מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

בידוד תא acinar הראשית, אפנון ביטוי או פעילות החלבון, תרבות ויישומים למטה-נחל הם בשפע שימושי לשעבר מחקר vivo של acinar-כדי-ductal מטפלזיה (ADM), אירוע מוקדם בהתפתחות של סרטן הלבלב.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fleming Martinez, A. K., Storz, P. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e59096, doi:10.3791/59096 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הבידול של תאים acinar תאי ductal במהלך לבלב, בפיתוח מוקדם של סרטן הלבלב הוא תהליך מפתח זה דורש מחקר נוסף. כדי להבין את מנגנוני ויסות מטפלזיה acinar-כדי-ductal (ADM), ex-vivo תרבות תלת-ממד, התמיינות של תאים acinar העיקרי על תאי ductal מציע יתרונות רבים על פני מערכות אחרות. עם הטכניקה בזאת, אפנון של ביטוי חלבון היא פשוטה ומהירה, המחייב רק יום אחד כדי לבודד, לעורר או לשווק להדביק, ולהתחיל culturing תאים acinar העיקרית לחקור את תהליך ה-ADM. בניגוד באמצעות מטריצת קרום המרתף, זריעה של תא acinar אשכולות של קולגן אני מטריצה חוץ-תאית, מאפשר acinar תאים לשמור על זהותם acinar לפני מניפולציה. זה חיוני בעת בדיקת התרומה של רכיבים שונים אינדוקציה של אדמירל תופעות של ציטוקינים או גורמים אחרים ectopically מנוהלת ברת באמצעות טכניקה זו, לא רק התרומה של מוטציות נפוצות, ביטוי חלבון מוגבר או נוקאאוט של ביטוי חלבון היא ברת דרך זיהום ויראלי של ראשי תאים acinar באמצעות וקטורים adenoviral או lentiviral. יתר על כן, התאים ניתן לבודד מחדש קולגן או קרום המרתף מטריקס-נקודת הקצה, ניתחו ביטוי חלבון.

Introduction

Acinar-אל-ductal מטפלזיה (ADM) היא מנגנון הגנה במהלך דלקת לבלב, תהליך מפתח נהיגה התפתחות סרטן הלבלב1 שדורש עוד תובנה מכניסטית. בזמן דלקת-induced ADM היא הפיכה2, oncogenic מוטציות קראס , אשר נמצאים ב- 90% של סרטן הלבלב המקרים3, למנוע בידול חזרה פנוטיפ acinar4,5, 6. Culturing, המבדילים תאים acinar הראשית לתוך תאי ductal בתרבות 3D מאפשר לימוד של המנגנונים המולקולריים המסדיר את תהליך ה-ADM, מה שקשה ללמוד ויוו. כגון ex-vivo מחקרים מאפשרים בזמן אמת להדמיה של ADM, מנהלי ההתקנים, הרגולטורים שלה. מספר מנהלי התקנים של תהליך ה-ADM, כמו גם תובנה מכניסטית על איתות המסלולים במורד הזרם שלהם, זוהו או מאומת באמצעות הכאן תיאר שיטה. אלה כוללים ADM אינדוקציה על ידי TGF-α (הפיכת גורם הגדילה אלפא)-מתווכת ביטוי של MMP-7 (מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-7) והפעלה של דרגה7, כמו גם RANTES (מווסתות על ההפעלה, נורמלי תא T הביע והוא מופרש; גם ידוע כימוקין ליגנד 5 או CCL5) ו TNFα (גידול נקרוזה מקדם אלפא)-induced ADM באמצעות הפעלה של NF-κB (גרעיני גורם-κB)8. מתווך נוסף של ה-ADM הוא oncogenic קראס9,10, מה שגורם לעלייה סטרס חמצוני זה משפר את תהליך ה-ADM דרך ביטוי מוגבר של EGFR (קולטן גורם הגדילה באפידרמיס) ו שלה ליגנדים, EGF ( גורם הגדילה באפידרמיס) ו- TGF-α11.

בעוד השימוש שורות תאים סרטן הלבלב היא נפוצה עבור מחקרים במבחנה, תרביות תאים ראשי מציעים יתרונות רבים. למשל, ראשי תאים acinar העכברים הטרנסגניים-שאינם או עכברים מחסה מוטציות ייזום, כגון קראסG12D, הם המודל המתאים ביותר עבור לומד האירוע מוקדם של ADM כי התאים יש מוטציות כמה ומבוקר, אשר ידועים להיות נוכח בשלב מוקדם של התפתחות סרטן הלבלב. זאת לעומת זאת רבים שורות תאים סרטן הלבלב אשר יש מוטציות רבות מגוונות הביטוי מבוסס על המעבר מספר12. בנוסף, איתות המסלולים המזוהה על-ידי באמצעים אלה אומתו על ידי מחקרים שנעשו בבעלי חיים. קודם השימוש תאים acinar העיקרית היא כי הם לא יכולים transfected שיותר שורות תאים סרטן טיפוסי.

השיטה בזאת פירוט הטכניקות של בידוד תא acinar, תרבות 3D המחקה ADM על-ידי הוספת חומרים ממריצים או להתכוונן ביטוי חלבון באמצעות זיהום adenoviral או lentiviral, כמו גם בידוד מחדש של תאים על נקודת הקצה עבור ניתוחים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי IACUC המרפאה מאיו.

1. הכנה של חומרים, פתרונות בסיסים מטריקס תלת-ממדי

  1. קיצוץ 76 מ מ ריבועים מיקרומטר 500 ולרשתות 105 מיקרומטר פוליפרופילן לתוך 76 מ מ. מקפלים כל ריבוע לחצי פעמיים כדי ליצור ריבוע מקופל קטן יותר. מקום אחד 500 מיקרומטר ו- 105 אחד מיקרומטר mesh כיכר לתוך כיס autoclavable.
  2. אוטוקלב פוליפרופילן רשת ריבועים, כמו גם שני זוגות מספריים וחדים.
  3. להפוך 100 מ של 10 x הפתרון של Waymouth. לערבב את מבחנה 1 (14 גרם) של האבקה של Waymouth בתוך 50 מ ל מים (DI) יונים ו, כאשר התפרקה, להוסיף 30 מ של 7.5% (75 גרם/ליטר) סודה לשתייה. להביא עוצמת הקול הסופי 100 מ ל באמצעות די מים, מסנן לחטא.
    1. התקשורת של חנות 10 x Waymouth 4 ° C ושימוש להכין קולגן ג'לים ומדיה של Waymouth x 1. כאשר ארגונייט שוקע טופס, למחוק.
  4. הפוך 50 מ של 1 x מדיה של Waymouth מלאה לכל הלבלב על ידי הוספת µL 125 של מעכבי טריפסין סויה 40 מ"ג/מ"ל, µL 12.5 של דקסאמתאזון 4 מ"ג/מ"ל, 500 µL של נסיוב שור עוברית (FBS). לחטא על-ידי סינון ולהשתמש בתוך 48 שעות.
  5. הכנת בסיסים מטריקס תלת-ממדי באמצעות מטריצת קולגן או קרום המרתף (ראה טבלה של חומרים עבור מידע אודות מוצר). כאשר pipetting את הבסיס, למקם את הצלחת על קרח, להימנע בועות, וסובב את הצלחת מיד לאחר pipetting אמצעי של טוב בכל כדי להבטיח כיסוי מלא.
    1. יצירת קולגן בסיסים על ידי ערבוב המרכיבים הבאים על הקרח בשכונה תרביות רקמה: 5.5 mL מסוג אלשין על הזנב קולגן µL 550 של 10 x המדיה של Waymouth, µL 366.6 של NaOH M 0.34 (מסונן).
      הערה: זהו פתרון מספיק להפוך קולגן בסיסים לצלחת אחת 24-. ובכן, ובכן 12 או 6-. טוב. צלחת אחת מספיקה עבור בידוד acinar מן הלבלב אחד.
    2. השתמש אמצעי האחסון הבאים כדי צלחת הבסיס קולגן: 80 µL (שקופיות זכוכית 8-טוב), 200 µL (צלחת 24-טוב), 400 µL (12-ובכן צלחת) או 800 µL (6-ובכן צלחת).
    3. על קרום המרתף מטריקס בסיסים, pipet המטריקס ללא רכיבים נוספים. השתמש אמצעי האחסון הבאים עבור כל טוב: µL 50 (שקופיות זכוכית 8-טוב), 120 µL (צלחת 24-טוב), 240 µL (12-ובכן צלחת) או 600 µL (6-ובכן צלחת).
    4. תן את כל הבסיסים לחזק במשך לפחות 30 דקות בחממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לפני יצירת שכבה נוספת של מטריקס עם תאים המוטבע על גבי בסיסים אלה (שלב 4).
  6. כהכנה בידוד acinar לשמור על גביע אחד של 600 מ ל, שלושה צינורות 50 מ ל, זוג מספריים, זוג מלקחיים בלוק, דלי קרח מתחת למכסה המנוע עם שלוש סירות שוקלים בלוק. לאחר מכן, להפוך 30 מ של HBSS עם µL 300 של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין, מכניס כל אחד שתי סירות שוקל 10 מ"ל ושמירה mL 10 הסופי בשפופרת 50 מ ל (לשימוש בשלבים 1.8.2 ו 2.1.4).
  7. להפוך את 40 מ של HBSS + 5% FBS, 20 מ של HBSS + 30% FBS ו- 5 מ של 2 מ"ג/מ"ל collagenase ב HBSS. לחטא את collagenase על-ידי סינון (0.22 נקבובית מיקרומטר) ולשמור בטמפרטורת החדר. שמור כל אחד הפתרונות HBSS על הקרח.
  8. להרכיב את סביבת עבודה עבור ניתוח הלבלב, אשר ניתן לבצע על ספסל מעבדה.
    1. המקום משטח סופג על השולחן, יחד עם מכסה פוליסטירן מכוסה בנייר כסף. אז במקום מגבת נייר עם 4 סיכות על גבי רדיד האלומיניום.
    2. תמשיך הפריטים הבאים והממוקם ניתוח סביבת העבודה: תיק מהשריפה, ערכה אחת של מלקחיים ומספריים בלוק, בקבוק ספריי עם 70% אתנול, דלי קרח (עם הצינור 50 מ של HBSS המכילה פניצילין-סטרפטומיצין מהשלב 1.6).
  9. להגדיר צנטריפוגה 4 ° C, מטרף עד 37 מעלות צלזיוס.

