Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Biochemistry

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Summary

Medições de engajamento do alvo de drogas são centrais para droga eficaz desenvolvimento e validação de sonda química. Aqui, detalhamos um protocolo para medição engajamento de droga-alvo utilizando imagens de conteúdo de alta em uma adaptação de microplacas-compatível do ensaio celular mudança térmica (CETSA).

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Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

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Abstract

Dosar a interação de moléculas pequenas com seu alvo pretendido proteína é fundamental para o desenvolvimento de drogas, validação de alvo e validação de sonda química. Métodos que medem este fenômeno sem modificação do alvo da proteína ou pequena molécula são particularmente valiosos, embora tecnicamente desafiador. O ensaio de celular mudança térmica (CETSA) é uma técnica para monitorar o engajamento do alvo em pilhas vivas. Aqui, descrevemos uma adaptação do protocolo CETSA original, que permite medições de alto rendimento, mantendo a Localização subcellular no nível da célula única. Acreditamos que este protocolo oferece importantes avanços para o aplicativo de CETSA para caracterização detalhada da interação de compostos-alvo, especialmente em populações heterogêneas de células.

Introduction

Ao desenvolver novas drogas ou sondas químicas é essencial para acoplar os efeitos farmacológicos observados ou leitura funcional para medições de ocupação de alvo ou noivado em células vivas1,2,3. Estes dados são necessários para garantir que a pequena molécula de fato atinge seu alvo desejado e para validar a hipótese biológica atrás da proteína alvo seleção4,5. Além disso, durante o desenvolvimento de drogas, sistemas modelo de crescente complexidade são usados para selecionar e confirmar um composto antes de ensaios clínicos de chumbo. Para confirmar a tradução de Biologia através destes sistemas pré-clínicos, métodos de rastreamento noivado droga-alvo e que acompanha a biologia em todo este processo de desenvolvimento são críticos.

Noivado de droga-alvo tem sido tradicionalmente desafiador para monitorar em células vivas com unfunctionalized pequenas moléculas e proteínas, especialmente em nível de célula única com resolução espacial de6,7. Um método recente para observar a interação entre sem modificações drogas e proteínas nas células vivas é o ensaio de celular mudança térmica (CETSA) no qual induzida pelo ligante estabilização de uma proteína nativa em resposta a um desafio de calor é quantificada8, 9,10. Isso é realizado através da quantificação da proteína solúvel restante após a exposição a um desafio de calor. Na divulgação inicial de CETSA, borrão ocidental foi usado para a deteção. Para habilitar a campanhas de rastreio e bateu na triagem das maiores coleções de compostos, os esforços para aumentar a taxa de transferência de experiências CETSA tem levado ao desenvolvimento de vários ensaios homogênea, baseada em microplacas10,11. No entanto, uma limitação com esses métodos é que são atualmente melhor adequados ao tratamento composto em suspensões celulares e a detecção exige lise celular, levando à perda de informação espacial. CETSA pode ser aplicado experimentalmente como uma mudança induzida pelo ligante na agregação térmica da temperatura (Tagg) em uma única concentração da molécula pequena ou a concentração de ligante necessária para estabilizar a proteína em uma única temperatura. O último é denominado impressões digitais de resposta de dose isotérmico (ITDRF) para significar a dependência dessas medições em condições experimentais específicas.

O objetivo do presente protocolo é medir o engajamento do alvo usando CETSA em células aderentes por detecção do anticorpo de imunofluorescência (IF) com alto teor de microscopia12. Este procedimento estende a plataforma CETSA original para permitir a quantificação de célula única de engajamento do alvo com a conservação de Localização subcellular. Nomeadamente, ao contrário de muitos relatórios anteriores, neste procedimento composto tratamento é realizado em células aderentes ao vivo sem desprendimento de superfície ou lavar antes o desafio de calor, preservando assim o equilíbrio de ligação estabelecida que pretendemos medir13. Atualmente, o método é validado por um alvo da proteína p38α (MAPK14) em várias linhas de células, e esperamos que compartilhando este procedimento a técnica pode ser aplicada amplamente em todo o derretimento proteome. Esperamos que este protocolo pode ser adaptado ao longo do canal de desenvolvimento de drogas do rastreio, bateu na triagem através de monitoramento do alvo engajamento na vivo.

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Protocol

1. semeadura de células

Nota: Para uma visão geral do fluxo de trabalho consulte a Figura 1. Uma lista detalhada de materiais e reagentes estão disponíveis na Tabela de materiais.

  1. Antes da semeadura das células, faça furos com uma broca padrão no quadro de preto 384-imagem do ensaio placas boas para evitar bolhas de ar, sendo presas sob a placa mais tarde durante a etapa de aquecimento. Para evitar plásticas partículas que entram nos poços durante esta etapa e a manutenção de condições estéreis, selar as placas com um adesivo de alumínio ou cobre a placa antes da perfuração de um capuz de cultura de tecidos. Normalmente, bastam 3 furos com um diâmetro de 3,5 mm em cada lado da placa (borda curta).
  2. Prepare um banco do fluxo laminar, limpeza com etanol a 70%. Na sequência de técnicas de cultura de tecido padrão asséptico, remova a mídia do balão de célula ou prato. Lavar as células com 5-10 mL de tampão fosfato salino (PBS) e então adicionar tripsina 2 mL no balão. Incube o frasco a 37 ° C até separar as células A-431. Conte as células ou usando um contador de haemocytometer ou celular. Prepare uma suspensão de células de 50.000 células/mL em meio de cultura.
  3. Dispense a 40 µ l de suspensão de células (dando uma densidade celular final de 2.000 células por poço) em cada poço de uma placa de ensaio utilizando um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal, dependendo da escala do experimento. Brevemente, mova a placa do lado-para dispersar as células uniformemente na parte inferior da placa.
  4. Para minimizar os efeitos de borda de placa, permitem que as células acertar na parte inferior da placa de ensaio por 20 minutos em temperatura ambiente na parte de trás da capa de fluxo laminar. Em seguida, coloque a placa em um recipiente de plástico com toalhas de papel úmido para garantir um ambiente úmido. Antes da utilização, limpe o recipiente de plástico com etanol a 70%.
  5. Incube a caixa com a placa de ensaio durante 2-3 dias a 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada convencional. Monitorar a confluência das células até 50-75%, avaliada pela inspeção visual com um microscópio de luz.

2. composto de tratamento

  1. No dia do experimento, Aspire o meio de cada poço usando uma máquina de lavar prato. Coloque a placa na máquina de lavar prato e selecione o programa de aspiração. Se uma máquina de lavar prato não estiver disponível, o líquido pode ser removido invertendo-se a placa com um toque de mão rápida sobre uma bandeja de resíduos ou pia. Remoção completa do líquido é essencial para o bom desempenho. Qualquer excesso de líquido é então removido esfregando com toalhas de papel.
  2. Adicione 30 µ l de compostos diluído na concentração apropriada em meio de cultura celular usando a distribuição automatizada ou uma pipeta multicanal, dependendo da escala do experimento. Certifique-se para adicionar um controle positivo (conhecido ligante) e negativos (DMSO) para vários poços em cada placa de ensaio. Já que este é um ensaio de mudança térmica, é necessário que a concentração de compostos excede a constante de dissociação para observar estabilização de proteínas. Assim, uma diretriz áspera para a concentração de compostos é 50 - 100 vezes o IC50, mas mais descrições de detalhe para as concentrações de compostos são encontradas na seção de discussão.
    Nota: A tolerabilidade de DMSO das linhas celulares deve ser testada antes do experimento.
  3. Selo, a placa de ensaio composto-tratados com uma placa respirável selar e incubar a 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada por 30 minutos.

3. calor desafio

  1. Primeiro, defina o banho de água à temperatura desejada. Note-se que a temperatura final que é alcançada dentro dos poços da placa de ensaio pode ser diferente a temperatura final em banho-maria. Investiga o deslocamento de antemão com um termômetro de placa e termopar de manequim. Normalmente demora 30 minutos para o banho para estabilizar na temperatura desejada.
  2. Para verificar que a temperatura desejada é atingida nos poços da placa de ensaio durante a etapa de aquecimento, prepare um prato fictício sem lacre, contendo o mesmo volume de meio como a placa de ensaio.
  3. Remova as placas de ensaio da incubadora. Tire o selo respirável e re-selar a placa de ensaio que contém as células tratadas composto com uma folha de alumínio adesiva apertado para garantir que nenhuma água irá vazar nos poços durante o aquecimento subsequente em banho-maria. Certifique-se de que os furos na moldura de placa são acessíveis.
  4. Coloque a placa de ensaio e a manequim placa no banho de água com o fundo do prato inclinado em direção a superfície da água para forçar todo o ar restante para fora debaixo das placas.
  5. Monitore a temperatura no interior os poços de uma placa de manequim novo usando um termômetro de termopar.
  6. Aquece a placa de ensaio em banho-maria durante 3 minutos. Transferi imediatamente o ensaio e a placa de manequim para outro banho de água com água de sala-moderado arrefecer por 5 minutos. A placa de ensaio está agora pronta para processamento adicional.

4. fixação

  1. Dispense o paraformaldeído de 16% (p/v) 10 µ l (PFA) diretamente para a placa de ensaio utilizando um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal. Incube a temperatura ambiente por 20 minutos.
    Nota: Alguns fixadores são classificados como substâncias cancerígenas e regulamentos de segurança institucional devem ser seguidos.
  2. Aspirar a solução PFA e lavar as células com 300 µ l PBS, usando uma máquina de lavar prato. Coloque a placa na máquina de lavar prato e selecione o programa de aspiração.
    Nota: Este procedimento foi otimizado usando um protocolo de estouro na máquina de lavar prato no qual líquido simultaneamente é dispensado e removido. Se uma máquina de lavar prato ou procedimento similar não estiver disponível, a etapa de lavagem Alternativamente pode ser feita manualmente.
  3. Manual de procedimento de lavagem: Remova o líquido dos poços, invertendo-se a placa com um toque de mão rápida sobre uma bandeja de resíduos ou pia. Remoção completa do líquido é essencial para o bom desempenho. Adicione 80 µ l de PBS com uma pipeta multicanal e inverter a placa novamente conforme descrito acima, repita o procedimento de lavagem duas vezes. Após a última lavagem, borre a placa contra as toalhas de papel limpo para remover qualquer excesso de líquido.

5. permeabilização

  1. Adicionar 20 µ l de 0,1% (v/v) NP-40 para os poços, com uma pipeta multicanal e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. Lave as células usando o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
  2. Como alternativa, quando for o caso, aplica um protocolo de recuperação de antígeno, por exemplo:
    1. Adicione 20 µ l de SDS 1% para os poços, com uma pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos e lave de acordo com o mesmo procedimento descrito acima (passo 4.2).
    2. Adicione 80 μL de glicina 10mm em pH 7,2 e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Aspire a solução de glicina usando uma máquina de lavar prato colocando na máquina de lavar prato e selecionando o protocolo de aspiração. Ver notas em 2.1 e 4.2 se uma máquina de lavar prato não está disponível.

6. bloqueio

  1. Adicione 15 µ l de 1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em PBS nos poços utilizando um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal. Incube a placa à temperatura ambiente por 1 hora ou durante a noite a 4 ° C, com um selo de placa de alumínio de alumínio.

7. primário anticorpo

  1. Aspire a solução bloqueio usando uma máquina de lavar prato colocando na máquina de lavar prato e selecionando o protocolo de aspiração. Ver notas em 2.1 e 4.2 se uma máquina de lavar prato não está disponível.
  2. Adicionar 10 µ l de anticorpo primário diluído em conformidade em 1% (p/v) BSA em PBS aos poços utilizando uma pipeta multicanal. Incube a placa à temperatura ambiente por 1 hora ou durante a noite a 4 ° C, com um selo de placa de alumínio de alumínio.

8. secundário anticorpo

  1. Aspirar a solução de anticorpo primário e lavar os poços de acordo com o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
  2. Adicionar 10 µ l de Alexa 488 anticorpo secundário diluído em conformidade em 1% (p/v) BSA em PBS. Incube a temperatura ambiente por 1 hora. A placa do selo com um selo de alumínio de alumínio adesiva para proteger da luz.
    Nota: Protege a placa da luz durante esta e as etapas subsequentes.

9. nuclear manchando e máscara de célula

  1. Adicione 10 µ l de corante nuclear diluído a 0,05 mg/mL em PBS aos poços utilizando uma pipeta multicanal. Incube a temperatura ambiente por mais 10 minutos.
  2. Aspirar o anticorpo secundário e Hoechst solução e lavar os poços usando o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
  3. Adicione 10 µ l de células máscara diluída a 200 ng/mL em PBS aos poços utilizando uma pipeta multicanal. Incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
  4. Aspirar a solução de máscara de célula e lavar os poços usando o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
  5. Dispensar 60 µ l de PBS para todos os poços, usando a máquina de lavar prato, um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal e selar as placas com um adesivo de alumínio.

10. aquisição e análise de imagem

  1. Capturar imagens em uma imagem de conteúdo elevada usando 3 canais fluorescentes: DAPI (387/447), GFP (472/520) e TexasRed (562/624). Adquira 4 imagens por alvéolo com 10 X objetivo. Uso automatizado do laser autofocus e aplicar as 2 durante a aquisição. Armazenar imagens como arquivos tiff escala de 16 bits, cinza juntamente com metadados.
  2. Analise imagens usando o software disponível. Identifica os limites da célula usando um algoritmo celular marcando com DAPI (núcleo) e TexasRed (citoplasma).
  3. Extrato de intensidade média para todos os comprimentos de onda adquiridas para posterior análise de dados.
  4. Calcule o Z-fator para garantir a robustez do ensaio.
  5. Calcular a % de estabilização através da seguinte fórmula: 100 * (1-(bem intensidade-intensidade média bem controlo negativo) / (média intensidade positiva controle-média intensidade de controlo negativo)). Aqui o controle negativo é DMSO e controle positivo é a substância de referência. Desde a estabilização máxima entre compostos pode variar e na verdade ser maior que o controle positivo para curvas ITDRF, as intensidades de estabilização de máximo e mínimo para cada composto são usadas às vezes no lugar dos valores de intensidade dos poços de controle .

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Representative Results

O protocolo descrito na Figura 1 descreve o fluxo de trabalho básico para a execução de ensaios CETSA em células aderentes com detecção de proteína solúvel restante pelo alta conteúda imagem. Este fluxo de trabalho pode ser facilmente adaptado a todas as fases de desenvolvimento do ensaio, modificando o layout da placa dos compostos ou reagentes14. Detalhamos os resultados esperados para vários antecipado abaixo de casos de uso.

Identificação de anticorpos e o desenvolvimento do ensaio. Um pré-requisito para resultados de sucesso é a identificação de um anticorpo primário ou outro reagente adequado afinidade que seletivamente reconhece a forma nativa da proteína na presença da proteína de agregados e precipitada formada durante o calor desafio na etapa 3. Para estabelecer o ensaio de imagens CETSA descrito aqui, nós selecionados de um painel de 9 anticorpos visando p38α a 52° C para janela de sinal entre os controles positivos e negativos. Em seguida, titulada os melhores anticorpos e se estabeleceram nas condições mostradas na Figura 2 A, B com representante imagens de imunofluorescência para p38α estabilizada por um ligante conhecido (controle positivo) e DMSO (controle negativo). Reconhecimento de anticorpos também não deve ser interrompido pelas alterações conformacionais da proteína alvo que pode ser induzida pelo ligante de ligação (Figura 2). Por exemplo, BIRB796 tem uma longa na tarifa e quantificação de engajamento alvo só foi possível através da aplicação de uma etapa de recuperação de antígeno (5.2; Figura 2D). É importante validar o desempenho do anticorpo primário com ligantes conhecidos cobrindo sítios de ligação diferentes da proteína alvo, se disponível. A validação de anticorpo é feita de preferência com e sem a etapa de recuperação de antígeno.

Tagg e curvas ITDRF. Como mencionado acima, CETSA experimentos podem ser executados em dois modos diferentes, curvas deagg T e ITDRF experiências. Ambas as variantes utilizam o mesmo protocolo básico descrito na Figura 1 e na seção de protocolo. Na configuração do primeira, o objetivo é desafiar as células com um gradiente de temperatura e comparar as curvas deagg T na presença e na ausência de uma única concentração de ligante. Para executar uma curva deagg T, chapas separadas são aquecidas por 3 minutos numa gama de temperaturas. Na execução deste experimento, é importante cronometrar a duração do tratamento composto por cada placa com o tempo que leva para o banho de água a estabilizar à nova temperatura. A este respeito, realizam o desafio de calor passo o banho de água é mais demorado do que os tubos em uma máquina PCR de aquecimento. O caminho experimental é a próxima concentração executar curvas de resposta de um ligante a uma temperatura fixa para gerar curvas ITDRF. Em geral, ao testar vários compostos, ensaio placas prontas para a adição de composto são preparadas com manipulação automatizada de líquido para alcançar os dados mais reprodutíveis. Compostos são serialmente diluídos em DMSO e então dissolvidos em meios de cultura celular para as concentrações desejadas. Nós testamos tipicamente série de concentração do ponto 11 começando em 50-100 µM em diluição de 3 ou 4 vezes, mas isso depende da potência de ligantes utilizados. É aconselhável primeiro estabelecer a curva deagg T tanto na ausência e presença de um ligante e selecionar a temperatura para posteriores experiências isotérmicas, onde se pode observar uma mudança entre as curvas. A temperatura seleccionada deve ser em torno ou acima do Tagg. Ambos os formatos permitem a confirmação do engajamento do alvo, mas para o ranking de afinidades compostas ITDRF experimentos são frequentemente mais adequado. A figura 3A mostra uma ilustração de resultados quantitativos previstos para uma curva deagg T e Figura 3B quantifica os resultados de um experimento típico de ITDRF.

Campanha de rastreio. O protocolo também pode ser adaptado para triagem de campanhas para identificar novos ligantes da proteína alvo. Neste caso, desafios de calor isothermal são aplicados para um grande número de compostos em uma única concentração seguido por experiências ITDRF para estabilização de compostos identificados. Preparamos o ensaio placas de triagem pronta e transferir os compostos diluídos em meios de cultura para as placas de ensaio usando manipulação automatizada de líquido. Como com todos os ensaios de estabilidade térmica, é necessário ultrapassar a constante de dissociação para observar estabilização de proteínas, e assim temos aplicado bibliotecas pequena molécula em 50 µM para facilitar a identificação de sucesso. Na triagem dos hits usando ITDRF mais tarde irá permitir classificação e priorização destes compostos. A Figura 4 mostra um resultado representativo de um placa de triagem.

Figure 1
Figura 1 . Visão esquemática do protocolo descrito neste artigo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Desenvolvimento de identificação e doseamento de anticorpos. A) dados de exemplo para a deteção de p38α humano nas células A-431. Imagens representativas de positivo (1 µM AMG548) e negativo (DMSO) controles. Vermelho - coloração nuclear da Hoechst, coloração verde-p38α. Imagens tiradas com ampliação de 10x; a barra de escala branco representa 73 µm. B) exemplo de dados quantitativos expressados como média intensidade/célula. Barras de erro representam o erro padrão da média de 16 repetições para 6 placas separadas. Cada prato foi aquecido a 52 ° C em banho de água, seguido de fixação das células, permeabilização e imunocoloração subsequente. Intensidade do sinal de imunofluorescência C) medido após tratamento de células A-431 com 1 µM BIRB796 ou DMSO conforme descrito acima seguido diretamente de fixação. Na ausência de uma etapa de aquecimento, o sinal de BIRB796 é menor do que o sinal de DMSO, sugerindo que BIRB796 interrompe a detecção de p38α com este anticorpo. D) curvasCETSA ITDRF para as células tratadocom com BIRB796 com (triângulo azul) ou sem protocolo de recuperação de antígeno (triângulo cinza). Esta figura foi modificada de Axelsson et al . 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Experiências de agregação térmica e ITDRF. A) experimentos de curva de agregação térmica para células tratadocom com positivo (1 µM AMG548, em laranja) e negativo de controles (DMSO em cinza). Barras de erro representam o erro padrão da média de 464 ou 32 repetições. B) experiênciaCETSA ITDRF feita a 52 ° C para as células tratadas com diluições em série de SB203580 em azul, Skepinone-L, em verde e RWJ67657 em vermelho. Barras de erro representam o erro padrão da média de 6 repetições. Dados quantificados são expressos como média intensidade/célula e normalizados contra a maior concentração de composto respectivo. Esta figura foi modificada de Axelsson et al . 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Visão representativa de uma placa de triagem na ampliação de 10x. Controles positivos (1 µM AMG548) estão nas colunas 2 e 24 e controles negativos (DMSO) estão nas colunas 1 e 23. Todos os outros poços contenham 50 µM dos compostos biblioteca usada para rastreio com vários hits denotados. Nas figuras de baixo-relevo, a linha branca no canto inferior direito representa 200 µm. Esta figura foi modificada de Axelsson et al . 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Conforme discutido na seção resultados, existem várias etapas-chave para o procedimento. Em primeiro lugar, é importante identificar um reagente de afinidade de alta qualidade. Recomendamos selecionando uma pequena biblioteca de anticorpos para cada destino desejado. Depois um anticorpo primário foi selecionado, é igualmente importante validar o sistema para um número de sítios de ligação diferente do alvo da proteína, se for o caso. Counter-triagem para compostos que interferem com o sinal de teste, conforme mostrado na Figura 2 , omitindo o desafio de calor é altamente encorajada. Quando é observado um sinal reduzido na presença de um ligante, um protocolo de recuperação de antígeno conforme descrito na etapa 5.2 pode ser testado. Aquecimento desigual das placas pode causar flutuações e variações para-placa nos dados observados. Desde que as placas são parcialmente submersa em um banho de água durante o desafio de calor transiente (passo 3.4) os poços exteriores das placas são expostos à água quente não só no fundo dos poços, mas também através da parede exterior. Isto pode causar uma temperatura mais elevada durante o mesmo tempo de submersão em poços de exterior da placa e efeitos de borda de placa subsequentes. Portanto, é recomendável evitar as exteriores cavidades da placa. Efeitos similares também podem ser vistos se as bolhas de ar estão presos sob a placa durante a etapa de aquecimento evitando contato suficiente entre a água quente e o fundo dos poços. Face aos desafios com placas de imagens térmicas, dispositivos e placas feitas especificamente para exposição ao calor podem ajudar avançar este método. Nós exploramos o uso de várias linhas de células e encontraram variabilidade em anexo de superfície após o desafio de calor para tipos de células aderentes. Experimentos preliminares em nosso laboratório sugerem que a utilização de uma matriz extracelular ou revestimento como Synthemax II-SC ou célula-Tak pode minimizar o desprendimento de células, mas isso poderia representar um desafio técnico ao usar os tipos de células semi anexado. Desde que o tratamento composto é realizado em células vivas, as pequenas moléculas devem ser célula permeável. Se o composto não é uma membrana permeável, métodos CETSA alternativa alto throughput são recomendados. Alguns compostos precisam ser ativadas metabolicamente para vincular a sua meta de proteínas11. Em tais casos, recomenda-se mais células de tratamento com o composto antes do desafio de calor.

Este protocolo requer um prato único da célula semeadura para torná-lo passível de alto throughput screening campanhas de imagem. O número de células para cada experimento é muito menor do que pode ser alcançado com borrões ocidentais ou AlphaScreen anterior ensaios15. Além disso, lavar ou etapas de desprendimento celular, que podem alterar a vinculação e a disponibilidade de compostos, são removidas, preservando o equilíbrio estabelecido ligação através da etapa de desafio do calor. Ao contrário dos procedimentos anteriores, a falta de sinal devido a citotoxicidade é relatada simultaneamente pela coloração nuclear. Finalmente, a imagem latente preserva a resolução espacial das células individuais, que permite medições de engajamento do alvo em populações mistas de células ou célula Estados.

Para realmente avaliar a aplicabilidade da abordagem, são necessários esforços concertados para aplicar a técnica do outro lado do proteome de derretimento. Tais experiências clarificará a facilidade de identificação de reagentes apropriados de afinidade, que relatam seletivamente na proteína nativa na presença de restantes desnaturado e agregados de proteínas. Atualmente não sabemos como os níveis de expressão da proteína afetará a capacidade de medir confiavelmente uma janela de sinal. Esperamos que isto reflecte afinidade e seletividade dos anticorpos disponíveis, e antecipar que para baixas proteínas abundantes tecnologias utilizadas para melhorar o sinal em ensaios de imunofluorescência será aplicáveis. Alternativamente, etiquetadas proteínas ou compostos funcionalizados poderiam ser usados para a deteção em versões modificadas do protocolo descrito. Este protocolo é limitado aos alvos que derretem e para interações onde se pode observar uma estabilização quantificável. Por exemplo, ligantes endógenos podem estabilizar uma proteína em ensaios de célula viva, que pode impedir a estabilização adicional por um ligante exógeno. Embora não exploradas aqui, acreditamos que será possível leituras multiplex para permitir o estudo de alvos múltiplos simultaneamente, ou um alvo com efetores a jusante. Mais estudos são necessários para investigar estes aspectos em situ CETSA.

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Disclosures

Os autores têm sem divulgações de relatório.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o suporte de infra-estrutura de ciência para a vida de laboratório e Karolinska Institutet. Os autores também reconhecem a entrada e discussões com Michaela Vallin, Magdalena Otrocka e Thomas Lundbäck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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