Une nouveau Portable In Vitro exposition Cassette pour l’échantillonnage des aérosols

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nous présentons ici un protocole pour effectuer des expositions portable cellulaire aérosol et mesurer la réponse cellulaire. La méthode utilise des cellules, cultivées à l’interface air-liquide, imitant en vivo physiologie. Réponse cellulaire aux aérosols de nanoparticules de cuivre a été observée dans le stress oxydatif grâce à la génération d’espèces réactives de l’oxygène et la cytotoxicité dans le communiqué de la lactate déshydrogénase.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ce protocole introduit un nouveau in vitro l’exposition système, pouvant être portés, y compris de sa caractérisation et performance. Systèmes de l’interface air-liquide (ALI) in vitro exposition sont souvent grands et encombrants, rendant le transport au champ et au fonctionnement à la source de l’émission ou la zone de respiration difficile. Grâce à la miniaturisation de ces systèmes, le laboratoire peut être amené au champ, accélérer les temps de traitement et en fournissant une méthode plus appropriée d’exposition qui n’altère pas l’aérosol avant de communiquer avec les cellules. Le Portable In vitro l’exposition Cassette (HONZÁK) s’adapte une cassette de filtre 37 mm pour permettre in vitro des essais de toxicité à l’extérieur du laboratoire traditionnel. Le HONZÁK a été caractérisée à l’aide de trois tailles de nanoparticules de cuivre afin de déterminer l’efficacité de dépôts basée sur gravimétrique et analyse de concentration nombre de particules. Cytotoxicité initiale expériences ont été réalisées avec des cellules pulmonaires exposées afin de déterminer la capacité du système de dépôt des particules tout en préservant la viabilité des cellules. Le HONZÁK offre une efficacité similaire ou une augmentation des dépôts lors de la comparaison d’appareils disponibles écoulement perpendiculaire in vitro d’exposition. Malgré le débit d’échantillon inférieur, la petite taille donne certains avantages au courant in vitro ALI systèmes d’exposition. Il s’agit de la capacité à être portés pour la surveillance personnelle, la mobilité du laboratoire à la source d’émission et l’option de mettre en place plusieurs systèmes de résolution spatiale tout en conservant un utilisateur plus faible coûtent. Le HONZÁK est un système capable de recueillir des aérosols sur le terrain et au sein de la zone de respiration sur un modèle air-relié, in vitro .

Introduction

Échantillonnage individuel en utilisant des techniques in vitro pourrait fournir des informations complètes concernant les effets biologiques des aérosols sur le lieu de travail. 1 exposition à des contaminants dans l’air inclure l’exposition au produit chimique lui-même, pour les échantillons d’air recueillis, dans des conditions submergées, où le gaz est introduit à la suspension cellulaire, exposition intermittente à l’aide d’un périphérique comme un rocker, ou direct expositions à l’interface air-liquide (ALI). 2 plusieurs de ces techniques sont effectuées avec des cellules cultivées en suspension ou de la collecte d’échantillons avant l’exposition, dont chacun peut affecter l’étude toxicologique à cause de changements potentiels dans l’aérosol. 3 pour éviter ces changements, le laboratoire peut être amené à ce champ en utilisant plusieurs in vitro systèmes d’exposition de la culture ALI qui sont utilisés dans la littérature,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 cependant, peu sont disponibles dans le commerce. 8 , 9 , 12 ces systèmes sont souvent volumineux, surtout quand les instruments pour réguler la température et l’humidité de l’environnement cellulaire et du débit de l’aérosol d’échantillon. En utilisant le HONZÁK, expositions de l’aérosol peuvent être réalisées en dehors d’un paramètre de laboratoire traditionnel ou la zone de respiration en imitant les conditions de l’inhalation.

La détermination de l’aerosol deposition in vitro est importante pour l’étude des effets de santé en raison de l’inhalation. La zone de respiration, la zone de moins de 30 cm de la bouche et le nez,14 est cruciale pour comprendre l’exposition aux nanoparticules et un lien vers les effets biologiques dans les poumons. 2 souvent, les dépôt sur les cellules est défini comme un rendement de dépôts, les particules déposées sur et absorbé par les cellules divisés par les particules administrées au système6,15 , ou sur une base massive des mêmes montants. 4 , 16 les méthodes actuelles pour mesurer les aérosols présents dans la zone de respiration sont filtre basé, capturant les particules sur une période donnée d’échantillonnage en utilisant les filtres de mener des essais supplémentaires. 17 surveillance personnelle nécessite un petit système qui vient avec le compromis de moins d’échantillons.

Il existe de nombreuses approches pour déterminer les effets sur la santé d’une exposition à un aérosol. Le modèle ALI permet l’aérosol à administrer directement aux cellules par l’intermédiaire de l’air comme dans un scénario d’exposition réelle, mais il est plus rentable et moins intensif de temps qu’in vivo études tout en imitant les barrières d’air liquide tels que les yeux, peau et les poumons. Poumon cellules cultivées à l’ILA ont la capacité de générer une couche barrière polarisée,18,19 , qui produit des caractéristiques physiologiques qui ressemblent à l’épithélium de poumon en vivo , y compris la production de mucus et agent tensio-actif en particulier lignées de cellules bronchiques ou alvéolaire, cils,19 des jonctions serrées,19,20 et cellules de polarisation. 18 changements comme ceux-ci peuvent affecter la réponse cellulaire mesurée dans les études de toxicité. 21 en outre, modèle, ALI in vitro résultats sont souvent plus sensibles que les cellules exposées par suspension modèles22 et sont capables de modèle aiguë in vivo toxicité par inhalation. 23 , 24 c’est pourquoi, un système d’exposition ALI qui est capable d’effectuer des mesures au sein de la zone de respiration est une étape naturelle.

En exposant les cellules à aérosols directement à la source d’émission, étude sur les effets de tous les gaz, les composés semi-volatils et particules impliquées dans le mélange se produit. Lorsque le mélange est recueilli sur un filtre, les gaz et les composés volatils ne sont pas capturés et le mélange entier ne peut pas être l’objet d’une enquête. En outre, reconstitution des particules dans une poudre ou une suspension liquide peut conduire à l’agrégation ou interactions particule-fluide, comme la dissolution, en suspension liquide. 25 , 26 lorsque des particules d’aérosol sont ajoutés au liquide, il y a un potentiel plus élevé d’agglomération, formation27 25,de corona de protéines,28 ou interaction avec des composés dans le liquide, qui peut affecter des dépôts et influencer la réponse biologique. 29 , 30

Exposition à l’ILA repose sur trois profils principaux aérosol, nuage des flux parallèles, décantation et écoulement perpendiculaire. Cloud s’installant, utilisé par exposition de cellule pour l’Interface Air-liquide (ALICE),4 est un système de traitement par lots où déposent des particules par gravitation et diffusion s’installer comme l’aérosol est traité comme une seule unité. Les flux parallèle, utilisée par les aérosols électrostatiques in vitro l’exposition système (gouttières)5 et Multiculture exposition chambre (MEC) II,6 permet pour les dépôts par le biais de l’ajout du mouvement brownien par le profil d’écoulement. Écoulement perpendiculaire, utilisé par un microsprayer,7 Nano aérochambre pour toxicité In Vitro (NACIVT),11 et commercial ALI systèmes8,9,10,12, ajoute l’impaction de particules dans la zone de dépôt. Beaucoup de ces systèmes d’exposition sont grands et encombrants, exigeant des systèmes excédentaires pour aérosol pré conditionnement, pompes pour l’écoulement, ou même de chauffage des chambres pour l’incubation des cellules. Cette grande taille diminue la portabilité du système. Au lieu de prélèvement à la source d’émission, ces systèmes ont souvent apportés à des aérosols de laboratoire ou modèle générés pour l’analyse des échantillons. La complexité de l’aérosol émis peut être perdue dans la traduction sur le terrain au laboratoire. Le HONZÁK est plus petit que les systèmes actuels, avec une surface extérieure d’environ 460 cm2 et ne pesant que 60 grammes, avec contrôle thermique et d’humidité intégré dans le système permettant à un périphérique portable. La diminution de taille et le poids permettent au système d’être porté ou prises à la source d’exposition, permettant le prélèvement direct.

La grande taille des systèmes actuels de l’exposition diminue également la capacité d’effectuer l’échantillonnage pour enquêter sur des gradients spatiaux dans les concentrations. Cette résolution est la clé pour déterminer les effets toxicologiques de nombreux risques pour l’environnement et des risques professionnels tels que les activités de matière ou lieu de travail particules d’échappement véhicules où aérosolisation se produit. Immédiatement après émission, il devient une variance spatiale dans la concentration de particules. Cela se développe avec le temps que les particules se dispersent dans l’atmosphère et ces effets peuvent changer selon les conditions ambiantes, tels que température, pression, vent et soleil. Les particules peuvent commencer à l’âge et oxyder ainsi une fois émis31,32 et taux de dispersion sont affectés par la topographie ; On trouvera des concentrations plus élevées dans les canyons et les tunnels, où les effets de dispersion sont ralenties, et des concentrations plus faibles se trouvent là où il y a une grande surface de dispersion. 33 ces changements dans les taux de dispersion peuvent avoir des effets importants sur la santé humaine et peuvent être vu quand on compare le nombre d’asthmatiques adultes vivant en urbain ou en milieu rural. 34 alors que de nombreux systèmes d’exposition fournissent plusieurs échantillons à la fois, plusieurs systèmes sont nécessaires avec une abondance de gros équipements pour effectuer la résolution spatiale.

En apportant le laboratoire sur le terrain, le temps d’analyse peut être diminué en utilisant la cellule entière comme un capteur. Suite de points de terminaison et les mécanismes biologiques connus peut aider à la détermination de la composition des aérosols et de la taille. En raison de méthodes de dégagement lent, y compris la clairance mucociliaire, phagocytose et translocation, ces particules sont souvent en interaction avec les cellules pour quelque jours à semaines3 génératrices de stress oxydatif, l’inflammation et même la mort des cellules. Ces points de terminaison biologiques peuvent être les points de départ pour les voies d’issue défavorable pour les maladies cardiovasculaires ou les maladies pulmonaires obstructives chroniques. En outre, Wiemenn et coll. réalisé un tableau in vitro tests à comparer avec les valeurs de la littérature à court terme en vivo toxicité par inhalation. 35 In vivo la réponse a été prévue avec deux des quatre résultats positifs des tests de cytotoxicité par communiqué de la lactate déshydrogénase, stress oxydatif, de réduction et peroxyde d’hydrogène la formation de glutathion et libération et inflammation potentielle de le gène de facteur de nécrose tumorale alpha. Hors des oxydes métalliques dix taille nano testés, six testées comme active (oxyde de titane, oxyde de zinc et quatre l’oxyde de cérium différents) à l’aide d’expositions in vitro avec confirmation en vivo

Afin d’étudier les effets des aérosols dans un milieu professionnel, notre laboratoire a développé le HONZÁK pour des expositions dans le domaine. En outre, le HONZÁK peut être porté pendant l’échantillonnage individuel de surveiller et d’enquêter sur l’exposition par inhalation comme le 37 mm filtre cassette36 ou plusieurs systèmes peuvent être utilisés pour obtenir une résolution spatiale dans une zone donnée. Dans ce protocole, la caractérisation et l’utilisation de la HONZÁK est discutée. Après l’exposition, les effets biologiques sont observés à travers des analyses de cytotoxicité.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les opérateurs doivent porter les équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes) lorsque les étapes 1, 2, 3, 5 et 6.

1. préparation des matériaux

  1. Préparer du matériel pour l’assemblage du système et l’exposition à assurer la répétabilité.
    1. Assurez-vous d’utilisation nouvelle ou 70 % éthanol nettoyé ¼" diamètre intérieur conducteur tube et ¼" diamètre extérieur connecteurs pour l’assembly system.
    2. Magasin matériaux d’essai y compris les filtres, les composants HONZÁK, pince à épiler et poudres de particules dans un environnement bien contrôlé, en ce qui concerne la température et l’humidité, pendant au moins 24 h avant l’expérience.
      Remarque : La température doit être à température ambiante, environ 20 ° C, avec une humidité relative inférieure à 35 %. C’est très important pour obtenir la répétabilité entre les expériences.
    3. Préparer des compteurs de particules à l’aide d’alcool isopropylique pour nettoyer les pièces et permettre le warm-up du système selon les recommandations du fabricant, y compris la numérisation sizer de particule de mobilité (SMPS) et sizer de particules optique (OPS) pour la mesure.

2. génération d’aérosols secs

Remarque : Les opérateurs devraient effectuer la génération d’aérosol sous une hotte.

  1. Assembler un système permettant de générer des aérosols secs
    Remarque : La suspension des particules dans les gaz ou un liquide doit être adaptée pour la culture modélisée de demande et de la cellule. La méthode suivante peut être effectuée à l’aide d’un aérosol à base de liquide. La conception du système aérosol sec provient de Tiwari et al. 37 une représentation schématique du système sec de dispersion est illustrée à la Figure 1.
    1. Raccorder la vanne à bille à chaque extrémité de la tubulure de taille fileté 4" 1/8, cela servira la trémie de la particule. Raccorder 2" 1/8 taille tuyau à un robinet.
    2. Peser les nanoparticules de cuivre, dans cette étude, la concentration en masse pour chaque taille de particule est maintenue constante tout en déterminant l’efficacité du dépôt. Environ utiliser 7,5 mg de 40 nm cuivre nanoparticules, 7 mg de nanoparticules de cuivre nm 100 et 13 mg de 800 nm cuivre nanoparticules par exposition. Placez les nanoparticules de cuivre dans la trémie de particules à travers l’extrémité ouverte.
      Remarque : La quantité de cuivre nanoparticules pesées servira la masse fonction concentration administrée.
    3. Placer un 3" ½" diamètre extérieur (OD) tube autour du tuyau de 2" et place un HEPA filtre à l’intérieur de ce tube court telle que la direction de l’écoulement soit par l’intermédiaire de la valve à bille.
    4. Connecter le générateur de vide à autre robinet à tournant sphérique à l’aide de filetage. Connecter le générateur de vide à réservoir d’air en plaçant un tube de 5/16" OD dans la connexion de la pousser à bloquer. Utilisez ¼" OD tuyauterie pour raccorder la sortie du générateur de vide pour le montage de l’expérience en plaçant le tuyau sur la sortie du générateur de vide.
  2. Utilisation du système sec aérosol pour générer des aérosols secs
    1. Ouvrir le réservoir d’air en tournant la soupape principale et permettre la circulation d’air dans le système. Ouvrez la valve sur le régulateur de débit sur le réservoir d’air et définissez tels que le débit à travers le système équivaut aux réglages désirés sur la pompe à vide.
    2. Ouvrez le robinet le plus proche de filtre HEPA, puis ouvrez le robinet le plus proche de générateur de vide. Gardez ces ouvert pour environ 3 s pour laisser les particules soit introduit dans le flux d’air.
    3. Fermer le robinet le plus proche de générateur de vide, puis fermez le robinet le plus proche de filtre HEPA. Permettre à l’air du réservoir s’écouler pendant la durée de l’expérience comme nécessaire.
    4. Fermer les vannes principales et régulateur de réservoir d’air pour arrêter l’écoulement. Robinets à tournant sphérique propres et générateur de vide à l’aide d’éthanol à 70 %. Tuyaux en métal autoclave pour la stérilisation.

3. dépôts efficacité mesure utilisant HONZÁK

Remarque : Les opérateurs doivent exécuter expositions aérosol sous une hotte.

  1. Mesurer la déposition en recueillant l’aérosol de nanoparticules de cuivre généré à l’étape 2.2 sur un filtre préalablement pesé. Utiliser la dose déposée, mesurée à l’aide de la masse recueillie sur le filtre et la dose administrée, mesurée à l’aide de la quantité de particules de cuivre pesés, pour déterminer l’efficacité du dépôt.
    1. Garder à 1,00 µm pore filtres verre fibre dans des conditions de faible humidité, décrites au paragraphe 1.1.2, pendant au moins 24 h avant les mesures avant l’exposition. Peser un filtre non utilisé trois fois et noter les poids du filtre. Place le filtre non utilisé dans une culture cellulaire insérer.
    2. Choisissez cellule appropriée la culture insert adaptateur (puits 6 ou 24 puits) pour HONZÁK soutenir l’insert de culture cellulaire avec le filtre. Place de la culture de cellules insérez-y adaptateur sur le dessus de la base de HONZÁK, mise en place, tels que la base de la pièce de l’adaptateur est plus large que haut.
    3. Utilisation pince à épiler pour placer la culture de cellules de filtre chargé insérer dans l’adaptateur. Placez le dessus du pied au sommet de la pièce de l’adaptateur, s’installer en place tel que la base de la pièce supérieure est plus large que haut. Envelopper HONZÁK avec une seule couche de ruban adhésif.
    4. Brancher pièces cassette 37 mm en haut et en bas de HONZÁK en poussant en place. Placer ¼" barbée adaptateurs en sortie et d’entrée cassette.
    5. Envelopper le chauffage résistif autour HONZÁK tels que les fils sont à la base. Ruban pour garantir.
    6. Envelopper HONZÁK avec ~ 8 tours de papier d’aluminium pour l’isolation. Fixez avec du ruban adhésif.
    7. Connect 2" long morceau de 1/2" diamètre extérieur des tuyaux flexibles à l’adaptateur sur le dessus de HONZÁK. Enlevez le tube poreux de l’eau stérile et le déposer dans le tube sur le dessus de HONZÁK.
    8. HONZÁK place au sein de la pince sur le stand de l’anneau et sûr. Set-up complet avec la pompe à vide, compteurs de particules et montage de l’aérosol.
      Remarque : La dose déposée reposant sur le numéro peut être déterminée que si les compteurs de particules sont placés avant le HONZÁK et après le HONZÁK sur des pistes séparées.
    9. Exposer des filtres à l’aide étape 2.2 du protocole et taux de temps et débit exposition souhaitée, dans la présente étude qu'a été utilisé un temps de pose de 10 min à 0,5 l/min. Retirez HONZÁK de la mise en place. Retirez l’insert de culture cellulaire et placer le filtre exposé dans le porte-filtre dans des conditions de faible humidité pendant au moins 24 h avant les mesures.
    10. HONZÁK propre avec l’éthanol à 70 %. Stérilisation à la lumière ultraviolette pendant au moins 30 min avant l’expérience suivante.
    11. Peser le filtre exposé trois fois et noter les poids du filtre. Placer le filtre exposé dans un porte-filtre marqué pour le stockage.

4. calcul de la Dose déposée et l’efficacité de dépôts

NOTE : La connaissance des dépôts est importante pour l’administration d’aérosols et l’interprétation de la réponse cellulaire.

  1. Calculer les dépôts de mesures basées sur la masse
    1. Calculer la masse déposée sur les filtres comme la différence entre le poids moyen de pré-exposition et poids moyen après l’exposition. Cette valeur est la dose déposée basée sur la masse pour l’expérience.
    2. Utilisation administré masse, madmin, et basée sur la masse déposée dose déterminée en 4.1.1, mdep, pour calculer l’efficacité basée sur la masse des dépôts, ηm, pour l’expérience.
      Equation
    3. Valeurs moyennes de 4.1.1 et 4.1.2 au moins 3 expériences pour déterminer le dépôt et l’efficacité de la déposition pour HONZÁK pour la taille des particules.
  2. Calculer les dépôts de mesures basées sur le nombre
    1. S’assurer que les mesures avec des compteurs de particules ont été effectuées avec compteurs après la HONZÁK et pour déterminer la concentration de particules avant le HONZÁK. Intégrer la concentration de particules dans le temps pour le compteur de particules puis intégrer sur le diamètre des particules pour déterminer le total des particules mesurées.
    2. Calculer le nombre de particules déposées comme la différence entre les particules administrés et le post-HONZÁK particules mesurées. Cette valeur est la dose déposée reposant sur le numéro pour l’expérience.
    3. Utilisation administrée particules, nadmin, reposant sur le numéro déposés dose, ndep, débit volumétrique, V et temps, t, pour calculer l’efficacité reposant sur le numéro de dépôt, ηn, pour l’expérience.
      Equation
    4. Valeurs moyennes de 4.2.2 et 4.2.3 au moins 3 expériences pour déterminer le dépôt et l’efficacité de la déposition pour HONZÁK pour la taille des particules.

5. aérosols exposition des cellules

Remarque : Pour la cellule culture à l’interface air-liquide le lecteur est appelée vide et al. 38 les opérateurs doivent exécuter insert de culture cellulaire chargement (mesures 5.1.2-5.1.4) au sein d’une cabinet de biosécurité. Les opérateurs devraient effectuent expositions aérosol sous une hotte.

  1. Cellules de culture à l’Interface Air-liquide
    1. Soulever des cellules A549 du flacon de culture en ajoutant la trypsine-EDTA, 3 mL pour une fiole T75 ou 1 mL pour une fiole T25 et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Ajouter 7 mL de médias complet pour une fiole T75 ou 4 mL de support complet pour un T25 fiole de fiole et le mur de fiole de rinçage avec suspension cellulaire afin de maximiser le nombre d’éléments récupérés. Transférer la suspension de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL puis centrifuger les cellules à 800 x g pendant 3 min.
    2. Retirez le surnageant contenant la trypsine-EDTA et resuspendre le culot dans 10 mL de médias complet. Retirer 10 µL de suspension cellulaire et ajouter à l’hémocytomètre. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la concentration et le nombre total de cellules.
    3. Verser 0,5 mL de médias complet dans chaque puits dans une plaque 24 puits. Placer les inserts de culture cellulaire non utilisés dans les puits. Culture de cellules de semences insère du côté apical à une densité cellulaire près de 1 x 105 cellules/cm2 pour les types de cellules qui se développent à un taux près de doublement par jour. Aux semences A549 cellules dans un 24 bien insérer, insérer à une densité de 1 x 105 cellules/cm2 en ajoutant 35 000 cellules dans la culture de cellules, les cellules de semences.
      Remarque : Les cellules avec un taux de croissance plus lent peuvent être semés à une densité accrue des cellules.
    4. Ajouter des éléments multimédias complètes du côté apical de l’insert de culture cellulaire pour atteindre le volume final (pour 24 volume final plaque puits est 0,25 mL).
    5. Culture pendant 7 jours dans des conditions submergées, remplaçant les médias tous les jours 1-2. Après 7 jours, retirez les médias apicale et la culture pendant au moins 1 jour dans des conditions de ALI, remplacer uniquement les médias basolatérale.
  2. Assembler HONZÁK
    1. Permettre aux cellules de s’équilibrer à l’interface air-liquide pendant au moins 24 h avant l’exposition.
    2. Choisissez cellule appropriée la culture insert adaptateur pour HONZÁK soutenir l’insert de culture cellulaire avec le filtre. Culture de cellules de lieu insérez-y adaptateur sur le dessus de HONZÁK base, mise en place, tels que la base de la pièce de l’adaptateur est plus large que haut. Ajouter 4 mL de milieux de culture cellulaire dans le puits de la base de la HONZÁK.
    3. Utilisation pince à épiler pour placer la culture de cellule insérer dans l’adaptateur pièce placée à l’étape 5.2.3. Placez le dessus du pied au sommet de la pièce de l’adaptateur, s’installer en place tel que la base de la pièce supérieure est plus large que haut. Enveloppez soigneusement, HONZÁK avec une seule couche de ruban adhésif.
    4. Brancher pièces cassette 37 mm en haut et en bas de HONZÁK, en poussant en place. Placer ¼" barbée adaptateurs en sortie et d’entrée cassette.
    5. Envelopper le chauffage résistif autour HONZÁK tels que les fils sont à la base. Ruban pour garantir.
    6. Envelopper HONZÁK avec ~ 8 tours de papier d’aluminium pour l’isolation. Fixez avec du ruban adhésif.
    7. Se connecter à petit morceau de tuyau flexible 1/2" diamètre extérieur à la carte sur le dessus de HONZÁK. Enlevez le tube poreux de l’eau stérile et le déposer dans le tube sur le dessus de HONZÁK.
    8. HONZÁK place au sein de la pince sur le stand de l’anneau et sûr. Compléter l’installation avec la pompe à vide et la configuration d’aérosol.
  3. Exposer les cellules à ALI, à l’aide de la HONZÁK
    1. Efficacité de dépôt déterminée à l’étape 2 permet de calculer la masse des particules pour être en aérosol. Peser la masse approprié et ajouter au système aérosol mis en place après l’étape 2 dans la hotte.
    2. Exposer les cellules en suivant l’étape 2.2, dans cette étude des paramètres biologiques les cellules sont exposées à environ 3,5 mg de nanoparticules de cuivre avec un débit de 0,5 l/min et une durée d’exposition de 10 min. des études de contrôle effectuées l’air humidifié pour déterminer l’influence de l’air seul. Retirez HONZÁK de la mise en place. Retirez l’insert de culture cellulaire, placer la plaque bien stérile et revenir à l’incubateur à CO2 (37 ° C, 5 % CO2, 90 % HR).
    3. Aspirer les médias de HONZÁK. Si vous effectuez d’autres expériences, bas de rinçage de HONZÁK avec phosphate buffered solution puis répétez l’étape 5.1 et 5.2.
    4. HONZÁK propre avec de l’éthanol 70 % lorsque vous avez terminé. Stérilisation à la lumière ultraviolette pendant au moins 30 min avant l’expérience suivante.
  4. Procédures de dosage biologique
    NOTE : Analyses exécutées dans cette étude étaient de cytotoxicité par libération de lactate déshydrogénase (LDH) et génération de stress oxydatif grâce à l’analyse de DHFC-DA.
    1. Dissoudre 24,4 mg de DHFC-DA dans 50 mL de méthanol pour rendre la solution 1 mM DHFC-DA. Cette solution peut être conservée à-20 ° C pendant 4 mois. Diluer 1 mM DHFC-DA solution en mélangeant 0,1 mL de 1 mM DHFC-DA solution avec 9,9 mL HBSS faire 10 mL de 10 µM DHFC-DA.
    2. Supprimer de lavage et milieux de culture cellulaire insert de culture cellulaire avec environ 1 mL de PBS. Ajouter 0,5 mL de solution de DHFC-DA 10 µM dans chaque puits, remplacement des plaquettes lorsque vous avez terminé. Plaque avec du papier d’aluminium pour empêcher photoactivation du colorant et retour à l’incubateur de 37° C pendant 1 h.
    3. Éliminer les cellules de l’incubateur et aspirer la solution de travail DHFC-DA des puits. Ajouter 0,5 mL HBSS aux puits et remplacer les inserts de culture cellulaire.
    4. Charger la plaque bien en fluorescence de base lecteur et mesure de plaque à l’aide de longueurs d’onde d’excitation/émission de 485/530 nm. Enlever plaque à plaque lecteur et charge insert dans HONZÁK pour l’exposition.
    5. Exposer les cellules pour la durée de l’exposition souhaitée. Enlevez l’insert de HONZÁK et revenir à plaque bien. 50 µL de fluide basolatérale retirez de la plaque bien et placer dans une plaque bien blanc 96. Mesurer la fluorescence des DCF en utilisant les longueurs d’onde d’excitation/émission de 485/530 nm toutes les 30 minutes après exposition pendant 2 h.
    6. Laissez basolatérale liquide est proportionnelle à la température ambiante pendant 20 à 30 min. ajouter 50 µL de solution de dosage LDH, protocole mixte de fabricant suivant, basolatérale fluide de plaque puits et laisser réagir pendant 10 min. ajouter 25 µL de solution d’arrêt bien. Lire la fluorescence du produit résorufine en utilisant les longueurs d’onde d’excitation/émission de 560/590 nm.
    7. Éliminer le liquide supplémentaire basolatérale et répétez l’étape 5.4.6 à 4 h et 24h après de l’exposition.

6 méthodes statistiques

  1. Analyse des données du test biologique
    1. Production de ROS de rapport que l’augmentation d’intensité de fluorescence des cellules traitées par rapport à des mesures de base. Rapport d’activité LDH comme l’augmentation d’intensité de fluorescence des cellules traitées par rapport aux cellules non traitées.
    2. Effectuer seul facteur ANOVA pour déterminer des différences statistiques entre les ensembles de données. Le cas échéant, effectuer les tests t étudiant à une valeur de signification de 0,05. Rapport de données comme la moyenne ± écart-type d’au moins trois mesures de l’exposition.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Professionnelle in vitro de toxicologie comprend le maintien de la viabilité cellulaire tout en effectuant l’exposition aérosol. Le système HONZÁK est montré dans la Figure 2, y compris la température et contrôle de l’humidité et la HONZÁK usé. La température a été maintenue à l’aide d’un appareil de chauffage résistif alimenté par batterie et l’aérosol humidifié à l’aide d’augmenté humidification naturelle à travers un tube poreux et humidifié. Dans un aérosol contrôlé réglage à l’intérieur d’un laboratoire, le HONZÁK peut être réglé pour l’exposition illustrée à la Figure 1. Caractérisation du système permet la détermination de la dose déposée sur les cellules, qui peut ensuite être corrélée à la réponse cellulaire.

L’efficacité du dépôt dépend de la taille des particules ajoutées au système puisque les dépôts des forces incluent impaction, sédimentation et diffusion. En outre, la déposition est tributaire de la vitesse d’écoulement, temps d’exposition et les caractéristiques du système l’exposition. Avec cette information, le dépôt peut être prédite. L’efficacité de la déposition de la HONZÁK a été déterminée par le biais de deux méthodes, l’analyse gravimétrique et comptage des particules numéro. Les équations 1 et 2 ont été utilisées pour déterminer l’efficacité de dépôts dans la tableau 1 en utilisant le filtre en fonction, balayage sizer de particule de mobilité (SMPS) et des mesures optiques de particules sizer (OPS), Figure 3. Une augmentation de dépôts sont observée dans l’ensemble pour les 24 design ainsi que les 6 bien concevoir et diminue légèrement pour 100 nm par rapport à 40 nm et 800 nm cuivre particules. Les dépôts dans les 24 puits sont très uniforme sur l’insert, cependant, les dépôts dans la conception de puits 6 manque uniformité comme la plupart le dépôt de particules près du centre de l’insert. Après l’exposition analyse peut être accélérée en déterminant la relation dose entre le filtre de 37 mm et l’insert de culture cellulaire, diminuant la nécessité de déterminer la dose après exposition cellulaire. Comparaison des dépôts dans la cassette de filtre 37 mm et la HONZÁK montre une forte corrélation pour toutes les tailles et les puits avec une corrélation de Pearson d’au-dessus de 0,7, toutefois seulement pour 800 nm est la corrélation significative avec un p < 0,05, voir la Figure 4. Par rapport à des systèmes similaires dans l’ensemble de la littérature,11,12 l’efficacité de la déposition de la HONZÁK sur la plage de tailles de particules testés est comparable ou accru sur les valeurs déclarées, observés dans la Figure 5. L’efficacité de dépôts dans le HONZÁK peut être améliorée par minimiser les pertes subies par le système en utilisant électrostatique matériel antistatique ou conductrice en plastique ou similaire pour concevoir la HONZÁK.

Si les filtres ne sont pas bien séchés dans un environnement à humidité contrôlée avant l’exposition, l’excès d’eau augmente la masse initiale et peuvent produire des doses déposés non-physiques, négatifs. Débits variables peuvent aussi favoriser incompatibles doses déposés au sein du système. Pour éviter ces problèmes, laisser au moins un jour avant et après l’exposition pour les filtres à sécher dans un environnement à humidité contrôlée.

Les réponses cellulaires seront touchés par la dose déposée et peuvent être affectées par la durée d’exposition si les cellules ne sont pas correctement entretenus. Les cellules A549, une lignée de cellules de carcinome épithélial alvéolaire, ont été exposés pendant 10 min à différentes tailles de nanoparticules de cuivre à un débit de 0,5 l/min. Alternative perpendiculaire flow exposition systèmes utilisation entre 0,005 l/min et 1,5 l/min pour une période d’exposition soutenue alors que cette méthode utilise un débit modéré au cours d’une exposition rapide. À l’aide de l’efficacité basée sur la masse des dépôts mesurés et administré la dose, 1,58 ± 0,04 mg/cm2 de 40 cuivre nm, 0,30 ± 0.00 mg/cm2 de 100 particules de cuivre nm, et de 0,32 ± 0,01 mg/cm2 de 800 particules nm en cuivre ont été déposés sur les cellules. Cytotoxicité et stress oxydatif ont été observés dans la premier vingt-quatre heures après l’exposition. Cytotoxicité a été mesurée à l’aide de la libération de lactate déshydrogénase (LDH) des cellules endommagées immédiatement, 4 heures et 24 heures après l’exposition. Il n’y avait aucune toxicité importante de nanoparticules de cuivre inférieures à 1,62 mg/cm2 dans les 4 heures d’exposition, Figure 6 b. Vingt-quatre heures après l’exposition il était une diminution statistiquement significative de la viabilité cellulaire de moins de 20 % la viabilité des cellules exposées à des nanoparticules de cuivre. Le stress oxydatif intracellulaire a été étudié en utilisant le test DHFC-DA, par l’intermédiaire de l’oxydation du DHFC par des espèces réactives de l’oxygène dans la premières deux heures après l’exposition, Figure 6 a. Des niveaux importants de stress oxydatif ont été mesurées à post-exposition trente minutes pour les cellules exposées à des nanoparticules de cuivre de toutes tailles. Le niveau de stress oxydatif a continué d’augmenter au même rythme pour toutes les tailles, testés dans les deux heures observées.

Succès des expositions peut être déterminée grâce à la reproductibilité de la réponse cellulaire. Deux critères d’acceptation proposées pour les analyses de cytotoxicité comprennent : 1) la fuite LDH totale % pour le contrôle positif doit être supérieur à 50 % et 2) le coefficient positif et l’échantillon de répliquer des variations devrait être moins de 50 %. 39 si ces critères ne sont pas remplies, cette suggérer des différences entre les expériences, tels que dépôts altérée ou mauvais contrôle de température ou d’humidité. En outre, observer les mesures de la cytotoxicité peut conduire à la compréhension des contrôles expérimentaux et aident à déterminer l’erreur. Lorsque le débit est trop élevé, les cellules peuvent mourir de quantités élevées de contrainte de cisaillement. En abaissant le taux d’écoulement, le stress sur les cellules de l’écoulement peut être diminué.

Figure 1
Figure 1. Schéma du système de dispersion sèche et montage expérimental. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Conception de HONZÁK. A) Design complète cette photo 30 cm boîte de haut pour la comparaison. B) HONZÁK avec température et humidité contrôlée sur la photo avec 30 cm boîte de hauteur pour la comparaison. C) HONZÁK usé. D) bonbout HONZÁK. E) cell Culture adaptateur pour 24 puits (à gauche) et 6 puits (à droite). F) bas pièce. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nombre d’après dépôt de rendement (%) Messe basée dépôts rendement (%)
6 puits 40 nm 17,83 ± 32.13 5,85 ± 0,85
100 nm 0,47 ± 4.06 5.11 ± 0,94
800 nm 3.70 ± 35,00 6.39 ± 1.01
24 bien 40 nm 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100 nm 1.37 ± 19 h 45 2.95 ± 0,75
800 nm 6.98 ± 3.93 15.95 ± 0,53

Le tableau 1. Efficacité de HONZÁK de dépôts.

Figure 3
Figure 3. Concentration en particules nombre d’aérosols de nanoparticules de cuivre. A) mesure SMPS. B) mesure OPS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Relation entre les dépôts sur insert cellulaire et filtre 37 mm SKC. Erreur ± 0,002 mg. A) les particules de cuivre nm 40. B) 100 particules de cuivre nm. C) les particules de cuivre nm 800. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Efficacité de dépôts de HONZÁK par rapport aux systèmes d’exposition écoulement perpendiculaire dans la littérature. Valeurs de la littérature de systèmes d’exposition flux perpendiculaires sont restituées en marqueurs solides et HONZÁK valeurs sont des marqueurs vide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Réponse cellulaire aux nanoparticules post-exposition (PE) de cuivre. Pour toutes les mesures, n = 3 et p < 0,05. A) oxidative Stress déterminé à l’aide de l’essai DHFC-DA. B) déterminée par le dosage de LDH de cytotoxicité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cassettes de filtre fournissent une méthode simple et peu coûteuse de recueillir des aérosols dans la zone de respiration ; Cependant, extraits des filtres des échantillons d’aérosols ne pas représenter l’aérosol entier (gaz, les substances volatiles et particules) et par conséquent limiter l’évaluation des effets biologiques associés. À l’aide de la conception initiale de la cassette de filtre 37 mm, le HONZÁK est conçu pour maintenir la portabilité et imiter la déposition en vivo de particules émises par inhalation. Le HONZÁK est nettement plus petit que les systèmes actuels d’exposition ALI, environ la taille d’une boîte à mouchoirs avec contrôle de température et d’humidité inclus. La taille est similaire à impacteurs personnels cascade tout en offrant en outre des données sur la réponse cellulaire à l’aérosol. Alors que le HONZÁK contient un espace pour un seul échantillon par rapport aux autres systèmes d’exposition actuelle, la petite taille permet plusieurs systèmes doivent être utilisés à la fois, par conséquent, augmentant la taille de l’échantillon et permettant la répartition spatiale à surveiller.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. Pour déterminer l’efficacité du dépôt, il est essentiel pour entretenir correctement les filtres, tel que décrit à l’étape 1. En outre, il est important de bien peser les nanoparticules de cuivre avant l’exposition et l’exposition de post filtre pour déterminer l’efficacité basée sur la masse des dépôts. L’efficacité de dépôt numéro doit être déterminée en utilisant la différence de dépôts entre la concentration d’aérosols initial et la concentration finale déterminée à l’aide des compteurs de particules. Si l’efficacité du dépôt n’est pas correctement déterminée, il est difficile de déterminer les différences de réaction biologique entre types d’aérosols. Modifications aux dépôts incluent altérant la déposition. Le dépôt peut être augmenté en modifiant la durée d’écoulement taux et l’exposition. Cela peut également influer la viabilité des cellules ayant le potentiel de dessécher les cellules. Le conditionnement d’aérosols est souvent réalisé pour compenser des caractéristiques physiologiques telles que la température corporelle et l’humidification des voies respiratoires. Humidité accrue, plus de 50 %, imite l’air inhalé et diminue la mort cellulaire due à l’exposition de véhicule. 43 lorsque la température et l’humidité ne sont pas bien contrôlés, la réaction cellulaire peut être influencée. En diminuant le débit d’eau, les particules additionnelles de toutes tailles déposera, augmentant la déposition. Durée d’exposition est proportionnelle aux dépôts, ce qui permet plus de particules à déposer sur une longue période expérimentale. Conditionnement de l’aérosol est important lors de l’augmentation de la durée de l’exposition pour que les cellules ne s’assèchent pas qui peut influer sur les réponses biologiques.

Le HONZÁK utilise écoulement perpendiculaire à déposer des particules par impaction, sédimentation et diffusion sur les cellules qui risquent de se dessécher de cellules par l’intermédiaire de la circulation et ajouté des contraintes sur les cellules. L’efficacité du dépôt dépend de la taille de la particule par les forces des dépôts. Beaucoup de systèmes exposition actuelle avec écoulement perpendiculaire ont un rendement de dépôts d’inférieure à 10 % et beaucoup plus proche à 1 %. Le HONZÁK a une efficacité de dépôt déterminée par analyse gravimétrique de 3 % à 16 % pour un 24 puits d’insert de culture cellulaire. L’efficacité de dépôts axée sur le nombre de particules est environ 1 % à 7 % du même foyer. Lorsque vous utilisez un 6 bien inserts de culture cellulaire, diminuent de ces chiffres, à l’exception de la taille des particules plus petite, en raison de la rationalisation de l’aérosol que plus les particules sont confinés dans l’insert de culture cellulaire sans espace pour la circulation à développer. Les inserts de culture cellulaire bien 6 permettent les flux d’aérosol pour contourner les dépôts. Autres systèmes d’écoulement perpendiculaire ont été caractérisés de façon massive à l’aide de 60 nm fluorescéine particules40, 80 nm et 180 nm cuivre particules16et 60 nm adipique particules acides41. Les gains d’efficience résultant de dépôts sont généralement entre 0,05 % et 11 %. Sur une base de numéro, ces systèmes ont été caractérisées à l’aide de particules de polystyrène12,15, de nanoparticules de carbone12et silice particules42, ce qui donne des gains d’efficacité entre 0,2 % et 11 %. Le HONZÁK fournit, des dépôts similaires ou plus fréquentes, en comparaison avec des appareils d’exposition cellulaires disponibles.

Cellule des expositions ont été réalisées en utilisant des nanoparticules de cuivre de 40 nm, 100 nm et 800 nm. La viabilité cellulaire a été définie à l’aide du dosage LDH sans diminution significative de la viabilité dans les quatre heures après l’exposition. Le dosage LDH a été utilisé avec un système d’exposition commerciale pour 74 ng/cm2 après 2 heures et 148 ng/cm2 après que 4 heures de 9,2 nm cuivre oxyde particules44 et 1 µg/cm2 déposé après une exposition séquentielle 4 heures, une incubation de 2 heures, puis une autre exposition pendant 4heures de 25 nm cuivre oxyde particules40, les deux mesure diminution significative de la viabilité des cellules. Une cytotoxicité a été observée dans un autre système pour 1.6-7,6 µg/cm2 de 180 particules nm nanoparticules de cuivre16 mesurée par exclusion du colorant bleu trypan. Exposition de 15 minutes à nanoparticules d’oxyde de 40 à 80 nm cuivre diminue la viabilité, mesurés 24 heures après l’exposition. La basse toxicité observée utilisant le HONZÁK était probablement dû à la durée d’exposition plus courte de 10 minutes et post exposition mesure plus courts. Après quatre heures après l’exposition, la viabilité des cellules exposées à la HONZÁK a diminué. Des cellules exposées à des contrôles d’air humide n’observés aucune cytotoxicité significative, en accord avec les autres études 9,40,44,45,46. Le stress oxydatif a été déterminé à l’aide de l’essai DHFC-DA. La production d’espèces réactives de l’oxygène, tels que le peroxyde d’hydrogène ou des radicaux d’oxygène, ont engendré un stress qui peut être mortel arrestation ou cellule de croissance. Après les expositions de la cellule, il y avait une augmentation minime dans le stress oxydatif des cellules conservés dans l’incubateur en tant que contrôle et pour les cellules exposées à l’air humide. Un stress oxydatif élevé ont eu lieu pour toutes les tailles de particules, augmentant au sein de l’exposition après 30 minutes. Dans une étude, 9,2 nm d’oxyde de cuivre particules44 et des particules d’oxyde de cuivre 25 nm40 a aussi induit un stress oxydatif mesuré par le dosage de la carboxy-DHFC-DA. Temps d’exposition accrue de 2 heures à un stress oxydatif élevé 4 heures pour 9,2 nm d’oxyde de cuivre particules44. Après quatre heures d’exposition, les particules d’oxyde de cuivre nm 9,2 a entraîné une réponse oxydante similaire comme l’exposition séquentielle de 25 nm cuivre oxyde particules40, ce qui suggère que l’exposition durée a une influence plus élevée sur la réponse au stress oxydatif que la taille des particules. Les cellules exposées au sein de la HONZÁK produisent un stress oxydatif élevé par rapport à cette étude, cependant, les particules exposés dans l’autre système sont l’oxyde de cuivre et seront dissout moins vite que le cuivre exposé au sein de la HONZÁK. Des études effectuées sur la dissolution du cuivre basé sur la composition et la taille des particules d’accord que les grosses particules et les oxydes métalliques libèrent des ions plus lentes que les particules métalliques ou leur nanoparticule homologues16,47 , 48 , 49 comme les contrôles de l’air humide n’a pas produit des quantités importantes de stress oxydatif comparée au contrôle de l’incubateur, l’influence des particules de cuivre pour induire un stress oxydatif est constante à l’intérieur la HONZÁK d’exposition in vitro semblable systèmes. Les réponses biologiques observées à l’aide de la HONZÁK suggèrent que le HONZÁK est un système approprié d’exposition cellulaire.

Bien que la caractérisation et études cellulaires de la HONZÁK concordent bien avec la littérature,9,16,40,44,46 le dispositif a ses limites. La petite conception diminue le nombre d’échantillons qui peuvent être exposées simultanément dans un seul périphérique par rapport aux autres systèmes d’exposition. Autres systèmes permettent au moins trois expositions cellulaires à la même aérosol9,12 , facilitant les mesures répétées. Même si le HONZÁK n'admet qu’un insert par système, la petite taille permet plusieurs systèmes à utiliser facilement, aidant à atténuer ce problème. Alors que les autres systèmes de surveillance personnelles n’utilisent pas de cellules, le HONZÁK doit être gardé près verticale pour réduire tout déversement les milieux de culture cellulaire nécessaire pour préserver la viabilité cellulaire. Bien que le HONZÁK n’a pas encore été optimisée pour des gammes spécifiques de particules (PM10, PM2,5, PM0,1), la HONZÁK a été caractérisé pour un éventail de tailles de particules. Semblable à d’autres systèmes d’écoulement perpendiculaire, la HONZÁK montre une diminution de la capacité de déposer des particules près de 100 nm de diamètre, tandis que 40 nm et 800 nm particules, déposés avec une efficacité similaire.

L’analyse d’après exposition des cellules peut être accélérée en effectuant une collection parallèle des aérosols dans le HONZÁK et une cassette de filtre SKC 37 mm. Une forte corrélation entre des dépôts de base gravimétrique permet l’estimation de la masse des particules collectée sur les cellules de données recueillies à l’aide de filtres de 37 mm. Comparaison de l’insertion de la cassette filtre réduit la nécessité de recueillir des échantillons additionnels et des mesures supplémentaires afin de déterminer la dose. Travaux en cours comprennent l’intégration d’un système de surveillance en temps réel pour la cytotoxicité, stress oxydatif ou autres paramètres biologiques. La petite taille de la HONZÁK lui permet d’être utilisé dans une variété de paramètres, tels que sur le corps comme un moniteur personnel, sur un drone au-dessus d’une usine de produits chimiques, ou à l’extérieur dans l’environnement pour la résolution spatiale. Cette méthode a démontré l’utilisation de la HONZÁK pour la collecte des particules d’aérosol sur cultures cellulaires à l’ILA. En conditionnant l’aérosol à 37 ± 1 ° C et > 80 % d’humidité relative, la viabilité cellulaire peut être maintenue pendant des expositions aiguës. Cette méthode est appropriée pour les gouttelettes liquides et solides axés sur les particules aérosols et a démontré que le dépôt de particules entre 40 nm et 800 nm dans les inserts de culture cellulaire. La polyvalence de la HONZÁK permet cette méthode pour être utilisés dans des environnements multiples avec divers paramètres biologiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L’affiliation des auteurs est comme indiqué sur la page couverture. Les auteurs sont financés par la Virginia Commonwealth University, où les travaux étaient achevés à Richmond, en Virginie. Les auteurs ont seul responsable de la rédaction et le contenu du présent document. Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun intérêts opposés.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier Boris Solomonov et l’atelier d’usinage Virginia Commonwealth Innovation pour aider avec le prototypage rapide de l’appareil. Les auteurs aimeraient également remercier Cristian Romero-Fuentes du groupe Lewinski, Dr Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov et la Virginia Commonwealth nanomatériaux Core caractérisation Facility pour leur aide avec la caractérisation des particules. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage fournis au Dr. Lewinski par la faculté d’ingénierie à la Virginia Commonwealth University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61, (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3, (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013, (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51, (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26, (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10, (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97, (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20, (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8, (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9, (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103, (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36, (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19, (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41, (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47, (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27, (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29, (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206, (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9, (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5, (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5, (3), 389-399 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics