En Fluorogenic peptid klyvning analysen till skärmen för den proteolytiska aktiviteten: program för coronavirus spike protein aktivering

* These authors contributed equally
Biochemistry

GE Global Research must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi presenterar en fluorogenic peptid klyvning analysmetod som tillåter en snabb screening av den proteolytiska aktiviteten av proteaser på peptider som representerar webbplatsen klyvning av viral fusion peptider. Denna metod kan också användas på någon annan aminosyra motiv inom en proteinsekvens för att testa för aktiviteten proteashämmare.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jaimes, J. A., Millet, J. K., Goldstein, M. E., Whittaker, G. R., Straus, M. R. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (143), e58892, doi:10.3791/58892 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Höljeförsedda virus som coronavirus eller influensa virus kräver proteolytisk klyvning av deras fusionsprotein för att kunna infektera värdcellen. Ofta virus uppvisar cell och vävnad tropism och är anpassade till specifika cell eller vävnad proteaser. Dessutom kan dessa virus introducera mutationer eller infogningar i sin arvsmassa under replikering som kan påverka klyvning, och därmed kan bidra till anpassningar till en ny värd. Här presenterar vi en fluorogenic peptid klyvning analysmetod som tillåter en snabb screening av peptider härma webbplatsen klyvning av viral fusionsproteinerna. Tekniken är mycket flexibel och kan användas för att undersöka den proteolytiska aktiviteten av en enda proteashämmare på många olika substrat, och det kan dessutom också utforskning av aktiviteten av flera proteaser på en eller flera peptid substrat. I denna studie använde vi peptider härma klyvning webbplats motiven av coronavirus spike protein. Vi testade mänskliga och camel härrör Middle East Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV) för att visa att enkla och dubbla substitutioner i webbplatsen klyvning kan förändra aktiviteten av furin och dramatiskt förändra klyvning effektivitet. Vi har också använt denna metod i kombination med bioinformatik att testa furin klyvning aktivitet av felint coronavirus spike proteiner från olika serotyper och stammar. Denna peptid-baserad metod är mindre arbetskraft- och tid intensivt än konventionella metoder som används för analys av proteolytiska aktivitet för virus, och resultaten kan erhållas inom en enda dag.

Introduction

Viral fusion med värd cellmembranet är ett avgörande steg i livscykeln för höljeförsedda virus och underlättar inträde in i cellen och replikering av viruset. Normalt äger virus ett specialiserat protein (eller proteiner) som binder till receptorer på värd cellmembranet och utlöser den virus-cell membran fusion1. Viral fusionsproteinerna har grupperats i tre klasser (I-III)1. Ett antal virus som för närvarande är ett stort problem för folkhälsan, såsom influensavirus (som representerar en långvariga zoonotiska uppkomst från fåglar) och Middle East Respiratory Syndrome-coronavirus (MERS-CoV) (som representerar en nyligen zoonotiska uppkomsten från kameler), utnyttja den så kallade klass I fusionsproteiner, som kräver proteolytiska bearbetning av värd proteaser, utöva sina fusogenic aktivitet2. Likaså felint coronavirus (FCoV), som representerar ett större sjukdom hot för vilda och tama katter, också äger en klass jag fusionsprotein. Klass I viral fusion proteiner syntetiseras vanligtvis som en uncleaved föregångare och består vanligen av två domäner som är ansvarig för receptor bindande och utlöser händelsen fusion respektive. Hittills är det influensa hemagglutinin (HA) bäst förstås fusionsprotein och ett flertal studier har beskrivit dess mekanistiska roll i mottagande cell inträde och fusion3. I detta fall uppstår klyvning av proteinet fusion på en viss sekvens eller klyvning plats inom HA, och i kombination med pH-beroende konfirmerande förändringar, resultat i exponeringen av viral fusion peptid1,2.

Fusion peptiden och dess föregående proteas erkännande sekvens är kritiska för patogenicitet och värd anpassning av viruset. Förändringar i sekvensen proteas erkännande kan ändra klyvning markant med potentiellt dramatiska konsekvenser för viruset och den värd4. Å ena sidan kan det upphäva klyvning och därmed eliminera viruset livscykel. Men däremot, en mutation kan öka substrat specificiteten för en given proteashämmare eller tillåta en ”ny” proteas klyva fusionsprotein. Därefter kan detta också expandera den cellen och vävnad tropism som påpekat, exempelvis med influensa virus subtyper5,6. Låg vanligtvis patogenicitet aviär influensa (LPAI) virus och de flesta mänskliga influensavirus är begränsade till den gastrointestinala eller respiratorisk tarmkanalen på grund av begränsad localizationen av de proteaser som aktiverar dem. Typiskt, fusion peptiden av sådan HA proteiner föregås av ett fyra-amino syra ordnar som består av 1-2 spridda grundläggande aminosyror, som är erkänd av trypsin-liknande serine proteaser som trypsin, matriptase eller TMPRSS27, 8. När viruset förvärvar infogningar eller mutationer som ändra webbplatsen klyvning till en flerbasiska webbplats, gör furin att aktivera HA och potentiellt orsaka en mycket mer allvarlig systemisk infektion6,9. Dessa virus benämns hög patogenicitet aviärt influensavirus (HPAI), kännetecknas av H5N1 stammar.

I motsats till influensa HA har många coronavirus, såsom MERS-CoV, två distinkta klyvning platser inom deras spike protein. S1/S2 webbplatsen skiljer den N-terminala receptor bindande domänen (S1) från C-terminal fusion domän (S2), med en andra plats för klyvning, som kallas S2', nedströms webbplatsen S1/S2, i närhet till fusion peptid10. Det föreslogs att webbplatser klyvs sekventiellt, på S1/S2 följt av S2'. I motsats till HA de flesta influensa virus-stammar, MERS-CoV S protein S1/S2 och S2' platser kan erkännas av proteaser i familjen proprotein convertase (PC), till exempel furin. Medlemmar av denna familj klyva på Parade grundläggande rester med motiv R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Generellt benämns aminosyrorna uppströms av klyvning webbplatsen P1, P2, P3, etc. räknat från webbplatsen för klyvning och aminosyror nedströms betecknas som P1', P2', P3', etc. 11. FCoV stammar kan antingen ha en enda eller en dual klyvning webbplats. Som MERS-CoV, vissa FCoV stammar också äger två klyvning platser (S1/S2 och S2') i sina S-protein. Denna egenskap är dock exklusive serotyp jag FCoVs (klad A). Däremot medlemmar i CB serotyp II (klad B) endast har en enda klyvning webbplats (S2')2,12. Flera proteaser har föreslagits för att klyva FCoV klyvning webbplatser, inklusive furin, trypsin-liknande proteaser och cathepsin. Det har föreslagits att S proteinet av enteriska FCoV (kallas även felint enteriska coronavirus eller FECV) kommer sannolikt att vara klyvs av furin på webbplatsen S1/S2, och mutationer i denna webbplats (as well as på S2') leder till förändringar i proteas krav. Dessa mutationer har associerats med förändringar i tropism och patogenicitet av dessa virus, så att viruset blir systemiska och makrofag-tropic (kallas även felin infektiös peritonit virus eller FIPV)13.

Virus naturligt introducera mutationer i deras genom under varje replikeringscykel och ofta nya subtyper och stammar av influensa, MERS-CoV och FCoV är beskrivna14,15,16. Som en del av en snabb utvärdering för att bedöma folkhälsa hotet om nya virus, är det viktigt att undersöka förändringar i webbplatsen klyvning och hur det påverkar utbudet av proteaser aktivera dessa virus. Här, vi beskriver en peptid-baserad analys som tillåter en mycket snabb bedömning av hur klyvning webbplats ändringarna i MERS-CoV S protein påverkar substrat specificiteten av en given proteas och att snabbt visa olika proteaser för deras förmåga att klyva en viss eller flera sekvenser4. I en andra uppsättning experiment använde vi tekniken för att avgöra aktiviteten furin klyvning över olika FCoV serotyper och stammar.

De peptider som används i denna analys är modifierad med fluorescens resonans energi överföring (bandet) paret, 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) vid N-terminalen och N-2,4-Dinitrophenylen (DNP) på C-terminus. Under analysen, MCA är upphetsad och avger ljusenergi som är kylda av DNP så länge paret är i nära närhet till varandra. Om klyvning sker dock DNP är inte kunna släcka utsläpp längre och det kan läsas av fluorescens plattan läsaren. Förändringar i fluorescensen mäts under experimentet att bestämma andelen peptid klyvning, och att beräkna den hastighet vid vilken proteasen klyver specifika peptid (kallas även Vmax)17.

För utformning av peptiderna, måste genen för proteinet respektive fusion ha varit sekvenserade eller görs tillgängliga i en databas. Metoden är dock mindre labor-intensiv och kostsam än konventionella metoder som vanligtvis kräver kloningen av fusion protein genen in i uttrycket vektorer att uttrycka det i däggdjursceller att analysera klyvning. Från början till slut, kan detta ta flera dagar upp till några veckor medan peptid analyserna presenteras här kan göras inom en dag så snart det finns peptider och proteaser. Inställningen av analysen tar mellan 5 och 30 min beroende på antalet prover och körningen i fluorescens plate reader är 1 h. analys av data kan ta upp till 2 h igen beroende på urvalets storlek.

Här, valde vi två olika exempel att presentera analysen. I det första exemplet presenterar vi data som jämför furin-medierad klyvning av mänskliga och kamel-derived MERS-CoV, att bedöma potentialen i camel-derived stammar av aktiveras hos människor om de korsar arter barriären. I det andra exemplet, vi använde en fluorogenic peptid analys för att bestämma furin-medierad klyvning av S1/S2 och S2' platser eller S2' platsen för två serotyp jag och två serotyp II FCoV stammar, respektive. För dessa försök använde vi trypsin klyvning som positiv kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utforma och förbereda peptiderna

  1. Förvärva sekvensen av proteinet fusion av intresse från en offentlig databas såsom NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eller patogen virusdatabasen (https://www.viprbrc.org). Välj webbplatsen proteas erkännande före fusion peptiden och inkluderar 2-3 aminosyror uppströms och nedströms denna sekvens.
  2. Vid beställning av peptiderna, ändra dem med den bandet par 7-methoxycoumarin-4-yl acetylen (MCA) vid N-terminalen och N-2,4-Dinitrophenylen (DNP) på C-terminus.
    Obs: Flera leverantörer ger dessa ändringar. Pris och leveranstid beror på leverantören av val. Dock finns alternativa modifikationer som varierar i känslighet och kräva justeringar av plattan läsaren i form av våglängder.
  3. Återsuspendera peptiden enligt tillverkare rekommendationer av pipettering försiktigt upp och ner. Till exempel Återsuspendera peptider i 70% etanol till en slutlig koncentration på 1 mM.
  4. Du kan också lägga röret som innehåller peptiden och lösningsmedlet i ett ultraljudsbehandling bad tills det är fullt resuspended om peptiden inte Omsuspendera mycket väl av pipettering.
  5. Alikvotens peptiden till ljus dämpa eller resistenta rör för att skydda peptiden från blekning. Hålla alikvotens storlekar liten att undvika flera frysas och tinas cykler (t.ex. 100 µL). Lagra alikvoter vid-20 ° C.

2. förbereda fluorescens plattan läsaren

  1. Slå på plattan läsaren och vänta tills självtestet är klar.
  2. Öppna den operativa programvaran på den anslutna datorn och kontrollera att den är ansluten med plattan läsaren.
  3. Öppna temperaturinställningen för och inställd på 30 ° C (eller önskad temperatur för optimal prestanda för proteashämmaren).
  4. Klicka på kontroll | Instrument Setup att ställa in experimentet.
  5. Välj Kinetic.
  6. Välj fluorescens.
  7. Ange Excitation och utsläpp våglängder: 330 nm och 390 nm respektive.
  8. Avmarkera Automatisk Cut-off.
  9. Välj Medium, normal känslighet.
  10. Välj en runtime på 1 h för analysen och välj en mätning var 60 s.
  11. Uppsättning 5 s blanda innan första mätning och 3 s före varje mätning
  12. Välj wells att läsa och starta analysen.

3. Förbered analysen

  1. Förbereda analysbuffert genom att beräkna de lämpliga kvantiteterna för varje ingrediens och att lägga till den. För furin, göra buffert bestående av 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, 5% Triton x-100. För trypsin, använda standard fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    Obs: Volymer på 10 mL eller mindre räcker. Bufferten varierar beroende på den protease(s) som används i analysen.
  2. Chill bufferten på is.
  3. Placera assay plattan på is med en tunn metallplatta under support kyla och stabilitet. Använd en solid svart polystyren plattan med 96 brunnar med en platt botten och icke-behandlade.
    Obs: Det är viktigt att använda svarta plattor för att förhindra fluorescerande ”läckage” från intilliggande brunnar.
  4. Beräkna lämplig mängd proteas lägga till för varje reaktion baserat på tidigare publikationer eller experimentella data. För furin, använda 1 enhet per reaktion vilket motsvarar 0,5 µL. För trypsin, Använd 0,5 µL av 160 nM TPCK trypsin.
  5. Förbered 3 tekniska replikat per analys i en total volym av 100 µL per prov per prov.
    Obs: Det utvärderades experimentellt att det inte gör någon skillnad om den pipettering genomförs under normala ljusförhållanden eller nedtonat ljus. Peptiderna bör dock inte utsättas för ljus under en längre tid.
  6. Pipettera lämplig mängd analysbuffert (94,5 µL enligt beskrivningen i steg 3.1) till varje brunn.
  7. Tillsätt proteasen till varje brunn. Använd 0,5 µL per prov för både, furin och TPCK trypsin. 6 wells (3 brunnar för ett blankprov) och 3 brunnar för en peptid kontroll, tillsätt 0,5 µL buffert i stället för de respektive proteashämmaren.
  8. Lägg till peptiden till en slutlig koncentration på 50 µM till varje brunn utom blankprovet. I det här fallet Pipettera 5 µL peptid beredd enligt beskrivningen i steg 1.3. Tillsätt 5 µL buffert till Tom kontroll istället för peptid.
    Obs: Flera koncentrationer av peptiden testades först med beskrivs enzym koncentrationerna så att enzymerna var mättad.
  9. Sätt in plattan i fluorescens plattan läsaren och klicka på Starta.

4. dataanalys

  1. Spara filen experiment.
  2. Klicka på Exportera och exportera filen som en .txt.
  3. Importera txt-filen till ett kalkylblad.
  4. För varje teknisk replikat per prov, skapa en graf plottning de relativa fluorescerande enheterna (RFU) på y-axeln mot tiden på x-axeln (kompletterande Figur1).
  5. Markera dataområdet där grafen är i en linjär utbud och närmast till början av fluorescens ökningen.
  6. Plotta valda uppgifter på en andra graf och lägga till en linjär trendlinje.
  7. Välj i alternativen trendlinje Display ekvation i diagrammet. Ekvationen visar Vmax.
  8. Beräkna Genomsnittligt Vmax för varje prov från 3 tekniska replikerar.
  9. Upprepa experimentet två gånger för att få 3 biologiska replikat.
  10. Beräkna standardavvikelsen baserad på data från 3 oberoende biologiska replikerar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den första delen av denna studie har vi använt peptider som representerar S2' klyvning webbplats av tre distinkta MERS-CoV S proteiner: från den prototypiska EMC/2012 mänsklig stammen (Genbank AFS88936.1) och två utvalda kamel-derived MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) och Mor215 (Genbank AVN89324.1) stammar, isolerade i Egypten och Marocko, respektive (tabell 1)16,18.

Jämfört med EMC/2012 stam, HKU205 S2' klyvning webbplats har två mutationer i P2 och P1' positioner som potentiellt skulle kunna påverka dess erkännande av furin och förändra klyvning effektivitet (tabell 1). Dessutom var vi intresserade av att undersöka om och hur varje enskild mutation hittades i HKU205 stam påverkar furin klyvning. Vi, därför ingår två peptider där enskilda substitutioner infördes i sekvensen EMC/2012 peptid (EMC/2012 mutA-S S2' och EMC/2012 mutS-jag S2') (tabell 1). Furin kunde klyva EMC/2012 peptiden effektivt med en Vmax på 6,3 ± 1,2 RFU/min, medan vi upptäckt nästan ingen klyvning när du använder S2' peptid HKU205 stam (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (figur 1a). När du undersöker EMC/2012 mutA-S S2' peptid, vi fann att klyvning var starkt reduceras jämfört med den wild type-sekvensen (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). Det fanns nästan ingen klyvning vid testning av EMC/2012 mutS-jag S2' peptid (Vmax 1,1 ± 0,9 RFU/min) (figur 1a).

MERS-CoV isolat från västra Afrika var nyligen rapporterade att fylogenetiskt skild från MERS-CoV finns i den arabiska halvö16. En av de nyligen beskrivna isolaten är den Mor213 stammen, som bär en leucin i stället för en arginin i P4 position av S2' plats (tabell 1), och som kunde potentiellt påverka dess erkännande av furin och förändra klyvning effektivitet. Våra peptid analys visade att det endast är minimal klyvning av Mor213 S2' webbplats jämfört med webbplatsen EMC/2012 (figur 1b). Vmax för Mor213 peptiden är 1,0 ± 0,1.

I den andra delen av denna studie används samma peptid analysen för att utvärdera furin-medierad klyvning av FCoV S protein klyvning platser. Vi använde peptider härma webbplatsens S1/S2 klyvning i två FCoV serotyp jag virus: FECV jag och-4 (från Whittaker lab) och FIPV jag svart (Genbank AB088223.1). Vi använde också peptider härma S2' platsen för dessa virus, samt två FCoV serotyp II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) och FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) stammar (tabell 1). Furin klyvning inträffar vanligtvis när grundläggande rester (arginin och lysin) finns i P1 och P4 positionerna för webbplatsen klyvning. Mutationer i P1, P4 och P1' positioner föreslås för att störa furin cleavability, därför förändra proteas kraven av protein. (Tabell 1). Furin klyvning observerades för prototypiska S1/S2 peptiden FECV jag och-4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min) men inte i den muterade S1/S2 peptiden FIPV jag svart S1/S2 (Vmax -1,37 ± 1,29 RFU/min) (figur 2A). Likaså furin kunde klyva prototypiska S2' peptid FECV II 1683 S2' (Vmax 5,46 ± 0,97 RFU/min), men inte den muterade S2' peptider FECV jag och-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV jag svart S2' (Vmax 0,30 ± 0,14 RFU/min) och FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0,11 RFU / min) (figur 2B). Vi använde trypsin som positiv kontroll för peptid klyvning och vi observerade trypsin klyvning i alla de peptider som används (kompletterande figur 2).

Table 1

Tabell 1. Peptider används och motsvarande aminosyresekvenser. De peptider som används i analyserna innehåller paret (7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl/2,4-Dinitrophenylen (MCA/DNP) bandet. P4 och P1 klyvning webbplats placerad arginin (R) restprodukter, som erkänns av furin, är i fetstil. Rester i rött motsvarar mutationer jämfört med referens-sekvenser.

Figure 1
Figur 1 . Furin-medierad proteolytisk klyvning av mänskliga och kamel-derived MERS-CoV S2' webbplatser fluorogenic peptider. A. Furin klyvning haltbestämning av mänskliga MERS-CoV EMC/2012 S2' webbplats och kamel-derived stam HKU205 (dubbel mutation), tillsammans med enda muterade varianter av EMC 2012 (mutA-S och mutS-jag). B. Furin klyvning haltbestämning av mänskliga MERS-CoV EMC/2012 S2' webbplats och kamel-derived stam Mor213. För paneler A och B, peptider inkuberades med rekombinant furin och ökningen av fluorescens på grund av proteolytiska bearbetning mättes med en fluorometer. Analyserna utfördes på exemplar med resultat som representerar medelvärden av Vmax från tre oberoende experiment (n = 3). Felstaplar visar SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Furin-medierad proteolytisk klyvning av FCoV S1/S2 och S2' webbplatser fluorogenic peptider. A. Furin klyvning haltbestämning av FECV I och-4 och FIPV jag svart S1/S2 platser. Peptider inkuberades med rekombinant furin. B. Furin klyvning haltbestämning av FECV I och-4, FIPV jag svart, FECV II 1683 och FIPV II 1146 S2' platser. Ökningen av fluorescens på grund av proteolytiska bearbetning mättes med en fluorometer. Analyserna utfördes på exemplar med resultat som representerar medelvärden av Vmax från tre oberoende experiment (n = 3). Felstaplar visar SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. 

Kompletterande tabell 1: Vmax värden används för figur 1 och figur 2. Den Vmax värdena beräknades utifrån grafer som illustreras i kompletterande bild 1 och som beskrivs i protokollet avsnitt 4. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.

Kompletterande figur 1: Illustration av rådata härrör från plattan läsarprogrammet. Ökning av fluorescens över tid grafer som användes för bestämning av Vmax. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande figur 2: Trypsin-medierad proteolytisk klyvning av FCoV S1/S2 och S2' webbplatser fluorogenic peptider. Trypsin klyvning haltbestämning av FECV I och-4 och FIPV jag svart S1/S2 platser och FECV I och-4, FIPV jag svart, FECV II 1683 och FIPV II 1146 S2' platser. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterar här en analys av fluorogenic-peptiden som möjliggör en snabb screening av proteinsekvenser för deras proteolytisk klyvning av proteaser. I vårt första exempel valde vi olika klyvning webbplats motiv av MERS-CoV spike (S) protein att illustrera en ansökan för denna analys. Flera höljeförsedda virus som besitter klass jag fusion proteiner såsom MERS-CoV, SARS-CoV (svår akut respiratorisk sjukdom) och influensa är viktiga frågor för folkhälsa och nya undertyper ständigt föränderliga som har en potential att korsa arter hinder från deras naturliga värdar till människor1,15,16. Isolera virus och odla dem i labbet kanske inte alltid är genomförbara eller kräver speciella laboratorier som inte är tillgängliga i varje forskningsanläggning. Därför finns det ett behov för metoder för att bedöma de potentiella hot mot folkhälsan framväxande virus som kan utföras under regelbunden laboratorieförhållanden. Förutom virus inriktning människor, vissa djur virus som FCoV också äger samma klass I fusionsproteinerna, därför har liknande egenskaper än sina mänskliga motsvarigheter. Isolera dessa virus kan också vara en utmaning, att göra användningen av innovativa verktyg för att studera dem nödvändiga.

Ett avgörande steg i livscykeln för de ovannämnda virus är värd cellinmatning och fusion medieras av proteolytiska bearbetning av proteinet respektive fusion av värd proteaser1,2. Ett standardiserat sätt att undersöka denna del av viral livscykel är att klona fusion protein genen i ett däggdjur uttryck vektor, transfect däggdjursceller som möjliggör proteinuttryck, inkubera eller samtidig transfect med proteasen sevärdheter, isolera de protein och utföra en western blot-analys. Denna metod kommer med flera begränsningar: tillgänglighet av virala DNA/RNA för kloning, kostnader för syntetisera genen om finns inga DNA eller RNA, tillgänglighet av en antikropp att upptäcka proteinet fusion och klyvning produkt(er), och det kan ta upp till flera veckor tills hela studien utförs. Det blir även mer tidskrävande, pengar och arbetskrävande om intressera av studien är att undersöka flera mutationer i webbplatsen klyvning eftersom det kräver webbplats riktad mutagenes. Fluorogenic peptid analysen beskriver vi här har inte dessa begränsningar. Peptiderna sevärdheter kan utformas utifrån offentligt tillgänglig sekvenser, det finns flera leverantörer som tillhandahåller ett brett utbud av rekombinant proteaser som är relevanta för dessa typer av studier och analysen inklusive analysen kan utföras inom en enda dag.

I vårt exempel vi granskat furin-medierad klyvning av S2' proteas erkännande webbplats av MERS-CoV S protein som härrör från människor och kameler från Egypten och Marocko. Både den mänskliga EMC/2012 och kamelen HKU205 S2' platser innehåller typiska RXXR furin klyvning motiv. Men enligt PiTou 2.0 klyvning scoring algoritm HKU205 S2' webbplats spås inte vara klyvs av furin, som vi försöksvis bekräftade19. Anledningen till varför HKU5 S2' bearbetas inte av furin kan bero på isoleucin i P1' position. När vi testade två peptider som de enskilda mutationerna i EMC/2012 S2' sekvens, vi kunde bekräfta att isoleucin i P1' till stor del upphäver klyvning av alanin till serin substitution medfört minskad klyvning. Mor213 S2' webbplats innehåller inte furin klyvning motiv och det var inte överraskande att upptäcka nästan ingen klyvning. Vi har även granskat hur furin klyver S1/S2 och S2' proteas erkännande platser av FCoV S protein. Vi kunde konstatera furin klyvning av båda FECV peptider (FECV jag och-4 S1/S2 och FECV II 1683 S2'), medan muterade sekvenser från FIPV virus inte var klyvs av furin.

När man jämför furin-medierad klyvning av EMC/2012 S2' peptid (figur 1A) med de FECV jag och-4 S1/2 peptiderna (figur 2A), Vi hittade att det var en ungefärlig 26-fold skillnad i Vmax. Detta kan förklaras av furin klyvning motivet i båda sekvenserna (tabell 1). Minimikravet för furin klyvning är ett RXXR motiv, är en RXRR sekvens mycket mer gynnsam2. Därför EMC/2012 S2' peptid, som har ett RSAR motiv, är klyvs med mindre specificitet jämfört med FECV I och-4 S1/2 peptiden som innehåller en RSRR furin klyvning webbplats (tabell 1).

En stor begränsning i analysen är dock att peptiderna inte återspeglar det protein som de vanligtvis är inbäddade i tertiär struktur. Klyvning av proteinet full längd fusion exponerar fusion peptiden och utlösare värd cell inträde1. Samspelet mellan proteashämmare och fusion protein påverkas också av tertiär struktur av proteinet fusion medan vi antar att Peptiderna är mer eller mindre linjärt. Därför klyvning upptäckts i peptid analys kan vara konstgjorda och kanske inte återspeglar i vivo situationen. Detta rapporterades för klyvning av influensa H3N2 HA subtyp av matriptase. Medan flera grupper beskrivs klyvning H3N2 hektar av matriptase peptid analyser, visades det också att inkubation av full längd H3N2 HA protein och matriptase i cellkultur inte resulterade i en fusogenic HA protein4,20, 21. Det finns andra exempel som visar att biologiskt viktiga regleringen av proteolytisk klyvning är om nivån på protein konformation. Det har beskrivits att fusionsproteinerna ibland måste en rad före fusion händelser för att kunna avslöja de klyvning webbplatserna vid fusion. Proteinet Semliki Forest virus fusion, exempelvis kräver strukturella rearrangements under ett antal prefusion händelser för att exponera dess fusionsprotein och göra den tillgänglig för proteolytisk aktivering22. Resultaten från en fluorogenic peptid analys måste därför valideras av cell fusion analyser eller liknande experiment. Peptid analysen kan dock fortfarande en snabb screening av flera proteas/peptid kombinationer och att minska arbetskraft och tid för uppföljning experiment eftersom kombinationer som inte visar klyvning är mycket sannolikt att ställa ut den samma resultat i vivo.

Den andra stora begränsningen i analysen avser proteaser. Hittills är det endast möjligt att testa lösliga proteaser men inte transmembrana proteaser. Beroende på syftet med försöket, kan detta vara ett problem. Till exempel aktiveras influensa har av ett antal transmembrana proteaser beläget på cellmembran8. Till viss del, detta problem kan kringgås med hjälp av löslig proteolytiska active domäner, men resultaten måste tolkas med försiktighet och bör valideras med konventionella metoder. Vi vill hänvisa till det ovannämnda exemplet med matriptase och dess aktivitet mot H3N2 HA. In vivo matriptase ligger i cellmembranet, men enzymet kommersiellt tillgängliga är den lösliga katalytiska domänen. Som diskuterats med avseende på fusionsproteinerna, kan det vara möjligt att det också krävs en fullängds proteas att interagera med fullängds protein substratet att erhålla klyvning och att testning endast enstaka domäner kan resultera i falska positiva.

Denna metod har visat sig vara effektivt att studera klyvning av specifik amino syra ordnar av furin. Dock tillämpningarna av teknik graderna till alla tillgängliga proteashämmare (t.ex., cathepsins, proprotein convertase), vilket gör det till en användbar metod till skärmen peptid kandidater för proteas klyvning. Det har dessutom visat att denna analys kan också användas för att testa effekten av proteashämmare och därmed ger en snabb och lätt att verktyg till skärmen protein-hämmare23.

Fluorogenic peptid klyvning analysen beskrivs här representerar ett tillägg till bioinformatiska klyvning scoring algoritmer, som förutspår peptid klyvning av en beslutsam proteas, baserat på aminosyran egenskaper och sekvens. Dessa två tekniker, i kombination med tradition western blotting tekniker kan användas som en effektiv metod för att studera proteas klyvning in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Forskningsfinansiering för MERS projektet presenteras i detta manuskript kom från NIH bevilja R21 AI111085. Den felint coronavirus studien stöddes av forskningsanslag från Morris djur Foundation, Winn Feline Foundation och Cornell Feline Health Center. Vi vill också tacka Malik Peiris för att förse oss med Mor213 sekvens innan det var allmänt tillgängliga.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptides Biomatik N/A
Furin NEB P8077S
Trypsin, TPCK-treated Sigma-Aldrich 4352157-1KT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Triton-X100 Sigma-Aldrich X100
PBS Corning 21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices XPS
SoftMax Pro 6.5.1  Molecular Devices N/A
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) Costar 3915
Light damping tubes Watson Lab 131-915BL or 131-915BR
Microsoft Excel Microsoft N/A
Prism 7 GraphPad N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology. 479-480, 498-507 (2015).
  2. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. (2014).
  3. Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4, (7), 1144-1168 (2012).
  4. Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12, (3), e0174827 (2017).
  5. Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (2), 324-328 (1988).
  6. Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90, (1), 400-411 (2016).
  7. Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258, (1), 1-20 (1999).
  8. Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69, (2), 87-100 (2013).
  9. Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68, (9), 6074-6078 (1994).
  10. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5871-5876 (2009).
  11. Polgar, L. General Aspects of Proteases. Mechanisms of Protease Action. 43-76 (1989).
  12. Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3, (1), 1-8 (2018).
  13. Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19, (7), 1066-1073 (2013).
  14. Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. Viral Mutation Rates. Journal of Virology. 84, (19), 9733-9748 (2010).
  15. Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3, (1), 172-185 (2015).
  16. Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1-6 (2018).
  17. Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58, (6), 1080-1083 (1986).
  18. Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5, (12), e126-e129 (2016).
  19. Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
  20. Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86, (19), 10579-10586 (2012).
  21. Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30, (878), 4237-4251 (2013).
  22. Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278, (9), 7189-7198 (2003).
  23. Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450, (2), 1070-1075 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics