Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas

Genetics

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Summary

Este trabajo describe la clonación de una cepa de caballo de Troya de Ustilago maydis para la entrega in situ de proteínas secretadas de maíz en tres tipos diferentes de tejidos de maíz.

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Fiedler, I. C., Weiberg, A., van der Linde, K. Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins. J. Vis. Exp. (144), e58746, doi:10.3791/58746 (2019).

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Abstract

Inspirado en el mito de caballo Trojan Homer´s, hemos diseñado el patógeno del maíz Ustilago maydis para proporcionar proteínas secretadas en el apoplasto maíz permitiendo análisis fenotípico en vivo. Este método no se basa en la transformación de maíz pero explota capacidades secretoras de patógenos y genética microbiana. En este documento, permite la inspección de en vivo entrega proteínas secretadas con alta resolución espaciotemporal en diferentes tipos de sitios de infección y los tejidos. La estrategia del caballo de Troya puede ser utilizada para complementar transitorio maíz fenotipos de pérdida de función, para caracterizar funcionalmente dominios de la proteína, para analizar los efectos de la proteína objetivo, o para el estudio de sobredosificación de proteína juego, convirtiéndolo en una poderosa herramienta estudios de la proteína en el sistema de cultivo de maíz. Este trabajo contiene un protocolo preciso sobre cómo generar una cepa de caballo de Troya seguida por protocolos estandarizados infección aplicar este método a tres tipos de tejido diferentes de maíz.

Introduction

El patógeno foliares Ustilago maydis es el agente causativo del maíz smut enfermedad1. Infecta todas las partes aéreas de maíz resultando en tumores grandes que contienen esporas de melanized, negro. A nivel mundial, se estima en U. maydis causa una pérdida anual de alrededor del 2% de la producción de maíz, mientras que los tumores son apreciados como un manjar gastronómico en México. Infección de la planta se inicia por un apresorio que secreta enzimas lisis celular para penetrar la primera capa de células epidérmicas maíz. De un sitio de infección primaria, U. maydis crece intracelularmente e intracelular, invaden células de uno o dos capas cada día1,2. Resultado exitoso de la infección en hipertrofia de planta que se transforma en tumores visibles en cinco días post infección1,3,4. Durante todas las etapas de la infección, los hyphae fungicidas invaginate la membrana de citoplasma de la planta sin contacto directo con el citoplasma host1,2. El espacio apoplasmic apretado entre la hifa infectante y la membrana de plasma de la planta se considera que el sitio interactivo de host/patógeno, llamado la zona de interacción de foliares. Para superar el sistema inmune innato de planta, U. maydis secretan una matriz de proteínas efectoras en foliares interacción zona1. Algunos efectores son tomados por células de la planta, mientras que otros permanecen en los foliares interacción zona5,6,7,8. Efectores apoplásticos uno es UmPit2, que interactúa con las proteasas apoplastic maíz para prevenir la liberación de la señalización del péptido ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplasto proteasa actividad9,10.

En las últimas décadas, U. maydis se convirtió no sólo un modelo para la genética fúngica en la interacción planta-patógeno, sino también una valiosa herramienta en la biotecnología debido a un ciclo de vida bien comprendido, fácil accesibilidad genética y expresión heteróloga de secretada proteínas11,12,13. Señales para la secreción de ambas proteínas convencionales y no convencionales se han determinado lo que permite el control de modificaciones del posttranslational14. Recientemente, U. maydis fue empleado como una herramienta de caballo de Troya para estudiar pequeños, secretan proteínas maíz en situ15. El enfoque de caballo de Troya fue utilizado con éxito para analizar la función de la proteína secretada, pequeñas ZmMAC1 que participa en el desarrollo de la antera. ZmMAC1 induce la división periclinal de las células pluripotentes y especificación de destino celular de las células recién formado15. Por el mismo método, la función biológica del péptido asociado daño maíz ZmZIP1 fue revelada. U. maydis secretando el maíz A que zmzip1 dio lugar problemas de formación de tumor10. Por lo tanto, el caballo de Troya enfoque representa una valiosa alternativa a la proteína los estudios ines situ de alta resolución espaciotemporal que ni requieren generación de líneas de transformación de maíz estable ni infiltración de tejidos con heterologously proteínas expresadas y purificadas. En particular, la estrategia del caballo de Troya permite la secreción de cualquier proteína heteróloga en el apoplasto de maíz y comparación directa de infectados frente a células no infectadas de la planta dentro del mismo tejido.

Este protocolo muestra los pasos principales para la generación de una cepa de caballo de Troya de U. maydis para estudiar una proteína de interés. Además incluye información precisa sobre los procedimientos de la infección de tres tipos de tejido diferentes de maíz (hojas adultas, borlas y orejas) con U. maydis, que es un requisito previo para el estudio de la función de progreso y el proteínas infección espaciotemporal en estos tejidos diana. Otras especificaciones no son dadas en la amplificación del gen maíz y microscópica imagen técnicas, puesto que estos pasos son específicos del destino y dependiente del instrumento. Así, este protocolo está dirigido a usuarios avanzados de técnicas de biología molecular estándar.

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Protocol

1. construcción de un caballo de Troya de U. maydis

Nota: Vea la figura 1.

  1. Amplificar un gen de interés a partir de maíz cDNA utilizando cartillas gene-específicas y una revisión ADN polimerasa. Clonar el producto primario de la polimerización en cadena y transforman la construcción de e. coli siguiendo las instrucciones del proveedor de plásmido. Verifique que el gen correcto de la secuencia de interés por Sanger secuenciación antes de los próximos pasos de la clonación.
    Nota: Especificaciones de PCR necesitan ser optimizado debido a la primer secuencia especificidades y condiciones de la reacción de polimerasa de la DNA óptimo.
  2. Diseño de cebadores para amplificar el gen maíz de interés sin la secuencia de codificación de un péptido de señal (SP).
  3. Extender el extremo 5´ del primer revés con el motivo RSIATA y un NcoI corte sitio (tabla 1).
  4. Amplificar el gen maíz de interés con una corrección ADN polimerasa mediante la construcción de la polimerización en cadena generada en 1.1 como la plantilla de la polimerización en cadena.
  5. Doble-digerir el producto PCR y el plásmido de transformación de U. maydis , p123-PUmpit2-SpUmpit2- ZmmCherry mac1-Ha15, con XbaI y Nco I. purificar el producto de PCR y el plásmido digerido.
  6. Ligar el producto PCR digerido en la p123-PUmpit2-SpUmpit2- ZmmCherry mac1-Ha plantilla con T4 ADN ligasa siguiendo las instrucciones de manufacturer´s. Transformar el producto de la ligadura en e. coli y verificar el gen correcto de la secuencia de interés por Sanger secuenciación.
  7. Alinear la p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgene de interés mCherry-Ha con la enzima de restricción SspI y transformación ADN en el solopathogenic U. maydis cepa SG20016. Aislar U. maydis transformantes selección carboxin y confirmar aislados transformantes por sur blot análisis16.
    Nota: Para cada proteína de interés, por lo menos tres independientes U. maydis transformantes deben ser aislados y analizados para estimar efectos de fenotipo de mutaciones al azar del fondo.

2. medios de cultivo

  1. Preparación de medio líquido de YEPSlight16: Extracto de levadura 1.0% (w/v), 0.4% (w/v) Bacto-peptona y 0.4% (p/v) de sacarosa. Disolver todos los componentes en ddH2O y autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.
  2. Preparar papa-dextrosa-agar (agar PD)20: 3,9% (w/v) papa dextrosa agar y 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). Mezclar todos los componentes directamente en la botella para el autoclave y añadir ddH2O más una barra de agitación magnética. Autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.
  3. Preparación de agar carbón PD20: 3,9% (w/v) papa dextrosa agar, carbón 1% (p/v) y 1.0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). Mezclar todos los componentes directamente en la botella para el autoclave y añadir ddH2O más una barra de agitación magnética. Autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.

3. planta infección

  1. Realizar análisis de maíz la división celular en respuesta a caballo de Troya entregada proteína (por ejemplo, basado en la microscopía celular contando) previamente. U. maydis -indujo proliferación celular maíz y formación de un tumor posterior comienza alrededor de 4-5 días post infección. Evaluación cuantitativa de la enfermedad dependen del tejido y se debe realizar de 6 a 14 días post infección.
    Nota: Distintos cultivares de maíz muestran diferentes niveles de susceptibilidad a la infección por U. maydis . Maíz cvs W23, A188, Pedernal de Gaspe, gallo de oro temprano o Va35 susceptibilidad a este patógeno y así cultivares adecuados para estudios de caballo de Troya.
  2. Preparación del inóculo de U. maydis
    1. Incluyen la cepa progenitora SG200 como control negativo en todos los experimentos de caballo de Troya para la estimación de los efectos secundarios a la infección por la cepa transgénica. Aquí, se utiliza una cepa de U. maydis expresando una versión no segregada de la proteína de interés como control negativo. Sin embargo, por razones de factibilidad (p. ej., grandes proyecciones), la cepa progenitora puede ser la opción más fácil de control.
    2. Antes de comenzar el experimento, estimar qué cantidad de la cultura de la infección es necesarios. Tenga en cuenta que la infección de la planta requiere de 1-1.5 mL de la suspensión de U. maydis depende del tipo de maíz tejido.
      Nota: Aproximadamente 1 mL de una cultura de la noche a la mañana es suficiente para la dilución a un OD600 de 0.2 en 20 mL de medio deluz YEPS y 25 mL de un cultivo de U. maydis con un OD600 de 0.8-1.0 es suficiente para la infección de plantas de 13-16.
    3. Rasguño U. maydis de un agar de PD la placa con una pipeta Pasteur estéril, inocular en 5 mL de medio YEPSluz y dejar que la cultura crece a 28 ° C con agitación constante a 200 rpm por 16 h.
    4. Antes de la infección, examinar la cultura de la inoculación de U. maydis por microscopia ligera estándar para el adecuado crecimiento y contaminación bacteriana con 400 aumentos.
      Nota: En una cultura adecuada, sólo el hongo en forma de cigarro es visible (figura 2).
    5. 900 μl de fresco YEPSluz se mezclan con 100 μl del cultivo durante la noche y medir el OD600 con YEPSluz medio como un espacio en blanco en el análisis de espectrofotómetro.
    6. Diluir la cultura durante la noche con medio fresco deluz YEPS a un OD600 de 0.2 y dejar que la cultura crece a 28 ° C con agitación constante a 200 rpm hasta llegar a la fase de crecimiento de registro media indicada por un OD600 nm de 0.8-1.0.
      Nota: U. maydis células duplican cada 2 h en estas condiciones, así el deseado OD600 se alcanza después de 4-5 h de cultivo.
    7. Cosechar las células en OD600 de 0.8-1.0 girando a 3.000 x g durante 10 min y descarte el sobrenadante.
    8. Lavar el precipitado de células una vez con el ddH2O. Para ello, añadir un volumen de cultivo de ddH2O, vuelta con 3000 x g durante 10 min y descarte el sobrenadante.
    9. Resuspender el precipitado celular cuidadosamente en ddH2O con una pipeta de vidrio de 20 mL, ajustando así el OD final600 3.0 (para un análisis de caballo de Troya) o 1.0 (para la calificación de la enfermedad).
  3. Verificación del caballo de Troya: en planta de la secreción de la proteína de fusión maíz
    1. Infectar las plántulas de maíz con una cepa de caballo de Troya17.
    2. Realizar la proyección de imagen microscópica de micorrizada en 2-3 días post infección usando un microscopio de escaneo láser confocal. Para ello, suprimir un trozo rectangular de la hoja de 1 cm por debajo del punto de inyección, coloque la muestra en un portaobjetos y añadir una gota de ddH2O. Para visualizar la proteína de fusión mCherry, excitar la muestra con λ = 561 nm y emisión récord a λ = 580-630 nm.
  4. Infección de hojas de maíz adulto
    1. Cultivar plantas de maíz a la etapa de adulto hojas (hoja de cuando menos 7 crece en el tallo).
      Nota: Esta etapa se llega después de cuatro semanas en la siembra bajo condiciones de invernadero de 14 h, 28 ° C día/10 h, ritmo de la noche de 22 ° C con CV W23. Duración puede variar con las condiciones de cultivo y efecto invernadero maíz.
    2. Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.
    3. Presione el tallo cuidadosamente para localizar el tejido meristemático en el tallo. La base de los meristemos se puede distinguir por una transición de tallo más duro al más suave del tejido.
    4. Marque el meristemo en el tallo con un bolígrafo.
    5. Inyectan 1.5 mL de cultivo de U. maydis 1 cm arriba del meristem del lanzamiento o meristemo de la inflorescencia.
    6. Tasa de síntomas de la enfermedad en 6 y 12 días post infección.
  5. Infección de borlas
    1. Crecer plantas de maíz hasta llegar a la etapa de la borla.
      Nota: Una detallada cronología sobre el desarrollo de la antera y borla en cultivar maíz W23 fue descrita1819. Borlas que contienen las anteras pre-meióticas son altamente susceptibles a la infección por U. maydis ; en el cultivar maíz W23 borlas son del tamaño de 4-7 cm.
    2. Presione el tallo cuidadosamente para localizar la borla en el tallo.
    3. Marca la punta y la base de la borla en el tallo con un bolígrafo.
    4. Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.
    5. Inyecta 1,5 mL del inóculo en la borla. Para garantizar la equitativa distribución del inóculo, lentamente colocar 0,5 mL en la base de la espiga marcada con la pluma, la punta y la parte media.
    6. Tasa de síntomas de la enfermedad a 10 días post infección.
  6. Infección de oídos
    Nota:
    el desarrollo de tejido de la oreja difiere en diferentes cultivares de maíz y en condiciones de invernadero y debe respetarse cuidadosamente antes de la inoculación. Orejas a superar sedas son altamente susceptibles a la infección por U. maydis .
    1. Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.
    2. Inyectar la aguja de inoculación en el espacio entre las hojas de cáscara tan profundamente como sea posible sin dañar el oído.
    3. Versión 1.5 mL del inóculo en el oído.
    4. Retire la jeringa y aguja y masaje con cuidado la cob para distribuir igualmente la solución de U. maydis .
    5. Tasa de síntomas de la enfermedad a 14 días post infección.
  7. Confirmar viabilidad del inóculo de U. maydis
    1. Colocar 10 μl del inóculo en una placa de agar carbón de PD e incube a temperatura ambiente durante 2 días.
      Nota: Si la cultura de U. maydis es capaz de filamentos de forma, micelio esponjoso, blanco se convierte en visible (figura 5)

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Representative Results

Construcciones para los experimentos de caballo de Troya de U. maydis se clonan en el plásmido p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene de interés mCherry-Ha. El maíz gen de interés se fusiona a un reportero de fluorescencia mCherry y un epitopo HA-etiqueta. La expresión de la proteína de fusión es bajo control del promotor U. maydis Umpit2 que específicamente se activa durante la infección21. La secreción directa de la proteína del péptido de interés en la zona de interacción de foliares, la región de la codificación está fusionada a la secuencia del péptido señal de U. maydis Umpit221 (figura 1). Sobre la transformación de U. maydis , el transgén se introduce en la SG200 ip-locus por recombinación homóloga y la inserción del genoma específicas puede ser verificado por análisis de Southern blot. Secreción de la proteína de fusión es confirmada por láser confocal de barrido la proyección de imagen microscópica en plántula hojas infectada con una cepa de caballo de Troya (figura 3). Por ejemplo, las plántulas infectaron con la cepa de caballo de Troya de U. maydis SG200Zmmac1 secretoras de un ZmMAC1-mCHERRY o un control no troyano la tensión expresando noSP ZmmCHERRY mac1 que carece elpit2del Um- SP y posteriormente no la proteína secreto el ZmMAC1-mCHERRY-HA, se muestran en la figura 315. Hifas ZmMAC1 de secreción están rodeados por señal mCherry fluorescente (Figura 3A). Por el contrario, hifas de no-secreción sólo muestran señal de fluorescencia en el citoplasma del hongo (figura 3B).

En particular, borla infección por U. maydis se basa en la inoculación de tejido adecuada, como se describe en el paso 3.5. Localización inadecuada de la borla o desigualdad en la distribución del inóculo puede resultar en borla no infectados (Figura 4A) o sólo parcial de la borla (Figura 4B). Para asegurar la distribución uniforme, el inóculo debe ser liberado lentamente de la aguja de inoculación para adquirir la infección del tejido entero (figura 4). Viabilidad del inóculo puede ser verificado poniendo una gotita en el agar de PD-carbón. Cepas infecciosas forman filamentos que aparecen como escriba pelusa sobre la placa como se muestra para la solopathogenic cepa progenitora de caballo de Troya SG200 (figura 5A) mientras que la cepa de U. maydis que FB1 requiere apareamiento antes de formación de filamento infecciosas ( Figura 5B).

Nombre Además de la cartilla Secuencia (5´→3´)
Hacia adelante Gen de XbaI-maíz GCTCTAGA...
Marcha atrás Gen de Brochothrix-RSIATA-maíz CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG...

Tabla 1: Secuencias de adiciones de cartilla para agregar restricción laterales y el motivo RSIATA codificación secuencia al maíz gene de interés.

Figure 1
Figura 1 : Descripción esquemática de la U. maydis caballo de Troya plásmido clonación estrategia. ZMmac1 (gris claro) es lanzado por doble recopilación de p123-PUmpit2-SpUmpit2- ZmmCherry mac1-Ha. En paralelo, el gen de interés (amarillo) es amplificado por PCR. Para clonar el propósito, se diseñan cartillas de avance y retroceso que incluyen XbaI y Ncoque clonación de sitios y un enlazador RSIATA (morado). El producto PCR se digiere con XbaI y NcoI. Después de la ligadura, el caballo de Troya plásmido contiene los siguientes elementos: impulsado por el promotor delpit2 Um, un Umpit2-SP (azul) está fusionada N-terminal a un gen de maíz de interés ORF (amarillo). En la terminal C, un enlazador RSIATA, un gen reportero de mCHERRY (rojo) y una HA del epítopo etiqueta (verde) se funden seguido por un codón de parada. Antes de la transformación de U. maydis , el plásmido de caballo de Troya se digiere con Sspque para permitir la integración homóloga en la U. maydisip-locus (gris).  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Examen microscópico de luz de U. maydis cultura de inoculación. Varios cigarros en forma de U. maydis esporidias son visibles, algunas de las cuales se someten a ciernes (indicado por asteriscos). No hay más células están presentes que indicarían una contaminación de la cultura. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : En la planta láser confocal de barrido de la proyección de imagen microscópica de un Ustilago Cepa de caballo de Troya. La proyección de imagen de la proteína del maíz mCherry fusionados con ZmMAC1 después de la infección de la plántula de maíz utilizando la cepa de caballo de Troya SG200Zmmac1 (A) o una cepa no-caballo de Troya SG200Zmmac1- noSP falta Umpit2-SP (B). Secretan ZmMAC1-mCHERRY-HA proteína de fusión se encuentra en la superficie de U. maydis hifas (A)15, indicado por las cabezas de la flecha. En SG200Zmmac1- noSP sólo localización citoplásmica de ZmMAC1 es visible (B), indicado por el asterisco 15. Barras de la escala = 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Infección con la espiga U. maydis. Se muestran infección fracasada de borla con U. maydis (A), infección de espiga parcial (B) e infección de espiga completa (C) 12 días después de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Análisis de viabilidad del inóculo en agar carbón PD. La cepa de solopathogenic SG2001 fue utilizada para la generación de caballo de Troya. SG200 es uno mismo-estimulante y forma filamentos infecciosas en una placa de agar de PD-carbón (A). Los haploides cepa de U. maydis FB1 requiere apareamiento con una cepa compatible antes de crecimiento filamentoso (B)22. Barras de escala = 2 mm.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Investigación de cultivo moderno exige protocolos de análisis molecular en genética y niveles de la proteína. Accesibilidad genética a través de transformación no es disponible o ineficientes y lentos para más especies de cultivos como el maíz. Por otra parte, herramientas genéticas confiables tales como sistemas de reportero promotor son escasos, lo que hace difícil para el estudio de la función de la proteína in situ de alta resolución espaciotemporal en sitios tisulares distintos. Apoplasto proteínas pueden estudiarse por la infiltración de proteínas heterologously expresadas y purificadas en los tejidos. Sin embargo, a pesar de los avances en la expresión de proteína heteróloga, infiltración específica en tejidos de cultivo sigue siendo difícil y a menudo ineficiente para el análisis funcional de la proteína. La estrategia del caballo de Troya es una alternativa que no requiere la transformación o la infiltración de proteínas. Empleando el aparato de secreción del maíz patógeno U. maydis, se logra la entrega de teóricamente cualquier proteína de interés en el apoplasto planta de tejido infectado. Con respecto al tamaño de una proteína de interés, los límites de esta técnica han llegado a ser explorado. En ensayos anteriores, el efector de U. maydis 290 aminoácidos que cmu1 fundido a mCherry fue secretada con éxito7. Sin embargo, la aplicabilidad del método de caballo de Troya para proteínas más grandes queda por probarse. Si adiciones de modificaciones postraduccionales de la proteína de interés son indeseables, secreción poco convencional se puede usar como una ruta alternativa a la clásica secreción vía SP14.

U. maydis se emplea como una herramienta estándar en la biotecnología de proteínas por plegamiento de la proteína confiable, modificación postraduccional y secreción eficiencias11,12,13. Sin embargo, la secreción de proteína para cada nueva cepa de caballo de Troya debe analizarse cuidadosamente como se describe en el paso 3. Se recomienda realizar una prueba inicial de cada cepa de caballo de Troya recién generado por infectar las plántulas que se puede infectar y a examinar por la proyección de imagen microscópica.

SG200 es una variedad de solopathogenic que no requiere de acoplamiento antes de los experimentos de caballo de Troya y así es más fácil de manejar. Aunque la eficiencia de la infección de cepas compatibles como FB1 y FB2 es mayor23, la eficacia de SG200 es suficiente para los experimentos de caballo de Troya. Algunas proteínas efectoras de U. maydis son tomados por las células del huésped, mientras que otros permanecen en el apoplasto. La diferenciación entre ambos grupos parece ser un proceso controlado y específico; sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo esquivos8 y no pueden tenerse en cuenta al diseñar un experimento. Por lo tanto, las proteínas del interés que tienen que ser integrados en la pared celular o que tienen que actuar intracelularmente no son candidatos aptos para el método del caballo de Troya.

U. maydis es omnipotente en infectar diversos tejidos aéreos de maíz, puede aplicarse el método del caballo de Troya para múltiples proteínas, en diferentes tejidos y etapas de desarrollo de plantas, como hojas de plántulas, hojas adultas, las borlas, y orejas. Por nombrar unas pocas aplicaciones útiles, el caballo de Troya permite realizar pruebas local sobredosis, efectos de la proteína fuera de juego o caracterización funcional de los dominios de proteínas distintas.

Mantener una incontaminada U. maydis cultura es fundamental para todos los experimentos descritos ya que coinfección con una gran cantidad de bacterias desencadena la respuesta inmune de la planta y altera su reacción a la proteína de interés, por lo que cualquier resultados no concluyentes. Estudios de caballo de Troya en adulto hojas, borlas y oídos tienen que realizarse con máximo cultura de infección de 1,5 mL como volumen alto puede resultar en daño tisular. Borla, infecciones de oído pueden ser entrenadas con comida agua teñida de color en vez de inóculo de Ustilago .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella y Armin Hildebrand para proporcionar espacio y planta el material de laboratorio. La obra original en el método del caballo de Troya fue apoyada por una beca postdoctoral de Leopoldina y proyecto NSF IOS13 39229. El trabajo presentado en este artículo fue apoyado por SFB924 (proyectos A14 B14) del DFG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL syringe  B. Braun 4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle B. Braun 4657640
Bacto Peptone  BD 211677
cDNA from maize from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal Sigma-Aldrich 05105
Confocal laser scanning microscope use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) Sarstedt 67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification use locally available equipment
Nco I NEB R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha please contact the corresponding author 
Pasteur pipet (glass, long tip) VWR 14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO Thermo Fisher Scientific K280002 can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar  VWR 90000-745
Sharpie pen use locally available equipment
Spectrophotometer use locally available equipment
Ssp I NEB R0132
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
T4 DNA ligase NEB M0202
TRIS Sigma-Aldrich TRIS-RO
Xba I NEB R0145
Yeast extract  BD 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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