利用高含量成像对增强细胞中的目标参与进行量化

Biochemistry

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Summary

药物靶向接触的测量是有效药物开发和化学探针验证的核心。在这里, 我们详细介绍了一种在细胞热转移分析 (cetsa) 的微板兼容适应中使用高含量成像测量药物靶点接触的协议。

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Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

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Abstract

量化小分子与其预期蛋白质靶标的相互作用对于药物开发、目标验证和化学探针验证至关重要。在不改变蛋白质靶点或小分子的情况下测量这种现象的方法特别有价值, 尽管在技术上具有挑战性。细胞热转移分析 (cetsa) 是监测活细胞中目标参与的一种技术。在这里, 我们描述了对原始 cetsa 协议的改编, 该协议允许进行高吞吐量测量, 同时在单个单元级别保持亚细胞定位。我们相信该协议为 cetsa 在复杂目标相互作用的深入表征方面的应用提供了重要的进展, 特别是在细胞的异质种群中。

Introduction

在开发新药或化学探针时, 必须将观察到的药理作用或功能读数与目标占位或参与活细胞 1,2,3的测量结合起来。这些数据是必要的, 既可以确保小分子实际上达到其预期目标, 也可以验证蛋白质靶标选择4,5背后的生物学假设。此外, 在药物开发过程中, 在临床试验之前, 使用日益复杂的模型系统来选择和证实铅化合物。为了确认生物学在这些临床前系统中的翻译, 在整个开发过程中追踪药物靶手和伴随的生物学的方法至关重要。

药物靶向参与传统上是一个具有挑战性的小分子和蛋白质的活细胞监测的难题, 特别是在具有空间分辨率6,7的单细胞水平.最近观察未修饰药物与活细胞中蛋白质相互作用的方法之一是细胞热转移试验 (cetsa), 在该方法中, 配体诱导的本地蛋白质在应对热挑战时的稳定性量化8, 9,10。这是通过量化剩余的可溶性蛋白质后暴露在热挑战。在 ctsa 的首次公开中, 使用了西方印迹进行检测。为了能够进行筛选活动和对较大的化合物集合进行分类, 为提高 cetsa 实验的吞吐量所做的努力导致了几个均匀的、基于微板的检测1011的开发。然而, 这些方法的一个局限性是, 它们目前最适合在细胞悬浮液中进行复合治疗, 检测需要细胞裂解, 导致空间信息丢失。ctsa 可以在实验中应用, 既可以作为在单个分子浓度下的热聚集温度 (tagg) 的配体诱导转移, 也可以应用于在单一温度下稳定蛋白质所需的配体浓度。后者被称为等温剂量响应指纹 (itdrf), 以表示这些测量的依赖性于特定的实验条件。

该方案的目的是利用 cetsa 在粘附细胞中的靶点接触进行免疫荧光 (if) 抗体检测,并进行高含量显微镜12。此过程扩展了原始的 cetsa 平台, 允许对目标参与进行单细胞量化, 并对亚细胞定位进行保护。值得注意的是, 与以往许多报告不同的是, 在这一过程中, 复合治疗是在活体粘附细胞中进行的, 在热挑战之前没有表面分离或清洗, 从而保持了我们旨在测量13的既定结合平衡。目前, 该方法已被验证为一个目标蛋白 p38α (mapk14) 在几个细胞系, 我们希望通过分享这个程序的技术可以广泛地应用于整个融化蛋白质组。我们预计, 该协议可以在整个药物开发过程中进行调整, 从筛选、打击试验到监测体内的目标参与。

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Protocol

1. 细胞的播种

请注意:有关工作流的一般概述, 请参见图 1。材料和试剂的详细清单可在材料表中找到。

  1. 在播种细胞之前, 在黑色384孔成像检测板的框架内安装带有标准钻头的钻孔, 以避免气泡在加热步骤后被困在板下。为了避免塑料颗粒进入井在这一步骤中, 并保持无菌条件, 密封板与粘合剂铝箔或覆盖板之前, 在一个组织培养罩钻孔。通常情况下, 3 孔的直径为3.5 毫米的每一侧的板 (短边缘) 足够。
  2. 用70% 乙醇清洗, 制备层流工作台。遵循标准的无菌组织培养技术, 从细胞瓶或盘子中去除培养基。用5-10 毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞, 然后在烧瓶中加入2毫升胰蛋白酶。在37°c 下培育烧瓶, 直到 a-431 细胞分离。使用血细胞计或细胞计数器对细胞进行计数。在培养基中制备 50, 000 细胞悬浮液。
  3. 根据实验的规模, 使用散装试剂分配器或多通道管道, 将40μl 细胞悬浮液 (给出每口 2, 000 细胞的最终细胞密度) 分配到检测板的每一口井中。简单地将板从一侧移动到另一侧, 将细胞均匀地分散在板的底部。
  4. 为了最大限度地减少板缘效应, 让细胞在层流罩后部的室温下在检测板底部沉淀20分钟。然后, 将盘子放在塑料容器中, 用潮湿的纸巾, 以确保潮湿的气氛。使用前, 请用70% 乙醇擦拭塑料容器。
  5. 在37°c 条件下用检测板孵育箱体 2-3天, 在传统的加湿孵化器中孵育 5% co 2。通过光学显微镜的目视检查, 监测细胞的融合程度, 直至50-75。

2. 复合处理

  1. 在实验当天, 使用板式垫圈从每口井中吸气介质。将板材放在板垫圈上, 然后选择吸气程序。如果没有板式垫圈, 则可以通过将盘子倒置, 用快速的手扭动在废纸盘或水槽上, 来去除液体。完全去除液体是良好的性能所必需的。然后用纸巾擦拭, 去除多余的液体。
  2. 根据实验的规模, 使用自动点胶或多通道移液器, 在细胞培养培养基中加入30微米稀释的化合物。确保在每个检测板上的几口井中添加负 (dmso) 和阳性 (已知配体) 控制。由于这是一种热转移试验, 因此为了观察蛋白质的稳定, 化合物浓度必须超过离解常数。因此, 化合物浓度的粗略指南是 ic50的50-100 倍, 但在讨论部分中找到了关于化合物浓度的更详细的说明。
    注: 应在实验前测试细胞系的 dmso 耐受性。
  3. 用透气板密封密封复合处理的检测板, 在37°c 和 5% co 2 中加湿孵化器中孵育 30分钟。

3. 热挑战

  1. 首先, 将水浴设置为所需的温度。请注意, 检测板井内达到的最终温度可能与水浴中的最终温度不同。用假板和热电偶温度计事先调查偏移情况。在所需的温度下, 洗澡水通常需要30分钟才能稳定。
  2. 为了验证在加热步骤中检测板的井中是否达到了所需的温度, 请制备一个未密封的假板, 其中含有与检测板相同体积的介质。
  3. 从孵化器中取出检测板。取下透气的密封件, 用紧密的粘合铝箔重新密封含有复合处理过的细胞的检测板, 以确保在随后的水浴加热过程中不会有水泄漏到水井中。确保板架上的钻孔是可访问的。
  4. 将检测板和假板放置在水浴中 , 板底部向水面倾斜 , 以迫使剩余的空气从板出。
  5. 使用热电偶温度计监测新假板井内的温度。
  6. 在水浴中加热检测板3分钟。立即将检测结果和假板转移到另一个水浴中, 用室温水冷却5分钟。检测板现在已准备好进行进一步加工。

4. 固定

  1. 使用散装试剂分配器或多通道移液器将 10μl 16% (w/v) 的甲醛 (pfa) 直接分配到检测板。在室温下孵化20分钟。
    注: 有些固定方法被归类为致癌物质, 应遵守机构安全条例。
  2. 使用平板垫圈, 使用 300μl pbs 对细胞进行吸气和清洗。将板材放在板垫圈上, 然后选择吸气程序。
    注: 此过程已使用板式垫圈上的溢出协议进行了优化, 在该协议中, 液体同时被分配和取出。如果没有板式垫圈或类似的程序, 也可以手动完成清洗步骤。
  3. 手动清洗程序:用快速的手在废纸盘或水槽上扭动盘子, 将液体从井中取出。完全去除液体是良好的性能所必需的。加入80μl 的 pbs 与多通道移液器, 并再次反转板, 如上所述, 重复清洗过程两次。最后清洗后, 将盘子涂在干净的纸巾上, 去除多余的液体。

5. 渗透性

  1. 在多通道移液的井中加入 20μl 0.1% 的 np-40, 并在室温下孵育10分钟。使用上述相同的步骤清洗细胞 (步骤 4.2)。
  2. 或者, 在适当的情况下, 应用抗原检索协议,例如:
    1. 在多通道管道的井中加入20μl 的 1% sds。在室温下孵化 5分钟, 并按照上述相同程序清洗 (步骤 4.2)。
    2. 在 ph 值7.2 下加入80μl 的 10 mm 甘氨酸, 在室温下孵育10分钟。通过放置在板垫圈上并选择吸气协议, 使用板式垫圈对甘氨酸溶液进行吸气。如果没有板式垫圈, 请参见2.1 和4.2 中的注释。

6. 阻塞

  1. 在 pbs 中使用散装试剂分配器或多通道移液器在井中加入15μl 的 1% (w/v) 牛血清白蛋白 (bsa)。在室温下将板材加氢 1小时, 或在4°c 下用铝箔板密封进行隔夜。

7. 原发抗体

  1. 通过放置在板垫圈上并选择吸气协议, 使用板式垫圈对堵塞溶液进行吸气。如果没有板式垫圈, 请参见2.1 和4.2 中的注释。
  2. 在 pbs 中的 1% (w/v) 中, 在使用多通道管道的井中加入10μl 的原代抗体, 并相应地稀释 bsa。在室温下将板材加氢 1小时, 或在4°c 下用铝箔板密封进行隔夜。

8. 继发性抗体

  1. 吸收主要抗体溶液, 并按照上述相同的程序清洗水井 (步骤 4.2)。
  2. 在 pbs 中添加10μl 的亚历克莎488二级抗体, 并在 1% (w/v) bsa 中相应稀释。在室温下孵化1小时。用粘合剂铝箔密封板, 以防止光线照射。
    注: 在此步骤和后续步骤中保护板材不受光线照射。

9. 核染色和电池面膜

  1. 在 pbs 中稀释至 0.05 mgml 的核染料中加入 10μl, 并使用多通道管道将其添加到井中。在室温下额外孵化10分钟。
  2. 吸收二级抗体和 hoechst 溶液, 并使用上述相同的程序清洗水井 (步骤 4.2)。
  3. 使用多通道管将在 pbs 中稀释至 200 ngml 的细胞掩模加入10μl。在室温下孵化30分钟。
  4. 使用上述相同的步骤 (步骤 4.2), 对细胞面膜溶液进行吸气和清洗。
  5. 使用板材垫圈、散装试剂分配器或多通道移液装置向所有油井分配 60μl pbs, 并用粘合剂铝箔密封板材。

10. 图像采集与分析

  1. 使用3个荧光通道在高含量成像仪上捕获图像: dapi (387/447)、gfp (472/520) 和 texasred (562/624)。使用10倍目标, 每口井获取4张图片。使用自动激光自动对焦, 并在采集过程中应用分翼2。将图像存储为 16位, 灰色缩放文件以及元数据。
  2. 使用可用的软件分析图像。使用带有 dapi (细胞核) 和 texasred (细胞质) 的细胞评分算法识别细胞边界。
  3. 提取所有获得波长的平均强度, 以便进一步进行数据分析。
  4. 计算 z 因子, 以确保检测的稳定性。
  5. 使用以下公式计算% 稳定: 100 * (1-(井强度-平均井强度负控制)/(平均强度正控制平均强度负控制))。负控制是 dmso, 正控制是参考物质。由于化合物之间的最大稳定性可能不同, 实际上大于 itdrf 曲线的正控制, 因此有时使用每个化合物的最大和最小稳定强度来代替控制井的强度值.

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Representative Results

图 1中概述的协议描述了通过高含量成像检测剩余可溶性蛋白质, 在粘附细胞上运行 cetsa 检测的基本工作流程。通过修改化合物或试剂的板材布局, 可以很容易地适应分析开发的所有阶段.我们详细介绍了以下几个预期用例的预期结果。

抗体鉴定和检测开发。成功结果的先决条件是鉴定一种初级抗体或其他合适的亲和力试剂, 在高温过程中形成的聚集和沉淀的蛋白质存在的情况下, 选择性地识别蛋白质的原生形式步骤3中的挑战。为了建立这里描述的 cedsa 成像检测, 我们筛选了一个由9个抗体组成的面板, 针对52°C 的 p38α, 用于正负对照之间的信号窗口。然后, 我们滴定了最佳抗体, 并确定了图 2 a, b 中显示的条件与代表性免疫荧光图像的 p38α稳定的已知配体 (阳性控制) 和 dmso (负对照)。抗体识别也不应该被分配结合可能引起的目标蛋白的构象变化所破坏 (图 2c)。例如, BIRB796 具有很长的关断率, 只有应用抗原检索步骤 (5.2;图 2d)。重要的是要验证的性能的主要抗体与已知的配体涵盖不同的结合位点的目标蛋白质, 如果可用。抗体验证最好是在有抗原检索步骤和不带抗原提取步骤的情况下进行。

t agg和 itdrf 曲线.如上所述, ctsa 实验可以在两种不同的模式下运行, tagg曲线和 itdrf 实验。这两种变体都使用图 1和协议部分中概述的相同基本协议。在第一个设置中, 目的是挑战具有温度梯度的细胞, 并在单浓度配体存在和不存在的情况下比较 t曲线。要执行 tagg曲线, 在不同的温度范围内加热单独的板3分钟。在进行本实验时, 重要的是要将每个板材的复合处理长度与水浴稳定到新温度所需的时间进行计时。在这方面, 在水浴中进行加热挑战步骤比 pcr 机器中的加热管更耗时。实验路径是在固定温度下生成配体的下一步运行浓度响应曲线, 以生成 itdrf 曲线。一般情况下, 在测试多种化合物时, 使用自动液体处理制备化合物添加的检测准备板, 以获得最可重现的数据。化合物在 dmso 中连续稀释, 然后在细胞培养基中溶解到所需的浓度。我们通常在3或4倍稀释中测试11点浓度系列, 从50-100μm 开始, 但这取决于所使用的配体的效力。建议首先在没有配体的情况下建立 t曲线, 并为随后的等温实验选择温度, 在这些实验中可以观察到曲线之间的变化。所选温度应在 t琼脂周围或正上方。这两种格式都允许确认目标参与, 但对于复合亲和力 itdrf 实验的排名通常更合适。图 3a显示了 tagg曲线的预期量化结果,图 3A量化了典型的 itdrf 实验的结果。

筛选活动。该协议还可以适应筛选运动, 以确定目标蛋白的新粘合剂。在这种情况下, 等温热挑战应用于大量的化合物在一个单一的浓度, 然后 itdrf 实验确定的稳定化合物。我们准备了制备的检测准备筛选板, 并使用自动液体处理将培养基中稀释的化合物转移到检测板。与所有热稳定性检测一样, 有必要超过离解常数来观察蛋白质的稳定性, 因此我们在50μm 时应用了小分子库, 以方便命中识别。使用 itdrf 对点击率进行测试后, 将允许对这些化合物进行排名和优先排序。图 4显示了一个具有代表性的筛选板的结果。

Figure 1
图 1.本文中描述的协议的原理图概述.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.抗体鉴定和检测开发。a) 用于检测 a-431 细胞中人类 p38α的示例数据。正面 (1μm amg548) 和负 (dmso) 控制的代表性图像。红核 hoechst 染色, greenp-p38α染色。使用10倍放大倍率拍摄的图像;白标表示 73μm. b) 以平均强度/细胞表示的量化数据示例。误差条表示6个独立板的16个副本平均值的标准误差。每个钢板在水浴中加热到 52°c, 然后固定细胞, 渗透和随后的免疫染色。c) 用上述1μm 治标或 dmso 治疗 a-431 细胞后测量免疫荧光信号强度, 然后直接进行固定。在没有加热步骤的情况下, BIRB796 信号低于 dmso 信号, 这表明 BIRB796 使用该抗体中断了 p38α的检测。d) 由 bird 796 处理的细胞的 itdrfcetsa 曲线, 有 (蓝色三角形) 或没有 (灰色三角形) 抗原回收协议。这一数字已从 axelsson等2018年12号提出.版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.热聚合和 itdrf 实验.a) 用阳性 (1μm amg548, 橙色) 和负 (灰色 dmso) 处理的细胞的热聚集曲线实验。错误条表示32或464复制平均值的标准误差。b) itdrfcetsa实验在52°c 下对使用 sb203580 系列稀释剂的细胞进行了实验, 用蓝色稀释, 用绿色的 skepinone-l, 用红色的 rwj67657 进行。错误条表示6个复制平均值的标准错误。定量数据以平均强度细胞表示, 并对照各自化合物的最高浓度进行归一化。这一数字已从 axelsson等2018年12号提出.版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.具有10倍放大倍率的筛分板的代表性概览.正控制 (1μm amg548) 在第2栏和第24栏, 负对照 (dmso) 在第1栏和第23列中。所有其他井都含有50μm 的库化合物, 用于筛选, 并表示了几次命中。在插入图中, 右下角的白线表示200μm。这一数字已从 axelsson等2018年12号提出.版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

如结果部分所述, 该过程有几个关键步骤。首先, 确定高质量的亲和力试剂是很重要的。我们建议为每个所需的目标筛选一个小型抗体库。在选择了初级抗体后, 如果合适的情况下, 验证蛋白质靶点的一些不同结合位点的系统也很重要。非常鼓励通过省略热挑战来反筛选干扰检测信号的化合物, 如图2所示。当观察到配体存在的减少信号时, 可以测试步骤5.2 中描述的抗原检索协议。板材加热不均匀会导致观测数据的波动和板对板的变化。由于板材在瞬态热挑战期间部分被淹没在水浴中 (步骤 3.4), 板材的外井不仅暴露在井底的热水中, 而且还通过外壁暴露在热水中。这可能会导致较高的温度在相同的淹没时间在相同的淹没时间在板的外井和随后的板边缘效应。因此, 建议避免板的外井。如果在加热步骤中气泡被困在板下, 防止热水与井底充分接触, 也可以看到类似的影响。考虑到加热成像板的挑战, 专门为暴露于高温而制作的器件和板可以帮助推进这种方法。我们探讨了几种细胞系的使用, 并在粘附细胞类型的热挑战之后发现了表面附着的变异性。在我们的实验室进行的初步实验表明, 使用涂层或细胞外基质, 如 synthemax ii-sc 或 cell-tak, 可以最大限度地减少细胞分离, 但这可能会带来技术挑战, 当使用半连接的细胞类型。由于复合治疗是在活细胞中进行的, 因此小分子必须具有细胞渗透性。如果该化合物不是膜渗透性的, 则建议采用其他高通量 ctisa 方法。有些化合物需要通过代谢激活才能与其目标蛋白结合 11.在这种情况下, 建议在热挑战之前使用该化合物进行更长的处理细胞。

该协议需要一个单一的板块, 从细胞播种到成像, 使其适合高通量筛选活动。每个实验的细胞数量远远低于西方印迹或以前的 alphasen 检测15所能达到的水平.此外, 洗涤或细胞分离步骤, 这可能会改变化合物的可用性和结合, 通过热挑战步骤保持既定的结合平衡。与以前的程序不同, 核染色同时报告了由于细胞毒性而缺乏信号的情况。最后, 成像保留了单个细胞的空间分辨率, 允许在细胞或细胞状态的混合群体中进行目标接触测量。

为了真正评估该方法的适用性, 需要协同努力, 将该技术应用于熔化的蛋白质组。这些实验将澄清识别合适的亲和力试剂的难易程度, 这种试剂在剩余变性和聚合蛋白存在的情况下, 有选择地报告原生蛋白质。我们目前不知道蛋白质表达水平将如何影响可靠测量信号窗口的能力。我们预计这将反映可用抗体的亲和力和选择性, 并预计对于低丰富的蛋白质技术, 用于增强免疫荧光检测的信号将是适用的。或者, 标记的蛋白质或功能化化合物可用于在所述协议的修改版本中进行检测。该协议仅限于融化的目标和可以观察到可量化稳定的相互作用。例如, 内源性配体可以稳定活细胞检测中的蛋白质, 这可能会阻止外源配体的进一步稳定。虽然这里没有探讨, 但我们相信, 可以同时进行多重读数, 以便同时研究多个目标, 或使用下游效应器研究一个目标。有必要进一步研究就地 cetsa 的这些方面。

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Disclosures

提交人没有可报告的披露情况。

Acknowledgments

作者承认科学生命实验室和卡洛林斯卡研究所提供的基础设施支持。提交人还感谢与 michaela valin、magdalena Otrocka 和 thomas lundbäck 的投入和讨论。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

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References

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