محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

عزل خلية acinar الأساسي والبروتين التحوير التعبير أو النشاط، الثقافة وتطبيقات تيار أسفل مفيدة تماما في السابق دراسة فيفو حؤول acinar للأقنية (ADM)، حدث مبكرا في الإصابة بسرطان البنكرياس.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fleming Martinez, A. K., Storz, P. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e59096, doi:10.3791/59096 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التفريق بين الخلايا أسينار إلى خلايا الأقنية خلال التهاب البنكرياس وفي التطور المبكر لسرطان البنكرياس هو عملية رئيسية التي تتطلب مزيدا من الدراسة. لفهم الآليات التي تنظم حؤول acinar للأقنية (ADM)، السابقين فيفو ثقافة 3D وتمايز الخلايا أسينار الأولية لخلايا الأقنية يوفر مزايا عديدة أكثر النظم الأخرى. مع تقنية هنا، تعديل التعبير البروتين بسيطة وسريعة، التي تتطلب يوما واحداً فقط عزل وحفز أو فيروسي يصيب، والبدء في استزراع خلايا أسينار الأولية للتحقيق في عملية ADM. وعلى النقيض من استخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي، بذر مجموعات خلية acinar في الكولاجين أنا المصفوفة خارج الخلية، يسمح أسينار الخلايا الاحتفاظ بهويتهم acinar قبل التلاعب. وهذا أمر حيوي عند اختبار إسهام مختلف مكونات لاستحثاث اﻷدميرال ليس فقط هي آثار السيتوكينات أو غيرها من العوامل التي تدار اكتوبيكالي قابل للاختبار من خلال هذا الأسلوب، ولكن مساهمة مشتركة الطفرات أو تعبير البروتين زيادة أو ضربة قاضية للتعبير البروتين قابل للاختبار عن طريق العدوى الفيروسية الخلايا الأولية أسينار، باستخدام ناقلات أدينوفيرال أو لينتيفيرال. وعلاوة على ذلك، يمكن إعادة عزل من الكولاجين أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي في نقطة النهاية الخلايا وتحليلها للتعبير البروتين.

Introduction

حؤول Acinar للأقنية (ADM) هو إليه وقائية أثناء التهاب البنكرياس وعملية رئيسية يقود التنمية سرطان البنكرياس1 الذي يحتاج إلى مزيد من التبصر آليا. بينما ADM التي يسببها التهاب عكسها2، النمطان كراس الطفرات، التي موجودة في 90% من حالات سرطان البنكرياس3، منع التفريق إلى النمط الظاهري أسينار4،5، 6-كولتورينج والتفريق بين الخلايا أسينار الأولية في خلايا الأقنية في الثقافة 3D يسمح لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم عملية ADM، مما يصعب من الدراسة المجراة في. مثل السابقين فيفو الدراسات تمكن في الوقت الحقيقي التصور ADM وسائقيها والمنظمين لها. تم تحديد العديد من برامج تشغيل عملية ADM، فضلا عن بصيرة آليا على هذه المسارات مما يشير إلى المصب، أو التحقق من استخدام هنا وصف الأسلوب. تشمل هذه ADM التعريفي ب TGF-α (تحويل عامل النمو ألفا)-بوساطة التعبير عن نظام التمثيل التناسبي المختلط-7 (مصفوفة أية-7) والتنشيط من الدرجة7، فضلا عن رنتيس (ينظم في التنشيط، الخلية تي العادية وأعرب ويفرز؛ أيضا معروفة كما يجند chemokine 5 أو CCL5) و TNFα (عامل نخر الورم ألفا)-التي يسببها ADM من خلال تفعيل NF-κB (النووية عامل-κB)8. وسيط إضافي ل ADM هي النمطان كراس9،10، مما يسبب ارتفاعا في الأكسدة التي تعزز عملية ADM من خلال زيادة التعبير عن EGFR (مستقبلات عامل نمو البشرة) ويغاندس، ولو ( عامل نمو البشرة) و TGF-α11.

وفي حين يشيع استخدام خطوط خلايا سرطان البنكرياس للدراسات في المختبر، الثقافات الخلية الابتدائية تقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال، خلايا acinar الأولية من الفئران غير المعدلة وراثيا أو الفئران إيواء الطفرات المبادر، مثل كراسG12D، هي النموذج الأنسب لدراسة هذا الحدث بداية من ADM لأن الخلايا الطفرات القليلة والخاضعة للرقابة، التي من المعروف أن يكون حاضرا في بداية التنمية سرطان البنكرياس. هذا على النقيض من ذلك أن العديد من خطوط خلايا سرطان البنكرياس التي لديها طفرات متعددة ويختلف التعبير استناداً إلى الممر رقم12. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من مسارات الإشارات المحددة بهذه الوسائل من الدراسات الحيوانية. أحد المحاذير من استخدام الخلايا acinar الأولية أنهم لا ترانسفيكتيد خطوط خلايا السرطان نموذجية يمكن.

الطريقة الواردة هنا تفاصيل تقنيات خلية أسينار العزلة والثقافة 3D الذي يحاكي ADM بإضافة المنشطات أو تحوير التعبير البروتين عن طريق العدوى أدينوفيرال أو لينتيفيرال، فضلا عن إعادة عزل الخلايا في نقطة النهاية لمزيد من التحليلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأقر جميع أعمال الحيوان IACUC عيادة مايو كلينيك.

1-إعداد مواد وحلول وقواعد مصفوفة ثلاثية الأبعاد

  1. خفض 500 ميكرومتر و 105 ميكرون تنسجم والبولي بروبيلين إلى 76 ملم بالساحات 76 ملم. أمثال كل مربع نصف مرتين لإنشاء ساحة صغيرة مطوية. مكان واحد 500 ميكرومتر وميكرومتر واحد 105 مش مربعة في حقيبة أوتوكلافابل.
  2. بولي بروبلين اﻷوتوكﻻف مش المربعات، فضلا عن اثنين من أزواج من المقص والملقط.
  3. جعل 100 مل 10 × الحل وايموث. إثارة قنينة 1 (14 جرام) من المسحوق في وايموث في 50 مل مياه (دي)، وعند حله، إضافة 30 مل بيكربونات الصوديوم 7.5% (75 غرام/لتر). إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 100 مل دي باستخدام المياه وتعقيم عامل التصفية.
    1. وسائط تخزين 10 x Waymouth في 4 درجات مئوية واستخدامها لإعداد المواد الهلامية الكولاجين ووسائل الإعلام ل 1 x وايموث. عندما رواسب النموذج، تجاهل.
  4. جعل 50 مل 1 × وسائط كاملة وايموث في الواحدة والبنكرياس بإضافة 125 ميليلتر من 40 مغ/مل فول الصويا التربسين مثبط و 12.5 ميليلتر من الديكساميتازون 4 مغ/مل 500 ميليلتر من مصل البقر الجنين (FBS). تعقيم بالترشيح واستخدامها ضمن ح 48.
  5. إعداد قواعد مصفوفة ثلاثية الأبعاد باستخدام مصفوفة أما الكولاجين أو الغشاء الطابق السفلي (انظر "الجدول للمواد" للحصول على معلومات المنتج). عندما بيبيتينج القاعدة، وضع اللوحة على الجليد وتجنب فقاعات، وتدوير اللوحة فور بيبيتينج حجم كل بئر لضمان التغطية الكاملة.
    1. إنشاء القواعد الكولاجين بخلط المكونات التالية على الجليد في غطاء زراعة الأنسجة: 5.5 مل نوع أنا فأر الذيل الكولاجين وميليلتر 550 من 10 × وسائل الإعلام وايموث، و 366.6 ميليلتر من 0.34 من هيدروكسيد الصوديوم M (تصفية).
      ملاحظة: هذا الحل ما يكفي لجعل قواعد الكولاجين للوحة 24-جيدا، 12-جيدا، أو 6-بئر واحدة. لوحة واحدة غير كافية لعزل أسينار من بنكرياس واحد.
    2. استخدام وحدات التخزين التالية للوحة قاعدة الكولاجين: 80 ميليلتر (الشريحة الزجاجية 8-جيدا) أو 200 ميليلتر (24-جيدا لوحة)، 400 ميليلتر (لوحة 12-جيدا) أو 800 ميليلتر (لوحة 6-جيدا).
    3. للغشاء قواعد مصفوفة، بيبيت المصفوفة دون أي مكونات إضافية. استخدام وحدات التخزين التالية لكل بئر: 50 ميليلتر (الشريحة الزجاجية 8 آبار)، 120 ميليلتر (24-جيدا لوحة)، 240 ميليلتر (12-جيدا لوحة)، أو 600 ميليلتر (لوحة 6-جيدا).
    4. واسمحوا أسس ترسيخ لمالا يقل عن 30 دقيقة في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2) قبل إنشاء طبقة ثانية من المصفوفة مع الخلايا المضمنة على رأس هذه القواعد (الخطوة 4).
  6. تمهيدا لعزله acinar تبقى واحدة 600 مل كوب، ثلاث أنابيب 50 مل، على زوج يعقم المقص وزوج يعقم ملقط دلو الجليد تحت غطاء محرك السيارة مع ثلاثة قوارب لوزن. ثم جعل 30 مل حبس مع 300 ميليلتر من 100 x البنسلين والستربتوميسين، وضع 10 مل في كل واحد من اثنين من قوارب تزن وإبقاء 10 مل النهائي في أنبوب 50 مل (للاستخدام في الخطوات 1.8.2 و 2.1.4).
  7. جعل 40 مل من حبس + 5% FBS، 20 مل حبس + 30% FBS، و 5 مل من كولاجيناز 2 مغ/مل في حبس. تعقيم كولاجيناز عن طريق الترشيح (0.22 ميكرومتر المسامية) وتبقى في درجة حرارة الغرفة. الاحتفاظ بكل من الحلول التي حبس على الجليد.
  8. تجميع مساحة لتشريح البنكرياس، الذي يمكن القيام به على مقاعد البدلاء مختبر.
    1. مكان جهاز pad ماصة على الطاولة، جنبا إلى جنب مع غطاء البوليستيرين المشمولة في إحباط. ثم ضع منشفة ورقية مع 4 دبابيس فوق إحباط.
    2. تبقى العناصر التالية متناول تشريح مساحة العمل: وجود حقيبة حرق ومجموعة واحدة من يعقم المقص والملقط زجاجة رذاذ مع الإيثانول 70% دلو الجليد (مع أنبوب 50 مل من حبس المحتوية على البنسلين-ستربتوميسين من الخطوة 1، 6).
  9. مجموعة من أجهزة الطرد مركزي إلى 4 درجات مئوية وشاكر إلى 37 درجة مئوية.

2-عزل الخلية أسينار

  1. التضحية بالماوس عن طريق الاستقراء2 CO، والقيام بخلع عنق الرحم. تشريح البنكرياس فورا. تشريح البنكرياس، دبوس أول آثار أقدام الماوس للغطاء البوليستيرين، وتوجيه الماوس مثل أن يواجه الذيل الباحث، ورذاذ البطن مع الإيثانول 70%.
    ملاحظة:
    الماوس المستخدمة في نتائج الممثل كان أنثى غير المعدلة وراثيا 12-أسبوع قديمة مع خلفية C57BL/6. تحديد الماوس مزيد من المناقشة في جزء المناقشة.
    1. استخدام مجموعة من يعقم المقص والملقط، رفع الفراء/الجلد بالملقط في خط الوسط واستخدام المقص جعل شق عن طريق الفراء والجلد من افتتاح الاحليل إلى منطقة الحجاب الحاجز/القفص الصدري.
    2. جعل شقوق إضافية إلى اليسار واليمين مثل أن يتم قطع الجلد/الفراء بعيداً لإنشاء طريقة عرض واضح تجويف البطن. ثم يقتطع بطانة البريتوني (أسفل الوسط واليمين واليسار) وتسحبه بعيداً عن الأجهزة، كما كان الحال مع الجلد/الفراء.
    3. رفع الأمعاء الملقط ووضعه على الجانب الأيمن من الماوس خلق مساحة لرؤية البنكرياس، الذي هو ضوء وردي اللون، وتعلق على الطحال، وشكل بيضاوي أحمر داكن. ويتميز بمادة إسفنجية لينة، وأنسجة البنكرياس. قطع البنكرياس التي سيتم تشغيلها على طول المعدة وتتشابك مع الأمعاء.
    4. فصل الطحال من البنكرياس. ثم وضع البنكرياس في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل هبس مع البنسلين x 1-ستربتوميسين وجلب هذا إلى هود الاندفاق الصفحي.
      ملاحظة: وينبغي أن يتم تنفيذ الخطوات المتبقية من البروتوكول استخدام تقنية تعقيم في غطاء الاندفاق الصفحي.
  2. صب البنكرياس وحبس (مع البنسلين-ستربتوميسين) إلى فارغة وزن القارب، واستخدام الملقط، يغسل البنكرياس التي يحوم عليه. ثم نقل البنكرياس بالملقط للمرة ثانية تزن القارب الذي يتضمن حبس (مع البنسلين-ستربتوميسين). ومرة أخرى، يغسل البنكرياس بدوامات.
  3. نقل البنكرياس إلى حبس الثالثة (مع البنسلين-ستربتوميسين)-التي تحتوي على وزن القارب والبدء في قطع البنكرياس إلى قطع صغيرة من 5 ملم أو أقل. بعد ذلك، صب القطع البنكرياس وحبس في أنبوب 50 مل فارغة.
    1. للقيام بذلك، استخدم الملقط لنقل القطع البنكرياس إلى السائل كما يجري يميل القارب وزنها. صب مرة واحدة كل قطعة لم تعد متصلة بقارب وزنها. تلتقط أي القطع المتبقية مع الملقط وتغسل الملقط في أنبوب 50 مل تحتوي على البنكرياس في حبس مع البنسلين والستربتوميسين.
  4. الطرد المركزي في 931 س ز 2 دقيقة عند 4 درجة مئوية ثم قم بإزالة حبس (وأي الدهون التي تطفو) التي بيبيتينج أنها قبالة مع ماصة 5 مل.
  5. إضافة 5 مل كولاجيناز (مخففة في حبس في الخطوة 1، 7) إلى البنكرياس. ضمان غطاء مختومة بالتفاف أنبوب 50 مل في الفيلم البارافين البلاستيك وثم وضعه في حاضنة تهز 220 لفة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تختلف الوقت كولاجيناز الهضم، كما لوحظ في المناقشة. في نهاية الحضانة، ينبغي أن يظل لا قطعة كبيرة من الأنسجة.
  6. لإيقاف في الانفصال، وضع أنبوب البنكرياس المحتوية على الجليد وإضافة 5 مل من البرد حبس + 5% FBS. الطرد المركزي في 931 x ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، ومن ثم بيبيت قبالة المادة طافية استخدام بيبيت 5 مل.
  7. ريسوسبيند في 10 مل من حبس + 5% FBS وأجهزة الطرد المركزي في 931 x ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية. بيبيت قبالة المادة طافية استخدام بيبيت 5 مل وكرر هذه الخطوة مع آخر 10 مل من حبس + 5% FBS.
  8. ريسوسبيند في 5 مل من حبس + 5% FBS، واستخدام P1000، نقل 1 مل في وقت واحد من خلال شبكة 500 ميكرون في أنبوب 50 مل. إضافة 5 مل إضافية هبس + 5% FBS من خلال الشبكة مع P1000 لغسل أي خلايا البنكرياس المتبقية عن طريق الشبكة.
  9. وضع تعليق خلية من شبكة 500 ميكرون من خلال ميكرون 105 من بيبيتينج 1 مل في وقت باستخدام P1000. المقبل، بلطف بيبيت تعليق خلية في أنبوب يحتوي على حبس + 30% FBS. وسوف تشكل طبقة من تعليق خلية في الجزء العلوي؛ عند استخدام الطرد المركزي، ستغرق الخلايا أسينار لتشكيل بيليه.
  10. أجهزة الطرد المركزي في 233 س ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 × وسائل الإعلام وايموث كاملة.
    1. إذا كان المضي مباشرة إلى امبيدمينت خلايا الكولاجين أو الغشاء المصفوفة، ريسوسبيند في وحدة تخزين لمل 7 في البنكرياس. إذا كان الشروع في الإصابة أدينوفيرال أو لينتيفيرال، ريسوسبيند في 4 مل في البنكرياس.

3. العدوى الفيروسية

  1. كما البنكرياس واحد يكفي لاثنين من العدوى الفيروسية (التحكم والتجريبية، مثل فارغة (null) ولجنة المساواة العرقية)، تقسيم تعليق خلية بين الأغطية اثنين 35 مم لوحات. يسمح استخدام غطاء اللوحات للإصابة في التعليق والحركة وبالتالي من السهل على الركيزة النهائية في وقت لاحق.
    1. عند العمل مع الفيروسات، نقع جميع النصائح الماصة المستخدمة في التبييض 10% لمدة 15 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: استخدام لوحات 35 ملم وحجم 4 مل يعمل جيدا للخلايا من الفئران غير المعدلة وراثيا بين 8 و 16 أسبوعا القديمة. حجم اللوحة ووحدة التخزين قد تحتاج إلى تعديل للحيوانات مع بانكريتا أصغر أو أكبر.
  2. للإصابة أدينوفيرال، إضافة الفيروس (مع عيار 10 على الأقل7 تي يو/مليلتر) في إضعاف 1:1,000 إلى الغطاء لكل لوحة ودوامه (الشكل 2، إتش التجارة والنقل). وضع اللوحات في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2) وعباب كل 15 دقيقة حاء 1 متابعة الحضانة ح 2 إضافية ثم الانتقال إلى امبيدمينت الخلايا في المصفوفة الكولاجين أو الغشاء.
  3. بعد الانتهاء من عمل الفيروسية في هود، نقع كافة المكونات في هود مع التبييض 10% لمدة 15 دقيقة على الأقل ونظيفة تماما ثم التبييض إيقاف استخدام الإيثانول 70%.

4-امبيدمينت خلايا الكولاجين أو مصفوفة الغشاء

  1. جل الكولاجين جعل على الجليد من خلال الجمع بين 7 مل النوع الأول من الكولاجين ذيل الفئران (3.3 ملغ/مل)، ميليلتر 700 10 × وسائل الإعلام وايموث، و 466.6 ميليلتر من 0.34 "م هيدروكسيد الصوديوم".
  2. أخذ كميات متساوية من تعليق خلية وجل الكولاجين، تخلط بلطف. في حالة إضافة حافز أو مثبط، الجمع بين هذا مع تعليق خلية الكولاجين. لوحة بئر واحدة في وقت واحد (لوحات من الخطوة 1.5.3)؛ حفظ لوحة على الجليد، دوامة لتوزيعها بالتساوي في طبقة خلايا الكولاجين.
    1. في كل بئر، بيبيت التالية وحدات التخزين من تعليق خلية الكولاجين: 200 ميليلتر (الشريحة الزجاجية 8-جيدا) أو 500 ميليلتر (24-جيدا لوحة)، 1000 ميليلتر (لوحة 12-جيدا) أو 2000 ميليلتر (لوحة 6-جيدا). لاحظ أن فعل ADM عن طريق التحفيز مع TGF-α (50 نانوغرام/مل) في الشكل 2.
  3. امبيدمينت خلايا في المصفوفة الغشاء، مزيج مصفوفة الغشاء جزء واحد مع أجزاء اثنين تعليق خلية. كما هو الحال مع الكولاجين، الحفاظ على تعليق خلية المصفوفة، فضلا عن لوحة على الجليد. بيبيت واحد جيدا في وقت واحد باستخدام وحدات التخزين نفسه أشار إلى 4.2.1 ودوامه للتوزيع حتى.
  4. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2) مدة 30 دقيقة ترسيخ ومن ثم إضافة 1 × وسائل الإعلام وايموث كاملة مع أي حافز أو مثبط (الشكل 2 يستخدم TGF-α في 50 نانوغرام/مل). تغيير الوسائط (مع التحفيز أو مثبط) في اليوم التالي، وبعد ذلك مرة كل يومين. اعتماداً على التحفيز، ويمكن ملاحظة ADM بين يوم 3، ويوم 5.

5-حصاد الخلايا من الكولاجين أو مصفوفة الغشاء

  1. جمع المواد التالية اللازمة لحصاد الخلايا من الكولاجين: 30 مل كولاجيناز 1 ملغ/مل مخففة في حبس، 40 مل حبس الباردة، مل 31 الباردة برنامج تلفزيوني وملاعق اثنين، هما 50 مل أنابيب والجليد. ضبط عدد ملاعق والأنابيب وكمية من الحلول إذا كانت المقارنة بين اثنين أو أكثر من ظروف الثقافة (حيث كل شرط هو نصف صفيحة). تعيين أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية وتعيين حاضنة الهز إلى 37 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة الوسائط واستخدام ملاعق لإزالة الأقراص الكولاجين مع الخلايا المدمجة. لكل حالة، ووضعت الأقراص منفصلة، قم بإفراغ أنبوب 50 مل.
  3. أضف 10 مل من 1 ملغ/مل كولاجيناز في حبس لكل أنبوب 50 مل. التفاف الأنابيب مع الفيلم البارافين البلاستيك ووضعها في 37 درجة مئوية تهز الحاضنة 225 لفة في الدقيقة لمدة تصل إلى 45 دقيقة. رصد عملية الهضم وإزالة أنابيب عندما يوجد الكولاجين لا أكثر وضوحاً.
  4. الطرد المركزي في 233 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة مع التباطؤ في الحد الأدنى. خلع المادة طافية وريسوسبيند في حل كولاجيناز 5 مل كل أنبوب. هضم في 37 درجة مئوية تهز الحاضنة 225 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق أو حتى يكون هناك لا الكولاجين مرئية.
  5. إيقاف عملية الهضم بإضافة 5 مل حبس الباردة وسينتريفوجينج فيما بعد في 233 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية مع التباطؤ في الحد الأدنى.
    1. ريسوسبيند في 15 مل حبس الباردة والطرد المركزي مرة أخرى في 233 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية مع التباطؤ في الحد الأدنى. كرر.
  6. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب 1.5 مل. الطرد المركزي في دلو سوينغ في 233 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية مع التباطؤ في الحد الأدنى. إزالة طافية والمفاجئة-التجميد في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف.
    ملاحظة: بيليه خلية يمكن تخزينها في-70 درجة مئوية أو استخدامها مباشرة في تطبيقات تيار أسفل.
  7. حصاد خلايا الغشاء جزءا لا يتجزأ من المصفوفة، وسائط بيبيت من كل بئر في أنبوب 50 مل على الجليد. ثم أضف الغشاء مصفوفة حل الاسترداد لكل بئر وكشط الخليط هلام الخلية في أنبوب 50 مل.
    ملاحظة: حجم الغشاء مصفوفة حل الاسترداد لإضافة إلى كل بئر على النحو التالي: 150 ميليلتر (الشريحة الزجاجية 8-جيدا)، ميليلتر 420 (24-جيدا لوحة)، 845 ميليلتر (12-جيدا لوحة) و 2,000 ميليلتر (لوحة 6-جيدا).
  8. أشطف جيدا مرتين مع حل الاسترداد مصفوفة الغشاء، مضيفاً يشطف إلى أنبوب 50 مل كل.
    ملاحظة: حجم الغشاء مصفوفة حل الاسترداد لكل شطف على النحو التالي: 150 ميليلتر (الشريحة الزجاجية 8-جيدا)، ميليلتر 420 (24-جيدا لوحة)، 845 ميليلتر (12-جيدا لوحة) و 2,000 ميليلتر (لوحة 6-جيدا).
  9. اترك الأنبوب على الجليد ح 1 أو حتى المصفوفة الغشاء يذوب واتبع بالطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة (قد نقل إلى أنبوب 1.5 مل إذا كان المطلوب هو بيليه الخلية).
  10. أجهزة الطرد المركزي في 3,500 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وأما الأداة تجميد بيليه الخلية أو إضافة المخزن المؤقت لتحلل والشروع مباشرة في تطبيقات المتلقين للمعلومات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنجاز هذا البروتوكول هنا يحدث خلال يوم واحد وعلى التحفيز، ويعتبر ADM في 3-5 أيام. ويصور الشكل 1 تسلسل الأسلوب، حيث يتم إكمال الخطوات من 1 إلى 4 في اليوم الأول. هذا يتضمن إعداد والعدوى الفيروسية والعزلة أسينار امبيدمينت في الكولاجين أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي. بينما يدفع المصفوفة الغشاء ADM، أسينار الخلايا داخل الكولاجين تتطلب حافزا، مثل TGF-α، الخضوع للتمايز إلى خلايا الأقنية. في يوم 1، الخلايا في المصفوفة الكولاجين أو الغشاء لها مظهر جولة مثل العنب وإذا كان الانتفاع بالعدوى الفيروسية مع ناقل التعبير عن بروتين فلوري، يمكن التحقق من كفاءة الإصابة. يوم 5، سوف تشكل الخلايا في الكولاجين مجاري إذا أعطى حافزا في الوقت امبيدمينت كملحق في وسائط الإعلام، الأمر الذي تغير في أيام 1 و 3 و 5. سوف تشكل الخلايا المضمنة في مصفوفة الغشاء مجاري في غياب حافز، ولكن عند التحفيز سوف تشكل القنوات أكبر، كما هو مبين في الشكل 2.

Figure 1
الشكل 1 : التخطيطي للإجراء لعزل الخلايا acinar الابتدائي موريني وتعدل التعبير البروتين و/أو تحفيز حؤول acinar للأقنية، وتضمين الخلايا في المصفوفة الكولاجين أو الغشاء. يتضمن سير العمل عزل الخلايا أسينار، التي تشمل تشريح البنكرياس والهضم، والترشيح للخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الممثل النتائج الأولية من الخلايا acinar مطلي ضمن مصفوفة الكولاجين أو الغشاء بعد الإصابة أدينوفيرال والتحفيز مع TGF-α- الخلايا أسينار الابتدائي من ماوس غير المعدلة وراثيا كانوا مصابين بالتجارة والنقل-إتش وجزءاً لا يتجزأ من الكولاجين أنا أو الغشاء مصفوفة، وحفزت مع أو بدون TGF-α (50 نانوغرام/مل). أربع وعشرين ساعة بعد الإصابة مع إتش التجارة والنقل، تم القبض على الصور لإظهار الكفاءة العدوى. في خمسة أيام بعد الإصابة، تدل الصور الاختلافات في خلايا حفز مع أو بدون TGF-α في الكولاجين أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي. المشار إليها بواسطة رؤوس الأسهم البيضاء الهياكل الشبيهة بمجرى الهواء ومقياس تمثل أشرطة الصور 50 ميكرومتر. تم الحصول على استخدام مجهر [كنفوكل] بهدف "المفوضية الأوروبية" خطة-نيوفلوار 10 ×/0.3 M27. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقدار الوقت للعزلة والعدوى، وطلاء الخلايا acinar الأولية قصيرة نسبيا ميزة لهذا الأسلوب. وفي المقابل، استزراع الخلايا أسينار من ثمرة explant تتطلب القليل من الوقت العملي، ولكن يستغرق سبعة أيام لثمرة الخلايا أسينار13. بروتوكولا بديلة لعزل acinar14 تلاحظ أسلوب قصيرة جداً للحصول على خلايا أسينار؛ ومع ذلك، لو عنصرا أساسيا في حفظ الخلايا أسينار على قيد الحياة عندما عزل باستخدام هذا البروتوكول. إذ لو يحفز التمايز للخلايا أسينار إلى خلايا الأقنية، الطريقة الواردة هنا، التي لا تتطلب مكونات حفز ADM للثقافة، أفضل لدراسة آليات للحث أو تنظيم اﻷدميرال في هذا الأسلوب، والحفاظ على الهوية أسينار الخلية خلال استزراع في الكولاجين ما لم تحفز التفريق في خلايا الأقنية. وعلاوة على ذلك، يتم التغلب على الصعوبات في ترانسفيكتينج الابتدائية الخلايا عن طريق التلاعب في التعبير البروتين بالعدوى الفيروسية.

ويوفر هذا الإجراء مباشرة دراسة ADM، يمكن أن تحدث التعريفي بالتصور الذي هيكل الأقنية عبر الفحص المجهري برايتفيلد و/أو الفلورة. لتطبيقات التصوير، وشرائح الدائرة (لاحظ في الجدول للمواد) أفضل. سيتم إصلاح التثبيت لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 4% بارافورمالدهيد الخلايا المضمنة في مصفوفة الغشاء دون هياكل الأقنية مثيرة للقلق. خلال هذه الحضانة، المصفوفة الغشاء سوف التسييل، ويمكن أن بيبيتيد برفق قبالة مع بارافورمالدهيد. ويرد الفلورة على خلايا الكولاجين المضمنة بالتفصيل ضمن بروتوكولات إضافية15،16. وتشمل طلبات أخرى لتحليل الآليات مما يشير إلى المشاركة في نقطة النهاية للتجربة لطخة غربية، قبكر، والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). سدس البنكرياس مادة كافية لتحليل عينة واحدة عبر لطخة غربية أو qPCR.

القيود المفروضة على هذا البروتوكول تنشأ عن استخدام مصفوفة الكولاجين أو الغشاء الطابق السفلي، حيث كل لديه مزايا وعيوب. في حين سوف تنتج امبيدمينت الخلايا في الكولاجين فقط القنوات إذا لم يتم إعطاء المحفزات، ستنتج الغشاء مصفوفة امبيدمينت القنوات دون حوافز إضافية. ومع ذلك، حجم الأقنية في مصفوفة الغشاء إخراج قابلة لقياس. قيداً إضافيا هو الوقت الذي يتطلبه في إجراءات الحصاد في الخطوة 5، التي يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني. ويمكن تخفيف هذا القيد بتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من النشاف الغربية مع الفلورة، فيه وقت التثبيت أقل بكثير من أن وقت الحصاد qPCR أو تحليل لطخة غربية.

بالإضافة إلى العدوى أدينوفيرال، يمكن استخدام لينتيفيرال العدوى في الخلايا الأولية. للإصابة لينتيفيرال، إضافة 6 ميكروغرام/مل العدوى الفيروسية محسن الكاشف (انظر الجدول للمواد) إلى الخلايا ولطف دوامة اللوحات. وفي وقت لاحق، إضافة لينتيفيروس (مع عيار 10 على الأقل7 تي يو/مليلتر) في إضعاف 1:1,000 ومرة أخرى، بلطف دوامة. احتضانها ح 3-5 (37 درجة مئوية، 5% CO2) ومن ثم تابع إلى امبيدمينت الخلايا في المصفوفة الكولاجين أو الغشاء. لإنشاء lentivirus مع بلازميد الاهتمام، استخدم المزيج التغليف لينتيفيرال ولاحظت في جدول المواد.

يمكن أن تتضمن التعديل زيادة عزلة خلايا في الفئران معربا عن كراسG12D. في هذه الفئران، التي لديها بالفعل مناطق تليفية مع آفات ADM وبانين، الهضم كولاجيناز وقتاً أطول. رصد كولاجيناز الهضم، كما هو موضح في الخطوات الحاسمة حذراً واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، المطلوب. الأنسجة غير طبيعية أكثر ماوس، سوف يستغرق وقتاً أطول الهضم (حوالي ساعة p48Cre اثني عشر عاماً في أسبوع؛ لسلكراسG12D الماوس). حيث يمكن أن يكون هناك تباين هائل بين الفئران من نفس الفئة العمرية، فإننا ننصح بعزل الخلايا أسينار من ماوس LSL-كراسG12D وتؤدي الإصابة أدينوفيرال أو لينتيفيرال باستخدام لجنة المساواة العرقية للحصول على النمطان كراس التعبير. ينبغي القول أيضا أن لدينا بروتوكول هو الأمثل لعزل الخلية أسينار للتحقيق في عملية ADM. عزل خلايا ADM وبانين من كراسG12D-الإعراب عن الفئران لثقافة أورجانويد ويتطلب تغيير البروتوكولات.

خطوة حاسمة واحدة هو مقدار الوقت الذي يقضيه البنكرياس المقطعة في كولاجيناز. يمكن أن يختلف وقت الهضم كولاجيناز مثالية الماوس للماوس وبين الكثير من كولاجيناز من نفس الشركة. الوقت لاحظت في البروتوكول مناسبة لوزنها حول 0.250 بانكريتا زاي جداً الكثير من الوقت يمكن أن تلحق الضرر وتقتل الخلايا، بينما سيؤدي إلى الوقت القليل جداً في الهضم غير مكتملة وذلك أقل الخلايا التي سوف تجعل من خلال عملية التصفية على اللوحة النهائية. تحقق التفكك بصريا بالنظر لانهيار القطع البنكرياس مقطعة إلى أعلى؛ يجب تشغيل الحل الملبدة بالغيوم. بالإضافة إلى ذلك، قبل إيقاف رد فعل كولاجيناز مع حبس الباردة، الحل يمكن تناولها مع بيبيت 5 مل، حيث سوف تبين السهولة التي يمكن اتخاذها الحل حتى إذا كان من الملائم أن تتوقف عن رد فعل. وهناك اعتبار آخر هو عدد بانكريتا تحصد. إذا كان أكثر من واحد البنكرياس معزولة في نفس الوقت، الإجراء يعمل بشكل أفضل عندما يتم الاحتفاظ في بانكريتا منفصلة.

نقطة أخرى هامة لضمان ثقافة صحية من الخلايا أسينار الابتدائي هو أنه ينبغي توخي الحذر عند بيبيتينج الحل خلية أسينار. بيبيتينج القوية قد تتسبب في تلف الخلايا ويؤدي إلى عدم تشكيل مجرى الهواء، وحتى مع إضافة مستحثات ADM المعروفة، مثل TGF-α. علاوة على ذلك، إذا كانت هناك مسائل السلامة، الطرد المركزي في الخطوات 2.4 و 2.6 و 2.7 يمكن اتخاذها وصولاً إلى 300 س ز لإنتاج بيليه أكثر ليونة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها منحة R01 (CA200572) من المعاهد الوطنية للصحة إلى س. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو الممولين لم يكن لها دور في "المعاهد الوطنية أجرت" دراسة تصميم وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C shaking incubator Thermo Scientific SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator NUAIRE NU-5500
50 mL tubes Falcon 352070
Absorbent pad, 20" x 24" Fisherbrand 1420662
Adenovirus, Ad-GFP Vector Biolabs  1060
Aluminum foil Fisherbrand 01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 Fisher Scientific  305167 Use as pins for dissection 
Beaker, 600 mL Fisherbrand FB-101-600
Bleach, 8.25% Clorox 31009
Cell Recovery Solution Corning 354253 Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge  Beckman Coulter Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone Sigma D1756 Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. 
Ethanol, 200 proof Decon Laboratories  2701
Fetal Bovine Serum  Sigma F0926-100mL
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Forceps  Fine Science Tools 91127-12
Glass slide, 8-well Lab-Tek 177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red Fisher Scientific SH3048801   
Ice bucket, rectangular Fisher Scientific  07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisherbrand 01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)  Minigrip SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower Invitrogen 44-2050
Matrigel Corning 356234 Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm Bemis PM992 Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS Fisher Scientific SH30028.02
Penicillin-Streptomycin  ThermoFisher Scientific 15140122
Pipet tips, 10 µL USA Scientific 1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL  Olympus Plastics 24-165RL
Pipet tips, 200 µL  USA Scientific 1111-1700
Pipet-Aid Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL Gilson F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL Gilson F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL Gilson F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL Gilson F123601
Pipettes, 10 mL  Falcon 357551
Pipettes, 25 mL Falcon 357525
Pipettes, 5 mL  Falcon 357543
Plate, 12-well Corning Costar 3513
Plate, 24-well plate Corning Costar 3524
Plate, 35 mm Falcon 353001
Plate, 6-well Falcon 353046
Polybrene EMD Millipore TR-1003-G Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. 
Polypropylene Mesh, 105 µm Spectrum Labs 146436
Polypropylene Mesh, 500 µm  Spectrum Labs 146418
Scissors  Fine Science Tools 14568-12
Scissors  Fine Science Tools 91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Scientific BP328-500
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8 Gibco 17075029
Spatula Fisherbrand 21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters  Millipore SCGP00525
TGF-α R&D Systems 239-A-100
Type I Rat Tail Collagen Corning 354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder) Sigma W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium  Fisherbrand 02-202-101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61, (3), 449-458 (2012).
  2. Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144, (6), 1170-1179 (2013).
  3. Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18, (1), 1-6 (1995).
  4. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22, (6), 737-750 (2012).
  5. Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120, (2), 508-520 (2010).
  6. Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63, (9), 2016-2019 (2003).
  7. Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (49), 19327-19332 (2007).
  8. Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202, (3), 563-577 (2013).
  9. De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18907-18912 (2008).
  10. Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18913-18918 (2008).
  11. Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14, (10), 2325-2336 (2016).
  12. Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43, (5), 577-578 (2007).
  13. Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90, (12), 1052-1060 (2011).
  14. Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  15. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
  16. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics