Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Uyuşturucu hedef nişan ölçümleri etkili ilaç geliştirme ve kimyasal sonda doğrulama için merkezi. Burada, uyuşturucu-hedef nişan yüksek içerik görüntüleme hücresel termal kayması tahlil (CETSA) bir Mikroplaka uyumlu uyum içinde kullanarak ölçmek için bir protokol ayrıntılı.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Küçük moleküller arasındaki etkileşimin amaçlanan protein hedefleri ile quantitating ilaç geliştirme, hedef doğrulama ve kimyasal sonda doğrulama için önemlidir. Bu fenomen protein hedef veya küçük molekül yapılmaksızın tedbir Teknik olarak zor olsa da özellikle değerli yöntemlerdir. Hücresel termal kayması tahlil (CETSA) hedef nişan canlı hücreler içinde izlemek için bir tekniktir. Burada, tek hücre düzeyinde hücre altı yerelleştirme koruyarak yüksek işlem hacmi ölçülerini sağlar orijinal CETSA iletişim kuralı bir uyarlaması açıklayın. Bizce bu protokolü CETSA uygulaması bileşik-hedef etkileşiminde, özellikle hücre türdeş olmayan nüfus derinlemesine karakterizasyonu için önemli gelişmeler sunar.

Introduction

Yeni ilaç veya kimyasal probları gözlenen farmakolojik etkisi veya fonksiyonel okuma hedef doluluk veya nişan canlı hücreleri1,2,3' te ölçülerini çift esastır geliştirirken. Bu veriler küçük molekül aslında istenen hedefine ulaştığından emin olmak için ve protein hedef seçimi4,5arkasında biyolojik hipotez doğrulamak için gereklidir. Ayrıca, ilaç geliştirme sırasında artan karmaşıklık model sistemleri seçin ve bir ipucu klinik öncesi bileşik teyit için kullanılır. Bu preklinik sistemleri arasında çeviri biyoloji onaylamak için uyuşturucu-hedef nişan izleme ve biyoloji bu gelişim süreci boyunca eşlik eden kritik yöntemlerdir.

Uyuşturucu-hedef nişan geleneksel unfunctionalized küçük moleküller ve protein, uzaysal çözünürlük6,7ile tek hücre düzeyinde özellikle canlı hücrelerdeki izlemek için zor olmuştur. Bir son yöntem arasındaki etkileşim gözlemlemek için uyuşturucu değiştirilmemiş ve canlı hücrelerdeki protein olduğunu ligand kaynaklı istikrar yanıt bir ısı meydan okuma olarak yerli protein quantified8olduğu hücresel termal kayması tahlil (CETSA), 9,10. Bu süre bir ısı meydan okuma maruz kalan çözünür protein miktarının tarafından gerçekleştirilir. CETSA ilk açıklanması Batı leke tespiti için kullanıldı. Tarama kampanyalarını etkinleştirmek ve daha büyük bileşik koleksiyonları önceliklendirmek vurmak için çabaları CETSA deneyler iş çıkarma yeteneğini artırmak için birkaç homojen, mikroplaka tabanlı deneyleri10,11gelişmesine yol var. Ancak, bir bu yöntemler ile Şu anda en iyi hücre süspansiyonlar bileşik tedavi uygundur ve hücre lizis, mekansal bilgi kaybına yol önde gelen algılama gerektirir kısıtlamadır. CETSA-ebilmek var olmak deneysel olarak termal toplama sıcaklık (Tagg) ligand kaynaklı vardiyada küçük molekül tek bir konsantrasyon veya ligand konsantrasyonu protein tek bir ısıda dengelemek gerekli uygulanan. İkinci izotermal doz yanıt parmak bağımlılık belirli deneysel koşullar üzerinde bu ölçümlerin belirtmek için (ITDRF) olarak adlandırılır.

Bu iletişim kuralı CETSA immünfloresan (Eğer) antikor algılama yüksek içerikli mikroskobu12ile yapışık hücreleri kullanarak hedef nişan ölçmek için hedeftir. Bu yordamı hücre altı yerelleştirme korunması ile hedef angajman tek hücreli miktar için izin vermek için orijinal CETSA platform uzanır. Özellikle, önceki raporların çoğu, bu yordamda yüzey dekolmanı veya çamaşır böylece biz13ölçmek amacıyla kurulan bağlama dengeyi koruyarak ısı meydan okuma önce geçmeden canlı yapisan hücrelerde bileşik tedavi yapılır. Şu anda, yöntem bir hedef protein p38α için doğrulanır (MAPK14) içinde birkaç satır hücre ve bu yordamı paylaşarak teknik geniş erime Proteom uygulanabilir olduğunu umuyoruz. Biz bu protokolü tarama ilaç geliştirme boru hattı boyunca adapte edilebilir, aracılığıyla hedef nişan vivo içindeizleme için önceliklendirme vurmak tahmin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tohum hücrelerinin

Not: İş akışı genel bakış için bkz: Şekil 1. Tablo malzemelerimalzemeler ve Kimyasalları ait ayrıntılı bir liste mevcuttur.

  1. Hücreleri tohum önce siyah 384-şey görüntüleme tahlil tabak tabak altında daha sonra Isıtma adımı sırasında yakalanan hava kabarcıkları önlemek için çerçeve içinde bir standart matkap ile delik. Plastik parçacıklar kuyuları bu adımı sırasında girerek önüne geçmek ve steril koşullar korumak için bir yapışkan alüminyum folyo ile plakalarının veya doku kültürü mahallede delme önce plaka kapak. Genellikle, her yan plaka (kısa kenar) bir 3, 5 mm çapında 3 delik yeterli.
  2. Laminar akış tezgah % 70 etanol ile temizleyerek hazırlayın. Standart aseptik doku kültürü teknikleri, medya cep şişesi veya çanak kaldırmak. 5-10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren hücreleri yıkayın ve 2 mL tripsin şişesi için ekleyin. A-431 hücreleri ayırmak kadar 37 ° C'de şişeye kuluçkaya. Ya da bir haemocytometer veya hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. 50. 000 hücre/mL kültür ortamında bir hücre süspansiyon hazırlamak.
  3. Bir toplu reaktif dağıtıcı veya deneme ölçeğini bağlı olarak bir çok kanallı damlalıklı kullanarak bir tahlil plaka her kuyuya hücre süspansiyon (iyi başına 2.000 hücre son hücre yoğunluğu veren), 40 µL dağıtmak. Kısa bir süre için hücreler eşit kalenin dibinde dağıtmak için yan plaka taşımak.
  4. Plaka-kenar etkileri en aza indirmek için laminar akış kapağın arkasında oda sıcaklığında 20 dakika tahlil kalenin dibinde razı hücrelere izin. O zaman, nemli bir ortam sağlamak için nemli kağıt havlu ile plastik bir kapta plaka yer. Kullanımdan önce % 70 etanol ile Plastik Konteyner silin.
  5. 2-3 gün 37 ° C ve % 5 CO2 geleneksel bir oksijen kuluçka için tahlil plaka kutusuyla kuluçkaya. Confluency hücrelerin 50-%75 kadar bir ışık mikroskobu ile görsel denetim tarafından değerlendirildi izlemeniz.

2. bileşik tedavi

  1. Deneme günü, her şey bir plaka çamaşır makinesi kullanarak orta Aspire edin. Plaka plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirin ve aspirasyon programı seçin. Bir tabak yıkama yoksa, sıvı atık tepsi ya da lavabo üzerinde bir hızlı el twist ile plaka ters çevirme tarafından kaldırılabilir. Sıvı tamamen kaldırılması için iyi bir performans esastır. Herhangi bir aşırı sıvı sonra kağıt havlu ile dabbing tarafından kaldırılır.
  2. Hücre kültür otomatik dağıtımı kullanarak orta veya çok kanallı pipet deneme ölçeğini bağlı olarak yürüttüğü konsantrasyonu seyreltilmiş bileşiklerin 30 µL ekleyin. Her tahlil plaka üzerinde birkaç wells (DMSO) negatif ve pozitif (bilinen ligand) denetim eklemek için emin olun. Çünkü bu bir termal üst karakter tahlil, bileşik toplama protein sabitleme gözlemlemek için ayrışma sabiti aşıyor gereklidir. Böylece, kaba bir kılavuz bileşik toplama için 50 - 100 kez IC50, ama daha ayrıntılı açıklamaları için bileşik konsantrasyonları tartışma bölümünde bulunur.
    Not: DMSO tolerabilite hücre hatları deneme önce test edilmelidir.
  3. Nefes alabilen bir plaka ile bileşik tedavi tahlil plaka mühür ve 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka 30 dakika boyunca kuluçkaya mühür.

3. ısı Challenge

  1. İlk olarak, su banyosu istenilen sıcaklığa ayarlayın. Tahlil plaka kuyu içinde ulaştığı son sıcaklık su banyosu içinde son sıcaklık farklı olabileceğini unutmayın. Uzaklık önceden bir sahte plaka ve ısıl termometre ile araştırmak. Genellikle banyo istenilen sıcaklıkta stabilize etmek için 30 dakika sürer.
  2. İstenen sıcaklık Isıtma adımı sırasında tahlil plaka wells ulaştığını doğrulayın mühürsüz bir kukla plaka orta aynı birim olarak tahlil plaka içeren hazır olun.
  3. Tahlil plakaları kuluçka makinesi kaldırın. Solunabilir mühür almak ve yeniden su kuyu su banyosu içinde sonraki Isıtma sırasında sızıntısı olmayacak emin olmak için sıkı yapışkan alüminyum folyo ile bileşik tedavi hücreleri içeren tahlil plaka mühür. Plaka çerçevesi içinde delik erişilebilir olduğundan emin olun.
  4. Tahlil plaka ve sahte plaka su banyosunda altından plakalar dışında kalan herhangi bir hava kuvvetleri için su yüzeyine doğru açılı plaka dibine yerleştirin.
  5. Isıl termometre kullanarak yeni bir kukla plaka kuyu içindeki sıcaklık izlemek.
  6. Sıcak su banyosu 3 dakika için tahlil plaka. Hemen tahlil ve sahte plaka başka bir su banyosu için 5 dakika soğumasını Oda temperli su ile aktarın. Tahlil plaka artık daha fazla işlem için hazırdır.

4. fiksasyon

  1. 10 µL % 16 (w/v) paraformaldehyde (PFA) doğrudan bir toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak tahlil plakasına dağıtmak. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya.
    Not: Bazı fiksajlar kanserojen olarak sınıflandırılır ve kurumsal güvenlik kurallarına uyulmalıdır.
  2. İngiltere'de yılın çözüm Aspire edin ve hücreleri bir tabak yıkama 300 µL PBS ile yıkayın. Plaka plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirin ve aspirasyon programı seçin.
    Not: Bu yordam içinde sıvı aynı anda reçete kaldırıldı ve plaka contalara bir taşma protokolünü kullanarak optimize edilmiştir. Bir tabak yıkama veya benzer yordam kullanılabilir değilse, çamaşır adım alternatif olarak el ile yapılabilir.
  3. Yordam yıkama el ile: Sıvı atık tepsi ya da lavabo üzerinde bir hızlı el twist ile plaka ters çevirme tarafından kuyulardan kaldırın. Sıvı tamamen kaldırılması için iyi bir performans esastır. PBS 80 µL bir çok kanallı pipet ile eklemek ve yukarıda açıklandığı gibi yeniden plaka ters çevir, iki kez çamaşır yordamı yineleyin. Son yıkama sonra plaka karşı herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak için temiz kağıt havlu leke.

5. permeabilization

  1. 20 µL % 0.1 (v/v) NP-40 için çok kanallı damlalıklı Wells'le ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. (Yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak hücreleri yıkayın.
  2. Alternatif olarak, uygun olduğunda, Örneğinbir antijen alma protokole uygulanır:
    1. 20 µL % 1 SDS wells ile çok kanallı damlalıklı ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya ve göre (yukarıdaki adım 4.2) açıklanan yordamın aynısını yıkayın.
    2. 10 mM glisin 80 μL pH 7.2 ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya. Glisin çözüm plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirerek ve aspirasyon Protokolü seçerek bir plaka çamaşır makinesi kullanarak Aspire edin. Bir tabak yıkama yoksa 2.1 ve 4.2 Notlar'a bakın.

6. engelleme

  1. %1 (w/v) Sığır serum albumin (BSA) 15 µL PBS içinde toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak wells ekleyin. Plaka 1 saat oda sıcaklığında veya gecede bir alüminyum folyo plaka mühür ile 4 ° C'de kuluçkaya.

7. birincil antikor

  1. Plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirerek ve aspirasyon Protokolü seçerek bir plaka çamaşır makinesi kullanarak engelleme çözüm Aspire edin. Bir tabak yıkama yoksa 2.1 ve 4.2 Notlar'a bakın.
  2. Birincil antikor buna göre seyreltilmiş 10 µL eklemek %1 (w/v) BSA PBS bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için. Plaka 1 saat oda sıcaklığında veya gecede bir alüminyum folyo plaka mühür ile 4 ° C'de kuluçkaya.

8. ikincil antikor

  1. Birincil antikor çözüm Aspire edin ve aynı yordam göre wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi yıkayın.
  2. Alexa 488 ikincil antikor buna göre seyreltilmiş 10 µL eklemek %1 (w/v) BSA PBS içinde. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya. Işıktan korumak için bir yapışkan alüminyum folyo mühür ile plaka mühür.
    Not: Bu sırasında ışık plaka ve sonraki adımları korumak.

9. nükleer boyama ve cep maskesi

  1. 0,05 mg/ml bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için PBS içinde seyreltilmiş nükleer boya 10 µL ekleyin. Oda sıcaklığında ek 10 dakika boyunca kuluçkaya.
  2. İkincil antikor ve Höchst çözüm Aspire edin ve wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak yıkayın.
  3. 10 µL 200 ng/ml PBS içinde bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için seyreltilmiş cep maskesi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçkaya.
  4. Cep maskesi çözüm Aspire edin ve wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak yıkayın.
  5. PBS 60 µL tabak yıkama, toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak bütün kuyuları için vazgeçmek ve bir yapışkan alüminyum folyo ile plakalarının.

10. görüntü toplama ve Analizi

  1. Yüksek bir içerik Imager 3 floresan kanallarını kullanarak görüntüleri yakalama: DAPI (387/447), GFP (472/520) ve TexasRed (562/624). 4 adet 10 X amacı istimal şey başına elde etmek. Otomatik Lazer otofokus kullanabilir ve satın alma sırasında binning 2 uygulayabilirsiniz. Görüntüler 16 bit, gri ölçek TIFF dosyaları meta veriler ile birlikte olarak saklar.
  2. Mevcut yazılım kullanarak görüntüleri analiz. Hücre kenarlıklarını DAPI (çekirdek) ve TexasRed (sitoplazma) ile hücre Puanlama bir algoritma kullanarak tanımlayın.
  3. Ortalama yoğunluk elde edilen dalga boyu daha fazla veri analiz için ayıklayın.
  4. Tahlil sağlamlık sağlamak için Z-faktör hesaplayın.
  5. % Sabitleme aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: 100 * (1-(iyi yoğunluğu-ortalama iyi yoğunluğu negatif kontrol) / (ortalama yoğunluğu olumlu denetim-ortalama yoğunluğu negatif kontrol)). Burada negatif kontrol DMSO ve olumlu denetim başvurusu maddedir. Maksimum istikrar bileşikler arasında farklılık gösterir ve hatta olumlu denetim ITDRF eğriler için daha büyük beri her bileşik için maksimum ve minimum sabitleme yoğunluklarda bazen kontrol wells yoğunluk değerleri yerine kullanılır .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 ' de özetlenen protokolünü CETSA deneyleri tarafından yüksek içerik görüntüleme kalan çözünür protein tespiti ile yapışık hücreleri üzerinde çalıştırmak için temel iş akışını açıklar. Bu iş akışı bileşikleri veya reaktifler14plaka yerleşimini değiştirerek tüm gelişimin tahlil için kolayca adapte edilebilir. Birkaç beklenen kullanım örnekleri aşağıda için beklenen sonuçlar ayrıntı.

Antikor kimlik ve tahlil geliştirme. Birincil bir antikor veya seçime bağlı olarak oluşan ısı sırasında toplanan ve zarlarını protein huzurunda protein yerli şeklinde tanır diğer uygun benzeşim reaktif kimliği başarılı sonuçlar için bir önkoşuldur 3. adımda meydan. Burada açıklanan CETSA görüntüleme tahlil oluşturmak için bir panel 9 antikorların pozitif ve negatif denetimler arasındaki sinyal penceresi için 52 ° C'de p38α hedefleme tarandı. Daha sonra en iyi antikor titre ve Şekil 2 A, B temsilcisi ile ayirt görüntüler bilinen ligand (pozitif kontrol) ve DMSO (negatif kontrol) tarafından stabilize p38α için gösterilen koşullara yerleşti. Antikor tanıma da (Şekil 2C) bağlama ligand tarafından indüklenen hedef proteinin konformasyon değişikliklerden kesintiye değil. Örnek olarak, BIRB796 bir uzun oranı kapalı olan ve sadece bir antijen alma adım (5.2; uygulayarak hedef angajman miktar mümkün Şekil 2B). Birincil antikor performansı bilinen ligandlar farklı bağlayıcı siteleri hedef protein varsa kapsayan doğrulanması önemlidir. Antijen alma adım olmadan ve ile antikor doğrulama tercihen yapılır.

Tagg ve ITDRF eğrileri. Yukarıda belirtildiği gibi CETSA deneyler iki farklı mod, Tagg eğrileri ve ITDRF deneyler çalıştırabilirsiniz. Her iki değişik Şekil 1 ' deki ve protokol bölümünde özetlenen aynı temel iletişim kuralını kullanır. İlk kurulumunda bir sıcaklık gradyanı hücrelerle meydan ve Tagg eğrileri ligand tek bir konsantrasyon ile karşılaştırmak için amacıdır. Bir Tagg eğrisi gerçekleştirmek için ayrı levhalar sıcaklık aralığında 3 dakika ısıtılır. Bu deney gerçekleştirirken, su banyosu için yeni sıcaklık stabilize etmek için gereken zamanı ile her plaka için bileşik tedavi uzunluk zaman önemlidir. Bu bağlamda, ısı meydan adım su banyosunda peforming PCR makinesi tüplerde Isıtma daha fazla zaman alıcı. Deneysel bir ligand ITDRF eğriler oluşturmak için sabit bir sıcaklık sonraki çalışma konsantrasyonu yanıt eğrileri için yoludur. Genel olarak, birden çok bileşikleri sınarken, tahlil hazır kaplamalar, bileşik toplama için en tekrarlanabilir veri elde etmek için otomatik sıvı işleme kullanarak hazırlanır. Bileşikler seri olarak DMSO içinde seyreltilmiş ve hücre kültür medya istenen konsantrasyonları çözünmüş. Genellikle 50-100 µM 3 ya da 4 kat seyreltme başlayan 11 nokta toplama serisi test ettik, ama bu kullanılan ligandlar potens bağlıdır. Bu ilk Tagg eğrisi devamsızlık ve bir ligand varlığı hem de kurmak ve eğriler arasındaki bir kayma nerede gözlenen sıcaklık sonraki izotermal deneyler için seçmek için tavsiye edilir. Seçili sıcaklığı çevresinde veya Tagghemen üstünde olmalıdır. Her ikisi oluşum hedef nişan onay için izin ancak bileşik benzeşim ITDRF sıralaması için deneyler çoğu kez daha uygun. Tipik bir ITDRF denemenin sonuçları Şekil 3B quantifies ve Şekil 3A Tagg eğriye ait beklenen quantified sonuçlarının bir örnek gösterir.

Kampanya eleme. İletişim kuralı da kampanyaları hedef protein roman ciltleri tanımlamak için eleme için adapte edilebilir. Bu durumda, izotermal ısı zorluklar çok sayıda bileşikler, ITDRF deneyler için tanımlanan teskin bileşikler ardından tek bir konsantrasyon için uygulanır. Tahlil hazır tarama plakaları hazırlayacak ve Kültür medya otomatik sıvı işleme kullanarak tahlil plakaları seyreltilmiş bileşikler transfer. Tüm termal kararlılık deneyleri ile protein sabitleme gözlemlemek için ayrışma sabiti aşmak gereklidir ve böylece küçük molekül kitaplıkları isabet kimlik kolaylaştırmak için 50 µM, uyguladığınız gibi. ITDRF kullanarak, şarkıları önceliklendirmek daha sonra sıralama ve öncelik belirlemesi bu bileşiklerin izin verir. Şekil 4 tarama plaka temsilcisi bir sonucu gösterir.

Figure 1
Resim 1 . Bu makalede açıklanan protokol şematik bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Antikor geliştirme kimlik ve tahlil. A) insan p38α A-431 hücrelerdeki tespiti için örnek veri. Pozitif temsilcisi görüntüler (1 µM AMG548) ve negatif (DMSO) kontrol eder. Kırmızı - nükleer Höchst boyama, boyama yeşil-p38α. 10 X büyütme ile çekilen görüntüler; Beyaz ölçek çubuğu 73 µm. B temsil eder) Ortalama Yoğunluk/hücre ifade edilen quantified veri örneği. Hata çubukları standart hatası 6 ayrı levhalar için 16 çoğaltır ortalamasını temsil eder. Her plaka hücreleri, permeabilization ve sonraki immunostaining fiksasyonu tarafından takip bir su banyosunda 52 ° c sıcak olduğu. C) ayirt sinyal yoğunluğu ölçülür A-431 hücreleri tedavi sonra 1 µM ile BIRB796 veya DMSO yukarıda açıklandığı gibi doğrudan fiksasyon tarafından takip. Bir Isıtma adım yokluğunda, BIRB796 sinyal BIRB796 p38α bu antikor ile tespiti bozan düşündüren DMSO sinyal daha düşüktür. D) ITDRFCETSA eğrileri hücreler için tedavi BIRB796 ile ikisinden biri (mavi üçgen) ile veya olmadan (gri üçgen) antijen alma protokolü. Bu rakam Axelsson vd. 201812den değiştirildi. Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Termal toplama ve ITDRF deneyler. A) termal toplama eğrisi deneyler hücreler için tedavi ile pozitif (1 µM AMG548, turuncu) ve negatif (DMSO gri) kontrol eder. Hata çubukları standart hatasını 32 veya 464 çoğaltır ortalamasını temsil eder. B) ITDRFCETSA deney 52 ° c hücreler için yapılan tedavi ile seri halinde dilutions SB203580 mavi, Skepinone-L yeşil ve kırmızı RWJ67657. Hata çubukları standart hatası 6 çoğaltır ortalamasını temsil eder. Quantified veriler Ortalama Yoğunluk/hücre ifade edilen ve ilgili bileşik en yoğun karşı normalleştirilmiş. Bu rakam Axelsson vd. 201812den değiştirildi. Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . 10 X büyütme bir tarama plaka temsilcisi bakış. Pozitif denetimleri (1 µM AMG548) 2 ve 24 sütun biçimidir ve negatif denetimleri (DMSO) sütun 1 ve 23 vardır. Diğer wells 50 µM ile belirtilen birden fazla bulunan ile tarama için kullanılan kitaplık bileşikleri içerir. İç metin rakamlar beyaz satır sağ alt köşesinde, 200 µm temsil eder. Bu rakam Axelsson vd. 201812den değiştirildi. Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sonuçları bölümünde anlatıldığı gibi birkaç anahtar adım prosedürü vardır. İlk olarak, bir yüksek kaliteli benzeşme reaktif belirlemek önemlidir. Antikorlar istenen her hedef için küçük bir kütüphane eleme tavsiye ediyoruz. Birincil bir antikor seçildikten sonra da uygunsa, protein hedef farklı bağlama siteler için sistem doğrulamak önemlidir. Karşı tarama için tahlil sinyal ile Şekil 2C içinde ısı meydan ihmal olarak gösterildiği gibi müdahale bileşikler yüksek teşvik edilmektedir. 5.2. adımda açıklandığı gibi bir antijen alma protokolü bir ligand varlığı düşük sinyal gözlenen zaman test edilebilir. Plakaların dengesiz ısınma dalgalanmalar ve plaka plaka çeşitleri gözlenen verilerde neden olabilir. Plakayı kısmen geçici ısı meydan (adım 3.4) sırasında bir su banyosunda batık bu yana dış kuyu plakaların sıcak su değil sadece alt Wells aynı zamanda dış duvar aracılığıyla maruz kalır. Bu plaka ve sonraki plaka kenar etkileri dış wells aynı batma süre içinde daha yüksek sıcaklık neden olabilir. Bu nedenle, bu kalenin dış kuyu önlemek için tavsiye edilir. Eğer hava kabarcıkları altında tabak sıcak su ve kuyu dibinde arasında yeterli temas engelleyen Isıtma adım sırasında tuzak benzer etkileri de görülebilir. Görüntüleme tabak Isıtma zorlukları göz önüne alındığında, aygıtları ve sıcağa maruz için özel olarak yapılmış plakaları bu yöntem peşin yardımcı olabilir. Biz birden fazla hücre satır kullanımı incelemiş bulunuyoruz ve değişkenlik yapisan hücre tipleri için ısı meydan sonra yüzey ekinde bulduk. Ön bizim laboratuvar deneylerinde bir kaplama veya hücre dışı matriks Synthemax II-SC veya hücre-Tak gibi kullanımı hücre dekolmanı en aza indirebilirsiniz ama bu yarı ekli hücre tipleri kullanırken bir teknik sorun oluşturabilecek öneririz. Bileşik tedavi canlı hücrelerde gerçekleştirilen beri küçük moleküller hücre geçirgen olmalıdır. Bileşik membran geçirgen değilse, alternatif yüksek işlem hacmi CETSA yöntem önerilir. Bazı bileşiklerin onların hedef proteinler11' e bağlamak için metabolik olarak aktive edilmesi gerekiyor. Bu gibi durumlarda, uzun tedavi hücreleri ile bileşik ısı meydan öncesinde tavsiye edilir.

Bu iletişim kuralı mükellef için kampanyalar eleme yüksek üretilen iş yapma Imaging'e tohum hücreden tek bir tabak gerektirir. Her deneme için hücre sayısı çok Batı lekesi ile elde edilebilir daha veya önceki AlphaScreen15deneyleri. Ayrıca, çamaşır veya bileşik kullanılabilirlik ve bağlama değiştirebilir, hücre dekolmanı adımları, ısı meydan adım üzerinden kurulan bağlama denge koruma kaldırılır. Önceki yordamlardan farklı olarak sinyal sitotoksisite nedeniyle eksikliği aynı anda üzerinde nükleer boyama tarafından bildirilmektedir. Son olarak, görüntüleme bırakmak için hedef nişan ölçümlerde hücreler veya hücre Birleşik karışık nüfus bireysel hücrelerin Uzaysal Çözünürlük korur.

Gerçekten yaklaşım uygulanabilirliğini değerlendirmek için uyumlu çabaları erime Proteom tekniği uygulamak için ihtiyaç vardır. Bu tür deneyler uygun benzeşim reaktifler, hangi rapor üzerinde kalan huzurunda seçmeli olarak yerli protein denatüre ve proteinler toplanan tanımlayan kolaylığı açıklığa kavuşacaktır. Biz şu anda protein ifade düzeyleri güvenilir bir sinyal pencere ölçmek için yeteneği nasıl etkileyeceğini bilmiyorum. Bu benzeşme ve seçicilik kullanılabilir antikorların yansıtmak ve düşük bol protein immünfloresan deneyleri sinyal artırmak için kullanılan teknolojiler geçerli olacak tahmin için bekliyoruz. Alternatif olarak, tagged proteinler veya functionalized bileşikler açıklanan protokol değiştirilmiş sürümlerini algılamak için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı eritmek hedeflerine ve etkileşimler için ölçülebilir bir istikrar nerede görülebilir sınırlıdır. Örneğin, endojen ligandlar daha fazla istikrar eksojen bir ligand tarafından engel olabilir canlı hücre deneyleri bir protein sakinleştirebilecek. Her ne kadar burada keşfedilmeyi değil, aynı anda birden çok hedef çalışması için izin vermek için çok katmanlı okumayı veya bir hedef aşağı akım effectors ile mümkün olacağına inanıyoruz. Daha fazla çalışmaları in situ CETSA bu yönleriyle araştırmak gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir açıklamaları rapor var.

Acknowledgments

Yazarlar için hayat laboratuar ve Karolinska Institutet bilim altyapı destek kabul etmiş oluyorsunuz. Yazarlar ayrıca giriş ve Michaela Vallin, Magdalena Otrocka ve Thomas Lundbäck ile sohbet edersiniz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17, (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13, (6), e1002165 (2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14, (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17, (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9, (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23, (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341, (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9, (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13, (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21, (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, (30), E6231-E6239 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics