cross-correlatie spectroscopie (sFCCS), cross-correlatie nummer en helderheid (ccN & B)) en het mengen van cellen uiten van een constructie van de fusie voor het eiwit van belang, bijvoorbeeld een hechting-receptor. De onderzochte receptoren in de twee interagerende cellen worden aangeduid met twee spectraal gescheiden fluorescente proteïnen (FPs), van de intracellulaire kant (Zie figuur 1A).

De werknemer methoden zijn gebaseerd op de statistische analyse van de fluorescentie schommelingen veroorzaakt door de diffusive motie van fluorescerende fusion eiwitten door het focal volume van een confocale laser scanning microscoop. Meer in detail sondes de bepaling de co verspreiding van de proteïnen van belang in beide naburige PMs op cel contacten. Als de eiwitten ondergaan trans interacties, zal deze trans -complexen fluorescente proteïnen uitstoten in beide spectrale kanalen, waardoor gecorreleerde fluorescentie schommelingen van beide vervuilers dragen. Aan de andere kant, als geen binding treedt op, zal het aantal schommelingen van eiwitten bij het omgaan met PMs onafhankelijk zijn, waardoor geen gecorreleerde schommelingen. De overname kan op twee manieren worden uitgevoerd: 1) sFCCS is gebaseerd op een lijn-vormige scan door de contactpersoon van de cel-cel en effectief onderzoekt de interacties in een plek gelegen in de regio contact. Door middel van een temporele analyse van fluorescentie schommelingen biedt sFCCS ook dynamica informatie, dat wil zeggen, de coëfficiënten van de diffusie van eiwitcomplexen; 2) ccN & B is gebaseerd op een pixel-wise analyse van een reeks beelden die zijn verworven op de cel contact regio's. Het heeft de mogelijkheid om te sonderen en kaart interacties langs de hele Neem contact op met de regio (in één brandvlak), maar levert geen informatie over dynamiek. Beide methoden kunnen worden gecombineerd met een analyse van de moleculaire helderheid, dat wil zeggen, de gemiddelde fluorescentie-signaal in de tijdseenheid uitgestoten door één verspreiden van eiwitcomplexen en schattingen van de stoichiometrie van eiwitcomplexen op dus op te leveren de contactpersonen van de cel.

In dit artikel geven wij gedetailleerde protocollen voor monstervoorbereiding, kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analyse uit te voeren van de voorgestelde bepaling over een commerciële confocale laser scanning microscoop. De experimenten kunnen worden uitgevoerd op elk instrument voorzien van foton tellen of analoge detectoren en een doelstelling met hoge numerieke diafragma. We verder bespreken kritische stappen van het protocol en correctie regelingen voorzien in verschillende processen veroorzaken artefactual signaal schommelingen, bijvoorbeeld detector geluidshinder, photobleaching of cel verkeer. Oorspronkelijk ontwikkeld om sonde interacties tussen Adherente cellen, de bepaling voor schorsing cellen kunnen worden gewijzigd of aangepast aan membraan modelsystemen, bijvoorbeeld gigantische unilamellar blaasjes (GUVs) of gigantische plasma membraan blaasjes (GPMVs), waardoor de kwantificering van interacties in verschillende lipide omgevingen of bij gebreke van een georganiseerde cytoskelet12,13.

Het scannen van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie is een gewijzigde versie van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie14 en werd specifiek ontworpen om de sonde langzaam diffusive dynamiek in lipide membranen15. Het is gebaseerd op een lijn-scan overname loodrecht op de PM met de fluorescente proteïnen van belang. Om de sonde twee anders gelabelde eiwit soorten interacties, wordt de verwerving uitgevoerd in twee spectrale kanalen met behulp van twee laserlijnen en twee detectie Vensters voor spectraal gescheiden fluorophores. Vanwege de dynamiek van de trage verspreiding van eiwitten in de PM (D≤ ~ 1 µm2/s), een cross-talk-gratis meting kan worden uitgevoerd door afwisselend de regeling van de excitatie van lijn tot lijn15. De analyse begint met: 1) een uitlijning algoritme corrigeren voor laterale cel verkeer op basis van block-wise gemiddeld van ~ 1000 lijnen, 2) bepaling van de positie met maximale fluorescentie signaaldat wil zeggen, de PM positie, in elk blok en 3) verschuiven van alle blokken te een gemeenschappelijke oorsprong12,15, afzonderlijk in elk kanaal. Vervolgens wordt een automatische selectie van pixels die overeenkomen met de PM uitgevoerd door het selecteren van de regio in het midden van een Gaussiaanse pasvorm van de som van alle uitgelijnde lijnen (d.w.z., centrum ± 2.5σ). Integratie van het signaal in elke regel levert de membraan fluorescentie tijdreeksen F(t) in elk kanaal (g = groen kanaal, r = rode kanaal). Opmerking dat de pixelgrootte moet klein genoeg, bijvoorbeeld < 200 nm, te reconstrueren van de vorm van het punt verspreiden op functie en vindt haar center, overeenkomt met de positie van de PM. In de aanwezigheid van aanzienlijke photobleaching, de fluorescentie tijdreeksen in elk kanaal kan worden gemodelleerd met een dubbel-exponentiële functie en vervolgens gecorrigeerd met behulp van de volgende formule:16

Equation 1.    (1)

Het is belangrijk op te merken dat deze formule effectief corrigeert zowel de amplitudes en de diffusie tijden verkregen correlatie analyse van F(t)c, vergeleken met de ramingen van de parameter die uit de niet-gecorrigeerde F(t)zou worden verkregen. Vervolgens, de auto - en cross-correlatie functies (ACFs / CCFs) van de fluorescentie signalen worden berekend:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

waar δFik = Fik(t) - Image 1 Fik(t)Image 2 en ik = g, r.

Het model van een twee-dimensionale diffusie is dan voorzien tot alle functies van de correlatie (CFs):

Equation 4.   (4)

Hier, geeft N het aantal fluorescente proteïnen in de omvang van de observatie en τd de diffusie-tijd voor elk kanaal. Dit model houdt rekening dat in de beschreven experimentele setting, verspreiding van eiwitten in de PM treedt op in het x-z vlak, in tegenstelling tot de veel gebruikte configuratie voor fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) experimenten op membranen sonderen verspreiding in de x-y-vlak van de confocal volume17. De taille w0 en de structuur factor S, met een beschrijving van de rek wz van het focal volume in z, S = wz/w0, een punt FCS kalibratie meting uitgevoerd met spectraal soortgelijke kleurstoffen en dezelfde optische instellingen worden verkregen met behulp van reeds beschikbare waarden voor de diffusie-coëfficiënt Dkleurstof:

Equation 5, (5).

waar τd, kleurstof de tijd gemeten gemiddelde verspreiding van de kleurstof moleculen is, verkregen uit de montage van een model voor driedimensionale verspreiding op gegevens, rekening houdend rekening overgangen van een breuk T van alle N -moleculen aan een triplet staat met een tijdconstante ττ:

Equation 6.   (6)

Tot slot zijn diffusie coëfficiënten (D), moleculaire helderheidswaarden (ε) en de relatieve cross-correlatie van sFCCS gegevens (rel.cc.) als volgt berekend:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

waar GKruis(0) is de amplitude van de functie cross-correlatie en Equation 14 is de amplitude van de autocorrelatiefunctie in het ik-th kanaal.

Deze definitie van de relatieve cross-correlatie, dat wil zeggen met behulp van max in plaats van betekenen in vergelijking 9, houdt rekening dat het maximum aantal complexen van twee eiwit soorten waarvan de aanwezigheid in verschillende concentraties wordt beperkt door de soorten waarvan de aanwezigheid in een lager nummer.

Cross-correlatie nummer en helderheid is gebaseerd op een analyse van het moment van de intensiteit van de fluorescentie voor elke pixel van een afbeeldingsstapel verworven na verloop van tijd op een vaste positie in de steekproef, meestal bestaande uit ~ 100-200 frames, met twee spectrale kanalen () g = groen kanaal, r = rode kanaal). Ten opzichte van de temporele gemiddelde Image 1 ikImage 2ik en variantie Equation 16 , de moleculaire helderheid εi en nummer nik worden berekend in elke pixel en spectrale kanaal (Ik = g, r)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

Het is belangrijk op te merken dat de gegeven vergelijkingen voor de ideale geval voor een ware foton-tellen detector gelden. Voor analoge detectiesystemen gelden de volgende vergelijkingen19,20:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

Hier, S is de omrekeningsfactor tussen gedetecteerde fotonen en de opgenomen digitale graven, Equation 24 is de uitlezing lawaai en offset verwijst naar de verschuiving van de intensiteit van de detector. In het algemeen, deze hoeveelheden moeten worden gekalibreerd, voor elk type van de detector, gebaseerd op de meting van de variatie van de detector als een functie van intensiteit voor constante verlichting19, bijvoorbeeld een reflecterend oppervlak van metalen of gedroogde kleurstof oplossing. De verschuiving kan worden bepaald door het meten van de graaf-tarief voor een monster zonder excitatie licht. Door het uitvoeren van een lineaire regressie van de afwijking van de detector-geassocieerde Equation 25 versus intensiteit (ik) perceel, S en Equation 24 kan worden bepaald19:

Equation 14.   (14)

Tot slot, de cross-correlatie helderheid in elke pixel wordt berekend en wordt gedefinieerd in het algemeen als21

Equation 15, (15).

waar Equation 29 is de Kruis-variantie Equation 30 .

Om het filteren van langlevende schommelingen, worden alle ccN & B berekeningen uitgevoerd na een boxcar filtering, onafhankelijk voor elke pixel22. Kort, ni, εik (Ik = g, r) en Bcc in glijden segmenten van bijvoorbeeld 8-15 frames worden berekend. De aldus verkregen waarden kunnen vervolgens om te verkrijgen van de laatste pixel aantal en helderheid waarden worden gemiddeld.

Stoichiometrie analyse
Om te kunnen inschatten van de stoichiometrie van eiwitcomplexen op cel contactpersonen, kan de moleculaire helderheid afzonderlijk worden geanalyseerd in elke spectrale kanaal voor de sFCCS of ccN & B gegevens. In sFCCS, wordt een helderheidswaarde verkregen per meting in elk kanaal. In ccN & B, een histogram van de helderheid van alle pixels die overeenkomen met de contactpersoon van de cel wordt verkregen en de waarde van de gemiddelde (of mediaan) kan worden gebruikt als vertegenwoordiger helderheid voor de meting. Door het uitvoeren van de dezelfde analyse op een monomeer verwijzing, kunnen alle helderheidswaarden rechtstreeks voor de gemiddelde oligomere staat van de gedetecteerde eiwitcomplexen worden genormaliseerd. Op dit punt, is het belangrijk om te corrigeren voor de aanwezigheid van niet-belichting fluorescerende FPs die leiden een onderschatting van de oligomere staat tot kan. Dit wordt meestal uitgevoerd door het meten van de helderheid van een homo-dimeric referentie eiwit23,24 met één kleur sFCS of nummer en de helderheid (N & B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. monstervoorbereiding: Assay van het mengen van de cel

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de mengen procedure voor Adherente cellen. Het kan worden gewijzigd voor de cellen gekweekt in suspensie.

  1. Zaad van een voldoende aantal cellen in een 6-well-plate, bijvoorbeeld 800.000 HEK 293T cellen (geteld met een Neubauer tellen kamer), een dag voor Transfectie. Het nummer kan worden aangepast afhankelijk van de tijd tussen zaaien en transfectie en aangepast voor andere celtypes. Voorbereiden voor het uitvoeren van een eenvoudige experiment (dat wil zeggen, eiwitten van belang en negatieve controle), ten minste 4 putten. Cultuur cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) medium, aangevuld met foetale runderserum (10%) en L-glutamine (1%).
  2. Transfect cellen volgens de instructies van de fabrikant (Zie de Tabel van de materialen).
    1. Voor het uitvoeren van een eenvoudige experiment, transfect, in aparte wells, plasmiden voor de proteïne van belang gesmolten tot een 'groen' (bijvoorbeeld monomeer verbeterde groen fluorescent proteïne (mEGFP), of gele fluorescent protein (mEYFP)) of 'rood' (bijvoorbeeld, mCherry, of mCardinal) TL proteïne.
      Opmerking: In dit protocol focussen we op APLP1-mEYFP en APLP1-mCardinal12, en de bijbehorende negatieve controle, bijvoorbeeld myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) en -mCardinal (myr-palm-mCardinal)12. In het algemeen, 200 ng - 1 µg plasmide DNA volstaan. Hoge transfectie efficiëntie verhoogt de kans om te 'rood' en 'groene' cellen in contact zoeken. Wijzigt de plasmide en transfectie reagens voor het optimaliseren van de transfectie efficiëntie. Kritisch: Cel confluentie moet ongeveer 70% bij transfecting van de cellen. Als cellen overmatig heuvels, zal de efficiëntie van de transfectie afnemen. Als cellen niet genoeg confluente, kan transfectie mengen veroorzaken stress en voorkomen dat veel cellen van goede bijlage na het mengen.
  3. Cel mengen ~4 ± 2 h na transfectie uitvoeren
    1. Verwijder groeimedium en wassen elk goed zachtjes met 1 mL PBS aangevuld met Mg2 + en Ca2 +. Verwijder vervolgens de PBS. (Kritische) PBS op goed rand om te voorkomen dat detachement van cellen tijdens wassen neerzet.
    2. Drop-wise ~ 50 µL trypsine ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) oplossing aan elk putje te vergemakkelijken detachement van cellen toevoegen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 min. daarna, langzaam schud de plaat 6-well als u lateraal wilt loskoppelen van de cellen.
      Opmerking: Uitgebreide incubatie tijden kunnen worden vereist voor sommige celtypes.
    3. 950 µL van groeimedium toevoegen aan elk putje en resuspendeer de cellen door een paar keer op en neer, waardoor het loskoppelen van alle cellen vanaf de onderkant goed pipetteren. (Kritische) Ervoor zorgen dat cellen geresuspendeerde correct en door visuele controle op de afwezigheid van grote cel aggregaten na resuspensie van elkaar losgekoppeld. Veel 'rode'-'rode' of 'groene'-'groene' contacten zal anders worden verkregen na het mengen.
    4. Breng de oplossing van de cel van één put (eiwit van belang of negatieve controle) met de corre-Nou, dat wil zeggen, 'rood' (bijvoorbeeld APLP1-mCardinal-transfected) 'Green' (bijvoorbeeld APLP1-mEYFP-transfected) cellen. Meng door zachtjes pipetteren een paar keer op en neer. Vervolgens uitgezaaid zaad de gemengde cellen op 35-mm glas onder gerechten (1 mL van gemengde cel oplossing per schotel), vermeerderd met 1 mL groeimedium en cultuur cellen voor een andere dag bij 37 ° C, 5% CO2.

Figure 1
Figuur 1 . Experimentele workflow en schematische weergave van het scannen van de fluorescentie cross-correlatie spectroscopie en cross-correlatie nummer en helderheid analyse op cel-cel contactpersonen. (A) regeling van de bereiding van de monsters: twee cel populaties transfected met de proteïne van belang (bijvoorbeeld APLP1) gefuseerd tot twee spectraal verschillende fluorescente proteïnen (b.v., mEYFP en mCardinal) na transfectie zijn gemengd. Contactpersonen van anders transfected cellen worden geselecteerd in de microscopie experimenten. Om te voorkomen storingen met extracellulaire bindende domeinen, moet de fluorescente proteïne worden gesmolten de intracellulaire eindhalte van de proteïne van belang. (B) scannen FCCS (sFCCS) metingen zijn uitgevoerd loodrecht op de contactpersoon van de cel in twee spectrale kanalen (kanaal 1, groene en kanaal 2, rood). Scanlijnen (weergegeven als kymographs) worden uitgelijnd en membraan pixels opgeteld. Vervolgens, ACFs en CCFs zijn berekend op basis van de intensiteit sporen Fik(t). ACFs zijn vertegenwoordigd in rood en groen. CCF is vertegenwoordigd in het blauw. (C) Cross-correlatie N & B (ccN en B) overname resulteert in een drie-dimensionale (x-y-time) afbeeldingsstapel. Een ROI is rond de contactpersoon van de cel geselecteerd. Dan kanaal en cross-correlatie helderheid (ε1, ε2en Bcc) waarden in elke cel contact pixel worden berekend. De resultaten worden vervolgens gevisualiseerd als histogrammen, bundeling van alle geselecteerde pixels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

2. de monstervoorbereiding: Positieve controle voor Cross-correlatie experimenten en Homo-dimeer Construct helderheid p.a.

  1. Beënt 600.000 HEK 293T cellen, met een cel tellen kamer, op 35-mm glas onder gerechten één dag vóór de transfectie geteld. Cultuur van de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in volledige DMEM medium (zie stap 1.1) voor een andere dag.
  2. Cellen met ~ 250 transfect ng van plasmide DNA volgens de instructies van de fabrikant. Voor de positieve controle van de cross-correlatie, gebruikt u een plasmide codering van een membraan-verankerd fluorescent proteïne hetero-dimeer, bijvoorbeeld myr-palm-mCherry-mEGFP of myr-palm-mCardinal-mEYFP12 , overeenkomt met de FPs van de proteïne van belang. Voor de kalibratie van de helderheid, plasmiden zowel een membraan-verankerd FP monomeer en homo-dimeer overeenkomt met de FOD gesmolten aan de proteïne van belang, bijvoorbeeld myr-palm-mEYFP en myr-palm-mEYFP-mEYFP-codering te gebruiken ter ijking van de analyse van de helderheid van APLP1-mEYFP12.
  3. Cultuur van de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in volledige DMEM medium (zie stap 1.1) voor een andere dag.

3. Confocale Laser Scanning Microscopie: Setup en kalibratie van Focal Volume

Opmerking: Het volgende protocol is geschreven voor experimenten met mEGFP/mEYFP en mCherry/mCardinal op de laser scannen confocal microscoop gebruikt in deze studie. De optische setup, de software-instellingen (laserlijnen, dichroïde spiegels, filters) en de keuze van kalibratie kleurstoffen kunnen worden gewijzigd voor andere FPs en Microscoop setups.

  1. Zet de Microscoop en lasers ten minste een uur voor het experiment om laser stabiliteit en evenwichtsinstelling van temperatuur.
  2. Bereiden van 100-200 µL van passende wateroplosbare fluorescente kleurstof oplossingen (Zie de Tabel van materialen voor voorbeelden) in water of PBS kalibreren de focal volume met de concentraties in het 10-50 nM-bereik.
  3. Plaats de kleurstof oplossingen op een schone 35-mm glas onder schotel #1.5, dat wil zeggen, met een dikte van 0,16-0,19 mm.
    Opmerking: Gebruik bij voorkeur gerechten met hoge prestaties cover glas met een laag dikte tolerantie, bijvoorbeeld 0.170 ± 0,005 mm, waardoor een optimale kraag ring correctie (stap 3.6). Het is belangrijk de dezelfde soort schotel zoals later gebruikt voor de volgende experimenten te gebruiken.
  4. Zet de schotel met de kleurstof oplossing rechtstreeks op het doel (bij voorkeur water onderdompeling, met NB 1.2) om zich te concentreren in de oplossing. Alternatief, zet de schotel op de monsterhouder en de focus in het monster (bijvoorbeeld 10-20 µm boven de onderkant van de schotel).
    Opmerking: We raden niet met behulp van de doelstellingen van de olie als gevolg van het slechte signaal verkregen bij het scherpstellen van de deep in waterige monsters.
  5. De excitatie en emissie pad ingesteld, kies bijvoorbeeld de 488 nm laser, een 488/561 nm dichroïde spiegel, detectie venster 499-552 nm en de grootte van een gaatje van 1 luchtige eenheid (AU). Zorg ervoor dat de grootte van het gaatje is hetzelfde als degene die in cross-correlatie metingen zal worden gebruikt.
  6. Pinhole positie (gaatje aanpassing) en de ring van de objectieve kraag te maximaliseren graaf tarief aanpassen. Voor dit doel, door kraag ring te draaien totdat het maximale aantal tarief wordt gedetecteerd.
    Opmerking: De correctie van de ring kraag is verantwoordelijk voor de specifieke dikte van het glas van de cover gebruikt. Maximaliseren van de graaf-tarief, dwz., het verzamelen van zoveel fotonen per molecuul mogelijk, is essentieel voor het maximaliseren van de signaal-ruisverhouding (SNR) van de metingen.
  7. Uitvoeren van een reeks van punt FCS metingen (bijvoorbeeld 6 metingen op verschillende locaties, elk bestaande uit 15 herhalingen van 10 s, dat wil zeggen, 2,5 min totale tijd, bemonsterd met 1 µs Nadruktijd of minder) op de dezelfde kracht van de laser zoals gebruikt in cross-correlatie metingen (meestal ~ 1%, dat wil zeggen, ~ 1-2 μW).
  8. Past een driedimensionale diffusie model met inbegrip van een triplet-bijdrage (vergelijking 6) aan de gegevens.
    Opmerking: De verkregen diffusie tijden zijn meestal ongeveer 30 µs en de structuur factor is rond 4-8.
  9. Berekenen van de taille w0 uit de gemeten gemiddelde verspreiding tijd en gepubliceerde waarden voor de coëfficiënt van de verspreiding van de gebruikte kleurstof op kamertemperatuur25 volgens vergelijking 5. Gebruikelijke waarden zijn 200-250 nm.
  10. Herhaal de kalibratieroutine (stappen 3.4-3.9) met een verschillende fluorescente kleurstof voor een tweede detectie kanaal indien nodig (bijvoorbeeld 561 nm excitatie en detectie tussen 570 nm en 695 nm). Houd de pinhole positie en grootte die was ingesteld voor de eerste detectie-kanaal.
  11. Berekenen van de moleculaire helderheid (vergelijking 8) uit de metingen van de kalibratie en de verkregen waarden opslaan.
    Opmerking: Typische waarden voor de gebruikte setup zijn ~8-10 kHz/molecuul (MOL) voor 1.8 μW 488 nm excitatie macht. Lager dan normale waarden op vuil op de doelstelling, de afwijking van de setup of een verminderde laservermogen wijzen kunnen. Controleren en op te slaan van laser uitvoer bevoegdheden op de doelstelling die regelmatig met behulp van een Energiemeter. Voor de vergelijking van verschillende opstellingen is moleculaire helderheid genormaliseerd door de kracht van de laser excitatie de meest betekenisvolle parameter te Microscoop prestaties beoordelen.

4. scannen fluorescentie Cross-correlatie spectroscopie: overname

Opmerking: Het volgende protocol is geschreven voor experimenten met mEGFP/mEYFP ('groen') en mCherry/mCardinal ('rood') op de laser scanning confocal microscoop gebruikt in deze studie. De optische setup en de software-instellingen (laserlijnen, dichroïde spiegels, filters) kunnen afwijken zijn voor andere FPs of Microscoop setups.

  1. Instellen van de optische weglengte van, bijvoorbeeld, 488 nm en 561 nm excitatie en een 488/561 nm dichroïde spiegel, gaatje op 1 AU voor 488 nm excitatie. Om te voorkomen dat de spectrale cross-talk, selecteert u twee afzonderlijke tracks te wekken en detecteren van mEGFP/mEYFP (488 nm excitatie, groene kanaal) en mCherry / mCardinal (561 nm excitatie, rode kanaal) sequentieel en selecteer schakelaar bijgehouden elke regel. Voor de detectie, door de juiste filters te gebruiken voor beide kanalen, bijvoorbeeld 499-552 nm in het groene kanaal en 570-695 nm in het rode kanaal.
  2. Als afgewisseld excitatie niet mogelijk is, geschikte filterinstellingen gebruiken voor het rode kanaal om te minimaliseren van spectrale cross-talk (d.w.z. het detecteren van mCherry/mCardinal fluorescentie niet onder 600 nm). Dit kan verminderen de hoeveelheid fotonen in het rode kanaal ontdekt en aldus de SNR te verminderen.
  3. Zet de schotel met de gemengde cellen op de monsterhouder. Wacht ten minste 10 min. temperatuur evenwichtsinstelling en focus drift verminderen.
  4. Focus op de cellen via licht in het menu zoeken .
  5. Zoekt u een paar van een 'rood' en een 'groene' cel met elkaar in contact. De positieve cross-correlatie of homo-dimeer Helderheidsregeling (zie punt 2), zoekt u een geïsoleerde cel uitstoten fluorescentie in beide kanalen of het signaal van de respectieve homo-dimeer bij de PM.
    Opmerking: (Kritische) minimaliseren monster blootstelling tijdens het zoeken naar cellen te vermijden vooraf bleken, die de cross-correlatie26kan verminderen. Daarom scannen op de snelste scan snelheid en lage laser bevoegdheden. Om te voorkomen dat de detector verzadiging terwijl imaging sterk uiting van cellen, zoeken in de modus van de integratie. Maar u wilt blootstelling te minimaliseren, is scannen op lagere laser powers mogelijk in foton tellen mode.
  6. Selecteer een scan pad loodrecht aan cel contactpersoon (of PM van een enkele cel voor de positieve controle voor cross-correlatie of homo-dimeer helderheid) met behulp van de knop bijsnijden , zoals afgebeeld in cijfers 1B en 2A.
    Opmerking: Sommige oudere microscopen laat geen willekeurige scan richtingen. In dit geval, moeten cel contacten met een richting loodrecht op de scan worden gevestigd.
  7. Zoom om een pixelgrootte van 50-200 nm en selecteer Line in Scanmodus. Framegrootte ingesteld op 128 × 1 pixels.
    Opmerking: Typische pixelgrootte is 160 nm, overeenkomt met de duur van een scan van circa 20 µm.
  8. Stel scansnelheid op de maximale toegestane waarde, bijvoorbeeld 472.73 µs per regel.
    Opmerking: Voor een regeling voor alternatieve excitatie, dit komt overeen met 954.45 µs scannen tijd, d.w.z. ~ 1000 scans/s op de setup gebruikt. De scan snelheid kan worden aangepast afhankelijk van de coëfficiënt van de verspreiding van de proteïne van belang. Voor membraan-verankerd eiwitten, typische diffusie tijden zijn rond 10-20 ms. de tijd van de scan moet ten minste tien keer kleiner dan de diffusie-tijden. Lagere snelheden van de scan kunnen induceren sterker photobleaching en lagere verlichting bevoegdheden vereisen. Anderzijds kan een een pauze, bijvoorbeeld 5 ms, tussen elke scan voor zeer langzaam verspreiden complexen met Interval in het submenu Tijdreeksen opleggen.
  9. Kies de juiste laser bevoegdheden, bijvoorbeeld, ~ 1-2 μW voor 488 nm en ~ 5-10 μW voor 561 nm excitatie.
    Opmerking: Hogere machten van de laser SNR verbeteren, maar verhogen photobleaching. Daarom, laser bevoegdheden moeten worden zodanig gekozen dat photobleaching minder dan 50% van de eerste telling is.
  10. Stel cycli op 100.000-500, 000.
    Opmerking: Het aantal scans opgebouwd, dat wil zeggen, de duur van de meting, kan variëren: langere meting tijden SNR zal verbeteren en wellicht meer geschikt voor langzaam het verspreiden van moleculen, echter, beweging van de cellen en photobleaching beperken de maximale meting tijd. Hier gepresenteerde gegevens werden routinematig verworven voor ~ 3-6 min, dat wil zeggen, 200.000-400.000 lijn scant.
  11. Detectoren Photon counting modus instellen Drukt u op Experiment starten om te beginnen met de overname. Herhaal stap 4.5-4.11 voor het meten van een andere cel.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen voor het meten van 10-15 cellen per monster bij verschillende expressie niveaus. (Kritische) Vermijd detector verzadiging op hoge expressie niveaus. Het maximale aantal tarief mag niet meer dan ~ 1 MHz.
  12. Als helderheid analyse wordt uitgevoerd om te bepalen van oligomere Staten, uitvoeren kalibratie metingen van de helderheid van de homo-dimeer volgens gemodificeerde stappen 4.1-4.11: elke fluorescent proteïne homo-dimeer (in geïsoleerde cellen, bereid met apart meten Protocol sectie 2) en het uitvoeren van metingen alleen in één spectrale kanaal.

5. scannen fluorescentie Cross-correlatie spectroscopie: Data-analyse

Opmerking: Het volgende protocol volgt een tenuitvoerlegging van de analyseprocedure in detail beschreven in de vorige artikelen12,15. De softwarecode is beschikbaar op verzoek aan de auteurs.

  1. De onbewerkte gegevens (bijvoorbeeld CZI)-bestanden exporteren naar een RGB TIFF-afbeelding in raw formaat. Dit bestand bevat een Kymograaf met de groene en rode kanaal gegevens, in het kanaal genoemd G en R van de afbeelding, respectievelijk.
  2. Het TIFF-bestand met de juiste analysesoftware importeren en gaat u verder met de analyses uit te voeren.
    Opmerking: De volgende stappen (in stappen van 5.3-5.7) worden afzonderlijk toegepast op elk kanaal:
  3. De lijnen door het uitvoeren van een segment-wise of bewegende tijdgemiddelde met blokken van 500-1000 lijnen uitlijnen De membraan-positie, dat wil zeggen, de positie van de pixel met de maximale graaf tarief, in elk blok bepalen. Alle blokken verschuiven naar de dezelfde zijligging. Deze procedure corrigeert voor zijdelingse verplaatsing van de cel-cel-contactpersoon, bijvoorbeeld als gevolg van beweging van de cel.
  4. Kortom alle uitgelijnde lijnen langs de tijdas en past het profiel van de gemiddelde intensiteit met een Gauss functie. In aanwezigheid van significante intracellulaire achtergrond, gebruik een Gaussiaan plus een sigmoid functie. Definieer de pixels die overeenkomen met het membraan als alle pixels binnen de ±2.5σ van de membraan positie en de som van de intensiteit van deze pixels in elke lijn, een enkel fluorescentie signaal-prijs voor elk punt van tijd (dat wil zeggen, voor elke lijn-scan) te krijgen.
  5. Indien nodig (bijvoorbeeld achtergrond > 10% van de membraan-signaal), een achtergrondcorrectie toepassen door de intensiteit van de gemiddelde pixel in het cytoplasma vermenigvuldigd met 2.5σ (in pixel eenheden) van de membraan fluorescentie, in blokken van 1000 lijnen af te trekken. Vermijd heldere intracellulaire vesikels bij het selecteren van de achtergrondpixels.
  6. Indien photobleaching wordt waargenomen, een bleken correctie toepassen. Daarom past de membraan fluorescentie tijdreeksen met een dubbel-exponentiële functie en toepassing van de juiste correctie formule, vergelijking 116.
    Opmerking: U kunt ook Fourier spectrum gebaseerd correctie regelingen mogelijk toegepaste27. (Kritische) Photobleaching is aanwezig, maar niet gecorrigeerd voor, het CFs ernstig vervormd zijn als parameter schattingen kunnen sterk vertekend beeld geven (b.v., Zie Figuur 5E).
  7. Bereken de ACFs en de CCFs volgens vergelijkingen 2 en 3 gebruikt, bijvoorbeeld een meerdere-tau algoritme28. Verbetering van de betrouwbaarheid van de analyse en vermijden van artefacten, de berekeningen voor 10-20 gelijke segmenten van de totale meting. Inspecteer de fluorescentie tijdreeksen en CFs in elk segment en verwijder van duidelijk vervormde segmenten (zie voorbeelden in figuur 4A- 4 D). Het gemiddelde van alle niet-vervormde segmenten.
    Opmerking: Deze procedure kan worden geautomatiseerd om te voorkomen dat een subjectieve bias tot en met de gegevens-29. Voor zeer onstabiel metingen kan hebben vele korte segmenten nuttig zijn. De lengte van een segment moet echter nog steeds ten minste drie ordes van grootte boven de diffusie-tijd om te voorkomen dat statistische undersampling fouten29,30,17.
  8. Past een twee-dimensionale diffusie model, vergelijking 4, de verkregen CFs. Daarom lossen de factor van de structuur op de waarde die is verkregen in kalibratie meting (Protocol sectie 3). De nauwkeurigheid van de pasvorm kan worden verbeterd door het uitvoeren van een gewogen pasvorm met behulp van de statistische gewichten van elk gegevenspunt verkregen uit de meerdere tau algoritme.
  9. Berekenen van de coëfficiënt van de verspreiding via de geijkte taille volgens vergelijking 7.
  10. Bereken de moleculaire helderheid door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in elk kanaal te delen door het overeenkomstige aantal deeltjes, vergelijking 8. Normaliseren de vastberaden helderheidswaarde in elk kanaal door de gemiddelde helderheid van de overeenkomstige monomeer verwijzing naar het verkrijgen van de oligomere staat, rekening houdend rekening niet-belichting fluorescerende FPs23. Voor dit doel, gemiddelde homo-dimeer helderheidswaarden uit één kleur analyse voor het berekenen van de Fractie van niet-belichting fluorescerende FPs23te bepalen.
  11. Bereken de relatieve cross-correlatie volgens vergelijking 9.

6. Cross-correlatie nummer en helderheid: Detector kalibratie

Opmerking: Het volgende protocol biedt een algemene richtlijn over hoe om te kalibreren van het detectiesysteem. Deze procedure is verplicht voor analoge detectiesystemen, maar is niet strikt nodig wanneer waar foton tellen detectoren worden gebruikt.

  1. Stomerij oplossingen van de passende in water oplosbare kleurstof (Zie Tabel van materialen voor voorbeelden) op een 35-mm glas onder schotel. Instellen van de optische weglengte dienovereenkomstig, dat wil zeggen, 488 of 561 nm excitatie en detectie op 499-552 nm of nm 570-695, respectievelijk.
    Opmerking: U kunt ook een reflecterende metalen oppervlak kan worden gebruikt in plaats van gedroogde kleurstof oplossingen door het plaatsen van de metalen stuk boven de doelstelling.
  2. Één kleur N & B metingen in regio's met verschillende kleurstof concentraties of bij verschillende laser bevoegdheden uitvoeren. Daarom gebruik Zoom om een pixelgrootte van 300 nm, scansnelheid instelt passende pixel nadruktijd, bijvoorbeeld 25 µs en cycli aan 100-200 frames.
  3. Detectoren foton tellen (of analoge modus als metingen worden uitgevoerd met analoge detectie) endrukop Experiment starten om te beginnen met de overname. Het uitvoeren van meting bij nul excitatie bevoegdheid tot het vaststellen van de verschuiving van de intensiteit.
  4. Pixel variantie worden uitgezet als functie van de pixel intensiteit voor alle gemeten pixels en het uitvoeren van een lineaire vlaag van deze gegevens. Bepalen S als de helling van de lineaire pasvorm. Bereken de uitlezing lawaai van het y-snijpunt, met behulp van S en de verschuiving van de vastberaden intensiteit volgens vergelijking 14.

7. Cross-correlatie nummer en helderheid: overname

  1. Stappen 4.1-4.4 van het protocol van de overname van sFCCS.
  2. Gewas gebruiken om een frame van 512 × 128 pixels rond een cel contactpersoon (of geïsoleerde PM voor homo-dimeer helderheid controle) te selecteren en zoomen om een pixelgrootte van 50-100 nm.
  3. Gebruik de scansnelheid te stellen passende pixel nadruktijd, bijvoorbeeld 6.3 µs.
    Opmerking: In N & B, de nadruktijd pixel moet veel kleiner zijn dan de tijd van de verspreiding van de proteïne van belang. Als een alternatieve excitatie-regeling is gekozen, bijvoorbeeld schakelen tussen elke regel wordt bijgehouden, de tijd tussen de twee sporen moet kleiner zijn dan de tijd van de verspreiding van de proteïne van belang. Anders is de detecteerbare cross-correlatie verminderd.
  4. Cycli aan 100-200 frames instellen
    Opmerking: Een hogere framenummer zal verbeteren de SNR, echter cel verkeer kan het beperken van de meting van de totale tijd. De tijd van de scan per frame moet veel hoger dan de tijd van de verspreiding van de proteïne van belang. Anders de schijnbare helderheid is verminderd, dat wil zeggen, deeltjes lijken te worden immobiel. Voor zeer langzaam verspreiden complexen, leggen een pauze, bijvoorbeeld 2 s, tussen frames met Interval in het submenu van Tijdreeksen .
  5. Laser bevoegdheden ingesteld op juiste waarden (typische waarden zijn ~ 1-2 μW voor 488 nm en ~ 5-10 μW voor 561 nm excitatie).
    Opmerking: Hogere laser macht leidt tot hogere helderheid en verbeterde SNR, maar ook verbeterde photobleaching. Laser bevoegdheden moet hoog genoeg om een gedetecteerde helderheid van ten minste ~ 1 kHz/MOL maar laag genoeg is om te voorkomen dat meer dan 10-20% photobleaching gehouden. Voor mEGFP/mEYFP of mCherry/mCardinal, op minder dan 10% photobleaching worden meestal verkregen.
  6. Detectoren instellen op foton tellen (of analoge modus als metingen worden uitgevoerd met analoge detectie). Drukt u op Experiment starten om te beginnen met de overname.
  7. Evalueren van het foton graaf tarief. Als graaf in cel contact pixels 1 MHz overschrijden, verminderen de laser macht of selecteer de cellen met lagere niveaus van de expressie. Herhaal de stappen 7.2-7.7. voor het meten van de volgende oefeningscombinatie cellen. Het wordt aanbevolen voor het meten van 10-15 cellen per experiment op verschillende expressie niveaus.
  8. Als helderheid analyse is uitgevoerd om te kwantificeren oligomerisatie, uitvoeren kalibratie metingen van de helderheid van de homo-dimeer volgens gemodificeerde stappen 7.1-7.7: elke fluorescent proteïne homo-dimeer (in geïsoleerde cellen, bereid met apart meten Protocol sectie 2) en het uitvoeren van metingen alleen in één spectrale kanaal.

8. Cross-correlatie nummer en helderheid: Data-analyse

Opmerking: Het volgende protocol volgt een analyse van de eerder beschreven procedure12,31. De softwarecode is beschikbaar van de auteurs op aanvraag.

  1. Importeren van de ruwe data (bijvoorbeeld CZI-bestanden kunnen worden geïmporteerd met behulp van de Bioformats32 -pakket). Gemiddelde van alle frames en selecteer een regio van belang (ROI) rond de cel-cel-contactpersoon.
  2. Het uitvoeren van een afbeelding uitlijning algoritme33, bijvoorbeeld door het maximaliseren van de ruimtelijke correlatie tussen ROIs in volgende frames voor willekeurige laterale vertalingen, gemiddeld over beide kanalen. Deze procedure wordt gecorrigeerd voor de zijdelingse beweging van de cellen.
  3. Toepassing een boxcar filter22 om vreemde langlevende schommelingen, die afkomstig zijn van, bijvoorbeeld, overblijvende cel verkeer of achtergrond bleken. U kunt ook kan een detrending methode worden toegepast om te corrigeren voor photobleaching34.
    Opmerking: Als er geen onderzoek gedaan naar segment-wise of detrending wordt toegepast, de schijnbare helderheid kan worden grotendeels overschat.
    1. Definiëren van glijdende segmenten van, bijvoorbeeld, 8 tot en met 15 frames (bijvoorbeeld frames 1 tot en met 8, 2 tot en met 9 en ga zo maar door) en bereken het kanaal en cross-correlatie helderheidswaarden volgens vergelijkingen 10, 11 en 15 pixel-wise in elk segment. Als detectoren niet true foton detectoren, tellen de geijkte detector parameters rekening houden bij de berekening van de helderheid, dat wil zeggen, het gebruik van vergelijkingen 12 en 13 in plaats daarvan.
      Opmerking: Berekening van de helderheidswaarden in segmenten van 8 tot en met 15 frames leidt tot een onderschatting van de 10-20% van de absolute helderheid en een 10-20% overschatting van deeltje getallen. Niettemin, helderheid ratio's (bijvoorbeeld dimeer monomeer helderheid) ondervinden geen problemen, zolang het segment lengte constant gedurende de analyse (gegevens niet worden weergegeven) wordt gehouden. De statistische fout voor de lengte van een bepaald segment kan worden bepaald via simulaties en aldus gecorrigeerd voor.
    2. Gemiddelde van de verkregen helderheidswaarden pixel-wise over alle segmenten. In deze stap kan één verwijderen van de hoogste en laagste 5% van de helderheidswaarden segment van het gemiddelde of uitsluiten van segmenten waaruit een duidelijke verstoring in de intensiteit, ten gevolge van bijvoorbeeld een intracellulair blaasje of een Transient aanwezig in deze statistiek pixels.
  4. Plot de pixel helderheidswaarden als een functie van de intensiteit van de pixel en selecteer het aantal pixels dat correspondeert met de contactpersoon van de cel. Achtergrondpixels zal hebben zeer lage intensiteitswaarden. Op dit punt opnieuw te evalueren het maximale aantal tarief. Uitsluiten van pixels met graaf tarieven boven 1 MHz pile-up gevolgen te voorkomen.
  5. Kanaal en cross-correlatie helderheid histogrammen van geselecteerde cel maken contact pixels en de ROI-gemiddeld helderheidswaarden te verkrijgen. Normaliseren de helderheidswaarde van de gemiddelde kanaal door de gemiddelde helderheid van de overeenkomstige monomeer verwijzing naar het verkrijgen van de oligomere staat, rekening houdend rekening niet-belichting fluorescerende FPs23. Daarom bepalen gemiddelde homo-dimeer helderheidswaarden tussen één kleur analyse voor het berekenen van de Fractie van niet-belichting fluorescerende FPs23.
  6. Ter illustratie, kanaal- en cross-correlatie helderheid kaarten worden uitgezet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een eerste test voor de eiwit-eiwit interactie assay, dat wil zeggen, mengen van cellen uiten spectraal verschillende fluorescente proteïnen, gevolgd door sFCCS/ccN & B metingen (Figuur 1), moet worden uitgevoerd op eiwitten die naar verwachting niet werken bij de cel contact (dat wil zeggen, een negatieve controle). Daarom HEK 293T cellen, uiting van myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) of -mCardinal waren gemengd en sFCCS werd uitgevoerd over de cel contact(Figuur 2). In een ideaal geval, het signaal van de fluorescentie in elk kanaal wordt verondersteld te schommelen rond een stabiele betekenen, als gevolg van de diffusive motie van de eiwitten in de PM en de statistische variaties van het aantal eiwitten in het focal volume. Eiwitten die geen interactie, de schommelingen in beide kanalen zijn onafhankelijk van elkaar en zo de spectrale cross-correlatie naar verwachting zal schommelen rond een nul. Inderdaad, een relatieve cross-correlatie dicht bij nul werd waargenomen in typische metingen (Figuur 2C). De ACFs Toon karakteristiek verval tijden van ~ 10-20 ms (overeenkomt, gemiddeld, Dmyr-palm = 1,3 ± 0,3 µm2/s (bedoel ± SD, n = 20 cellen)), zoals verwacht voor de verspreiding van myr-palm-mEYFP en -mCardinal in de PM, bijvoorbeeld Dmyr-palm = 0.88 ± 0.11 µm2/s (gemiddelde ± SEM) op basis van fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) experimenten35. Met name staan deze nogal traag dynamiek het gebruik van een afwisselende excitatie regeling, dat wil zeggen, schakelen tussen alleen groen en enige rode excitatie en opsporing van elke lijn, waardoor een ~0.5 ms vertraging tussen signalen in beide kanalen maar onderdrukken spectrale cross-talk. Gemiddeld, een zeer lage gemiddelde cross-correlatie van 0,08 ± 0,10 (bedoel ± SD, n = 17 cellen) is verkregen voor de negatieve controle (Figuur 3E), zoals verwacht.

Vervolgens werd een positieve controle van de cross-correlatie gebruikt voor het kalibreren van de maximale mogelijke cross-correlatie in de optische setup. Daarom de membraan-verankerd hetero-dimeer myr-palm-mCardinal-mEYFP werd uitgedrukt in HEK 293T cellen en sFCCS metingen werden uitgevoerd op afzonderlijke cellen (Figuur 2B). De verkregen CCFs hadden positieve amplitudes en toonde hetzelfde tijdstip van verval als de ACFs, opnieuw ~ 10-20 ms (Figuur 2D). Gemiddeld, een relatieve cross-correlatie van 0.96 ± 0.18 (bedoel ± SD, n = 14 cellen) werd gemeten voor de positieve controle (Figuur 3E).

Figure 2
Figuur 2 . Het scannen van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie controlemetingen. (A) representatieve beelden van gemengde HEK 293T cellen waarin myr-palm-mEYFP /-mCardinal als negatieve controle voor trans interacties. De gele pijl geeft aan dat de sFCCS scannen pad. Schaal bars zijn 5 µm. (B) representatieve beelden van HEK 293T cellen uiten van myr-palm-mCardinal-mEYFP hetero-dimeer (links: groene kanaal, rechts: rode kanaal) als positieve controle van de cross-correlatie. De gele pijl geeft aan dat de sFCCS scannen pad. Schaal bars zijn 5 µm. (C) vertegenwoordiger CFs (groene: ACF in groene kanaal (mEYFP), rode: ACF in het rode kanaal (mCardinal), blauwe: CCF) verkregen in sFCCS metingen voor de negatieve controle. Ononderbroken lijnen Toon vlagen van een twee-dimensionale diffusie model aan het CFs. (D) vertegenwoordiger CFs (groene: ACF in groene kanaal (mEYFP), rode: ACF in het rode kanaal (mCardinal), blauwe: CCF) verkregen in sFCCS meting van de positieve controle. Ononderbroken lijnen Toon vlagen van een twee-dimensionale diffusie model aan het CFs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De geschiktheid van deze bepaling werd vervolgens onderzocht in een biologisch relevante context door het sonderen van de trans -interacties van de amyloïde precursor-achtige eiwitten 1 (APLP1), een type ik transmembraan eiwit dat is voorgesteld om op te treden als een neuronale hechting receptor. Voor dit doel, APLP1 gesmolten naar mEYFP of mCardinal werd uitgedrukt in HEK 293T cellen. Als u wilt uitsluiten van interferentie met de extracellulaire bindende domeinen, de FOD aan de C-terminus van APLP1, dat wil zeggen, op het intracellulaire domein waren gesmolten (Zie Figuur 1). Vervolgens werden sFCCS metingen uitgevoerd op cel-cel contacten tussen APLP1-mEYFP en APLP1-mCardinal cellen (Figuur 3A) uitdrukken, wat resulteert in ACFs en CCFs (afbeelding 3C), die informatie over de verspreiding van de APLP1 geven en interacties. Een positieve relatieve cross-correlatie van 0,45 ± 0.21 (bedoel ± SD, n = 17 cellen) werd waargenomen, dat wil zeggen, een waarde die aanzienlijk groter waren dan die van de negatieve controle (Figuur 3E). Interessant is dat was de gemiddelde relatieve cross-correlatie lager dan die van de positieve controle (Figuur 3E), die slechts gedeeltelijke trans bindende aangeeft.

Tot slot werd de bepaling gebruikt om te laten zien dat zink ionen vergemakkelijken verbeterde APLP1 trans bindend12,31. De sFCCS CFs metingen verkregen over APLP1 clusters op cel-cel contacten (gekenmerkt door een sterke co lokalisatie van APLP1-mEYFP en de APLP1-mCardinal en de vorming van snel in aanwezigheid van zink ionen, Figuur 3B) bleek sterk lagere dynamiek, zoals blijkt uit het grote verval tijden en de trillingen op grote vertraging tijden (Figuur 3D). Niettemin, analyse van de amplitudes korte vertraging tijde bleek een aanzienlijke stijging van de relatieve cross-correlatie met 0,8 ± 0,3 (bedoel ± SD, n = 17 cellen), dat wil zeggen, ~ 80% van het gekalibreerde maximumbedrag (Figuur 3E). Het is te verwachten dat deze langzaam dynamics ernstige verstoringen van de curven van de correlatie veroorzaken (Zie Figuur 3D) wegens het beperkte aantal voor gebeurtenissen die kunnen worden ontdekt tijdens de meting van eindige-tijd, inducerende zogenaamde deeltje lawaai30. Voor een nauwkeurige kwantificering moet de maximale vertraging ten minste 3 ordes van grootte hierboven de diffusie-tijd (zie vorige overzichten30,17 voor meer details).

De moleculaire helderheid van de sFCCS APLP1 gegevens werd verder geanalyseerd, met de negatieve controle van myr-palm als monomeer referentie in elk kanaal en corrigeren voor de hoeveelheid niet-belichting fluorescerende eiwitten23. Op zink ion toevoeging, de moleculaire helderheid aanzienlijk verhoogd van kleine oligomeren (~ Dimeren) naar grotere multimeren ~ 10-50 uit monomeren op elke cel (Figuur 3F). Dus gemiddeld zijn tot ~ 100 APLP1 monomeren aanwezig in een cluster van hele eiwit over de kruising van de cel.

Figure 3
Figuur 3 . Scannen van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie metingen van APLP1 interacties in cel contactpersonen. (A, B) Representatieve beelden van HEK 293T cellen uiten (groen) APLP1-mEYFP / APLP1-mCardinal (rood) voor (A) en 30 min na zink ion behandeling (B, verschillende cellen). De gele pijlen geven aan dat de sFCCS scan paden. Schaal bars zijn 5 µm. (C, D) vertegenwoordiger CFs (groene: ACFs in groene kanaal (mEYFP), rode: ACFs in rode kanaal (mCardinal), blauw: CCFs) in sFCCS metingen voor (C) APLP1 voor zink ion behandeling en (D) na verkregen zink ion behandeling. Ononderbroken lijnen Toon vlagen van een model van de tweedimensionale diffusie naar het CFs. (E) vak percelen van relatieve cross-correlatie verkregen sFCCS analyse van de negatieve controle ("negatieve"), APLP1 in afwezigheid en aanwezigheid van zink ionen, en positieve cross-correlatie controle ("positief"). Percelen weergeven mediane waarden en snorharen variërend van minimaal tot maximale waarden (F) doos percelen van genormaliseerde moleculaire helderheid in groene kanaal (mEYFP) verkregen uit analyse van de sFCCS van APLP1 op cel-cel contacten in afwezigheid en aanwezigheid van zink ionen. Helderheidswaarden werden gecorrigeerd voor niet-belichting fluorescerende mEYFP op basis van metingen van de sFCS van myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-Dimeren uitgedrukt in HEK 293T cellen, gemeten onder de zelfde voorwaarden23. Percelen weergeven mediane waarden en snorharen variërend van minimaal tot maximale waarden Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Alle metingen tot nu toe getoond werden gecorrigeerd voor extra, valse fluctuaties die zich voordoen in de cellen waardoor, als niet in aanmerking genomen, zou de sFCCS analyse uitdagend. Voor de negatieve controle, bijvoorbeeld, kan deze een vals-positieve cross-correlatie, als geen correctie schema's zijn toegepast. Twee belangrijke processen die het CFs ernstig kunnen verstoren zijn: 1) instabiliteiten in de opgenomen fluorescentie signaal door intracellulaire vesikels die Transient invoert het focal volume of vertragen van de dynamiek van de membraan, bijvoorbeeld drift in z-richting, en 2) photobleaching. Om te identificeren voorbijgaande instabiliteit, is het aanbevolen te verdelen de volledige metingen in 10-20 even grote segmenten en Inspecteer het instrument visueel de intensiteit tijdreeksen en CFs in elk segment. Deze procedure wordt geïllustreerd in Figuur 4, dat een voorbeeld van duidelijk vervormde segmenten verkregen in de analyse van een meting van de negatieve controle geeft. Voorbijgaande instabiliteiten (Figuur 4A, sporen van de intensiteit van de segmenten 1 en 2) kunnen leiden tot een CCF met negatieve waarden (Figuur 4B, segment 1) of een hoge vals-positieve cross-correlatie (Figuur 4B, segment 2). Dergelijke instabiliteit zijn meestal zichtbaar in de serie intensiteit als traag signaal variaties (Figuur 4A). De overeenkomstige CFs meestal sterk afwijken van de CFs voor de meerderheid van de segmenten, weergeven, bijvoorbeeld hogere amplitude en veel langzamer verval tijden op de ~ tweede schaal (Zie figuur 4B-4 D). Het wordt aanbevolen om dergelijke segmenten van de analyse en voor de berekening van de definitieve CFs door het gemiddelde van alle niet-vervormde segmenten, dat wil zeggen, segmenten te gekenmerkt door CFs niet af te wijken van de meerderheid van CFs. meestal, dit gebeurt in een grafische het verwijderen van de interface door 1) iteratief onderzoek van de segmenten, 2) duidelijk vervormd segmenten van het gemiddelde en 3) inspectie van het CFs resterende segmenten met betrekking tot de bijgewerkte gemiddelde CFs van segmenten die niet zijn verwijderd. Door het toepassen van deze procedure, gedeeltelijk vervormde lange metingen (Figuur 5A), waaruit langzaam rottend (beschadigde) CFs (Figuur 5B) werden met succes verholpen en zinvolle correlatie krommen werden herstelde (Figuur 5C). In het algemeen, kunnen deze correctieprocedure werd ingeleid geautomatiseerde29, het vermijden van een visuele inspectie door de gebruiker, die vatbaar voor subjectieve partijdigheid worden kan. In vergelijking met de intensiteit gebaseerde filtering methoden36, waarin kleine opslaglocaties van de meting worden geëvalueerd op basis van hun intensiteit in vergelijking met de gemiddelde intensiteit van de volledige meting en verwijderd als meer dan een drempel parameter, de beschreven procedure niet afhankelijk is van externe parameters en gevoelig is ook voor kleine instabiliteit.

Om te compenseren voor photobleaching, werd de beschreven wiskundige correctie, vergelijking 1, toegepast. Typisch, photobleaching kan worden geïdentificeerd door een exponentiële afname van de fluorescentie-signalen (Figuur 5D), domineert het CFs, die vervolgens een vals-positieve Toon cross-correlatie en verval tijden op de ~ min schaal (Zie de typische kromme vorm in Figuur 5E). De correctieprocedure werd ingeleid hersteld de niet-vervormde CFs (Figuur 5F). Zoals reeds vermeld, dezelfde intensiteit kunnen variaties binnen enkele metingen ook worden veroorzaakt door PM beweging, bijvoorbeeld z verwaaiing of grote langzaam structuren. Als soortgelijke exponentiële vervalt in alle maten weergegeven, zullen photobleaching echter de meest waarschijnlijke bron. In het algemeen, correctie regelingen kunnen worden gecombineerd, bijvoorbeeld intensiteit filteren, CF-gebaseerd filteren en verder methoden zoals Fourier transform gebaseerde filtering van langzame signaal variaties in frequentie ruimte27.

Figure 4
Figuur 4 . Segment-Wise analyse van het scannen van de fluorescentie cross-correlatie spectroscopie metingen van de negatieve controle van de cross-correlatie. (A) intensiteit van de fluorescentie in groen (F1) en de rode kanaal (F2) van twee verschillende tijd segmenten (elke meting werd geanalyseerd in 20 segmenten van ~ 20 s elk), verkregen uit sFCCS meting van de negatieve controle. (B) CCFs van elk van de 20 segmenten. De CCFs voor segmenten 1 en 2 worden gemarkeerd in rood en oranje, respectievelijk. (C, D) ACFs van elk segment in groen (C) en rode (D) kanaal. De ACFs voor segmenten 1 en 2 worden gemarkeerd in rood en oranje, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Verstoringen in het scannen van de fluorescentie cross-correlatie spectroscopie metingen op cel contacten, geïllustreerd voor de negatieve controle van de cross-correlatie. (A) volledige fluorescentie tijdreeksen voor de meting van een exemplar in groen (F1) en de rode kanaal (F2). De doorgetrokken rode lijnen vertegenwoordigen een dubbel-exponentiële pasvorm van de tijdreeks in elk kanaal. (B, C) CFs (groene: ACFs in het groene kanaal, rood: ACFs in rode kanaal, blauw: CCFs) van de fluorescentie-serie getoond in A, berekend door (B) correleren de hele meting of (C) correleren 20 segmenten afzonderlijk en gemiddeld de minste vervormd CFs voor ~ 80% (groene kanaal) en ~ 50% (rode kanaal) van de segmenten. Ononderbroken lijnen vertegenwoordigen pasvorm van een twee-dimensionale diffusie-model op de gegevens. (D) volledige fluorescentie tijdreeksen en dubbel-exponentiële fit (rode lijnen) van meting gekenmerkt door aanzienlijke bleken in groen (F1) en de rode kanaal (F2). (E, F) CFs (groene: ACFs in het groene kanaal, rood: ACFs in rode kanaal, blauw: CCFs) van de fluorescentie tijdreeks weergegeven in D, berekend door (E) correleren de hele meting of (F) de bleken correctie, vergelijking 1, toe te passen correleren 20 marktsegmenten afzonderlijk en gemiddeld de minste vervormde CFs ~ 90% (beide kanalen) van de segmenten. Ononderbroken lijnen vertegenwoordigen pasvorm van een twee-dimensionale diffusie-model op de gegevens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Als een complementaire benadering van sFCCS, kan ccN & B (Figuur 1C) worden gebruikt om op te sporen van eiwit-eiwitinteractie na het mengen van de cel. In tegenstelling tot sFCCS, ccN & B geeft geen informatie over eiwit dynamiek, maar kunt meten trans interacties langs de hele cel-cel-contactpersoon in één brandvlak. Metingen op APLP1 monsters werden uitgevoerd voor en na behandeling met 50 µM ZnCl2, alsook inzake de bestrijding van de negatieve myr-palm. Deze metingen zijn gevoelig voor cel bewegingen, vooral voor zink ion behandeld monsters, langdurige overname keer ter verantwoording voor de langzame dynamiek van APLP1 clusters vereisen. Daarom werd een afbeelding uitlijning algoritme geïmplementeerd om te corrigeren voor de zijdelingse beweging van de cellen33. Ook, een boxcar filteren22 (8 frames vak grootte, ~ 5 s) werd toegepast om te verwijderen van lage frequentie schommelingen van de gemeten signalen. Deze procedure is zeer vergelijkbaar met andere filters die worden gebruikt in N & B analyse waarbij lokale gemiddeld37 of detrending18,34, maar de oorspronkelijke gegevens ongewijzigd blijft, dat wil zeggen, de pixels onafhankelijk van elkaar worden behandeld en geen gemiddeld of aftrekken van signalen wordt uitgevoerd. Deze procedure wordt effectief onderdrukt langlevende schommelingen op tijdschema's langer dan het vak grootte22. Na deze data-analyse, de helderheidswaarden van cross-correlatie voor alle monsters werden vergeleken door een bundeling van alle cel-cel contact pixels in een cross-correlatie helderheid histogram. Voor APLP1 bij gebrek aan zink ionen (figuur 6A en 6 D), een positieve gemiddelde Bcc van 0.068 ± 0.004 (bedoel ± SEM, n = 18 cellen) werd waargenomen. Na zink ion toevoeging (Figuur 6B en 6E), de B-cc -waarde verhoogd tot 0.266 ± 0.006 (bedoel ± SEM, n = 19 cellen). Voor de negatieve controle (Figuur 6C en 6F), een lagere gemiddelde helderheid van de cross-correlatie werd ontdekt (Bcc = 0.022 ± 0.002, betekenen ± SEM, n = 26 cellen). Als u wilt schatten de stoichiometrie van APLP1 complexen op cel contactpersonen, de helderheid van de APLP1-mEYFP was genormaliseerd met behulp van de gemiddelde waarde die verkregen voor myr-palm-mEYFP (dwz., de negatieve controle) en gecorrigeerd voor de hoeveelheid niet-tl eiwitten23. In overleg met de sFCCS gegevens, is de verdeling van de helderheid gecentreerd rond een waarde die overeenkomt met Dimeren (Figuur 6G), bij gebrek aan zink ionen, suggereren gemiddeld 2:2 stoichiometrie. Na zink ion behandeling, de genormaliseerde helderheid sterk verschoven naar grotere waarden, variërend van ~ 10 ~ 60 (Figuur 6H), dat wil zeggen, stoichiometries van op ten minste 10:10 of groter, weer in goede overeenkomst met sFCCS gegevens.

Figure 6
Figuur 6 . Cross-correlatie nummer en helderheid metingen van APLP1 interacties in cel contactpersonen. (A-C) Vertegenwoordiger ccN & B beeld frames van cel-cel contacten tussen APLP1-mEYFP en APLP1-mCardinal waarin HEK 293T cellen zonder (A) en met zink cellen ionen (B) of myr-palm-mEYFP en myr-palm-mCardinal uiten als negatief cross-correlatie controle (C). Schaal bars zijn 5 µm. (D-F) Cross-correlatie helderheid (Bcc) histogrammen van alle onderzochte pixels en cellen verkregen ccN & B analyse voor cel-cel contacts in APLP1 monsters (D), zink-behandeld APLP1 monsters () E) en monsters met myr-palm-mEYFP en myr-palm-mCardinal (F). (G, H) Genormaliseerd helderheid histogrammen van APLP1 monsters (G: zonder zink ionen, H: met zink ionen) voor het groene kanaal (mEYFP), verkregen uit de analyse van de helderheid van de dezelfde cellen en ROIs gebruikt voor de berekening van Bcc. Inzet in G toont een vergroting in het bereik van de genormaliseerde helderheid van -2 tot en met 10. Helderheidswaarden werden gecorrigeerd voor niet-belichting fluorescerende mEYFP op basis van N & B metingen van myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-Dimeren uitgedrukt in HEK 293T cellen, gemeten onder de zelfde voorwaarden23. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Om de ccN & B analyse, moet een zorgvuldige kalibratie van de detectoren worden uitgevoerd. Voor de experimentele opzet gebruikt in deze studie, werd de behoefte aan dergelijke een kalibratie duidelijk toen de moleculaire helderheid werd geanalyseerd in vaste monsters (dat wil zeggen, bij gebrek aan aantal schommelingen). In dit geval is de moleculaire helderheid naar nul volgens vergelijking 10, omdat de afwijking moet alleen zijn afkomstig uit de detector lawaai verwachting. Echter, toen een ROI die alleen (onbeweeglijk) achtergrondpixels bevat geanalyseerde (Figuur 7A en 7B), een positieve helderheid van ~0.1 cts./(MOL x dwell time) werd vastgesteld. Een soortgelijke waarde werd verkregen presterende N & B metingen van HEK 293T cellen uiten van glycosylphosphatidylinositol-mCherry (GPI-mCherry, Figuur 7C) met variërende laser bevoegdheden en de gemeten moleculaire helderheid te extrapoleren nul laser macht. We uitgevoerd om te corrigeren voor dit effect, een systematische kalibratie van de detector, als eerder gemeld (Zie vergelijking 12)19,20. We daarom de afwijking van de gemeten als functie van de detector graaf tarief op een steekproef uit een oplossing van gedroogde fluorescente kleurstof en bepaald de parameters S, Equation 24 en de donkere graaf tarief offset. De laatste is afkomstig van het meten van de intensiteit op nul laser kracht en was, in ons geval, te verwaarlozen. Van een lineaire pasvorm van de variantie versus intensiteit plot, wij vastbesloten, volgens vergelijking 14, een helling van S = 1.1, en een te verwaarlozen uitlezing lawaai. De aldus bepaalde waarden (S = 1.1, Equation 24 = 0, offset = 0) werden vervolgens gebruikt voor het correct berekenen moleculaire helderheid en nummer volgens vergelijkingen 12 en 13-19. U kunt ook kan een meer empirische correctie regeling gebaseerd op het feit dat een superpoissonian detector geluid, dat wil zeggen, ~ 10% grotere lawaai dan Poissonian geschoten van lawaai, zou ook het verklaren van de waarneming van een positieve moleculaire helderheid in worden toegepast pixels zonder nummer schommelingen. Met behulp van deze veronderstelling, kan de vastberaden helderheid van ~0.1 cts./(MOL x dwell time) in dergelijke pixels worden beschouwd als een constante lichtsterkte compenseren en moet dus worden afgetrokken van alle helderheidswaarden die zijn berekend met de vergelijking 10. Belangrijkst, beide benaderingen leiden tot dezelfde resultaten beschreven bij de berekening van de ratio van de helderheid, zolang er stoelen Equation 24 en offset te verwaarlozen zijn. Het is vermeldenswaard dat onder andere microscopen van hetzelfde type (hetzelfde model, dezelfde leverancier, GaAsP detectoren in foton tellen modus) verschillende S waarden werden waargenomen, benadrukken de noodzaak van een zorgvuldige detector kalibratie op elke individuele setup.

Een verdere belangrijke parameter beïnvloeden de prestaties van de detector in helderheid metingen is de detector dode tijd. Zoals eerder gebleken, de detector dode tijd de gedetecteerde moleculaire helderheid, zelfs op middellange graaf tarieven aanzienlijk kan verminderen (boven 102-103 kHz)38. Om te voorkomen dat dit artefact, moeten ofwel de metingen worden verricht tegen lagere tarieven van de graaf, of de dode tijd moet worden gekalibreerd op basis van het uitvoeren van N & B of FCS in een verdunningsreeks van, bijvoorbeeld, EGFP in bufferoplossing. Vervolgens kunnen gemeten graaf tarieven worden gecorrigeerd met behulp van een gekalibreerde dode tijd38. Voor de setup gebruikt in deze studie, bleek deze een kalibratie met behulp van N & B op verdunde kleurstof oplossingen stabiele moleculaire helderheidswaarden tot graaf tarieven van ~0.5 MHz en een bijbehorende dode tijd van ~ 6 ns (Figuur 7E). De daling tot een hoger niveau van de telling dus kan worden gecorrigeerd met behulp van een eerder gepubliceerde correctie formule38, wat resulteert in een helderheidswaarde van de constante van ~ 8 kHz/MOL.

Figure 7
Figuur 7 . De kalibratie van de detector voor aantal en helderheid analyse. (A) representatieve afbeelding van N & B metingen van HEK 293T cellen uiten van GPI-mCherry. Een ROI (blauwe onderbroken rechthoek) werd geselecteerd in de achtergrond. (B) Pixel helderheid histogram van alle pixels die overeenkomt met de ROI in Aweergegeven. De gemiddelde pixel helderheid, verkregen uit de montage van de pixel helderheid histogram met een Gauss functie, is ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Gegevens werden verkregen op 25 µs pixel Nadruktijd. Moleculaire helderheid (C) verkregen uit N & B analyse van GPI-mCherry uitgedrukt in HEK 293T cellen, gemeten op drie verschillende laser powers (6 cellen ieder 561 nm excitatie, 25 µs pixel Nadruktijd). Gegevens worden weergegeven zoals bedoel ± SD. Een lineaire regressie (rode lijn) biedt een offset waarde van 0.11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time). (D) Plot van variantie van de pixel als een functie van pixel intensiteit van N & B metingen van een gedroogde oplossing van een fluorescente kleurstof (enthousiast op 561 nm), gebundelde van alle pixels van meerdere metingen in verschillende regio's van de steekproef. De stevige rode lijn toont een lineaire pasvorm van de gegevens, wat resulteert in een helling van 1.1, verstrekken van de S-factor van de kalibratie van de detector. De moleculaire helderheid (E) als een functie van detector graaf tarief, verkregen van N & B metingen van verdunde fluorophore oplossingen (enthousiast op 488 nm). Een correctie van de eerder gepubliceerde schema38 werd toegepast met behulp van verschillende mogelijke waarden voor de detector dode tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De experimentele procedure die hier beschreven staat het onderzoek van eiwit-eiwitinteractie trans interacties bij cel contacten, fluorescentie schommelingen spectroscopie technieken, namelijk sFCCS en ccN & B. Deze methodes omvatten een statistische analyse van de schommelingen van de fluorescentie die wordt uitgestoten door twee spectraal gescheiden FPs gesmolten tot de expressie gebrachte eiwitten van belang bij een contact van twee naburige cellen, elk één of de andere fusieproteïne uitdrukken. De aanwezigheid van trans complexen wordt gekwantificeerd door het sonderen van de mate van co verspreiding van eiwitten in naburige PMs. Naast gedetailleerde protocollen op de bereiding van de monsters, data-acquisitie en analyse biedt dit artikel experimenteel bewijs van de succesvolle toepassing van de bepaling van de neuronale hechting eiwit APLP1. We laten zien dat APLP1 specifieke, homotypic trans interacties in cel contacten ondergaat. Zink ionen bevorderen, de vorming van APLP1 clusters op cel-cel-contactpersonen die bieden een multivalent platform voor trans interacties en, dus, het opwekken van nauwere trans bindend.

In tegenstelling tot de vorige tests om te ontdekken van dergelijke interactie op basis van storend biochemische methoden6, kan de gepresenteerde aanpak rechtstreeks op levende cellen, zonder de noodzaak voor fixatie of isolatie van eiwitcomplexen worden uitgevoerd. Bovendien biedt het moleculaire specificiteit en informatie door detectie van fluorescente proteïnen genetisch gesmolten tot de proteïne van belang, in tegenstelling tot eerdere kwalitatieve tests8,9. Verschillend van andere benaderingen van de fluorescentie gebaseerd zoals FRET10 en fluorescentie complementatie11is er geen verplichting voor de fluorescerende labels worden gelokaliseerd aan de extracellulaire kant (potentieel verstoren eiwit-eiwitinteractie). Toch moet worden opgemerkt dat C-terminal FPs de binding aan intracellulaire componenten, bijvoorbeeld adaptor eiwitten die interacties met het cytoskelet bemiddelen kan nog worden gewijzigd. De bepaling is met name van toepassing op zowel homo- als heterotypic interacties.

Een paar eisen voor een succesvolle toepassing van de voorgestelde bepaling zijn het vermelden waard. De uitgevoerde fluorescentie schommelingen methoden zijn gebaseerd op tijdelijke metingen waarvoor helder en photostable monomeer FPs, die een grote beperking vormt voor veel rode FPs23. Hoewel de gepresenteerde scannen regeling bijzonder goed geschikt voor het onderzoek van de langzame dynamiek van transmembraan eiwitten, die meestal in cel-cel interacties betrokken zijn is, kan nog steeds residuele photobleaching optreden. Daarom presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van de correctie schema's, dat wil zeggen, een bleken correctie voor sFCCS en boxcar filter voor ccN & B, die dergelijke verstoringen te minimaliseren. Verder, wij bespreken numerieke uitlijning algoritmen die effectief worden gecorrigeerd voor andere systematische verstoringen, zoals zijdelingse beweging van cellen, en bieden richtlijnen voor het verwijderen van tijdelijke instabiliteit. Een belangrijke bron van dergelijke instabiliteiten is vesiculaire vervoer, dat wil zeggen, intracellulaire vesikels uitvoering van de proteïne van belang die Transient het focal volume invoert. Hoewel variërend van geval tot geval, kan dit verschijnsel in het algemeen ernstig verstoren data-acquisitie en analyse. Echter, de toepassing van de correctie algoritmen verbetert de stabiliteit van de overname, waardoor uitgebreide meting tijden die moest sonde de vooral traag voor dynamiek. In dit verband moet worden onderstreept dat de aanwezigheid van diffusive dynamiek is een essentiële voorwaarde voor de methode om te werken. Het voorbeeld van zink ion gemedieerde APLP1 clustering toont een drastische voorbeeld van grote, zeer traag eiwitcomplexen (D ≈ 0,001 µm2/s) dat de techniek tot het uiterste duwen en te voorkomen dat een nauwkeurige kwantificering van de onderliggende dynamiek, als gevolg van grote lawaai geïnduceerd door de beperkte overname tijd30,17.

In dit verband, recente vooruitgang op het kammen van sFCS en super resolutie benaderingen, bijvoorbeeld scannen gestimuleerde emissie uitputting FCS (STED-FCS), voordelig kunnen zijn door middel van een kleinere focal volume en dus kleinere effectieve verspreiding keer39 ,40. Dit kan ook helpen om te lossen eiwit clusters in het geval van een inhomogene lokalisatie van de proteïne van belang bij de contacten van de cel, zoals waargenomen voor APLP1 in aanwezigheid van zink. Helaas, een cross-correlatie implementatie van scannen STED-FCS, dat wil zeggen, STED-FCCS, die worden direct hier toegepast kon, is niet met succes aangetoond nog als gevolg van de moeilijkheid van het vinden van compatibele kleurstoffen voor twee kleuren STED-FCS. In het geval van voldoende snelle dynamiek (D ≥ ~0.05 µm2/s) kunt sFCCS analyse kwantificeren van de verspreiding van eiwitten op cel-cel contacten of in andere regio's van de PM-12.

Verder een helderheid analyse kan worden uitgevoerd voor alle gegevens (sFCCS en ccN & B), verstrekken een raming van de stoichiometrie van trans eiwitcomplexen. Er moet worden opgemerkt dat de juistheid van de kwantificering van de stoichiometrie met de hoeveelheid eiwitten die in trans (dat wil zeggen toeneemt binden, als er slechts enkele cis complexen die ook van invloed kunnen zijn op de helderheid-bepaling). Helderheid analyse staat geen oplossing van mengsels van verschillende oligomere Staten, e.g.,cis monomeren en trans -tetramers. Meer in het algemeen moet opgemerkt worden dat N & B mengsels van verschillende oligomere soorten homogeen verdeeld in een monster niet oplossen. Als meerdere soorten op een pixel aanwezig zijn, zullen één enkele waarde voor helderheid gemeten (d.w.z., een gewogen gemiddelde van de helderheid van elke oligomere soort). De statistische verdeling van de waargenomen helderheidswaarden (bijvoorbeeld in verschillende pixels) is niet rechtstreeks verbonden met de relatieve hoeveelheden van oligomere soorten. U kunt oplossen door deze mengsels, andere methoden moeten worden gebruikt (bijvoorbeeld ruimtelijke intensiteit distributie analyse (SpIDA)41, foton tellen histogram (PCH)42). De kwantificering van de spectrale cross-correlatie in de sFCCS biedt ook een nauwkeurige kwantificering van de breuk van afhankelijke en niet-afhankelijke eiwitten alleen voor eenvoudige, bekende stoichiometries, bijvoorbeeld 1:1. Voor een meer complexe stoichiometrie, verdere moeten veronderstellingen plaatsvinden43. Over het geheel genomen blijft helderheid analyse een krachtig hulpmiddel van de experimentele, als het systeem van de detector en de Fractie van niet-belichting fluorescerende FPs gekalibreerd23 zijn als beschreven in de protocollen.

Hoewel de toepassing hier gepresenteerd is gericht op eiwit-eiwitinteractie in Adherente cellen, kan de bepaling worden toegepast op een breder scala van monsters, bijvoorbeeld schorsing cellen. Voor dergelijke systemen, kan correctie voor laterale cel verkeer met name cruciaal zijn. Bovendien, kan het gemakkelijk worden toegepast op model membraan systemen zoals GUVs of GPMVs, waardoor de kwantificering van de moleculaire interacties onder goed gecontroleerde omstandigheden, b.v., verschillende lipide composities of membranen ontbreekt een georganiseerde cytoskelet. Bij het uitvoeren van sFCCS op dergelijke blaasjes, verticale beweging extra signaal schommelingen kan veroorzaken, maar bij het scherpstellen op grote blaasjes kan worden geminimaliseerd. In dit verband meerdere combinaties zijn veelbelovend, bijvoorbeeld GUV- / GPMV-cel mengen12. Zoals blijkt uit een recente publicatie, kan de vorming van immuun synapsen met succes worden gemodelleerd door dergelijke systemen44. Dus, de voorgestelde bepaling zal ongetwijfeld nuttig zijn voor het onderzoek van een grote verscheidenheid van interacties van de cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) verlenen van 254850309. De auteurs bedanken Madlen Luckner voor kritische lezing van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1, (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144, (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3, (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401, (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24, (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28, (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28, (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3, (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91, (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96, (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788, (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94, (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71, (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95, (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8, (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102, (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80, (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18, (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10, (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137, (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189, (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76, (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33, (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184, (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111, (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210, (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105, (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8, (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78, (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88, (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132, (4), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics