गैर-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के ओटिओक्लास्ट गठन पर प्रभाव और विट्रो में अस्थिकलास्ट प्रणेता के प्रसार

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

इस प्रोटोकॉल में म्यूरिन लांग हड्डियों और अस्थि मज्जा अलगाव का विच्छेदन, अस्थि मज्जा मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए और मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक के रिसेप्टर उत्प्रेरक का उपयोग करने वाले अस्थिकोशीय उत्पादन कापा-बी लिगेद (RANKL) या ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) और विरोधी के द्वारा उनकी गिरफ्तारी सी-एफएमएस एंटीबॉडी, एम-सीएसएफ रिसेप्टर ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

अस्थि remodeling एक जटिल प्रक्रिया है और यह जमाव और अवशोषण की अवधि शामिल है । अस्थि अवशोषण एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा अस्थि अस्थिभंग विभिन्न उत्तेकणों के प्रत्युत्तर में हड्डी के नीचे टूट जाती है । अस्थिशोषक पुरोगामी मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और नाभिकीय कारक कापा-बी लिग्ड (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक के जवाब में मल्टीन्यूक्लियर ऑस्क्लेस्ट में अंतर । रोगविज्ञान की स्थिति के तहत, cytokine प्रोफ़ाइल अलग है और भड़काऊ cytokines का एक मिश्रण शामिल है । ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (tnf-α) सबसे महत्वपूर्ण साइटोकिंस में से एक के रूप में यह सूजन osteolysis के साथ शामिल क्षेत्रों में बड़ी मात्रा में पाया जाता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक विधि प्रदान करना है जिसके द्वारा म्यूरिन बोन मैरो को एम-सीएसएफ के साथ प्रेरण के माध्यम से अस्थिकलाएँ उत्पन्न करने के लिए अलग किया जाता है और या तो RANKL या TNF-α जो बाद में विरोधी की खुराक बढ़ाने से हिचकते हैं-सी-एफएमएस एंटीबॉडी, रिसेप्टर एम-सीएसएफ के लिए । यह प्रयोग भड़काऊ अस्थि अवशोषण के रोगों में एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के चिकित्सीय मूल्य पर प्रकाश डालता है ।

Introduction

अस्थिकोशिकाएँ अत्यधिक विशेषीकृत कोशिकाएं होती हैं, और वे कई अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के संलयन के माध्यम से टेम स्टेम कोशिकाओं से अंतर करते हैं । वे स्वस्थ अस्थि remodeling के लिए आवश्यक है और रोगग्रस्त अस्थि अवशोषण के लिए योगदान ऐसे रुमेटी गठिया और periodontal रोग के रूप में भड़काऊ अस्थिबहुलक रोगों के साथ जुड़े1

अस्थिकजनन और अस्थिशोषक फलन दो प्रमुख कारकों द्वारा मध्यस्थता किया जाता है; मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और नाभिकीय कारक कापा-ब लिगल (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक । दोनों एम-सीएसएफ और RANKL अस्थिशोषक भेदभाव2के लिए महत्वपूर्ण हैं । एक अन्य कारक जो अस्थि मज्जा मैक्रोफेज से अस्थिशोषक गठन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है विट्रो में ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (tnf-α)3,4,5है । tnf-α मध्यस्थता अस्थिप्रसू गठन के लिए हानिकारक अस्थि रोगों में अस्थिलयन के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है जैसे रुमेटी गठिया6, periodontal रोग7, और रजोनिवृत्ति उपरांत ऑस्टियोपोरोसिस8.

सी-एफएमएस एम-सीएसएफ की झिल्ली रिसेप्टर है और इसकी कार्रवाई मध्यस्थता करता है । सी-एफएमएस की भूमिका अच्छी तरह से साहित्य में प्रलेखित है के रूप में यह प्रदर्शन किया गया है कि सी के खिलाफ एक एंटीबॉडी के प्रशासन-fms (विरोधी सी-fms एंटीबॉडी) पूरी तरह से एक गठिया मॉडल में osteoclastogenesis के रूप में अच्छी तरह से TNF में गिरफ्तार-α प्रेरित अस्थि कटाव जबकि ऑस्टियोकनोजेनेसिस सूजन संयुक्त से दूर अभी भी मजबूत9था । विरोधी के प्रशासन-सी-एफएमएस एंटीबॉडी हिचकी ऑस्क्लेस्ट गठन और अस्थि अवशोषण के लिए लिपोपॉलीसैकेराइड (LPS) में माउस calvariae10 के रूप में अच्छी तरह के रूप में lps प्रेरित periodontitis मॉडल11. इसके अलावा, विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी के लिए यांत्रिक तनाव प्रेरित जड़ अवशोषण के दौरान ऑर्थोडोंटिक दांत आंदोलन12, साथ ही ऑर्थोडोंटिक दांत आंदोलन और हड्डी orthodontic दांत आंदोलन के साथ जुड़े अवशोषण13

एम-सीएसएफ को अन्य कार्यों के लिए सूचित किया गया है जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं. बैक्टीरियल निमोनिया के साथ सेशन/सेशन चूहों में एम-सीएसएफ की अनुपस्थिति यकृत परिगलन14के साथ बैक्टीरिया के बोझ और बैक्टीरिया के प्रसार को बढ़ाने के लिए नेतृत्व । इसलिए, M-csf संक्रमण से सुरक्षा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है ।

इस अध्ययन के प्रभाव को दर्शाता है एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी पर एम-सीएसएफ और RANKL या TNF-α विट्रो और M-सीएसएफ में विकलांग अस्थिशोषक गठन के साथ ही अस्थिशोषक व्यापारियों के प्रसार प्रेरित । यह प्रोटोकॉल लंबी हड्डियों से म्यूरिन अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अलगाव को दर्शाता है, और कदम अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (bmm) जो अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के रूप में माना जाता है और दो द्वारा मल्टीयूक्लियर ऑस्टेक्स्टस में bmm के भेदभाव को प्रेरित उत्पंन करने के लिए विधियों या तो RANKL या TNF-α । प्रोटोकॉल भी दोनों विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी का उपयोग करने के तरीकों में अस्थिसंजनन की गिरफ्तारी की तुलना ।

वह प्रक्रिया जिसके द्वारा अस्थि मज्जा निकाला जाता है और बाद में अस्थिशोषक पूर्ववर्ती उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, शुद्ध अस्थिप्रसू संस्कृतियों की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने में विश्वसनीय होता है, जो कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे औषध परीक्षण में उपयोग किया जा सकता है । या तो RANKL या TNF-α के उपयोग के इस प्रोटोकॉल में अस्थिकपटनजनन को प्रेरित करने के लिए एक रोगजनक प्रक्रिया (TNF-α), जो बारी में दो वैकल्पिक प्रक्रियाओं प्रदान करता है के रूप में एक फिजियोलॉजिकल प्रक्रिया (RANKL) के रूप में osteoclastogenesis अलग है गाइड वह निर्णय जिसमें से एक अभिकर्मक के संदर्भ में श्रेष्ठ है, अनुप्रवाह अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाना । इस प्रोटोकॉल को भी एक तरीका है जिसके द्वारा हम विरोधी के एक उपयुक्त एकाग्रता सी-fms एंटीबॉडी है कि सुरक्षित रूप से बाद में अस्थि अवशोषण और osteolytic रोगों में शामिल अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का निर्धारण कर सकते है प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं और पशु देखभाल Tohoku विश्वविद्यालय के नियमों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. म्यूरिन हिंदलिंब विच्छेदन और हैंडलिंग

  1. विच्छेदन से पहले, कंटेनर के आकार के आधार पर लगभग ५० मिलीलीटर α-मेम के साथ एक प्लेट भरें और इसे बर्फ पर रखें । यह सभी हड्डियों का विच्छेदन पूरा होने तक एक संग्रह कंटेनर के रूप में काम करेगा । इसके और बाद के प्रयोगों के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० IU/mL पेनिसिलिन जी, और १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त α-मेम का उपयोग करें ।
  2. 5% isoflurane की अधिक मात्रा की साँस लेने के द्वारा माउस C57Bl/
  3. एक स्पिन की स्थिति में माउस को ठीक हथेलियों और पैरों और ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से स्प्रे के माध्यम से छेदा पिन का उपयोग कर ।
  4. कूल्हे के स्तर पर बाँझ शल्य कैंची और चिमटी का उपयोग कर एक त्वचा चीरा बनाओ और मांसपेशियों को उजागर पैर करने के लिए इसे नीचे का विस्तार ।
  5. quadriceps मांसपेशी संलग्न कण्डरा और हड्डी के लिए दौडऩे मांसपेशी संलग्न कण्डरा काटें । छीलकर कूल्हे और घुटने के जोड़ों को उजागर करने वाली मांसपेशियां दूर करें । इन tendons का पता लगाने नरम ऊतक टैग छोड़ने के बिना अपने अनुलग्नकों से दोनों की मांसपेशियों को मुक्त करने में आसानी होगी । हड्डी में कटौती न करें ।
  6. फीमूर के सिर और संयुक्त स्थान के बीच कैंची की स्थिति और यह फेम्पर को मुक्त करने पर हड्डी को बरकरार रखने में कटौती । यह अस्थि मज्जा को उजागर करने के जोखिम के बिना हड्डियों की टुकड़ी सक्षम हो जाएगा ।
  7. इसी प्रकार टिबिया के लिए संलग्न मांसपेशियों को काट । टिबिया के टखने में अपने लगाव से मुक्त हड्डी को बरकरार रखने के संदूषण से बचने के संयुक्त ।
  8. कैंची ब्लेड और kimwipe का उपयोग कर फीम और टिबिया से किसी भी शेष नरम ऊतक परिमार्जन और इसे बर्फ पर रखा α-मेम के साथ एक थाली में जगह है ।

२. मॅरीन हिंदलिंब अस्थि मज्जा अलगाव

  1. α-मेम के साथ एक 30 ग्राम सुई सिरिंज भरें ।
  2. घुटने के जोड़ से टिबिया और फीमूर को दूर डिस्कनेक्ट करें ।
  3. कैंची का उपयोग करते हुए दोनों तरफ से लंबी हड्डी के सिरों को काट लें ।
  4. चिमटी का उपयोग कर शाफ्ट से हड्डी पकड़ो, हड्डी के मज्जा अंतरिक्ष में सुई डालने के लिए और धीरे से एक 6 सेमी संस्कृति डिश में मज्जा की सामग्री फ्लश । हड्डी सफेद दिखाई देगा, सभी अस्थि मज्जा सामग्री की निकासी का संकेत है । सभी हड्डियों के लिए दोहराएं ।
  5. एक ५० मिलीलीटर शंकु सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और 5 मिनट के लिए ३०० एक्स जी में सेंट्रीफ्यूज में एक ४० μm नायलॉन सेल छलनी का उपयोग कर अस्थि मज्जा निकालने तनाव ।
  6. supernatant छोड़ें, α-मेम के 5 मिलीलीटर के साथ धोने, और ३०० x g पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए. दोहराएं धोने के लिए कुल 2 बार ।
  7. α-मेम के 10 मिलीलीटर में गोली को पुनः भिजवाएं और एक हीमोसिटोमीटर का उपयोग करके एक कोशिका गणना निष्पादित करें:
    1. एक बार १.५ मिलीलीटर ट्यूब और पिपेट में ०.४% trypan ब्लू के 10 μL के लिए सेल निलंबन के 10 μL जोड़कर सेल निलंबन के एक 1:1 कमजोर बनाना ।
    2. एक स्लाइड कवर के साथ hemocytometer चैंबर को कवर और hemocytometer के लिए डाई निलंबन स्थानांतरण. यह महत्वपूर्ण है के लिए नहीं भर या कक्ष अवभरण और निलंबन की अनुमति केशिका कार्रवाई से चैंबर को भरने के लिए ।
    3. हीमोमाइक्रोमीटर को सूक्ष्मदर्शी स्तर पर रखें । 10x उद्देश्य का उपयोग करना, केंद्र स्क्वायर पर ध्यान केंद्रित । 3 पंक्तियों से बाउंड सभी कक्षों की गणना । यह सुनिश्चित करने के लिए कि कक्षों की दो बार गणना न की जाए, प्रत्येक वर्ग के ऊपरी और दाएँ कोनों की गणना करें. मृत कोशिकाओं गहरे नीले रंग दिखाई देगा, इन गिनती से बाहर रखा गया है ।
  8. डाउनस्ट्रीम आवेदन के आधार पर, एक उपयुक्त संस्कृति पोत में कोशिकाओं बीज । इस विशेष प्रयोग के लिए, धारा 3 का पालन करें ।

3. बीएमएम की पीढ़ी

  1. बीज 1 x 107 कोशिकाओं एक 10 सेमी संस्कृति डिश में 10 एमएल और एम-सीएसएफ १०० एनजी/एमएल जोड़ें । एम-सीएसएफ की अंतिम सांद्रता १०० एनजी/एमएल संस्कृति माध्यम है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते, 5% सह2 3 दिनों के लिए ।
  2. 3 दिनों के बाद, संस्कृति मध्यम निकालें, कोशिकाओं को तेजी से धो फॉस्फेट buffered खारा (PBS) के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार गैर आसंन कोशिकाओं को हटाने के लिए, कमरे के तापमान के 5 मिलीलीटर जोड़ें ०.०२% trypsin-पीबीएस में EDTA और ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते, 5% सह2 के लिए 5 मिनट ।
  3. पूरी तरह से पिख्ता द्वारा कोशिकाओं को अलग । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को एक खुर्दबीन के नीचे संस्कृति देख द्वारा अलग किया गया है (कोशिकाओं गोल और मीडिया में तैर दिखाई चाहिए) । यदि कक्ष संलग्न रहते हैं, तो उन्हें अलग करने के लिए अच्छी तरह से पिख्ता दोहराएँ. जब कोशिकाएं अलग हो गई हों, तो प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करने के लिए 5 मिलीलीटर α-मेम जोड़ें ।
  4. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में कोशिकाओं को ले लीजिए । अधिनतांत छोड़ दें, और α-मेम की 5 मिलीलीटर से धो लें ।
  5. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर सेंट्रीफ्यूज और α-मेम के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  6. पहले चरण 2.7.1 में वर्णित के रूप में कोई कक्ष संख्या निष्पादित करें ।
  7. बीज 1 x 106 कोशिकाओं/10 सेमी संस्कृति डिश में 10 मिलीलीटर और एम-सीएसएफ १०० एनजी/एमएल जोड़ें । एम-सीएसएफ की अंतिम सांद्रता १०० एनजी/एमएल संस्कृति माध्यम है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते, 5% सह2 3 दिनों के लिए ।

4. बीएमएम से अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के रूप में ऑस्टियोक्लोस्ट की पीढ़ी

  1. 3 दिनों के बाद, फसल संलग्न कोशिकाओं जो अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के रूप में bmm प्रतिनिधित्व करते हैं, 3.2-3.7 चरणों का पालन ।
  2. एक ९६ कूप प्लेट में 5 x 104 कोशिकाओं/α-मेम के 200 μl पर बीज बीएमएम । ५० एनजी/एमएल या TNF-α के अंतिम एकाग्रता के लिए १०० एनजी/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए RANKL जोड़ें । प्रत्येक कूप को १०० एनजी/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए एम-सीएसएफ जोड़ें ।
  3. विरोधी सी-fms एंटीबॉडी जोड़ें (0, 1, 10, १००, १००० एनजी/एमएल के अंतिम सांद्रता) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते, 5% सह2 4 दिनों के लिए । मीडिया बदलें हर दूसरे दिन के लिए 4 दिन ।

5. टार्ट्रेट-प्रतिरोधी अम्ल फॉस्फेट (TRAP) दाग

  1. ऊष्मायन के 4 दिनों के बाद, धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम से महाप्राण । कमरे के तापमान 1x PBS के २०० μL के साथ एक बार अच्छी तरह से धो लें ।
  2. 10% फार्मेलिन के २०० μl प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से निर्धारण के लिए जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए सेते । इस फार्मेलिन महाप्राण और प्रत्येक अच्छी तरह से धोने 3 बार विआयनीकृत पानी के साथ ।
  3. PBS में ०.२% Triton X-१०० की २०० μL जोड़ें प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से permeabilization और कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए सेते । इस triton एक्स-१०० महाप्राण और प्रत्येक अच्छी तरह से धोने 3 बार विआयनीकृत पानी के साथ ।
  4. एक अच्छी तरह से जाल दाग समाधान के २०० μL जोड़ें । माइक्रोस्कोप के नीचे दाग कल्पना । यह दाग को ठीक से विकसित करने के लिए 10-30 मिनट से ले जाएगा ।
  5. दाग को महाप्राण और एक अच्छी तरह से धोने के साथ विआयनीकृत पानी 3 बार, और हवा सूखी । आगे की निगरानी में उपयोग करने के लिए कमरे के तापमान पर रखें ।

6. प्रसार परख

  1. बीज BMM 5 x 103 कोशिकाओं/200 μl में α-मेम एक ९६ कूप थाली में अस्थिकलास्ट पूर्ववर्ती के रूप में । प्रत्येक कूप को १०० एनजी/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए एम-सीएसएफ जोड़ें ।
  2. विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी जोड़ें (अंतिम सांद्रता 0, 1, 10, १००, १,००० एनजी/एमएल) और मध्यम परिवर्तन के बिना 3 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 पर सेते ।
  3. 3 दिनों के बाद, 1x PBS के साथ कोशिकाओं को धो लें । एक अच्छी तरह से करने के लिए α-मेम के १०० μL जोड़ें ।
  4. सेल गिनती किट समाधान के 10 μL जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते, 2 ज के लिए 5% सह2 और ४५० एक microplate पाठक का उपयोग कर एनएम पर अच्छी तरह से के अवशोषण का निर्धारण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी की उपस्थिति में अस्थिशोषक गठन पर RANKL या TNF-α, और के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए अस्थिशोषक पुरोगामी प्रसार पर एम-सीएसएफ । इस प्रोटोकॉल में, हमने एक विश्वसनीय प्रक्रिया प्रदान की है जिसके द्वारा बड़ी मात्रा में शुद्ध अस्थिशोषक संस्कृतियों का सृजन होता है । हम भी विभिंन संस्कृति की स्थिति के तहत अस्थिभंग गठन बाधा के लिए विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी उपयुक्त एकाग्रता परीक्षण करने के लिए एक रास्ता प्रदान की है ।

एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ एम-सीएसएफ + RANKL संस्कृति में अस्थिशोषक गठन चित्रा 1में दिखाया गया है । 1, 10 एनजी/एमएल विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी में, नियंत्रण की तुलना में ऑस्फेक्स्ट की संख्या में कोई महत्वपूर्ण कमी थी (0 एनजी/एमएल) । जबकि १००, १,००० एनजी विरोधी सी-fms एंटीबॉडी में, वहां नियंत्रण की तुलना में ऑस्टिक्स्ट की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी थी । एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ एम-सीएसएफ + TNF-α संस्कृति में अस्थिशोषक गठन चित्रा 2में दिखाया गया है । 1 ng/mL एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी में, नियंत्रण (0 एनजी/एमएल) की तुलना में ऑस्फेक्स्ट की संख्या में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं थी । जबकि 10, १००, १,००० एनजी/एमएल एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी में, नियंत्रण की तुलना में ऑटिओक्लोस्ट की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी थी ।

एम-सीएसएफ + एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ अस्थिशोषक पुरोगामी संस्कृति चित्रा 3में दिखाया गया है । 1, 10, १०० एनजी/mL में, नियंत्रण की तुलना में अस्थिशोषक पूर्ववर्ती की संख्या में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं थी (0 एनजी/एमएल), जबकि १,००० एनजी/एमएल में, नियंत्रण की तुलना में अस्थिकलास्ट पूर्ववर्ती की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी थी । यह इंगित करता है कि १,००० एनजी/एमएल के रूप में उच्च के रूप में एक एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण अस्थिशोषक पुरोगामी के प्रसार को रोकना आवश्यक है ।

इन परिणामों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं RANKL के निर्माण में ऑटिओस्क्लेस्ट, जबकि ५० एनजी/एमएल के RANKL का एक एकाग्रता का इस्तेमाल किया गया था, और १०० एनजी/एमएल के TNF-α की एक ही संख्या प्राप्त करने के लिए की जरूरत थी ओस्क्लेस्ट । इन विधियों के दोनों अस्थिशोषक पीढ़ी के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन जो का निर्णय बेहतर है अभिकर्मकों के संदर्भ में डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग पर निर्भर करता है बाद में इस्तेमाल किया जाएगा । के रूप में परिणाम से संकेत मिलता है, RANKL का उपयोग TNF-α का उपयोग करने के लिए अस्थिकलाएं उत्पंन करने के बराबर नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम विरोधी clastogenesis को बाधित करने के लिए एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है, और परिणामों को देखकर, हम पाते है कि १०० की एकाग्रता एनजी/मिलीलीटर विरोधी सी-fms एंटीबॉडी के लिए rankl कुओं में अस्थिशोषक संख्या में महत्वपूर्ण कमी का उत्पादन करने की जरूरत थी । एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के १,००० एनजी/मिलीलीटर की एकाग्रता के लिए mcsf प्रसार परख में अस्थिशोषक अग्रदूत प्रसार रोकना आवश्यक था, जबकि केवल 10 एनजी/विरोधी की एक-सी-fms एंटीबॉडी की एकाग्रता के लिए अस्थिकलास्ट में महत्वपूर्ण कमी का उत्पादन करने की आवश्यकता थी TNF-α कुओं में संख्या ।

Figure 1
चित्रा 1: विरोधी के प्रभाव सी-एफएमएस एंटीबॉडी पर RANKL प्रेरित अस्थिकलास्ट गठन । अस्थिशोषक पूर्ववर्ती का सूक्ष्म प्रेक्षण जो एम-सीएसएफ, RANKL और एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी (0, 1, 10, १०० और १,००० एनजी/एमएल) की विभिन्न खुराक के साथ 4 दिनों के लिए इलाज किया गया था । कोशिकाओं को तय किया गया और जाल धुंधला के साथ दाग । ट्रैप पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या एम-सीएसएफ, RANKL और विरोधी के विभिंन सांद्रता सी-एफएमएस एंटीबॉडी (0, 1, 10, १०० और १,००० एनजी/एमएल) के साथ 4 दिनों के लिए सभ्य । कोशिकाओं को तय किया गया और जाल धुंधला के साथ दाग । ट्रैप पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या का आकलन किया गया । चार संस्कृतियों के माध्य ± S.D. के रूप में परिणाम व्यक्त किए गए । Scheffe के परीक्षणों का उपयोग करके सांख्यिकीय अंतरों का पता लगाया गया था (n = 4; * पी < ०.०१). स्केल पट्टियां = २०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2: TNF-α-प्रेरित अस्थिशोषक गठन पर विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी का प्रभाव । 4 दिनों के लिए गैर-सीएसएफ, टीएनएफ-α और एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी (0, 1, 10, १०० और १,००० एनजी/एमएल) की विभिन्न खुराक के साथ इलाज किया गया कि अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के सूक्ष्मदर्शी अवलोकन । कोशिकाओं को तय किया गया और जाल धुंधला के साथ दाग । 4 दिनों के लिए एम-सीएसएफ, टीएनएफ-α और एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी (0, 1, 10, १०० और १,००० एनजी/एमएल) की विभिन्न सांद्रता वाले ट्रैप पॉजिटिव सेल की संख्या । कोशिकाओं को तय किया गया और जाल धुंधला के साथ दाग । ट्रैप पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या का आकलन किया गया । परिणाम चार संस्कृतियों के meanv ± S.D. के रूप में व्यक्त किए गए । Scheffe के परीक्षणों का उपयोग करके सांख्यिकीय अंतरों का पता लगाया गया था (n = 4; * पी < ०.०१). स्केल पट्टियां = २०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3: विरोधी का प्रभाव सी-एफएमएस एंटीबॉडी के प्रसार पर अस्थिशोषक पूर्वगामी । अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के सेल व्यवहार्यता कि एम-सीएसएफ और विरोधी के विभिंन खुराक सी-एफएमएस एंटीबॉडी (0, 1, 10, १०० और १,००० एनजी/एमएल) के साथ इलाज किया गया 3 दिन के लिए । सेल काउंटिंग किट-8 का उपयोग व्यवहार्यता मापने के लिए किया गया था । डेटा को एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है जिसमें एम-सीएसएफ + एंटी-सी-एफएमएस युक्त कुओं की सापेक्ष गतिविधि की तुलना की जाती है, जिसमें एम-सीएसएफ अकेले होते हैं और चार संस्कृतियों के माध्य ± S.D. के रूप में व्यक्त किए जाते हैं । Scheffe के परीक्षणों का उपयोग करके सांख्यिकीय अंतरों का पता लगाया गया था (n = 4; * पी < ०.०१). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अध्ययन में, हम विरोधी के प्रभाव की जांच-सी-एफएमएस एंटीबॉडी पर RANKL-प्रेरित अस्थिशोषक गठन, TNF-α-प्रेरित अस्थिप्रसू गठन और एम-सीएसएफ प्रेरित अस्थिकलास्ट अग्रदूत प्रसार । हमने पाया कि विरोधी की प्रभावी राशि-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के बीच अस्थिकजनन के निषेध के लिए RANKL-प्रेरित अस्थिशोषक गठन, TNF-α विकलांग अस्थिकलास्ट गठन और अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के एम-सीएसएफ प्रेरित प्रसार अलग है ।

rankl इन विट्रो में एम-सीएसएफ की उपस्थिति में osteoclastogenesis, और रैंक-अशक्त चूहों के लिए15विकसित करने के लिए अस्थिकलाओं की विफलता के कारण गंभीर अस्थिपेशियों का अनुभव है, इस प्रकार rankl अस्थिकजनन के लिए एक अनिवार्य cytokine है और एक अस्थि होमियोस्टैसिस में महत्वपूर्ण विनियामक भूमिका । इसलिए, यदि RANKL प्रेरित अस्थिशोषक गठन नियंत्रित किया जा सकता है, अस्थि द्रव्यमान में कमी को नियंत्रित किया जा सकता है । हालांकि, अगर अत्यधिक दमन होता है, हड्डी homeostasis नहीं रखा जाएगा । इस प्रयोग में, हम बताते हैं कि एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी को उच्च सांद्रता १०० एनजी/एमएल में होने की जरूरत है जो कि रैंकल द्वारा प्रेरित अस्थिकलास्ट गठन में कमी कर सकता है ।

tnf-α मध्यस्थता अस्थिप्रसू गठन के लिए हानिकारक अस्थि रोगों में अस्थिलयन के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है जैसे रुमेटी गठिया6, periodontal रोग7, और रजोनिवृत्ति उपरांत ऑस्टियोपोरोसिस8 और यहां हम बताते है कि विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी आसानी से ऑस्टियोक्लेस्ट गठन को बाधित कर सकते है TNF-α द्वारा मध्यस्थता 10 एनजी/एमएल की कम एकाग्रता पर । परिणाम से पता चलता है कि विरोधी के एक कम एकाग्रता सी-एफएमएस एंटीबॉडी चिकित्सीय मूल्य की हो सकता है रोगविज्ञान की स्थिति में अस्थिकजनन की प्रक्रिया में कमी लेकिन सामांय परिस्थितियों में अस्थिकजनन पर ंयूनतम प्रभाव होगा ।

एम-सीएसएफ सेशन/सेशन चूहों के रूप में अस्थिशोषक गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, जो एम-सीएसएफ के लिए जीन कोडिंग Csf1 कमी के कारण ऑस्सोलोस्टस16के पूर्ण अभाव में एक अस्थिरोपेतिक phenotype दिखा एम-सीएसएफ भी अस्थिशोषक पुरोगामी2के अस्तित्व को बढ़ावा देता है । एम-सीएसएफ स्तर रुमेटोइड गठिया के साथ रोगियों के सीरम में वृद्धि हुई है जो गंभीर ankylosing स्पोंडिलाइटिस17 और ढीला संयुक्त कृत्रिम अंग18के आसपास श्लेष द्रव में है । tnf-α, stromal कोशिकाओं9में एम-सीएसएफ जीन अभिव्यक्ति उत्प्रेरण का एक परिणाम के रूप में विवो में अस्थिशोषक पूर्ववर्ती की संख्या बढ़ जाती है । इन आंकड़ों के आलोक में हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि एम-सीएसएफ, स्ट्रोमल कोशिकाओं पर टीएनएफ-α के प्रभाव के कारण सूजन का एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ है जिसके कारण इन कोशिकाओं से एम-सीएसएफ उत्पादन में वृद्धि होती है ।

यह सूचित किया गया है कि एम-सीएसएफ, निमोनिया14के दौरान फेफड़ों और यकृत मोनोन्यूक्लियर फेगोसाइट दोनों के रोगाणुरोधी कार्यों के रूप में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, अगर एम के अत्यधिक दमन-सीएसएफ होता है, वहां एक संभावना है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कम हो जाएगा । इस प्रयोग में, हमें पता चला कि विरोधी की एक बहुत उच्च एकाग्रता सी-fms एंटीबॉडी (१,००० एनजी/एमएल) के लिए अस्थिशोषक पुरोगामी अस्तित्व को रोकना और प्रसार एम-सीएसएफ द्वारा मध्यस्थता की जरूरत थी । ये पक्ष द्वारा पक्ष लिया परिणाम का सुझाव है कि विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी एक चिकित्सकीय के रूप में काम कर सकते है एक ही समय में इस एकाग्रता अतिरिक्त अस्थिभंग गठन से प्रेरित होगा TNF-α में ऑस्टियोफोलेसिस को गिरफ्तार करने के लिए कम एकाग्रता पर osteolytic रोगों RANKL और M-सीएसएफ जो हड्डी remodeling के लिए होने की अनुमति देगा ।

प्रयोग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकाल में महत्वपूर्ण कदमों को सावधानीपूर्वक निष्पादित करना होगा । जबकि विदारक प्रोटोकॉल की शुरुआत में, यह अस्थि मज्जा के संदूषण से बचने के लिए हड्डी में कटौती से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । अस्थि मज्जा निकालने की प्रक्रिया में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी अस्थि मज्जा निकाला गया है, निस्तब्धता प्रक्रिया के प्रति दोहराया जाना चाहिए जब तक सभी अस्थि मज्जा निकाला गया है, जो कोशिकाओं की एक उच्च उपज प्रदान करेगा. इस प्रोटोकॉल अभिकर्मक परीक्षण के रूप में कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों, में उपयोग किया जा सकता है, और यह भी एक तरीका है जिसके द्वारा विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी की एकाग्रता परीक्षण किया जा सकता है प्रदान करता है परिणामों की झूठी व्याख्या से परहेज । जैसा कि हम ने दिखाया, विरोधी के एकाग्रता-सी-एफएमएस एंटीबॉडी जो अस्थिशोषक गठन को बाधित करने की जरूरत थी विधियों के बीच नहीं है जिसके द्वारा ऑस्फेक्स्टस प्राप्त किया गया (RANKL या TNF-α), इस प्रकार विरोधी के एकाग्रता के संबंध में प्राप्त किसी भी परिणाम सी-एफएमएस है भविष्य में प्रयोगों की सावधानीपूर्वक जांच की जाए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को जापान सोसाइटी से विज्ञान (सं. सं.) के संवर्धन हेतु एक जेएसपीएस काकेनही अनुदान द्वारा अंशतः समर्थित किया गया । 16K11776 को एच. के., नहीं, 17K17306 के लिए के. एस., नहीं, 16K11776 के लिए के. के., no. 16K11776 से एम. एस., no. 18K09862 से आई. एम.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289, (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275, (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191, (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202, (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110, (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100, (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64, (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20, (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79, (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87, (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196, (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13, (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65, (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27, (4), 894-899 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics