Con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes

Biochemistry

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Summary

Medidas del contrato de blanco de la droga son fundamentales para desarrollo de fármacos eficaces y validación química de la sonda. Aquí detallamos un protocolo para la medición de compromiso de Diana farmacológica con alta proyección de imagen contenido en una adaptación de microplacas compatibles del ensayo celular cambio térmico (CETSA).

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Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

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Abstract

Cuantificación de la interacción de moléculas pequeñas con su blanco prevista de la proteína es fundamental para desarrollo de fármacos, validación de destino y validación química de la sonda. Métodos que miden este fenómeno sin modificación del destino de la proteína o molécula pequeña son particularmente valiosos aunque técnicamente difícil. El ensayo celular cambio térmico (CETSA) es una técnica para supervisar el contrato de blanco en las células vivas. Aquí, describimos una adaptación del protocolo original de CETSA, que permite mediciones de alto rendimiento manteniendo la localización subcelular en el nivel unicelular. Creemos que este protocolo ofrece importantes avances para la aplicación de CETSA profunda caracterización del compuesto objetivo interacción, especialmente en poblaciones heterogéneas de células.

Introduction

En el desarrollo de nuevos fármacos o sondas químicas es esencial par el efecto farmacológico observado o lectura funcional a las medidas de ocupación del destino o participación en células vivas1,2,3. Estos datos son necesarios para que la molécula pequeña de hecho llegue a su destino deseado y validar la hipótesis biológica detrás de proteína objetivo selección4,5. Además, durante el desarrollo de drogas, modelo de los sistemas de complejidad creciente se utiliza para seleccionar y corroborar un plomo compuesto antes de los ensayos clínicos. Para confirmar la traducción de la biología a través de estos sistemas preclínicos, métodos de rastreo contrato de drogas blanco y acompañando la biología a lo largo de este proceso de desarrollo son fundamentales.

Compromiso de Diana farmacológica ha sido tradicionalmente difícil de controlar en células vivas con unfunctionalized pequeñas moléculas y proteínas, especialmente a nivel unicelular con resolución espacial6,7. Sin modificar de un método reciente para observar la interacción entre fármacos y proteínas en células vivas es el ensayo celular cambio térmico (CETSA) en el cual estabilización inducida por ligando de una proteína nativa en respuesta a un desafío de calor es cuantificada8, 9,10. Esto se logra mediante la cuantificación de proteína soluble restante después de la exposición a un desafío de calor. En la divulgación inicial de CETSA, mancha blanca /negra occidental fue utilizada para la detección. Para activar campañas de detección y clasificación de colecciones compuestos más grandes del golpe, los esfuerzos para aumentar el rendimiento de CETSA experimentos han llevado al desarrollo de varios ensayos homogéneos, basado en una microplaca10,11. Sin embargo, una limitación con estos métodos es que ellos son actualmente más adecuados para tratamiento compuesto en suspensiones celulares y lisis celular, llevando a la pérdida de la información espacial requiere de la detección. CETSA puede ser aplicado experimentalmente como un cambio inducido por ligando de temperatura térmica agregación (Tagg) en una concentración única de la molécula pequeña o la concentración del ligand necesaria para estabilizar la proteína en una sola temperatura. Este último se denomina huellas dactilares isotermo dosis respuesta (ITDRF) para indicar la dependencia de estas mediciones en las condiciones experimentales específicas.

El objetivo de este protocolo es medir el compromiso de destino mediante CETSA en células adherentes detección inmunofluorescente del anticuerpo de (IF) con microscopía de alto contenido12. Este procedimiento extiende la plataforma original de CETSA para permitir la cuantificación unicelular del contrato de blanco con la conservación de la localización subcelular. En particular, a diferencia de muchos informes anteriores, en este procedimiento de tratamiento compuesto se realiza en células vivas adherentes sin desprendimiento superficial o lavado antes del reto de calor, preservando así el equilibrio establecido enlace que pretendemos medir13. Actualmente, el método está validado para un destino proteína p38α (MAPK14) en varias líneas celulares, y esperamos que al compartir este procedimiento la técnica se puede aplicar ampliamente a través del fusión proteoma. Esperamos que este protocolo puede ser adaptado a lo largo de la tubería del desarrollo drogas de proyección, golpe clasificación a través de seguimiento de objetivo participación en vivo.

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Protocol

1. siembra de células

Nota: Para una visión general del flujo de trabajo vea la figura 1. Una lista detallada de materiales y reactivos están disponibles en la Tabla de materiales.

  1. Antes de la siembra de las células, perforar con un taladro estándar en el marco de placas de ensayo imágenes de 384-pozo negro para evitar burbujas de aire que está atrapadas debajo de la placa más adelante durante la etapa de calefacción. Para evitar partículas de plástico en los pozos durante este paso y mantener las condiciones de esterilidad, sellar las placas con un papel de aluminio adhesivo o cubra la placa antes de la perforación en una campana de cultivo de tejidos. Por lo general, 3 agujeros con un diámetro de 3,5 mm en cada lado de la placa (borde corto) es suficiente.
  2. Preparar un banco de flujo laminar limpiándolo con etanol al 70%. Siguiendo técnicas de cultivo de tejido aséptica estándar, retire media celular frasco o plato. Lavar las células con 5-10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego añadir tripsina 2 mL en el matraz. Incube el frasco a 37 ° C hasta que se desprenda de las células A-431. Contar las células usando un hemocitómetro o celda contador. Preparar una suspensión de 50.000 células/mL en medio de cultivo.
  3. Añada 40 μl de suspensión celular (dando una densidad celular final de 2.000 células por pocillo) en cada pocillo de una placa de ensayo usando un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal, dependiendo de la escala del experimento. Pasar brevemente la placa de lado a lado para dispersar las células uniformemente en la parte inferior de la placa.
  4. Para minimizar los efectos de borde de la placa, permiten que las células se colocan en la parte inferior de la placa de ensayo durante 20 minutos a temperatura ambiente en la parte posterior de la campana de flujo laminar. Luego, colocar la placa en un recipiente de plástico con toallas de papel húmedo para asegurar una atmósfera húmeda. Antes del uso, limpie el recipiente de plástico con etanol al 70%.
  5. Incubar la caja con la placa de ensayo durante 2-3 días a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada convencional. Supervisar la confluencia de las células hasta 50-75%, según lo determinado por la inspección visual con un microscopio de luz.

2. tratamiento del compuesto

  1. En el día del experimento, aspirar el medio de cada pocillo con una arandela de placa. Coloque la placa en la lavadora de placa y seleccionar el programa de aspiración. Si no hay una arandela de placa, el líquido puede eliminarse invirtiendo la placa con un giro rápido de la mano sobre una bandeja de residuos o un lavabo. Retiro completo del líquido es esencial para el buen funcionamiento. Cualquier exceso de líquido se retira entonces taponando con toallas de papel.
  2. Añadir 30 μl de compuestos diluido a la concentración apropiada en medio de cultivo celular mediante dosificación automática o una pipeta multicanal según la escala del experimento. Asegúrese de añadir un control positivo (ligando conocido) y negativo (DMSO) a varios pozos en cada placa de ensayo. Ya que este es un ensayo de cambio térmico, es necesario que la concentración de compuesto supera la constante de disociación para observar la estabilización de la proteína. Por lo tanto, una pauta aproximada para la concentración del compuesto es 50 - 100 veces el IC50pero más descripciones de detalle de las concentraciones de compuestos se encuentran en la sección de discusión.
    Nota: Tolerancia de DMSO de las líneas celulares debe analizarse antes del experimento.
  3. Sello sello de la placa de ensayo compuesto tratado con una placa transpirable e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada durante 30 minutos.

3. calor desafío

  1. En primer lugar, establecer el baño de agua a la temperatura deseada. Tenga en cuenta que la temperatura final que se alcanza dentro de los pocillos de la placa de ensayo puede ser diferente de la temperatura final en el baño de agua. Investigar previamente el desplazamiento con un termómetro simulado de la placa y termopar. Por lo general toma 30 minutos para el baño María se estabilice a la temperatura deseada.
  2. Para verificar que la temperatura deseada se alcanza en los pocillos de la placa de ensayo durante la etapa de calentamiento, prepare una placa simulada no sellada que contienen el mismo volumen de medio que la placa de ensayo.
  3. Retire las placas de ensayo de la incubadora. Quite el sello transpirable y volver a sellar la placa de ensayo que contiene las células tratadas con compuestos con una papel de aluminio adhesivo firmemente para asegurar que no hay agua se escapará en los pozos durante el posterior calentamiento en el baño de agua. Asegúrese de que los orificios perforados en el marco de la placa son accesibles.
  4. Coloque la placa de ensayo y la placa del maniquí en el baño de agua con la parte inferior de la placa en ángulo hacia la superficie del agua a la fuerza todo el aire restante hacia fuera debajo de las placas.
  5. Monitorear la temperatura dentro de los pocillos de una placa simulada nueva usando un termómetro termopar.
  6. Calentar la placa de ensayo en el baño de agua durante 3 minutos. Transferir inmediatamente el ensayo y la placa falsa a otro baño de agua con agua templado de habitación se enfríe durante 5 minutos. La placa de ensayo está lista para su posterior procesamiento.

4. fijación

  1. Dispense el paraformaldehído al 10 μl 16% (w/v) (PFA) directamente a la placa de ensayo con un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
    Nota: Algunos fijadores se clasifican como carcinogénicos y deben seguirse las normas de seguridad institucional.
  2. Aspire la solución de la PFA y lavar las células con 300 de μl PBS, usando una arandela de placa. Coloque la placa en la lavadora de placa y seleccionar el programa de aspiración.
    Nota: Este procedimiento se ha optimizado con un protocolo de desbordamiento en la arandela de placa que líquido al mismo tiempo dispensado y quitado. Si no hay una arandela de placa o procedimiento similar, el paso de lavado puede también hacer manualmente.
  3. Procedimiento de lavado manual: Retire el líquido de los pozos invirtiendo la placa con un giro rápido de la mano sobre una bandeja de residuos o un lavabo. Retiro completo del líquido es esencial para el buen funcionamiento. Añadir 80 μl de PBS con una pipeta multicanal e invertir la placa otra vez como se describe anteriormente, repetir el lavado dos veces. Después del último lavado, secar la placa sobre toallas de papel limpias para quitar cualquier exceso de líquido.

5. la permeabilización

  1. Añadir 20 μl de 0,1% (v/v) NP-40 para los pozos con una pipeta multicanal e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar las células con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
  2. Alternativamente, cuando sea apropiado, aplicar un protocolo de recuperación de antígeno, por ejemplo:
    1. Añadir 20 μl de SDS 1% a los pozos con una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y lavar siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente (paso 4.2).
    2. Añadir 80 μL de glicina de 10 mM a pH 7,2 e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de glicina con una arandela de placa colocando en la arandela de placa y seleccionar el protocolo de aspiración. Ver notas en 2.1 y 4.2 Si no hay una arandela de placa.

6. bloqueo

  1. Añadir 15 μl de 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS en los pocillos con un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C con un sello de placa de papel de aluminio.

7. primaria del anticuerpo

  1. Aspirar la solución bloqueo usando una arandela de placa colocando en la arandela de placa y seleccionar el protocolo de aspiración. Ver notas en 2.1 y 4.2 Si no hay una arandela de placa.
  2. Añadir 10 μl de anticuerpo primario diluido por consiguiente en el 1% (w/v) BSA en PBS para los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C con un sello de placa de papel de aluminio.

8 anticuerpo secundario

  1. Aspire la solución de anticuerpo primario y lavar los pocillos según el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
  2. Añadir 10 μl del anticuerpo secundario Alexa 488 diluido por consiguiente en el 1% (p/v) BSA en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Selle la placa con un sello adhesivo de aluminio para proteger de la luz.
    Nota: Proteja la placa de la luz durante este y los pasos posteriores.

9. nuclear la coloración y la mascarilla de células

  1. Añadir 10 μl de colorante nuclear diluido a 0,05 mg/mL en PBS en los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos más.
  2. Aspire la solución de Hoechst y anticuerpo secundario y lavar los pocillos con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
  3. Añadir 10 μl de la mascarilla de células diluida a 200 ng/mL en PBS en los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  4. Aspire la solución de la máscara de la célula y lavar los pocillos con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).
  5. Añada 60 μL de PBS a todos los pozos con la arandela de placa, un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal y sellar las placas con un papel de aluminio adhesivo.

10. adquisición y análisis de imágenes

  1. Captura de imágenes en un sensor contenido alto con 3 canales fluorescentes: DAPI (387/447), GFP (472/520) y TexasRed (562/624). Adquisición de 4 imágenes por pozo con objetivo de 10 X. Utilizar autoenfoque láser automatizado y aplicar 2 binning durante la adquisición. Guardar imágenes como archivos de tiff de escala de grises de 16 bits, junto con metadatos.
  2. Analizar imágenes utilizando el software disponible. Identificar los límites de la celda utilizando un algoritmo de puntuación de célula con DAPI (núcleo) y TexasRed (citoplasma).
  3. Extracto de media intensidad para todas longitudes de onda adquiridas para su posterior análisis de datos.
  4. Calcular el factor Z para asegurar la robustez del ensayo.
  5. Calcular % estabilización con la siguiente fórmula: 100 * (1-(bien intensidad-control negativo de intensidad bien media) / (promedio del control negativo de la intensidad promedio de control positivo de intensidad)). Esta control negativo de DMSO y el control positivo es la sustancia de referencia. Puesto que la máxima estabilización entre compuestos puede variar y de hecho ser mayor que el control positivo para las curvas ITDRF, las intensidades máxima y mínima estabilización para cada compuesto se utilizan a veces en lugar de los valores de intensidad de los pozos de control .

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Representative Results

El protocolo descrito en la figura 1 describe el flujo de trabajo básico para ejecución de ensayos CETSA en células adherentes con detección de la proteína soluble restantes por proyección de imagen de contenido alto. Este flujo de trabajo puede ser fácilmente adaptada a todas las etapas de desarrollo de ensayos modificando el diseño de la placa de los reactivos o compuestos14. Detallamos los resultados esperados para varias previsto a continuación de casos de uso.

Identificación de anticuerpos y desarrollo de ensayos. Un requisito previo para obtener resultados exitosos es la identificación de un anticuerpo primario u otros reactivo adecuado afinidad que reconoce selectivamente la forma nativa de la proteína en presencia de la proteína agregada y precipitada formada durante el calor desafío en el paso 3. Para establecer el ensayo imágenes de CETSA descrito aquí, defendimos a un panel de 9 anticuerpos focalización p38α a 52° C para la ventana de la señal entre los controles positivos y negativos. Luego valora los mejores anticuerpos y se establecieron en las condiciones que se muestra en la figura 2 A, B con representante imágenes de inmunofluorescencia para p38α estabilizada por un ligando conocido (control positivo) y DMSO (control negativo). Reconocimiento de anticuerpos también no debe ser perturbado por los cambios conformacionales de la proteína blanco que puede ser inducida por ligando vinculante (figura 2). Por ejemplo, BIRB796 tiene mucho descuento en la tarifa, y cuantificación del contrato de blanco sólo fue posible mediante la aplicación de un paso de recuperación de antígeno (5.2; Figura 2D). Es importante validar el rendimiento del anticuerpo primario con ligandos conocidos que cubren los sitios de Unión diferentes de la proteína diana si está disponible. La validación de anticuerpos se realiza preferentemente con y sin el paso de recuperación de antígeno.

Tagg y curvas ITDRF. Como se mencionó anteriormente, experimentos CETSA pueden funcionar en dos modos diferentes, Tagg curvas y experimentos ITDRF. Ambas variantes utilizan el mismo protocolo básico que se indica en la figura 1 y en la sección de protocolo. En la primera configuración, el propósito es desafiar las células con un gradiente de temperatura y comparar las curvas de Tagg en presencia y en ausencia de una sola concentración de ligando. Para realizar una curva deagg de T, separados de las placas se calientan durante 3 minutos a través de una gama de temperaturas. En la realización de este experimento, es importante el tiempo de la duración del tratamiento compuesto para cada placa con el tiempo que lleva para que el baño de agua estabilizar a la nueva temperatura. En este sentido, realizar el reto de calor paso en el baño de agua es más lento que calentar los tubos en una máquina PCR. La vía experimental es próxima ejecución curvas de concentración-respuesta de un ligando a una temperatura fija para generar curvas ITDRF. En general, cuando se prueban múltiples compuestos, ensayo preparado para la adición compuesta se preparan platos uso automatizado manejo de líquidos para lograr los datos más reproducibles. Compuestos son diluidos en serie en DMSO y entonces disuelto en medios de cultivo de células a las concentraciones deseadas. Por lo general hemos probado punto 11 series de concentración a partir de 50-100 μm en 3 o 4 veces la dilución, pero esto depende de la potencia de los ligandos utilizados. Se aconseja en primer lugar establecer la curva de Tagg en ausencia y en presencia de un ligando y seleccione la temperatura para posteriores experimentos isotérmicos donde puede observarse un desplazamiento entre las curvas. La temperatura debe ser alrededor o justo por encima de la Tagg. Ambos formatos permiten para la confirmación del contrato de blanco pero para la clasificación de compuestos afinidades ITDRF experimentos son a menudo más conveniente. Figura 3A muestra una ilustración de los resultados cuantificados previstos para una curva deagg de T y figura 3B cuantifica resultados de un experimento típico de ITDRF.

Campaña de detección. El protocolo también puede adaptarse para detección campañas para identificar nuevos ligantes de la proteína diana. En este caso, desafíos de calor isotérmica se aplican para un gran número de compuestos en una sola concentración seguido por ITDRF experimentos para identificados compuestos estabilizadores. Preparar platos proyección listo para ensayo y transferencia de los compuestos diluidos en medios de cultivo para las placas de ensayo mediante manejo automatizado de líquidos. Como con todos los ensayos de estabilidad térmica, es necesario superar la constante de disociación para observar la estabilización de la proteína, y así hemos aplicado las bibliotecas de molécula pequeña a 50 μm para facilitar la identificación exitosa. Clasificación de los golpes con ITDRF permitirá más adelante clasificación y priorización de estos compuestos. La figura 4 muestra un resultado representativo de una placa de proyección.

Figure 1
Figura 1 . Descripción esquemática del protocolo descrito en este artículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Desarrollo identificación y determinación de anticuerpos. A) datos de muestra para detección de p38α humano en células A-431. Imágenes representativas de la positivas (1 μm AMG548) y negativos (DMSO) controles. Rojo - tinción nuclear de Hoechst, coloración verde-p38α. Imágenes tomadas con 10 aumentos; la barra de escala blanca representa 73 μm. B) ejemplo de datos cuantificados expresados como célula de intensidad media. Barras de error representan el error estándar de la media de 16 repeticiones para 6 placas separadas. Cada placa se calentó a 52 ° C en un baño seguido por la fijación de las células, permeabilización y posterior immunostaining. Intensidad de la señal C) inmunofluorescencia medido después de tratar las células A-431 con 1 μm BIRB796 o DMSO como se describe anteriormente seguido directamente por fijación. En la ausencia de un paso de la calefacción, la señal de BIRB796 es menor que la señal de DMSO, lo que sugiere que BIRB796 interrumpe la detección de p38α con este anticuerpo. D) curvasCETSA ITDRF para las células trataron con BIRB796 con (triángulo azul) o sin el protocolo de recuperación de antígeno (triángulo gris). Esta figura ha sido modificada desde Axelsson et al 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Experimentos de agregación térmica y ITDRF. A) experimentos de curva de agregación termal para las células trataron con positivo (1 μm AMG548, en naranja) y negativos los controles (DMSO en gris). Barras de error representan el error estándar de la media de repeticiones 32 o 464. B) experimentoCETSA ITDRF realizado a 52 ° C para las células tratadas con diluciones seriadas de SB203580 en azul, Skepinone-L en verde y RWJ67657 en rojo. Barras de error representan el error estándar de la media de 6 repeticiones. Datos cuantificados son expresados como célula de intensidad media y normalizados frente a la concentración máxima del compuesto respectivo. Esta figura ha sido modificada desde Axelsson et al 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Resumen representativo de una placa de proyección con 10 aumentos. Controles positivos (1 μm AMG548) son en las columnas 2 y 24 y controles negativos (DMSO) en las columnas 1 y 23. Todos los pozos contienen 50 μm de los compuestos de la biblioteca utiliza para proyección con varios golpes marcados. En las figuras del recuadro, la línea blanca en la esquina inferior derecha representa 200 μm. Esta figura ha sido modificada desde Axelsson et al 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Como comentamos en la sección de resultados, hay varias medidas claves para el procedimiento. En primer lugar, es importante identificar un reactivo de alta calidad afinidad. Recomendamos una pequeña biblioteca de anticuerpos para cada objetivo deseado de detección. Después de que un anticuerpo primario se ha seleccionado, también es importante validar el sistema para un número de sitios de Unión diferentes de la meta de proteína si es necesario. Counter-detección de compuestos que interfieren con la señal de ensayo como se muestra en la figura 2 , omitiendo el desafío de calor es muy animado. Cuando se observa una señal reducida en presencia de un ligando, se puede probar un protocolo de recuperación de antígeno como se describe en el paso 5.2. Desigual calentamiento de las placas puede causar fluctuaciones y variaciones de placa a placa en los datos observados. Puesto que las placas son en parte sumergidas en un baño de agua durante el desafío de calor transitoria (paso 3.4) los pozos exteriores de las placas se exponen al agua caliente no sólo en la parte inferior de los pozos, sino también a través de la pared exterior. Esto puede causar una temperatura más alta durante el mismo tiempo de inmersión en el exteriores pozos de la placa y efectos de borde de placa posterior. Por lo tanto, se recomienda evitar el exteriores pocillos de la placa. También se observan efectos similares si las burbujas de aire quedan atrapadas debajo de la placa durante la etapa de calentamiento evitando contacto suficiente entre el agua caliente y el fondo de los pozos. Dados los retos con imágenes de las placas de calefacción, dispositivos y placas hechas específicamente para la exposición al calor podrían ayudar a promover este método. Hemos explorado el uso de varias líneas celulares y han encontrado variabilidad en superficie accesorio después el desafío de calor para los tipos de células adherentes. Experimentos preliminares en nuestro laboratorio sugieren que el uso de una matriz extracelular o capa como Synthemax II-SC o Cell-Tak puede reducir al mínimo la separación de la célula, pero esto podría plantear un desafío técnico al usar tipos celulares semi conectado. Puesto que se realiza tratamiento compuesto de células vivas, pequeñas moléculas deben ser permeable de la célula. Si el compuesto no es permeable la membrana, se recomiendan métodos CETSA alternativo de alto rendimiento. Algunos compuestos necesitan ser metabólicamente activa para enlazar a su objetivo las proteínas11. En tales casos, se recomienda más células de tratamiento con el compuesto antes el desafío de calor.

Este protocolo requiere una sola placa de siembra a hacer susceptibles a las campañas de detección de alto rendimiento de procesamiento de imágenes de la célula. El número de células para cada experimento es mucho más bajo que puede alcanzarse con manchas blancas /negras occidentales o ensayos de AlphaScreen anterior15. Además, lavado o pasos de separación celular, que pueden alterar la encuadernación y la disponibilidad de compuestos, se quitan, preservando el equilibrio de enlace establecido a través de la etapa de desafío de calor. A diferencia de los procedimientos anteriores, la falta de señal debido a la citotoxicidad simultáneamente informa sobre coloración nuclear. Por último, la proyección de imagen preserva la resolución espacial de las células individuales, lo que permite mediciones de compromiso de destino en poblaciones mixtas de células o de los Estados de la célula.

Para realmente evaluar la aplicabilidad del enfoque, se necesitan esfuerzos concertados para aplicar la técnica a través del fusión proteoma. Tales experimentos clarificarán la facilidad de identificar reactivos de afinidad adecuada, que informe selectivamente en la proteína nativa en presencia de los restantes desnaturalizado y agregados de proteínas. Actualmente no sabemos cómo los niveles de expresión de la proteína afectará la capacidad de medir fiablemente una ventana de la señal. Esperamos que esto a reflejar afinidad y selectividad de los anticuerpos disponibles y prever que para proteínas abundantes bajas tecnologías utilizadas para mejorar la señal en los ensayos de inmunofluorescencia será aplicables. Alternativamente, podrían utilizarse etiquetadas proteínas o compuestos funcionalizados para la detección de versiones modificadas del protocolo descrito. Este protocolo está limitado a los objetivos que se funden y las interacciones de donde puede observarse una estabilización cuantificable. Por ejemplo, ligandos endógenos pueden estabilizar una proteína en los ensayos de células vivas, que puede impedir una estabilización adicional por un ligando exógeno. Aunque no explorada aquí, creemos que será posible lecturas multiplexores para permitir el estudio de múltiples objetivos simultáneamente, o un blanco con efectores corriente abajo. Otros estudios son necesarios investigar estos aspectos en situ CETSA.

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Disclosures

Los autores no tienen ninguna revelación al informe.

Acknowledgments

Los autores reconocen el apoyo de infraestructura de ciencia para laboratorio de la vida y el Karolinska Institutet. Los autores también reconocen entrada y discusiones con Michaela Vallin, Magdalena Otrocka y Thomas Lundbäck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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