Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Mätningar av drogen mål engagemang är centralt för utveckling av effektiva läkemedel och kemiska sonden validering. Här, detalj vi ett protokoll för mätning av drogen-mål engagemang med hög innehåll imaging i en mikroplattan-kompatibel anpassning av cellulära termisk Skift analysen (CETSA).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Quantitating samverkan mellan små molekyler och deras avsedda protein mål är avgörande för läkemedelsutveckling, target validering och kemiska sonden validering. Metoder som mäter detta fenomen utan modifiering av protein målet eller liten molekyl är särskilt värdefulla men tekniskt utmanande. Cellulära termisk Skift analysen (CETSA) är en teknik för att övervaka mål engagemang i levande celler. Här beskriver vi en anpassning av det ursprungliga CETSA-protokollet, som möjliggör hög genomströmning mätningar bibehållen subcellulär lokalisering på enstaka cellnivå. Vi tror detta protokoll erbjuder viktiga framsteg att tillämpningen av CETSA för djupgående karakterisering av förening-target interaktion, särskilt i heterogena populationer av celler.

Introduction

Vid utveckling av nya läkemedel eller kemiska sonder är det viktigt att den observerade farmakologiska effekten eller funktionella avläsning till mätningar av målet beläggning eller engagemang i levande celler1,2,3. Dessa uppgifter är nödvändiga både för att säkerställa att den lilla molekylen i själva verket når sitt önskade mål och för att validera biologiska hypotesen bakom protein mål urval4,5. Dessutom under läkemedelsutveckling används modellsystem av ökande komplexitet för att välja och bekräfta ett lead förening innan kliniska prövningar. För att bekräfta översättning av biologi över dessa prekliniska system, är metoder för spårning drog-mål engagemang och medföljande biologi i hela denna utvecklingsprocess kritisk.

Läkemedel-mål engagemang har traditionellt varit utmanande att övervaka i levande celler med unfunctionalized små molekyler och proteiner, särskilt på enskild cell nivå med rumslig upplösning6,7. En nyligen metod att observera samspelet mellan omodifierade droger och proteiner i levande celler är den cellulära termiska Skift analys (CETSA) där ligand-inducerad stabilisering av en infödd protein som svar på en värme utmaning är kvantifierade8, 9,10. Detta åstadkoms genom att kvantifiera återstående lösligt protein efter exponering för en värme utmaning. I inledande utlämnande av CETSA användes western blot för detektion. För att aktivera screening kampanjer och slå triaging av större sammansatta samlingar, har insatser för att öka genomströmningen av CETSA experiment lett till utvecklingen av flera homogen, mikroplattbaserade analyser10,11. En begränsning med dessa metoder är dock att de är för närvarande bäst lämpade till sammansatta behandling i cellsuspensioner och upptäckt kräver cellys, leder till förlust av rumslig information. CETSA kan vara tillämpas experimentellt antingen som en ligand-inducerad Skift i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enda koncentration av små molekylen eller ligand koncentrationen nödvändigt att stabilisera proteinet vid en inre temperatur. Den senare kallas isotermiska dos svar fingeravtryck (ITDRF) för att beteckna beroendet av dessa mätningar på de särskilda villkor som experimentell.

Målet med detta protokoll är att mäta målet engagemang med CETSA i vidhäftande celler genom Immunofluorescerande (om) påvisande av antikroppar med hög-innehåll mikroskopi12. Proceduren omfattar den ursprungliga CETSA plattformen som möjliggör encelliga kvantifiering av mål engagemang med bevarande av subcellulär lokalisering. Särskilt, till skillnad från många tidigare rapporter, i den här proceduren sammansatta behandlingen utförs i levande vidhäftande celler utan ytan avlossning eller tvättning innan värmen utmaningen, därmed bevara etablerade bindande equilibriumen siktar vi på att mäta13. För närvarande, metoden är validerad för ett mål protein p38α (MAPK14) i flera cellinjer, och vi hoppas att genom att dela denna procedur tekniken kan tillämpas i stort sett hela det smältande proteomet. Vi räknar med att detta protokoll kan anpassas under hela rörledningen drog utveckling från screening, hit triaging genom övervakning av mål engagemang i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sådd av celler

Obs: Se figur 1för en allmän översikt över arbetsflödet. En detaljerad lista över material och reagenser finns i Tabell för material.

  1. Före sådd av cellerna, borra hål med en standardborr inom ramen för svart 384-väl tänkbar assay plattor att undvika luftbubblor att bli instängd under plattan senare under värme steg. Att undvika plast partiklar in brunnarna under detta steg och för att upprätthålla sterila förhållanden, förslut plattorna med en självhäftande aluminiumfolie eller täcka plattan innan borrning i vävnadsodling huva. Vanligtvis räcker 3 hål med en diameter på 3,5 mm på varje sida av plattan (kortsida).
  2. Förbereda en laminär bänk av rengöring med 70% etanol. Efter standard aseptisk vävnadsodling tekniker, ta bort medier från cell kolven eller maträtt. Tvätta cellerna med 5-10 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och Lägg sedan till 2 mL trypsin kolven. Inkubera kolven vid 37 ° C tills de A-431 cellerna lossa. Räkna celler antingen med en haemocytometer eller cell räknare. Förbered en cellsuspension av 50.000 celler/mL i odlingsmedium.
  3. Dispensera 40 µL cellsuspension (vilket ger en sista cell densiteten av 2 000 celler per brunn) till varje brunn av en assay platta med en bulk reagens dispenser eller en flerkanalig Pipettera, beroende på omfattningen av experimentet. Kort flytta plattan från sida till sida att sprida celler jämnt på undersidan av plattan.
  4. För att minimera plattan-kanteffekter, kan cellerna att bosätta sig på botten av assay plattan i 20 minuter vid rumstemperatur i baksidan av LAF. Sedan placera plattan i en plastbehållare med fuktigt hushållspapper för att säkerställa en fuktig atmosfär. Före användning, torka plastbehållare med 70% etanol.
  5. Inkubera i rutan med assay plattan i 2-3 dagar vid 37 ° C och 5% CO2 i en konventionell befuktade inkubator. Övervaka konfluens celler tills 50-75%, bedömt genom okulärbesiktning med ett ljusmikroskop.

2. sammansatta behandling

  1. På dagen för experimentet, aspirera på medellång från varje brunn med hjälp av en tallrik bricka. Placera plattan på plattan brickan och välj programmet aspiration. Om det inte finns en tallrik bricka, kan då vätskan tas bort genom att vända plattan med en snabb hand twist över en spillfacket eller sjunka. Fullständig borttagning av vätska är viktigt för bra prestanda. Överflödig vätska avlägsnas sedan genom att badda med hushållspapper.
  2. Tillsätt 30 µL av föreningar utspädd tillgripits koncentrationen i cellodlingsmedium använder automatiserade dispensering eller en flerkanalspipett beroende på omfattningen av experimentet. Se till att lägga till en negativ (DMSO) och positiva (känd ligand) kontroll flera brunnar på varje assay platta. Eftersom detta är en termisk Skift analys, är det nödvändigt att sammansatta koncentrationen överstiger konstanten dissociation för att observera protein stabilisering. Således, en grov riktlinje för sammansatta koncentration är 50 - 100 gånger den IC50, men mer detalj beskrivningar för sammansatta koncentrationerna finns i avsnittet diskussion.
    Obs: DMSO tolerabilitet av cellinjer bör testas innan experimentet.
  3. Seal compound-behandlade assay plattan med en ventilerande plattan tätar och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator i 30 minuter.

3. värme utmaning

  1. Ställ först vattenbadet till önskad temperatur. Observera att den slutliga temperaturen som är nått inuti brunnarna av assay plattan kan vara olika från den slutliga temperaturen i vattenbadet. Undersöka förskjutningen i förväg med en dummy plåt och termoelement termometer. Det tar vanligtvis 30 minuter för bad att stabilisera på önskad temperatur.
  2. Kontrollera att önskad temperatur nås i brunnarna av assay plattan under värme steg, förbereda en oförseglade dummy plåt innehållande samma volym av medium som assay plattan.
  3. Ta bort assay plattorna från inkubatorn. Ta av ventilerande tätningen och åter försegla assay plattan som innehåller förening-behandlade celler med en tight självhäftande aluminiumfolie att se till att inget vatten kommer att läcka i brunnar under efterföljande uppvärmning i vattenbad. Säkerställa att de borrade hålen i plattan ram är tillgängliga.
  4. Placera den analys och den dummy plåten i vattenbadet med botten av plattan vinklad mot vattenytan att tvinga någon kvarvarande luft ut från under plattorna.
  5. Övervaka temperaturen inuti brunnarna nya dummy platta med ett termoelement termometer.
  6. Värm assay plattan i vattenbadet i 3 minuter. Omedelbart överföra analysen och overksam plattan till en annan vattenbad med rum-härdat vatten svalna i 5 minuter. Assay plattan är nu färdiga för vidarebehandling.

4. fixering

  1. Dosera 10 µL 16% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) direkt till assay plattan med en bulk reagens dispenser eller en flerkanalig Pipettera. Odla i rumstemperatur i 20 minuter.
    Obs: Vissa fixativ klassificeras som cancerframkallande och institutionella säkerhetsföreskrifter följas.
  2. Aspirera PFA lösningen och tvätta cellerna med 300 µL PBS med hjälp av en tallrik bricka. Placera plattan på plattan brickan och välj programmet aspiration.
    Obs: Denna procedur har optimerats med ett bräddavlopp protokoll på plattan brickan där vätska samtidigt ut och tas bort. Om en tallrik bricka eller liknande förfarande inte är tillgänglig, kan steget tvätt alternativt göras manuellt.
  3. Manuell tvättning förfarande: Avlägsna vätskan från brunnarna genom att vända plattan med en snabb hand twist över en spillfacket eller sjunka. Fullständig borttagning av vätska är viktigt för bra prestanda. Tillsätt 80 µL av PBS med en flerkanalspipett och vänd på plattan igen som beskrivits ovan, upprepa förfarandet tvätt två gånger. Efter den sista tvättningen, blot plattan mot rent hushållspapper för att ta bort någon överflödig vätska.

5. permeabilisering

  1. Tillsätt 20 µL av 0,1% (v/v) NP-40 till brunnarna med en flerkanals Pipettera och odla i rumstemperatur i 10 minuter. Tvätta cellerna med samma procedur som beskrivs ovan (steg 4.2).
  2. Alternativt, när så är lämpligt, tillämpa ett antigen retrieval protokoll, t.ex.:
    1. Tillsätt 20 µL av 1% SDS att brunnarna med en flerkanals Pipettera. Odla i rumstemperatur i 5 minuter och tvätta enligt samma procedur som beskrivs ovan (steg 4.2).
    2. Tillsätt 80 μl av 10 mM glycin vid pH 7,2 och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Aspirera om glycin lösningen med en tallrik bricka genom att placera på tallrik bricka och välja protokollet aspiration. Se anteckningar i 2.1 och 4.2 om en tallrik bricka inte är tillgänglig.

6. blockera

  1. Tillsätt 15 µL av 1% (w/v) bovint serum albumin (BSA) i PBS till brunnarna med en bulk reagens dispenser eller en flerkanalig Pipettera. Inkubera plattan i rumstemperatur i 1 timme eller över natten vid 4 ° C med aluminiumfolie plattan plomb.

7. primär antikropp

  1. Aspirera blockerande lösningen med en tallrik bricka genom att placera på tallrik bricka och välja protokollet aspiration. Se anteckningar i 2.1 och 4.2 om en tallrik bricka inte är tillgänglig.
  2. Tillsätt 10 µL av primär antikropp utspädd med detta i 1% (w/v) BSA i PBS till brunnarna med en flerkanals Pipettera. Inkubera plattan i rumstemperatur i 1 timme eller över natten vid 4 ° C med aluminiumfolie plattan plomb.

8. sekundär antikropp

  1. Aspirera primär antikropp lösningen och Tvätta brunnarna enligt samma förfarande som beskrivs ovan (steg 4.2).
  2. Tillsätt 10 µL av Alexa 488 sekundär antikropp utspädd med detta i 1% (w/v) BSA i PBS. Odla i rumstemperatur i 1 timme. Försegla plattan med en självhäftande aluminiumfolie tätning för att skydda mot ljus.
    Obs: Skydda plattan från ljus under denna och efterföljande steg.

9. nukleär färgning och Cell Mask

  1. Tillsätt 10 µL av nukleära dye efter utspädning 0,05 mg/ml i PBS till brunnarna med en flerkanals Pipettera. Odla i rumstemperatur i ytterligare 10 minuter.
  2. Aspirera den sekundära antikroppar och Hoechst lösningen och Tvätta brunnarna med samma procedur som beskrivs ovan (steg 4.2).
  3. Tillsätt 10 µL av cell mask utspätt till 200 ng/mL i PBS till brunnarna med en flerkanals Pipettera. Odla i rumstemperatur i 30 minuter.
  4. Aspirera cell mask lösningen och Tvätta brunnarna med samma procedur som beskrivs ovan (steg 4.2).
  5. Dispensera PBS 60 µL till alla brunnar med tallrik bricka, en bulk reagens dispenser eller en flerkanalig Pipettera och försegla plattorna med en självhäftande aluminiumfolie.

10. bild förvärv och analys

  1. Fånga bilder på en hög innehåll imager med 3 lysrör kanaler: DAPI (387/447), GFP (472/520) och TexasRed (562/624). Förvärva 4 bilder per brunn med 10 X-objektiv. Använd automatiserade laser autofokus och applicera binning 2 under förvärv. Lagra bilder som 16 bit, grå skala tiff-filer tillsammans med metadata.
  2. Analysera bilder med hjälp av tillgänglig programvara. Identifiera cellgränserna med en Cell Scoring algoritm med DAPI (kärnan) och TexasRed (cytoplasman).
  3. Extrahera genomsnittliga intensitet för alla förvärvade våglängder för ytterligare dataanalys.
  4. Beräkna den Z-faktorn för att säkerställa robustheten i analysen.
  5. Beräkna % stabilisering med hjälp av följande formel: 100 * (1-(väl intensitet – genomsnittliga väl intensitet negativ kontroll) / (genomsnittliga intensitet positiv kontroll-genomsnittet intensitet negativ kontroll)). Negativ kontroll är här DMSO och positiv kontroll är referensämnet. Eftersom den maximala stabiliseringen mellan föreningar kan variera och faktiskt vara större än den positiva kontrollen för ITDRF kurvor, används högsta och lägsta stabilisering stödnivåerna för varje förening ibland i stället för intensitetsvärdena av kontrollbrunnar .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet beskrivs i figur 1 beskriver det grundläggande arbetsflödet för att köra CETSA analyser på vidhäftande celler med påvisande av återstående lösligt protein av högt innehåll imaging. Arbetsflödet kan enkelt anpassas till alla stadier av assay utveckling genom att ändra layouten plattan av reagens eller föreningar14. Vi detalj förväntade resultat för flera förväntade användningsfall nedan.

Antikropp identifiering och haltbestämning utveckling. En förutsättning för lyckat resultat är identifiering av en primär antikropp eller andra lämpliga affinitet reagens som selektivt erkänner inhemska form av proteinet i närvaro av aggregerade och utfällda proteinet bildas under värmen utmaning i steg 3. För att fastställa CETSA imaging analysen beskrivs här, vi en panel av 9 antikroppar riktade p38α vid 52° C för signal fönster mellan de positiva och negativa kontrollerna. Vi har sedan titreras bästa antikropparna och bosatte sig på de villkor som visas i figur 2 A, B med representant immunofluorescens bilder för p38α stabiliseras av en känd ligand (positiv kontroll) och DMSO (negativ kontroll). Antikropp erkännande bör också inte störas av konfirmerande ändringarna av målproteinet som kan induceras av liganden bindande (figur 2 c). Som ett exempel, BIRB796 har en lång off hastighet och kvantifiering av mål engagemang var bara möjligt genom att tillämpa ett antigen retrieval steg (5.2; Figur 2D). Det är viktigt att validera prestanda av primär antikropp med kända ligander som täcker olika bindningsställen i målproteinet om tillgängliga. Antikropp validering görs helst både med och utan det antigen retrieval steget.

Tagg och ITDRF kurvor. Som nämnts ovan, kan CETSA experiment köras i två olika lägen, Tagg kurvor och ITDRF experiment. Båda varianter utnyttjar samma grundläggande protokoll anges i figur 1 och i avsnittet protokoll. I den första installationen är syftet att utmana cellerna med en temperaturgradient och jämföra Tagg kurvorna i närvaro och frånvaro av en enda koncentration av liganden. För att utföra en Tagg kurva, värms separata plattor i 3 minuter inom en rad olika temperaturer. Vid utförandet av detta experiment, är det viktigt att tid sammansatta behandling längden för varje platta med den tid det tar för vattenbad att stabilisera till den nya temperaturen. I detta avseende, är peforming värme utmaningen steg i vattenbad mer tidskrävande än värme rör i en PCR-maskin. Den experimentella sökvägen leder till nästa kör koncentrations-responskurvorna av en ligand på en fast temperatur att generera ITDRF kurvor. I allmänhet när du testar flera föreningar, är assay redo plattor för sammansatta tillägg beredda för att uppnå den mest reproducerbara data genom automatiserad vätskehantering. Föreningar är seriellt spädas i DMSO och sedan upplöst i cell kultur media till de önska koncentrationerna. Vi har vanligtvis testat 11 punkt koncentrationen serien börjar på 50-100 µM i 3 eller 4 faldig utspädning, men detta beror på styrkan hos de ligander som används. Det är klokt att först etablera Tagg kurvan både i frånvaro och närvaro av en ligand och välj temperaturen för efterföljande isotermiska experiment där en förskjutning mellan kurvorna kan observeras. Den valda temperaturen bör vara runt eller strax ovanför Tagg. Båda formaten tillåter mål anställningslöfte men för rangordning av sammansatta tillhörighet ITDRF experiment är ofta mer lämplig. Figur 3A visar en illustration av förväntade kvantifierade resultat för en Tagg kurva och figur 3B kvantifierar resultat av typiska ITDRF experiment.

Screening kampanj. Protokollet kan också anpassas till screening kampanjer för att identifiera nya bindemedel av målproteinet. I det här fallet tillämpas isotermiska värme utmaningar för ett stort antal föreningar på en enda koncentration följt av ITDRF experiment för identifierade stabiliserande föreningar. Vi förbereder assay redo screening plattor och överföra de föreningar som utspädd i kultur media till assay plattorna med hjälp av automatiserad vätskehantering. Som med alla termisk stabilitet-analyser, är det nödvändigt att överstiga den dissociationskonstant för att observera protein stabilisering, och därmed vi har tillämpat småmolekylära bibliotek vid 50 µM att underlätta hit identifiering. Triaging av träffar med ITDRF blir det möjligt ranking och prioritering av dessa föreningar. Figur 4 visar representativa resultat från en screening-plattan.

Figure 1
Figur 1 . Schematisk översikt över det protokoll som beskrivs i denna artikel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Identifieringen och haltbestämningen antikroppsutveckling. A) exempeldata för detektering av mänsklig p38α i A-431 celler. Representativa bilder av positiv (1 µM AMG548) och negativa (DMSO) kontroller. Röd - nukleär Hoechst färgning, grön-p38α färgning. Bilder tagna med 10 X förstoring; vita skalstapeln representerar 73 µm. B) exempel på kvantifierade uppgifter uttryckt som genomsnittlig intensitet/cell. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet av 16 replikat för 6 separata plattor. Varje platta var uppvärmd till 52 ° C i ett vattenbad som följt av upptagning av celler, permeabilisering och efterföljande immunfärgning. (C) immunofluorescens signalintensitet mätt efter behandling av A-431 celler med 1 µM BIRB796 eller DMSO som beskrivs ovan följt direkt av fixering. I avsaknad av en värme-steg är BIRB796 signalen lägre än signalen DMSO, vilket tyder på att BIRB796 stör detektion av p38α med denna antikropp. (D) ITDRFCETSA kurvor för celler behandlas med BIRB796 antingen med (blå triangel) eller utan (grå triangel) antigen retrieval protokoll. Denna siffra har ändrats från Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Termiska aggregering och ITDRF experimenterar. (A) termisk aggregering kurva experiment för celler behandlas med positiv (1 µM AMG548, i orange) och negativa (DMSO i grått) kontroller. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet av 32 eller 464 replikat. (B) ITDRFCETSA experiment utförs vid 52 ° C för celler behandlas med seriespädningar av SB203580 i blått, Skepinone-L i grönt och RWJ67657 i rött. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet av 6 replikat. Kvantifierade uppgifter uttrycks som genomsnittliga intensitet/cell och normaliserade mot den högsta koncentrationen av respektive förening. Denna siffra har ändrats från Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Representativa översikt över en screening plattan vid 10 X förstoring. Positiva kontroller (1 µM AMG548) i kolumnerna 2 och 24 och negativa kontroller (DMSO) är i kolumnerna 1 och 23. Alla andra brunnar innehåller 50 µM bibliotek föreningar används för screening med flera hits betecknas. I de infällda siffrorna representerar den vita linjen i det nedre högra hörnet 200 µm. Denna siffra har ändrats från Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som diskuteras i resultatavsnittet, finns det flera viktiga steg till förfarandet. Först, är det viktigt att identifiera en hög affinitet reagens. Vi rekommenderar screening ett litet bibliotek av antikroppar för varje önskat mål. Efter en primär antikropp har valts, är det också viktigt att validera systemet för ett antal olika bindande platser av protein målet om lämpliga. Kampen mot screening för föreningar som stör signalen assay som visas i figur 2 c genom att utelämna värme utmaningen är mycket uppmuntras. När en svagare signal i närvaro av en ligand observeras, kan ett protokoll för hämtning av antigen som beskrivs i steg 5.2 testas. Ojämn uppvärmning av plattorna kan orsaka fluktuationer och plattan-till-plåt variationer i den observerade data. Eftersom plattorna är delvis nedsänkt i ett vattenbad under övergående värme utmaningen (steg 3,4) exponeras yttre brunnarna av plattorna för varmvatten inte bara på botten av brunnarna men också genom ytterväggen. Detta kan orsaka högre temperatur under samtidigt nedsänkning i yttre brunnarna av plattan och efterföljande plattan kanteffekter. Därför är det rekommenderat att undvika de yttre brunnarna i plattan. Liknande effekter kan också ses om luftbubblor är fångade under plattan under värme steg förhindrar tillräcklig kontakt mellan varmvatten och botten av brunnarna. Tanke på utmaningarna med värme imaging plattor, kunde enheter och plattor speciellt framtagen för exponering för värme främja denna metod. Vi har utforskat användningen av flera cellinjer och har hittat variabilitet i ytan bilaga när värme utmaningen för vidhäftande celltyper. Preliminära experiment i vårt labb föreslår att användningen av en beläggning eller extracellulär matrix som Synthemax II-SC eller Cell-Tak kan minimera cell avlossning, men detta kan innebära en teknisk utmaning när du använder semi bifogade celltyper. Eftersom sammansatta behandling utförs i levande celler, måste de små molekylerna cellen genomsläpplig. Om föreningen inte är membran som är permeabla, rekommenderas alternativt hög genomströmning CETSA metoder. Vissa föreningar behöver aktiveras metaboliskt för att binda till sina mål proteiner11. I sådana fall rekommenderas längre behandling celler med föreningen innan utmaningen värme.

Detta protokoll kräver en enda skylt från cell seedning för imaging vilket gör den mottaglig för high throughput screening kampanjer. Antalet celler för varje experiment är mycket lägre än kan uppnås med western blotting eller tidigare AlphaScreen analyser15. Dessutom tas tvätt eller cell avlossning steg som kan förändra sammansatta tillgänglighet och bindande, bort, bevara etablerade bindande jämvikt genom steget värme utmaning. Till skillnad från tidigare förfaranden rapporteras en brist på signal på grund av cytotoxicitet samtidigt på av nukleär färgning. Slutligen, imaging bevarar den rumsliga upplösningen i de enskilda cellerna, vilket möjliggör målet engagemang mätningar i blandade populationer av celler eller cell stater.

Att verkligen bedöma tillämpligheten av metoden, behövs samordnade ansträngningar för att tillämpa tekniken över det smältande proteomet. Sådana experiment kommer att klargöra lättheten identifiera lämplig affinitet reagenser, vilken rapport selektivt på infödda proteinet i närvaro av de återstående denatureras och aggregerade proteiner. För närvarande vet vi inte hur protein uttryck nivåer påverkar förmågan att tillförlitligt mäta en signal fönster. Vi förväntar oss att detta avspeglar affinitet och selektivitet av tillgängliga antikroppar och förutse för låg rikligt proteiner teknik används för att förbättra signal i Immunofluorescerande analyser kommer att tillämpas. Alternativt, märkta proteiner eller functionalized föreningar kunde användas för detektion i ändrade versioner av protokollet beskrivs. Detta protokoll är begränsat mål som smälter och för interaktioner där en kvantifierbar stabilisering kan observeras. Till exempel kan endogena ligander stabilisera ett protein i levande cell analyser, vilket kan förhindra ytterligare stabilisering av en exogen ligand. Även om inte utforskas här, anser vi att det blir möjligt att multiplex utläsningar som möjliggör studier av flera mål samtidigt, eller ett mål med nedströms effektorer. Ytterligare studier är nödvändiga för att undersöka dessa aspekter av i situ CETSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga upplysningar till rapport.

Acknowledgments

Författarna erkänner infrastrukturstöd från Science for Life Laboratory och Karolinska Institutet. Författarna också erkänna input och diskussioner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka och Thomas Lundbäck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17, (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13, (6), e1002165 (2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14, (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17, (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9, (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23, (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341, (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9, (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13, (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21, (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, (30), E6231-E6239 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics