Effekten av Anti-c-fms-antikropp på Osteoclast bildande och spridning av Osteoclast föregångare In Vitro

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll innehåller dissekering av murina långa ben och benmärg isolering, att generera benmärgen makrofager och producerar Osteoklasterna använder makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator av nuclear factor Kappa-B-ligand (RANKL) eller tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) och deras gripande av anti-c-fms-antikropp, M-CSF-receptorn.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Benremodellering är en komplex process och det innebär perioder av nedfall och resorption. Benresorption är en process genom vilken ben bryts ned av osteoklaster som svar på olika stimuli. Osteoclast prekursorer differentieras till multinukleära osteoklaster svar på makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator av nuclear factor Kappa-B-ligand (RANKL). Under patologiska förhållanden, cytokin profil är olika och innebär en blandning av inflammatoriska cytokiner. Tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) är en av de viktigaste cytokiner som det finns i stora mängder i områden med inflammatoriska Osteolys. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod genom vilken murina benmärg är isolerade för att generera osteoklaster genom induktion med M-CSF och RANKL eller TNF-α som därefter kommer att hämmas av ökande doser av anti-c-fms-antikropp, receptorn för M-CSF. Detta experiment belyser det terapeutiska värdet av anti-c-fms-antikroppar vid sjukdomar i inflammatoriska benresorption.

Introduction

Osteoklaster är högt specialiserade celler, och de skilja från hematopoetiska stamceller genom fusion av flera osteoclast prekursorer. De är viktiga för friska benremodellering och bidra till patologiska benresorption som är associerad med osteolytiska inflammationssjukdomar såsom reumatoid artrit och tandlossning1.

Osteoclastogenesis och osteoclast funktion förmedlas av två viktiga faktorer; makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator av nuclear factor kappa-B-ligand (RANKL). Både M-CSF och RANKL är viktiga för osteoclast differentiering2. En annan faktor som har visat sig framkalla osteoclast bildas från benmärgen makrofager in vitro-är tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α medierad osteoclast bildandet har visat sig vara avgörande för Osteolys i destruktiva skelettsjukdomar såsom reumatoid artrit6, tandlossning7och postmenopausal osteoporos8.

C-fms är membranet receptorn av M-CSF och förmedlar sin talan. Rollen som c-fms är väl dokumenterade i litteraturen som det visades att administrering av en antikropp mot c-fms (anti-c-fms antikropp) helt greps osteoclastogenesis i en artrit modell samt i TNF-α inducerade benet erosioner medan osteoclastogenesis fjärran från den inflammera leden var fortfarande robust9. Administrering av anti-c-fms antikropp hämmade osteoclast bildandet och ben resorption induceras av lipopolysackarid (LPS) i mus calvariae10 samt för liksom LPS-inducerad parodontit modell11. Dessutom inhiberad anti-c-fms antikropp mekaniska stressinducerade root resorption under Tandregleringstjänster tand rörelse12, liksom Tandregleringstjänster tand rörelse och benresorption kopplad Tandregleringstjänster tand rörelse13.

M-CSF har rapporterats ha andra funktioner som är väsentliga för värd immunsvaret. Avsaknad av M-CSF i op/op möss med bakteriell lunginflammation leda till en ökning av bakteriell börda och bakteriell spridning till levern med levernekros14. M-CSF är därför viktigt för immunologisk reaktion i skyddet från infektion.

Denna studie visar effekten av anti-c-fms-antikropp på M-CSF och RANKL eller TNF-α inducerad osteoclast bildande in vitro- och M-CSF inducerad spridning av osteoclast prekursorer. Detta protokoll visar isolering av murina benmärgsceller från långa ben, och stegen att generera benmärgen makrofager (BMM) som betraktas som osteoclast prekursorer och inducerar differentiering av BMM in multinukleära Osteoklasterna av två metoder; RANKL eller TNF-α. Protokollet jämför också arresteringen av osteoclastogenesis i båda metoderna med anti-c-fms antikroppen.

Processen genom vilken benmärg extraheras och sedan används för att generera osteoclast prekursorer är tillförlitlig i producerar stora kvantiteter av ren osteoclast kulturer som kan användas i flera nedströms tillämpningar som drogtester. Användning av antingen RANKL eller TNF-α att inducera osteoclastogenesis i detta protokoll skiljer osteoclastogenesis som en fysiologisk process (RANKL) från osteoclastogenesis som en patologisk process (TNF-α), som i sin tur ger två alternativa förfaranden för att vägleda beslut av vilka en är överlägsen när det gäller reagenserna som ska användas i efterföljande program. Detta protokoll ger också en metod genom vilken vi kan bestämma en lämplig koncentration av anti-c-fms-antikropp som kan användas säkert för senare studier involverade i benresorption och osteolytiska sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden för djur och Djurvård utfördes enligt Tohoku University regler och föreskrifter.

1. murina bakbenet dissektion och hantering

  1. Innan dissektion, Fyll en tallrik med ca 50 mL av α-MEM beroende på storleken på behållaren och placera den på is. Detta kommer att fungera som en samling behållare tills dissektion av alla ben är klar. För detta och efterföljande använda experiment, α-MEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 IE/mL penicillin G och 100 μg/mL streptomycin.
  2. Euthanize C57Bl/6J mus vid inandning av en överdos av 5% isofluran.
  3. Fixa musen i ryggläge med pinnarna genomborrat palms och fötter och spraya noggrant med 70% etanol.
  4. Gör en huden snitt med sterila kirurgiska saxar och pincetter i nivå med höften och utvidga det ner till fötterna utsätta musklerna.
  5. Skär senan fästa i quadriceps-muskeln och senan fästa hamstring muskeln till skelettet. Skala bort musklerna utsätta både höft och knäled. Att lokalisera dessa senor lättar att frigöra både muskler från deras bilagor utan att lämna mjukvävnad Taggar. Skär inte in i benet.
  6. Placera saxen mellan huvudet av lårbenet och det gemensamma utrymmet och skär i det att frigöra lårbenet men hålla benet intakt. Detta aktiverar avlossning av ben utan att riskera att utsätta benmärgen.
  7. På samma sätt skära bort musklerna fästa till skenbenet. Skär skenbenet fri från dess fastsättning vid fotleden att hålla benet intakt att undvika kontaminering.
  8. Skrapa någon återstående mjuk vävnad från lårben och skenben med hjälp av sax blad och kimwipe och placera den i en tallrik med α-MEM placeras på is.

2. murina bakbenet benmärgen isolering

  1. Fyll en 30 G nål spruta med α-MEM.
  2. Koppla bort skenbenet och lårbenet från knäleden.
  3. Klipp ändarna på långa ben från båda sidor med sax.
  4. Håll benet från axeln med hjälp av pincett, Stick in nålen i benmärg utrymmet av ben och långsamt spola innehållet i märgen i en skål med 6 cm i kultur. Benet visas vit, som anger utvinning av alla benmärgen innehåll. Upprepa för alla ben.
  5. Stam benmärgen extrakt med en 40 μm nylon cell sil till en 50 mL konisk centrifugrör och centrifugera vid 300 x g under 5 minuter.
  6. Tag bort supernatanten, tvätta med 5 mL av α-MEM och centrifugera 300 x g för 5 min. Upprepa tvätt för totalt 2 gånger.
  7. Återsuspendera pelleten i 10 mL av α-MEM och utför en cell sammanräkning med en hemocytometer enligt följande:
    1. Gör en 1:1 utspädning av cellsuspensionen genom att lägga till 10 μl cellsuspension 10 μL av 0,4% trypan blå i en 1,5 mL tub och Pipettera en gång.
    2. Täck hemocytometer kammaren med en Skjutlucka och överför färg till hemocytometer. Det är viktigt att inte överfyllnad eller underfill kammaren och tillåta fjädringen att fylla kammaren genom kapillärkraft.
    3. Placera hemocytometer på en Mikroskop scenen. Använder 10 x mål, fokusera på centrum torget. Räkna alla celler bunden av 3 rader. Kontrollera att cellerna inte räknas två gånger, räknas den övre och högra hörnen av varje ruta. Döda celler visas mörkblå, dessa är undantagna från greven.
  8. Beroende på programmet nedströms utsäde cellerna in en lämplig kultur kärlet. För detta särskilda experiment, Följ avsnitt 3.

3. generation av BMM

  1. Frö 1 x 107 celler/10 mL i en 10 cm kultur skålen och tillsätt M-CSF 100 ng/mL. Den slutliga koncentrationen av M-CSF är 100 ng/mL odlingsmedium. Inkubera kulturen vid 37 ° C, 5% CO2 i 3 dagar.
  2. Efter 3 dagar, ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna med 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger för att ta bort icke-anhängare celler, tillsätt 5 mL av rumstemperatur 0,02% trypsin-EDTA i PBS och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 5 min.
  3. Lossa cellerna genom grundlig pipettering. Kontrollera att cellerna har varit fristående genom att observera kulturen i Mikroskop (cellerna ska visas rundade och flytande i media). Om cellerna sitta kvar, upprepa pipettering grundligt för att lossa dem. När cellerna har varit fristående, tillsätt 5 mL av α-MEM att inaktivera reaktionen.
  4. Samla in cellerna i en 50 mL konisk rör och centrifugera vid 300 x g för 5 min. Kassera supernatanten och tvätta med 5 mL av α-MEM.
  5. Centrifugera vid 300 x g i 5 min och återsuspendera pelleten i 10 mL av α-MEM.
  6. Utföra en cell sammanräkning som tidigare beskrivs i steg 2.7.1.
  7. Frö 1 x 106 celler/10 mL i en 10 cm kultur skålen och tillsätt M-CSF 100 ng/mL. Den slutliga koncentrationen av M-CSF är 100 ng/mL odlingsmedium. Inkubera kulturen vid 37 ° C, 5% CO2 i 3 dagar.

4. generation av osteoklaster från BMM som Osteoclast prekursorer

  1. Efter 3 dagar, skörda bifogade cellerna som företräder BMM som osteoclast prekursorer, efter steg 3.2-3.7.
  2. Utsäde BMM på 5 x 104 celler/200 μL av α-MEM i en 96 väl platta. Lägga till RANKL för en slutlig koncentration på 50 ng/mL eller TNF-α för en slutlig koncentration på 100 ng/mL. Lägg till M-CSF för en slutlig koncentration på 100 ng/mL till varje brunn.
  3. Lägger till anti-c-fms-antikropp (slutliga koncentrationer av 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) till varje brunn.
  4. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 i 4 dagar. Ändra media varannan dag i 4 dagar.

5. tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) fläcken

  1. Efter 4 dagars inkubation, aspirera försiktigt odlingssubstratet i varje brunn. Tvätta vart väl en gång med 200 μL av rumstemperatur 1 x PBS.
  2. Tillsätt 200 μl 10% formalin till varje brunn för fixering och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Aspirera i formalin och tvätta varje brunn 3 gånger med avjoniserat vatten.
  3. Tillsätt 200 μl av 0,2% Triton x-100 i PBS till varje brunn för permeabilisering och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Aspirera på Triton x-100 och tvätta varje brunn 3 gånger med avjoniserat vatten.
  4. Tillsätt 200 μl fälla fläcken lösning till varje brunn. Visualisera fläcken under mikroskopet. Det kommer att ta 10-30 min för fläcken att utvecklas ordentligt.
  5. Aspirera på fläcken och tvätta varje brunn med avjoniserat vatten 3 gånger och lufttorka. Förvara i rumstemperatur att använda i ytterligare observation.

6. proliferation Assay

  1. Utsäde BMM som osteoclast prekursorer på 5 x 103 celler/200 μL av α-MEM i en 96 väl platta. Lägg till M-CSF för en slutlig koncentration på 100 ng/mL till varje brunn.
  2. Lägger till anti-c-fms-antikropp (slutliga koncentrationer av 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 i 3 dagar utan medium förändring.
  3. Efter 3 dagar, tvätta cellerna med 1 x PBS. Tillsätt 100 μL av α-MEM till varje brunn.
  4. Tillsätt 10 μL av cell räknar kit lösning och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 2 h och bestäm absorbansen hos varje brunn vid 450 nm med en microplate reader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Syftet med detta protokoll är att utvärdera effekten av anti-c-fms-antikropp på osteoclast bildas i närvaro av RANKL eller TNF-α och att avgöra effekten av M-CSF på osteoclast prekursorer spridning. I detta protokoll, har vi tillhandahållit en tillförlitlig process genom vilken stora mängder ren osteoclast kulturer genereras. Vi har också gett ett sätt att testa lämplig anti-c-fms antikroppskoncentration för att hämma osteoclast bildandet under olika odlingsbetingelser.

Osteoclast bildandet i M-CSF + RANKL kultur med anti-c-fms antikropp visas i figur 1. 1, 10 ng/mL anti-c-fms-antikropp, det fanns ingen signifikant minskning av antalet osteoklaster jämfört med kontroll (0 ng/mL). Samtidigt 100, 1000 ng anti-c-fms-antikropp, fanns det en betydande minskning av antalet osteoklaster jämfört med kontrollgruppen. Osteoclast bildandet i M-CSF + TNF-α kultur med anti-c-fms antikropp visas i figur 2. På 1 ng/mL anti-c-fms-antikropp fanns det ingen signifikant minskning av antalet osteoklaster jämfört med kontroll (0 ng/mL). Tag 10, 100, 1000 ng/mL anti-c-fms-antikropp, fanns det en betydande minskning av antalet osteoklaster jämfört med kontrollgruppen.

Osteoclast prekursorer kultur med M-CSF + anti-c-fms antikropp visas i figur 3. På 1, 10 eller 100 ng/mL, det fanns ingen signifikant minskning av antalet osteoclast prekursorer jämfört med kontroll (0 ng/mL), medan vid 1000 ng/mL, fanns det en betydande minskning av antalet osteoclast prekursorer jämfört med kontrollgruppen. Detta indikerar att en koncentration som är så högt som 1000 ng/mL för att hämma spridning av osteoclast prekursorer betydligt.

Dessa resultat ger information om robust karaktär av RANKL i producerar Osteoklasterna medan en koncentration av 50 ng/mL av RANKL användes, och en koncentration på 100 ng/mL av TNF-α behövdes för att få samma antal osteoklaster. Båda dessa metoder är lämpliga för osteoclast generation men beslut som är överlägsen beror på nedströms tillämpningen inom ramen av reagenser ska användas senare. Som resultaten visar, är med hjälp av RANKL inte motsvarande med TNF-α för att generera osteoklaster.

I detta protokoll, vi använde anti-c-fms-antikropp som hämmar osteoclastogenesis och genom att titta på resultaten, finner vi att en koncentration på 100 ng/mL anti-c-fms antikropp behövdes för att producera betydande minskning av osteoclast nummer i RANKL brunnar. En koncentration av 1 000 ng/mL anti-c-fms antikropp behövdes för att hämma osteoclast föregångare spridning i MCSF proliferation assay, medan en koncentration av endast 10 ng/mL av anti-c-fms antikropp behövdes för att producera betydande minskning hos Osteoklasterna nummer i TNF-α brunnar.

Figure 1
Figur 1: effekten av anti-c-fms-antikropp på bildandet av RANKL-inducerad osteoclast. Mikroskopisk observation av osteoclast prekursorer som behandlades med M-CSF, RANKL och olika dos anti-c-fms-antikropp (0, 1, 10, 100 och 1000 ng/mL) i 4 dagar. Cellerna var fixeras och färgas med fälla färgning. Antal TRAP-positiva celler odlade med M-CSF, RANKL och olika koncentrationer av anti-c-fms-antikropp (0, 1, 10, 100 och 1000 ng/mL) i 4 dagar. Cellerna var fixeras och färgas med fälla färgning. Antalet TRAP-positiva celler bedömdes. Resultaten uttrycktes som medelvärde ± S.D. av fyra kulturer. Statistiska skillnader upptäcktes med hjälp av Scheffes tester (n = 4; * p < 0,01). Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: effekt av anti-c-fms-antikropp på bildandet av TNF-α-inducerad osteoclast. Mikroskopisk observation av osteoclast prekursorer som behandlades med M-CSF, TNF-α och olika dos anti-c-fms-antikropp (0, 1, 10, 100 och 1000 ng/mL) i 4 dagar. Cellerna var fixeras och färgas med fälla färgning. Antal TRAP-positiva celler odlade med M-CSF, TNF-α och olika koncentrationer av anti-c-fms-antikropp (0, 1, 10, 100 och 1000 ng/mL) i 4 dagar. Cellerna var fixeras och färgas med fälla färgning. Antalet TRAP-positiva celler bedömdes. Resultaten var uttryckt som meanv ± S.D. av fyra kulturer. Statistiska skillnader upptäcktes med hjälp av Scheffes tester (n = 4; * p < 0,01). Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: effekt av anti-c-fms-antikropp på spridning av osteoclast föregångare. Cell livskraft hos Osteoklasterna prekursorer som behandlades med M-CSF och olika dos av anti-c-fms-antikropp (0, 1, 10, 100 och 1000 ng/mL) i 3 dagar. Cell räknar kit-8 användes för att mäta lönsamhet. Data presenteras som en procentsats för att jämföra den relativa aktiviteten av brunnar innehåller M-CSF + anti-c-fms kontra brunnarna innehåller M-CSF ensam och uttryckt som menar ± S.D. av fyra kulturer. Statistiska skillnader upptäcktes med hjälp av Scheffes tester (n = 4; * p < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie undersökt vi effekten av anti-c-fms-antikropp på RANKL-inducerad osteoclast bildandet, TNF-α-inducerad osteoclast bildning och M-CSF-inducerad osteoclast föregångare spridning. Vi fann att den effektiva mängden anti-c-fms antikropp för hämning av osteoclastogenesis bland RANKL-inducerad osteoclast bildandet, TNF-α inducerad osteoclast bildandet och M-CSF-inducerad spridning av osteoclast prekursorer är olika.

RANKL förmedlar osteoclastogenesis i närvaro av M-CSF in vitro- och rang-null möss upplever svår osteopetros på grund av osteoklaster att utveckla15, således RANKL är en obligatorisk cytokin för osteoclastogenesis och har en viktig reglerande roll i ben homeostas. Därför, om RANKL-inducerad osteoclast bildandet kan kontrolleras, minskningen i ben massa kan styras. Om överdriven dämpning inträffar, kommer dock ett ben homeostas inte bibehållas. I detta experiment visar vi att anti-c-fms-antikropp behöver vara vid hög koncentration 100 ng/mL för att kunna minska osteoclast bildandet induceras av RANKL.

TNF-α medierad osteoclast bildandet har visat sig vara avgörande för Osteolys i destruktiva ben sjukdomar såsom ledgångsreumatism6, tandlossning7och postmenopausal osteoporos8 och här visar vi att anti-c-fms antikroppar kan enkelt hämmar osteoclast bildandet medieras av TNF-α i en låg koncentration av 10 ng/mL. Resultatet tyder på att en låg koncentration av anti-c-fms antikropp kan vara av terapeutiskt värde att minska processen för osteoclastogenesis i patologiska förhållanden men skulle ha minimal inverkan på osteoclastogenesis i normala förhållanden.

M-CSF är en nyckelfaktor för osteoclast bildande som op/op möss som saknar Csf1 genen kodar för M-CSF Visa en osteopetrotic fenotyp på grund av total avsaknad av osteoklaster16. M-CSF främjar också överlevnaden av osteoclast prekursorer2. M-CSF nivåer höjs i serum hos patienter med reumatoid artrit som har svår ankyloserande spondylit17 och i ledvätskan runt lös gemensamma protes18. TNF-α ökar antalet osteoclast prekursorer i vivo till följd av inducerande M-CSF genuttryck i stromaceller9. Mot bakgrund av dessa uppgifter kan vi konstatera att M-CSF är en viktig mediator av inflammation på grund av effekterna av TNF-α på stromaceller som orsakar en ökning i M-CSF produktionen från dessa celler.

Det har rapporterats att M-CSF spelar en viktig roll i värd immunsvar såsom antimikrobiella funktioner både lungorna och levern mononukleära fagocyter under pneumoni14. Därför, om överdriven dämpning av M-CSF uppstår, finns det en möjlighet att immunsvaret kommer att minska. I detta experiment visade vi att det behövdes en mycket hög koncentration av anti-c-fms-antikropp (1000 ng/mL) för att hämma osteoclast prekursorer överlevnad och spridning som medieras av M-CSF. Dessa resultat tagit sida vid sida tyder på att anti-c-fms-antikropp kan fungera som ett terapeutiskt att arrestera osteoclastogenesis i TNF-α inducerade osteolytiska sjukdomar vid låg koncentration, på samma gång denna koncentration kommer att bespara osteoclast bildandet induceras av RANKL och M-CSF som möjliggör ben remodeling för att uppstå.

Kritiska steg i protokollet måste göras noggrant för att säkerställa framgång för experimentet. I början av protokollet medan dissekera är det viktigt att undvika skärning i benet att undvika kontaminering av benmärgen. Håller på att utvinna benmärg, för att säkerställa att alla benmärg har utvunnits, rodnad förfarandet upprepas behövs tills alla benmärg har utvunnits, som ger en hög avkastning av celler. Detta protokoll kan utnyttjas i flera efterföljande program, såsom reagens testning, och det ger också ett sätt genom vilket koncentrationen av anti-c-fms antikropp kan testas att undvika falska tolkning av resultaten. Som vi visade, koncentrationen av anti-c-fms-antikropp som behövdes för att hämma osteoclast bildandet är inte lika bland metoderna genom vilka osteoklaster erhölls (RANKL eller TNF-α), har således alla resultat som erhållits när det gäller koncentrationen av anti-c-fms för att vara noggrant undersökt i framtiden experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds delvis av en JSPS KAKENHI bevilja från Japan Society för främjande av vetenskap (nr 16K 11776 till H. K., nr 17K 17306 till K. S., No. 16K 20637 till K. K., No. 16K 20636 till M. S., No. 18K 09862 till I. M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289, (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275, (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191, (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202, (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110, (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100, (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64, (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20, (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79, (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87, (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196, (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13, (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65, (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27, (4), 894-899 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics