척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Biochemistry

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Summary

마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.

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Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

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Abstract

Quantitating 그들의 의도 된 단백질 목표와 작은 분자의 상호 작용 하는 것이 신약 개발, 대상 유효성 검사 및 화학 프로브 유효성 검사에 대 한 중요 합니다. 단백질 대상 또는 작은 분자의 수정 없이이 현상을 측정 하는 메서드는 기술적으로 도전 하지만 특히 가치가 있습니다. 세포 열 교대 분석 실험 (CETSA)은 살아있는 세포에서 대상 참여 모니터링 하 한 기술입니다. 여기, 우리는 단일 세포 수준에서 subcellular 지 방화를 유지 하면서 높은 처리량 측정을 위한 수 있는 원래 CETSA 프로토콜의 적응을 설명 합니다. 우리는이 프로토콜 제공 세포의 유형이 다른 인구에서 특히 화합물 대상 상호 작용의 깊이 특성에 대 한 CETSA의 응용 프로그램에 중요 한 진보를 믿습니다.

Introduction

때 개발 하는 새로운 약물 또는 화학 프로브 측정 대상 인 또는 약혼 라이브 셀1,2,3의 관찰 된 약리 효과 또는 기능 판독 하 필수적 이다. 이러한 데이터는 작은 분자는 실제로 원하는 목표에 도달할 수 있도록 고 단백질 대상 선택4,5뒤에 생물 학적 가설을 확인 하기 위해 필요. 또한, 약물 개발 동안 증가 복잡성의 모델 시스템을 선택 하 여 확증 임상 시험 전에 복합 리드 사용 됩니다. 이러한 전 임상 시스템 생물학의 번역을 확인, 추적 마약 대상 참여와 함께이 개발 과정을 통해 생물학에 대 한 메서드는 중요 합니다.

마약-대상 참여 도전 unfunctionalized 작은 분자와 단백질, 특히 공간적 해상도6,7단일 세포 수준에서 라이브 셀에서 모니터링 하 전통적으로. 간의 상호 작용을 관찰 하는 최근 방법은 수정 되지 않은 약물 및 살아있는 세포에 있는 단백질은 세포 열 변화 분석 결과 (CETSA)는 열 도전 하 응답에서 네이티브 단백질의 ligand 유도 안정화는 정량된8, 9,10. 이것은 열 문제에 노출 된 후 남아 있는 수용 성 단백질을 측정 함으로써 이루어집니다. CETSA의 초기 공개, 서쪽 오 점 검출을 위해 사용 되었다. 심사 캠페인을 활성화 하 고 더 큰 복합 컬렉션의 심사 했다, CETSA 실험의 처리량을 증가 노력 여러 동종, microplate 기반 분석10,11의 개발을 리드를 해야 합니다. 그러나, 이러한 방법 한 가지 한계는 셀 정지에 복합 치료에 현재 가장 적합 한 하며 탐지 세포 세포의 용 해, 공간 정보의 손실에 지도 이다. CETSA 일 수 있다 실험적으로 열 집계 온도 (Tagg) ligand 유도 된 변화에 적용 작은 분자의 단일 농도 또는 ligand 농도 단일 온도에서 단백질을 안정화 하는 데 필요한. 후자은 등온선 복용량 응답 지문 (ITDRF) 이러한 측정 특정 실험 조건에의 의존을 불린다.

이 프로토콜의 목표 대상 약혼이 콘텐츠 현미경12immunofluorescent (IF) 항 체 검출에 의해 부착 셀에 CETSA를 사용 하 여 측정 하는입니다. 이 절차는 subcellular 지 방화의 절약 대상 포용의 단일 셀 정량화에 대 한 허용 하도록 원래 CETSA 플랫폼을 확장 합니다. 특히, 많은 이전 보고서와 달리이 절차에서 복합 치료 수행 됩니다 라이브 부착 세포 표면 분리 또는 열 도전, 따라서 우리가13를 측정 하는 것을 목표로 설립 된 바인딩 균형을 보존 하기 전에 세척 하지 않고. 현재 메서드는 유효성을 검사 한 대상 단백질 p38α에 대 한 (MAPK14)에 여러 셀 라인, 그리고 우리는이 절차를 공유 함으로써 기술 적용 광범위 하 게 녹는 프로테옴 바랍니다. 우리는이 프로토콜 검사에서 약물 개발 파이프라인에 걸쳐 적용할 수 있습니다, 대상 참여에서 vivo에서의 모니터링을 통해 심사 히트 예상.

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Protocol

1. 셀의 시드

참고: 워크플로 대 한 일반적인 개요에 대 한 그림 1을 참조 하십시오. 재료 및 시 약의 상세 목록 테이블의 재료에서 사용할 수 있습니다.

  1. 셀의 시드, 이전 나중 단계에서 난방 접시 아래 갇혀 공기 방울을 피하기 위해 검은 384-잘 이미징 분석 결과 접시의 프레임에 표준 드릴 구멍을 드릴 합니다. 플라스틱 입자가이 단계 동안 우물을 입력을 방지 하 고 살 균 조건을 유지 하기 위해 밀봉 접착제 알루미늄 호 일 접시 또는 조직 문화 후드에 드릴링 전에 접시 커버. 일반적으로, 각 접시 (짧은 가장자리)의 측면에 3.5 m m의 직경을 가진 3 구멍 충분.
  2. 70% 에탄올으로 청소 하 여 층 류 벤치를 준비 합니다. 표준 무 균 조직 배양 기술, 다음 셀 플라스 크 또는 접시에서 미디어를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5-10 mL로 세포 세척 하 고 플라스 크에 트립 신 2 mL를 추가 합니다. A-431 셀 분리 될 때까지 플라스 크에서 37 ° C를 품 어. Haemocytometer 또는 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 문화 매체에 50, 000 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
  3. 벌크 시 약 디스펜서 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (주는 잘 당 2000 셀 마지막 셀 밀도)의 40 µ L을 분배. 짧게 사이드-투-측면에서 접시의 바닥에 세포를 균일 하 게 분산 하는 접시를 이동 합니다.
  4. 접시 가장자리 효과 최소화 하기 위해 층 류 두건 뒤 실 온에서 20 분에 대 한 분석 결과 접시의 하단에 정착을 셀 수 있습니다. 다음, 다습 한 대기권을 보장 하기 위해 젖은 종이 타월로 플라스틱 용기에 접시를 놓습니다. 사용 전에 70% 에탄올과 플라스틱 용기를 닦아.
  5. 기존의 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 2-3 일에 대 한 분석 결과 플레이트 상자를 품 어. 가벼운 현미경으로 검사 하 여 평가는 50-75%까지 셀의 confluency를 모니터링 합니다.

2. 복합 치료

  1. 실험 당일, 잘 사용 하 여 각 접시 세탁기에서 중간 발음. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다. 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우에, 액체 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 제거할 수 있습니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 어떤 초과 액체 다음 종이 타월로 dabbing에 의해 제거 됩니다.
  2. 자동 분배를 사용 하 여 세포 배양 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피 펫 적절된 농도를 희석 하는 화합물의 30 µ L를 추가 합니다. 각 분석 결과 접시에 여러 우물을 네거티브 (DMSO)와 긍정적인 (알려진된 ligand) 컨트롤을 추가 하려면 확인 하십시오. 이후이 열 교대 분석 실험, 화합물 농도 분리 상수 관찰 단백질 안정화를 초과 하는 것이 필요 하다. 따라서, 화합물 농도 대 한 대략적인 가이드라인은 50-100 번 IC50, 하지만 화합물 농도 대 한 더 많은 세부 사항 설명을 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
    참고: 셀 라인의 DMSO 내성 실험 전에 시험 되어야 한다.
  3. 인감 숨 플레이트 화합물 처리 분석 결과 플레이트 밀봉 하 고 30 분 동안 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.

3. 열 도전

  1. 먼저, 원하는 온도에 물 목욕을 설정 합니다. 참고 분석 결과 접시의 우물 내부에 도달 최종 온도 물 목욕에 최종 온도에서 다를 수 있습니다. 더미 플레이트 및 열전대 온도계와 오프셋을 미리 조사. 그것은 일반적으로 원하는 온도에서 안정화 목욕 30 분 걸립니다.
  2. 원하는 온도 난방 단계 분석 결과 격판덮개의 우물에서에 도달 확인, 분석 결과 접시와 매체의 동일한 볼륨을 포함 하는 봉인 되지 않은 더미 플레이트를 준비 합니다.
  3. 인큐베이터에서 분석 결과 플레이트를 제거 합니다. 숨 봉인 해제 하 고 다시 물 물 목욕에 연속적인 난방 동안 우물에 누설 것 이다 되도록 꽉 접착제 알루미늄 호 일 화합물 취급 셀을 포함 하는 분석 결과 접시를 봉인. 플레이트 프레임에 드릴된 구멍 액세스할 수 있는지 확인 하십시오.
  4. 접시 아래에서 밖으로 남아 있는 공기를 물 표면으로 각도 판의 아래쪽 물 목욕에 분석 결과 접시와 접시 더미를 놓습니다.
  5. 열전대 온도계를 사용 하 여 새로운 더미 격판덮개의 우물 내부 온도 모니터링 합니다.
  6. 분석 결과 접시 물 욕조에 3 분 동안 열. 즉시 다른 물 목욕을 5 분 동안 방 강화 물 분석 결과 및 더미 플레이트 전송. 분석 결과 격판덮개는 이제 추가 처리에 대 한 준비 이다.

4입니다. 고정

  1. 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 접시에 직접 10 µ L 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA)을 분배. 20 분 동안 실 온에서 품 어.
    참고: 일부 fixatives 발암으로 분류 되 고 기관 안전 규정을 따라야 한다.
  2. PFA 솔루션 발음 하 고 접시 와셔를 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 씻어. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다.
    참고:이 절차는 최적화 되어 있는 액체는 동시에 적절 하 게 하 고 제거 접시 세탁기에 오버플로 프로토콜을 사용 하. 접시 와셔 또는 유사한 절차를 사용할 수 없는 경우 세척 단계 수동으로 수행할 수도 있습니다.
  3. 수동 세척 절차: 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 우물에서 액체를 제거 합니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 멀티 채널 피 펫으로 PBS의 80 µ L을 추가 및 위에서 설명한 대로 다시 접시를 반전, 세척 절차를 두 번 반복. 마지막 세척 후 깨끗 한 종이 수건을 초과 액체를 제거에 대 한 접시를 되 리.

5입니다. permeabilization

  1. 0.1% (v/v) NP 40를 멀티 채널 피펫으로와 웰 스의 20 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어. (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 셀을 씻어.
  2. 또는 적절 한 경우 적용 한 항 원 검색 프로토콜, 예를 들면:
    1. 멀티 채널 피펫으로와 우물에 1 %SDS 20 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 실내 온도에 incubate 고 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 씻어.
    2. PH 7.2에서 10 mM 글리신의 80 μ를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어. 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 글리신 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.

6. 차단

  1. 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 PBS에서 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 15 µ L를 추가 합니다. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.

7. 1 차 항 체

  1. 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 차단 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.
  2. 1 차적인 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.

8. 2 차 항 체

  1. 1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 (단계 4.2) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 우물을 세척.
  2. 알 렉 사 488 이차 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에. 1 시간 동안 실 온에서 품 어. 빛 으로부터 보호 하기 위해 접착제 알루미늄 호 일 인감과 접시를 봉인.
    참고:이 빛에서 접시와 후속 단계를 보호 합니다.

9. 핵 얼룩 및 셀 마스크

  1. 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물 PBS에 0.05 mg/mL를 희석 하는 핵 염색의 10 µ L를 추가 합니다. 추가 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
  2. 이차 항 체 및 Hoechst 솔루션 aspirate과 웰 스 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
  3. 셀 마스크 200 ng/mL PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 희석의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
  4. 셀 마스크 솔루션을 발음 하 고 우물 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
  5. 접시 와셔, 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 모든 우물에 PBS의 60 µ L를 분배 하 고 밀봉 접착제 알루미늄 호 일로 접시.

10. 이미지 수집 및 분석

  1. 3 형광 채널을 사용 하 여 높은 콘텐츠 영상에 이미지 캡처: DAPI (387/447), GFP (472/520) 및 TexasRed (562/624). 10 X 목표를 사용 하 여 잘 당 4 이미지를 취득 합니다. 자동된 레이저 자동 초점을 사용 하 고 범주화 2 중 적용. 16 비트, 회색 스케일 tiff 파일로 메타 데이터와 함께 이미지를 저장 합니다.
  2. 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. DAPI (핵)와 TexasRed (세포질) 셀 점수 알고리즘을 사용 하 여 셀 경계를 식별 합니다.
  3. 추가 데이터 분석에 대 한 모든 인수 파장에 대 한 평균 강도 추출 합니다.
  4. 분석 결과의 안정성을 보장 하기 위해 Z 요소를 계산 합니다.
  5. 다음 수식을 사용 하 여 % 안정화 계산: 100 * (1-(잘 강도-평균 잘 휘도 부정적인 제어) / (평균 휘도 긍정적인 제어 평균 강도 부정적인 제어)). 여기 부정적인 제어 DMSO 이며 긍정적인 컨트롤 참조 물질 이다. 각 화합물에 대 한 최대 및 최소 안정화 농도 제어 우물의 강도 값 대신 가끔 사용 됩니다 이후 최대 안정화 화합물 사이 다를 수 있으며 실제로 ITDRF 곡선에 대 한 긍정적인 통제 보다 클 수, .

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Representative Results

그림 1 에 설명 된 프로토콜에서는 높은 콘텐츠 영상으로 남아 있는 수용 성 단백질의 탐지와 부착 세포에 CETSA 분석 실험을 실행 하기 위한 기본 워크플로 설명 합니다. 이 워크플로 화합물 또는 약14의 격판덮개 레이아웃을 수정 하 여 쉽게 분석 결과 개발의 모든 단계에 맞게 수 있습니다. 우리 선발 예상된 결과 예상 몇 가지 사용 하는 경우 아래.

항 체 식별 및 분석 결과 개발입니다. 성공적인 결과 대 한 필수 구성 요소는 기본 항 체 또는 선택적으로 열 동안 집계 및 침전 된 단백질의 단백질의 기본 형태를 인식 하는 다른 적합 한 선호도 시 약의 식별 3 단계에 도전 한다. 설정 하려면 여기에 설명 된 CETSA 이미징 분석 결과, 우리는 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 간의 신호 창 52 ° C에서 p38α를 대상으로 하는 9 항 체의 패널 상영. 우리는 다음 최고의 항 체 적정 하 고 p38α 알려진된 ligand (긍정적인 제어)와 DMSO (부정적인 컨트롤)에 의해 안정화에 대 한 면역 형광 이미지 대표 그림 2 A, B 에 표시 된 조건에 정착. 항 체 인식 한다 또한 하지 중단 될 대상 단백질 ligand 바인딩 (그림 2C)에 의해 유도 될 수 있는 구조적 변화에 의해. 예를 들어, BIRB796는 요금에서 긴 및 대상 참여의 정량화는 (5.2; 항 원 검색 단계를 적용 하 여만 가능 그림 2D)입니다. 그것은 가능한 경우 대상 단백질의 다른 바인딩 사이트를 포함 하는 알려진된 ligands와 기본 항 체의 성능을 확인 해야 합니다. 모두와 함께 항 원 검색 단계 없이 항 체 확인 선호 이루어집니다.

Tagg 및 ITDRF 곡선. 위에서 설명 했 듯이, 두 가지 모드, Tagg 곡선 및 ITDRF 실험에서 CETSA 실험을 실행할 수 있습니다. 두 이체 다 프로토콜 섹션에서 그림 1 에 설명 된 동일한 기본 프로토콜을 사용 합니다. 첫 번째 설치에서 목적 온도 그라데이션으로 셀에 도전 하 여 존재에 ligand의 단일 농도 Tagg 곡선을 비교입니다. Tagg 곡선을 수행 하려면 별도 접시는 3 분에 대 한 온도 범위에서가 열. 이 실험을 수행, 각 접시 물 목욕을 새로운 온도를 안정화 하는 데 걸리는 시간으로 복합 치료 길이 시간이 중요 하다. 이와 관련, peforming 및 열 도전 물 목욕에 단계는 PCR 기계에 튜브가 열 보다 더 많은 시간이 소요. 실험적인 경로 ITDRF 곡선을 생성 하기 위해 고정된 온도에 ligand의 다음 실행된 농도 응답 곡선입니다. 일반적으로, 여러 화합물을 테스트 하는 경우 복합 추가 대 한 분석 결과 준비 번호판 자동된 액체 처리를 사용 하 여 가장 재현할 수 데이터를 달성 하기 위해 준비가 되어있습니다. 화합물은 DMSO에 순차적으로 희석 하 고 원하는 농도에 세포 배양에 녹아. 우리는 일반적으로 3 또는 4 배 희석, µ M 50-100에서 시작 하는 11 포인트 집중 시리즈를 테스트 하지만이 사용 하는 ligands의 힘에 따라 다릅니다. 먼저 Tagg 곡선 모두는 ligand의 존재와 부재에 설정 곡선 사이 변화를 관찰할 수 있는 후속 등온 실험 온도 선택 하는 것이 좋습니다. 주위 또는 Tagg바로 위에 선택한 온도 이어야 한다. 두 형식 모두 대상 포용의 확인에 대 한 허용 하지만 복합 화력 ITDRF의 순위에 대 한 실험은 종종 더 적당 한. 그림 3A Tagg 곡선에 대 한 예상된 정량된 결과의 그림을 표시 하 고 그림 3B 는 전형적인 ITDRF 실험의 결과 단정.

캠페인을 심사. 프로토콜 또한 심사 대상 단백질의 비 발한 바인더를 식별 하는 캠페인을 적용할 수 있습니다. 이 경우에, 등온 열 도전 단일 농도 확인 된 안정 된 화합물을 위한 ITDRF 실험 뒤에 화합물의 많은 수를 위해 적용 됩니다. 우리 시험 준비 심사 접시를 준비 하 고 자동된 액체 처리를 사용 하 여 분석 결과 판 문화 미디어에 희석 하는 화합물을 전송. 모든 열 안정성 분석, 것과 같이 관찰 단백질 안정화, 분리 상수를 초과 하는 데 필요한 이며 따라서 우리 히트 식별을 용이 하 게 하 50 µ M에서 작은 분자 라이브러리 적용. 순위 및 우선 순위 지정이이 화합물의 ITDRF를 사용 하 여 조회 수의 심사 후 허락할 것 이다. 그림 4 는 심사 접시에서 대표적인 결과 보여준다.

Figure 1
그림 1 . 이 문서에서 설명 하는 프로토콜의 개요 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 항 체 식별 및 분석 결과 개발입니다. A) A-431 세포에 인간 p38α의 검색을 위한 예제 데이터. 대표 이미지 (1 µ M AMG548) (DMSO) 컨트롤을 제외 하 고. 레드-핵 Hoechst 얼룩, 그린-p38α 얼룩. 10 배 확대;로 찍은 이미지 흰색 눈금 막대 나타냅니다 73 µ m. B) 평균 강도/셀으로 정량된 데이터의 예. 오차 막대는 6 별도 번호판에 대 한 16 복제의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 각 접시 뒤에 셀, permeabilization 및 후속 immunostaining의 고정 물 욕조에 52 ° C에가 열 했다. A-431 셀 치료 후 C) 면역 형광 신호 강도 측정 1 µ M와 BIRB796 또는 DMSO 위에서 설명한 뒤 직접 고정. 난방 단계의 부재에서 BIRB796 신호 BIRB796이 항이 체와 p38α의 검색을 방해 하는 것을 건의 하는 DMSO 신호 보다 낮습니다. 셀 D) ITDRFCETSA 곡선 BIRB796 치료 (파란색 삼각형)로 또는 (회색 삼각형) 항 원 검색 프로토콜 없이. 이 그림은 Axelsson 그 외 여러분 201812에서 수정 되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 열 집합 및 ITDRF 실험. 셀 A) 열 집계 곡선 실험 긍정적인 치료 (1 µ M AMG548, 오렌지에서) (회색에서 DMSO) 컨트롤을 부정. 오차 막대는 32 또는 464 복제의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 셀에 대 한 52 ° C에서 B) ITDRFCETSA 실험 SB203580 파란색에서, 녹색에서 Skepinone-L의 직렬 희석 대우와 빨간색으로 RWJ67657. 오차 막대는 6 복제의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 정량된 데이터 평균 강도/셀으로 표현 하 고 각 화합물의 높은 농도 대 한 정규화 됩니다. 이 그림은 Axelsson 그 외 여러분 201812에서 수정 되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 10 배 확대에서 상영 판의 대표 개요. 긍정적인 컨트롤 (1 µ M AMG548) 열 2와 24 이며 부정적인 컨트롤 (DMSO) 열 1, 23에에서. 다른 모든 우물 여러 안타 표시와 함께 심사에 대 한 사용 라이브러리 화합물의 50 µ M를 포함. 삽입 된 그림에서 오른쪽 아래 모서리에 흰색 라인 200 µ m을 나타냅니다. 이 그림은 Axelsson 그 외 여러분 201812에서 수정 되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

결과 섹션에서 설명 했 듯이, 절차를 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 높은-품질 선호도 시 약을 식별 하는 것이 중요입니다. 각 원하는 대상에 대 한 항 체의 작은 도서관을 심사 하는 것이 좋습니다. 1 차적인 항 체를 선택한 후 적절 한 단백질 대상의 다른 바인딩 사이트의 숫자에 대 한 시스템의 유효성을 검사 하는 것이 중요 이기도 합니다. 열 문제를 생략 하 여 그림 2C 와 같이 분석 결과 신호 방해 하는 화합물에 대 한 카운터 검사는 매우 좋습니다. ligand의 존재에 있는 감소 된 신호를 관찰 하는 때 단계 5.2에서에서 설명한 대로 항 원 검색 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 플레이트의 고르지 못한 난방 관찰된 데이터 변동 및 격판덮개 변형을 일으킬 수 있습니다. 접시 부분적으로 (3.4 단계) 과도 열 도전 하는 동안 물 욕조에 잠긴 이후 플레이트의 외부 우물 외부 벽을 통해 뿐만 아니라 우물의 바닥에서 뿐만 아니라 뜨거운 물에 노출 됩니다. 이 같은 침수 시간 동안 접시와 후속 접시 가장자리 효과의 외부 우물에서 높은 온도 발생할 수 있습니다. 따라서, 격판덮개의 외부 우물을 방지 하는 것이 좋습니다. 기포는 뜨거운 물과 우물의 바닥 사이 충분 한 접촉을 방지 난방 단계 접시 아래 갇혀 경우 비슷한 효과 또한 볼 수 있습니다. 열 이미징 접시와 과제를 감안할 때, 장치 및 열 노출에 대 한 구체적으로 만든 접시 도움이 될이 방법을 사전. 우리 여러 셀 라인의 사용을 탐험 하 고 부착 셀 형식에 대 한 열 도전 후 표면 부착에 다양성을 발견 했다. 우리 실험실에서 예비 실험 Synthemax II-SC 또는 셀 탁 같은 코팅 또는 세포 외 매트릭스를 사용 하 여 셀 분리를 최소화할 수 있지만 반 연결 된 셀 형식을 사용할 때이 기술 도전 포즈 수 것이 좋습니다. 복합 치료는 라이브 셀에서 수행 하 고, 이후 작은 분자 세포 투과성 이어야 합니다. 화합물은 막 투과성, 대체 높은 처리량 CETSA 메서드는 권장 됩니다. 일부 화합물 그들의 타겟 단백질11에 바인딩할 metabolically 활성화 될 필요가 있다. 이러한 경우에 더 이상 치료 셀 열 도전 하기 전에 화합물을 것이 좋습니다.

이 프로토콜에는 높은 처리량 캠페인 상영 의무가 만들기 이미징 하 시드 셀에서 단일 플레이트를 필요 합니다. 각 실험에 대 한 셀 수는 서쪽 오 점 달성 될 수 있다 보다 훨씬 낮은 또는 이전 AlphaScreen 분석 실험15. 또한, 세척 또는 복합 가용성 및 바인딩을 변경할 수 있습니다, 셀 분리 단계 제거 됩니다 열 도전 단계를 통해 설립된 바인딩 평형 유지. 이전 절차와는 달리 세포 독성으로 인해 신호의 부족은 동시에에 핵 얼룩에 의해 보고 됩니다. 마지막으로, 이미징 대상 셀 또는 셀 상태의 혼합된 인구에 있는 약혼 측정에 대 한 수 있도록 개별 셀의 공간 해상도 유지 합니다.

진정으로 평가 방식의 적용, 녹는 프로테옴 걸쳐 기법을 적용 하는 공동된 노력 필요 합니다. 같은 실험 적합 한 선호도 시 약, 나머지의 네이티브 단백질에 선택적으로 보고 변성 그리고 단백질 집계를 식별 용이성을 명확히 것 이다. 우리가 현재 알지 어떻게 단백질 표정 수준 신호 창 안정적으로 측정 하는 능력에 영향을 미칠 것입니다. 우리는이 선호도 사용 가능한 항 체의 선택도 반영 하 고 낮은 풍부한 단백질에 대 한 immunofluorescent 분석 실험에서 신호를 향상 하는 데 사용 하는 기술이 적용 될 것을 기대 합니다. 또는 태그 단백질 또는 기능성된 화합물 검출 기술된 프로토콜의 수정된 버전에 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹아 대상 및 상호 작용에 대 한 제한 같지는 안정화를 관찰 될 수 있다. 예를 들어, 내 인 성 ligands exogenous ligand에 의해 더 안정화 수 있는 살아있는 세포 분석 실험에 있는 단백질을 안정 수 있습니다. 여기 탐험 하지, 하지만 우리는 그것은 동시에 여러 대상의 연구에 대 한 허용 하도록 다중 판독 또는 다운스트림 이펙터와 대상에 수 있을 것입니다 믿습니다. 더 학문은 제자리에 CETSA의 이러한 측면을 조사 하는 데 필요한.

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Disclosures

저자 아무 공개 보고 있다.

Acknowledgments

저자는 과학 생활 연구소와 카롤 린스 카 Institutet 위한 인프라 지원을 인정합니다. 저자는 또한 입력과 Michaela Vallin, 막달레나 Otrocka와 토마스 Lundbäck 토론을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

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References

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