2. acinar תא בידוד

  1. להקריב את העכבר באמצעות אינדוקציה2 CO, ולבצע נקע בצוואר הרחם. מיד לנתח הלבלב. לנתח את הלבלב, סיכת הראשון כפות רגליו של העכבר כדי המכסה פוליסטירן, אוריינט העכבר כך הזנב עומדת בפני החוקר, לרסס את הבטן עם 70% אתנול.
    הערה:
    העכבר להשתמש בתוצאות הנציגה הייתה נקבה שאינה הטרנסגניים 12 - בן שבועיים עם רקע C57BL/6. העכבר בחירה נוסף נדון במקטע דיון.
    1. באמצעות ערכת מלקחיים ומספריים בלוק, הרם הפרווה/העור עם המלקחיים בקו האמצע, השתמש המספריים לעשות חתך דרך הפרווה והעור מפתיחת השופכה אל אזור הסרעפת/בית החזה.
    2. לבצע חתכים נוספים ימין ועל שמאל כזה הפרווה/העור נחתך כדי ליצור תצוגה ברורה של חלל הבטן. לאחר מכן, וחותכים הבטנה הצפק (באמצע, כדי לימין ולשמאל), משוך את זה מן האברים, כפי שנעשה עם העור/הפרווה.
    3. הרם את המעיים עם המלקחיים, לשים את זה בצד שמאל של העכבר יוצרים מקום לראות את הלבלב, אשר אור ורוד בצבע, והוא מחובר הטחול, אשר הוא אליפסה אדום כהה. רקמת הלבלב מאופיינת שלה מרקם רך, ספוגי. לגזור הלבלב אשר להפעיל לאורך הבטן, משתלבים עם המעיים.
    4. הפרד הטחול מן הלבלב. לאחר מכן, מכניסים הלבלב צינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של HBSS עם פניצילין x 1-סטרפטומיצין, להעביר למינארי.
      הערה: השלבים הנותרים של הפרוטוקול צריך להיעשות ניצול סטרילי טכניקה ב תא למינארי.
  2. יוצקים הלבלב ו- HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין) לתוך ריק שוקל הסירה, באמצעות מלקחיים, לשטוף את הלבלב על ידי מתערבל זה. לאחר מכן, להזיז הלבלב עם המלקחיים נוסף שוקל הסירה המכילים HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין). לשטוף שוב, הלבלב על ידי לטמיון.
  3. להעביר HBSS השלישי (עם פניצילין-סטרפטומיצין) הלבלב-המכיל שוקלים סירה ולהתחיל חיתוך הלבלב לחתיכות קטנות של 5 מ מ או פחות. בשלב הבא, שופכים את חתיכות הלבלב ואת HBSS לתוך שפופרת ריק 50 מ ל.
    1. כדי לעשות זאת, השתמש המלקחיים כדי להעביר את חתיכות הלבלב לתוך הנוזל כמו להיות מועמד. הסירה השקילה. יוצקים לאחר כל החלקים אינם מחוברים לסירה השקילה. לאסוף את כל החלקים הנותרים עם המלקחיים ולשטוף המלקחיים לשפופרת 50 מ ל המכיל בלבלב HBSS עם פניצילין-סטרפטומיצין.
  4. צנטריפוגה ב x 931 g למשך 2 דקות ב 4 ° C, ואז להסיר את HBSS (ואת כל השומן צף) על-ידי pipetting את זה עם פיפטה 5 מ ל.
  5. הוסף 5 מ של collagenase (מדולל ב HBSS בשלב 1.7) הלבלב. להבטיח מכסה אטום על ידי ליפוף הצינור 50 מ ל סרט פרפין פלסטיק ולאחר מכן מקם אותו באינקובטור רועדת-220 סל"ד למשך 20 דקות ב 37 º C.
    הערה: הפעם עיכול collagenase עשויים להשתנות, כאמור בדיון. בסוף הדגירה, צריכים להישאר אין חתיכות גדולות של רקמות.
  6. כדי להפסיק את הדיסוציאציה, למקם את צינור הלבלב המכילות על קרח ולהוסיף 5 מיליליטר קר HBSS + 5% FBS. צנטריפוגה ב x 931 g למשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן pipet את תגובת שיקוע שימוש של pipet מ.
  7. Resuspend ב- 10 מ"ל של HBSS + 5% FBS ו צנטריפוגה ב 931 x g למשך 2 דקות ב 4 º C. Pipet תוריד את תגובת שיקוע באמצעות pipet של 5 מ"ל, חזור על שלב זה עם עוד 10 מ"ל של HBSS + 5% FBS.
  8. Resuspend ב 5 מ של HBSS + 5% FBS ו, תוך שימוש של P1000, להעביר 1 מ"ל בכל פעם דרך רשת מיקרומטר 500 לתוך צינור 50 מ ל. להוסיף 5 אוטם נוסף של HBSS + 5% FBS מבעד לרשת עם P1000 לשטוף כל בתאי הלבלב הנותר מבעד לרשת.
  9. לשים התליה תא מן הרשת מיקרומטר 500 מבעד לרשת מיקרומטר 105 מאת pipetting 1 מ"ל בכל פעם באמצעות של P1000. . הבא בתור, בעדינות pipet התליה תא לתוך צינור המכיל HBSS + 30% FBS. שכבה של תאים ההשעיה יהוו בחלק העליון; על צנטריפוגה, התאים acinar ישקעו להקים גלולה.
  10. צנטריפוגה ב 233 x g למשך 2 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר 1 x מדיה מלאה של Waymouth.
    1. אם ממשיכים ישירות אל embedment של תאים קולגן או קרום המרתף מטריקס, resuspend באמצעי אחסון של 7 מ לכל הלבלב. אם הליך זיהום adenoviral או lentiviral, resuspend ב 4 מ"ל לכל הלבלב.

3. זיהום ויראלי

  1. כמו לבלב אחת מספיקה עבור שני זיהומים נגיפיים (שליטה ו ניסיוני, למשל, ערך null ו- cre), לפצל את התליה תא בין עפעפיו של שתי צלחות 35 מ מ. באמצעות המכסה של הלוחות מאפשר זיהום ההשעיה ולכן קל תנועה על גבי המצע הסופי מאוחר יותר.
    1. בעת עבודה עם וירוס, משרים כל העצות פיפטה בשימוש ב- 10% מלבין במשך 15 דקות לפחות.
      הערה: ניצול של הלוחות 35 מ"מ ונפח מ"ל 4 עובד היטב עבור תאים מן העכברים הטרנסגניים-שאינם בין בני 8 ו-16 שבועות. נפח וגודל צלחת ייתכן שתצטרך לכוונן את חיות עם pancreata קטן או גדול יותר.
  2. זיהום adenoviral, להוסיף את הוירוס (עם כייל לפחות 107 TU/mL)-לדילול 1:1,000 את המכסה של כל צלחת ו מערבולת (איור 2, אדנו GFP). הכנס את הצלחות חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) ו מערבולת מדי 15 דקות 1 ה דגירה המשך עבור h 2 נוספים לאחר מכן המשך embedment של תאים במטריצת קולגן או קרום המרתף.
  3. לאחר השלמת העבודה ויראלי בשכונה, להשרות את כל הרכיבים בשכונה עם אקונומיקה 10% לפחות 15 דקות, ואז ניקוי יסודי האקונומיקה להשתמש 70% אתנול.

4. embedment של תאים קולגן או קרום המרתף מטריקס

  1. יצירת קולגן ג'ל על הקרח על ידי שילוב של 7 mL מסוג קולגן זנב העכברוש (3.3 mg/mL), 700 µL של 10 x המדיה של Waymouth ו µL 466.6 של 0.34 M NaOH.
  2. לוקחים נפחים שווים של קולגן ג'ל ותא השעיה, מערבבים בעדינות. אם הוספת גירוי או מעכב, לשלב את זה עם המתלה קולגן תאים. צלחת באר אחת בכל פעם (צלחות מהשלב 1.5.3); שמירה על הלוחית קרח, מה עוללת לפיזור אחיד של השכבה קולגן-תא
    1. כל היטב, pipet הבאות כרכים של קולגן תאים ההשעיה: 200 µL (שקופיות זכוכית 8-טוב), 500 µL (צלחת 24-טוב), µL 1000 (12-ובכן צלחת) או 2000 µL (6-ובכן צלחת). שימו לב כי ADM מושרה באמצעות גירוי עם TGF-α (50 ng/mL) באיור2.
  3. עבור embedment של תאים במטריצת קרום המרתף, מערבבים אחד-חלק קרום המרתף מטריקס עם שני-חלקים תא ההשעיה. כמו עם קולגן, לשמור על התליה תא מטריקס, כמו גם את הצלחת על קרח. Pipet אחד טוב בכל פעם באמצעות אמצעי האחסון באותו ציין 4.2.1 ו מערבולת להפצה אפילו.
  4. מקם את הצלחת ב חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 30 דקות כדי לחזק ולאחר מכן להוסיף 1 x מדיה של Waymouth מלאה עם כל גירוי או מעכב (איור 2 שימושים TGF-α-50 ng/mL). לשנות את המדיה (עם גירוי או מעכב) למחרת, אז בכל יום אחר. בהתאם הגירוי, ניתן לצפות ADM בין יום 3 יום 5.

5. לקצור תאי קולגן או קרום המרתף מטריקס

  1. לאסוף את החומרים הבאים לצורך קצירת תאים קולגן: 30 מ של 1 מ"ג/מ"ל collagenase מעורבבת עם HBSS, 40 מ של HBSS קר, 31 מ של קר PBS, שפכטלים שני, שני צינורות 50 מ ל, קרח. לכוונן את מספר שפכטלים, צינורות, כמות פתרונות אם השוואת תנאים תרבות יותר משני (כאשר כל תנאי הוא ½ של צלחת). מוגדר לצנטריפוגה 4 ° C, מוגדר החממה חזק 37 מעלות צלזיוס.
  2. מסיר את המדיה והשתמש שפכטלים כדי להסיר את הדיסקים קולגן עם תאים מוטבעים. עבור כל תנאי, מכניסים את הדיסקים נפרדת, ריק שפופרת 50 מ.
  3. להוסיף 10 מ של 1 מ"ג/מ"ל collagenase ב HBSS כל שפופרת 50 מ. לעטוף את הצינורות עם סרט פרפין פלסטיק ולשים של 37 ° C רועד חממה-225 סל ד עד 45 דקות. לפקח על העיכול ולהסיר צינורות כאשר יש קולגן יותר גלוי.
  4. צנטריפוגה ב x 233 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות עם ההאטה מינימלי. . תוריד את תגובת שיקוע, resuspend מ ל תמיסת collagenase למחזור. לעכל ב- 37 מעלות צלזיוס רועד חממה-225 סל ד במשך 10 דקות או עד יש אין קולגן גלוי.
  5. לעצור את העיכול על ידי הוספת 5 מ של HBSS קר, לאחר מכן צריך שתוציאו ב x 233 g למשך 2 דקות ב 4 ° C עם ההאטה מינימלי.
    1. Resuspend ב-15 מיליליטר HBSS קר, שוב צנטריפוגה ב x 233 g למשך 2 דקות ב 4 ° C עם ההאטה מינימלי. חזור.
  6. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS ולהעביר אל צינור 1.5 מ. צנטריפוגה בדלי הנדנדה ב x 233 g למשך 2 דקות ב 4 ° C עם ההאטה מינימלי. להסיר supernatant snap-הקפאה בחנקן נוזלי או על קרח יבש.
    הערה: בגדר תא יכול להיות מאוחסן ב-70 מעלות צלזיוס או להשתמש מיד ביישומים למטה-stream.
  7. הקציר קרום המרתף מטריקס-מוטבע תאים, pipet מדיה מכל קידוח לתוך צינור 50 מ על קרח. לאחר מכן, להוסיף פתרון שחזור קרום המרתף מטריקס מכל קידוח, לגרד את התערובת תא-ג'ל לתוך הצינור 50 מ.
    הערה: הנפח של קרום המרתף מטריקס פתרון שחזור כדי להוסיף כל אחד טוב הוא כדלקמן: 150 µL (שקופיות זכוכית 8-טוב), µL 420 (צלחת 24-טוב), 845 µL (12-ובכן צלחת) ו- 2,000 µL (6-ובכן צלחת).
  8. לשטוף היטב פעמיים עם פתרון שחזור מטריקס קרום המרתף, הוספת שטיפות את הצינור 50 מ.
    הערה: הנפח של קרום המרתף מטריקס פתרון שחזור עבור כל שטיפה הוא כדלקמן: 150 µL (שקופיות זכוכית 8-טוב), µL 420 (צלחת 24-טוב), 845 µL (12-ובכן צלחת) ו- 2,000 µL (6-ובכן צלחת).
  9. להשאיר את הצינורית על קרח לשעה או עד המטריקס קרום המרתף מתמוסס ופעל עם צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS קר (עשוי להעביר צינור 1.5 mL אם צניפה תא רצוי).
  10. צנטריפוגה ב 3,500 x g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע, הצמד גם להקפיא בגדר תא או להוסיף מאגר פירוק ולהמשיך ישירות ליישומים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השלמה של פרוטוקול בזאת מתרחשת תוך יום אחד, בעת גירוי, ADM נראה ב 3-5 ימים. איור 1 מציג את הרצף של השיטה, לפיה יושלמו השלבים 1 עד 4 ביום הראשון. זה כולל הכנה, בידוד acinar, זיהום נגיפי, embedment קולגן או קרום המרתף מטריקס. בעוד המטריקס קרום המרתף המניע ADM, תאים acinar בתוך קולגן דרוש גירוי, כגון TGF-α, לעבור התמיינות לתאים ductal. יום 1, תאים מטריצת קולגן או קרום המרתף יש מראה עגול כמו ענבים, אם ניצול זיהום נגיפי עם וקטור ביטוי חלבון פלואורסצנטי, ניתן לבדוק יעילות זיהום. ביום 5, בתאי הקולגן יהוו צינורות אם נותנים גירוי בזמנו של embedment ושל כתוספת בתקשורת, אשר משתנה בימים 1, 3 ו-5. תאים בתוך קרום המרתף מטריקס יהוו צינורות בהיעדר גירוי, אבל על גירוי צינורות גדולים יותר יהוו, כפי שניתן לראות באיור2.

Figure 1
איור 1 : סכמטי של התהליך כדי לבודד תאים acinar הראשית מאתר לווסת את ביטוי חלבון ו/או לעורר מטפלזיה acinar-כדי-ductal, להטביע תאים מטריצת קולגן או קרום המרתף. זרימת העבודה כולל בידוד של תאים acinar, הכולל ניתוח של הלבלב, עיכול, סינון של התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תוצאות נציג של תאים acinar הראשית מצופה בתוך מטריצת קולגן או קרום המרתף לאחר זיהום adenoviral, גירוי עם TGF-α- ראשי acinar תאים שאינם-עכבר נדבקו בנגיף ה-GFP-אדנו, המוטבעות קולגן או קרום המרתף מטריקס ו מגורה עם או בלי TGF-α (50 ng/mL). עשרים וארבע שעות לאחר הפגיעה עם אדנו GFP, תמונות נלקחו בשבי להראות יעילות זיהום. -חמישה ימים לאחר הפגיעה, הדימויים מציינות את ההבדלים בתאים מגורה עם או בלי TGF-α קולגן או קרום המרתף מטריקס. מבנים דמויי-צינור מסומנים באמצעות חץ לבן ולשנות את קנה המידה מייצגים ברים ש-50 מיקרומטר. תמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם המטרה M27 EC תוכנית-Neofluar 10 x / 0.3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כמות הזמן בידוד, זיהום של ציפוי ראשי תאים acinar קצר יחסית היא יתרון של שיטה זו. לעומת זאת, culturing תאים acinar תוצר explant דורשת מעט זמן על הידיים, אך לוקח שבעה ימים בשביל תוצר של תאים acinar13. פרוטוקול חלופי עבור בידוד acinar14 הערות שירות קצר מאוד להשגת תאים acinar; עם זאת, EGF היא מרכיב חיוני בשמירה על תאים acinar בחיים כאשר מבודדים באמצעות פרוטוקול זה. מאז EGF מעוררת התמיינות של תאים acinar על תאי ductal, השיטה בזאת, אשר לא דורשת ADM-מגרה רכיבי תרבות, עדיף ללמוד מנגנונים של אינדוקציה או רגולציה של אדמירל בשיטה זו, הזהות תא acinar נשמר במהלך culturing ב קולגן, אלא אם כן מגורה להבדיל לתוך תאי ductal. יתר על כן, קשיים בתאים הראשי transfecting יש להתגבר באמצעות מניפולציה ביטוי חלבונים על ידי זיהום ויראלי.

הליך זה מציע לימוד ישיר של ה-ADM, על ידי איזו הדמיה של מבנה ductal אינדוקציה יכול להתרחש באמצעות מיקרוסקופ brightfield ו/או immunofluorescence. הדמיה יישומים, שקופיות קאמרית (ציין את הטבלה של חומרים) הם הטובים ביותר. קיבוע למשך 15 דקות ב 37 ° C עם 4% paraformaldehyde יהיה לתקן תאים בתוך קרום המרתף מטריצה ללא מבנים ductal מטרידה. במהלך זה דגירה, המטריקס קרום המרתף ' נזילות ', יכול להיות בעדינות pipetted עם paraformaldehyde. Immunofluorescence בתאי הקולגן מוטבע מתואר בפירוט בתוך פרוטוקולים נוספים15,16. יישומים נוספים עבור ניתוחים של מנגנוני איתות מעורב על נקודת הקצה של הניסוי כוללים תספיג, qPCR תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS). שישית פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי הוא חומר מספיק לניתוח דוגמא אחת דרך תספיג או qPCR.

מגבלות של פרוטוקול זה נובעים השימוש של מטריצת קולגן או קרום המרתף, בה לכל אחד יש יתרונות וחסרונות. בעוד embedment של תאים בקולגן יפיקו רק צינורות אם ניתנים גירויים, קרום המרתף מטריקס embedment ייצרו צינורות ללא גירויים נוספים. עם זאת, גודל ductal במטריצת קרום המרתף הוא פלט מדיד. הגבלה נוספת זה הזמן מעורב בהליכים האיסוף בשלב 5, אשר יכול להשפיע על ביטוי גנים. מגבלה זו יכולה להיות חמאני המאשרת את התוצאות המתקבלות מן סופג המערבי עם immunofluorescence, שבו קיבוע הזמן הוא הרבה פחות מזה של הזמן האיסוף qPCR או ניתוח תספיג חלבון.

בנוסף זיהום adenoviral, זיהום lentiviral ניתן להשתמש בתאים הראשי. זיהום lentiviral, הוספת ריאגנט משפר זיהום ויראלי של µg/mL 6 (ראה טבלה של חומרים) לתאים ובעדינות מערבולת הלוחות. לאחר מכן, להוסיף את lentivirus (עם כייל לפחות 107 TU/mL)-לדילול 1:1,000 ו שוב, בעדינות מערבולת. תקופת דגירה של h 3-5 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) ולאחר מכן להמשיך embedment של תאים במטריצת קולגן או קרום המרתף. כדי ליצור lentivirus עם פלסמיד עניין, השתמש המיקס אריזה lentiviral ציין בטבלה של חומרים.

שינוי נוסף יכול לכלול בידוד תאים של עכברים המבטאים קראסG12D. בעכברים הללו, אשר כבר שהותירה אזורים עם נגעים ADM הייתה, עיכול collagenase לוקח יותר זמן. זהירות פיקוח של collagenase עיכול, כפי שמתואר לשלבים הקריטיים ופתרון בעיות, נדרש. הרקמה יותר נורמלי עכבר כולל, ככל העיכול ייקח (סביב שעה בשביל p48Cre בת שבוע-12; LSL-KrasG12D עכבר). מאז שיש וריאציה עצום בין עכברים בני אותו גיל, אנו מייעצים לבודד תאים acinar העכבר LSL -קראסG12D ולבצע ניצול cre כדי לקבל ביטוי קראס oncogenic זיהום adenoviral או lentiviral. גם יצוין כי הפרוטוקול שלנו ממוטבת עבור בידוד של תא acinar לחקור את תהליך ה-ADM. בידודו של תאים ADM, הייתה מן קראסG12D-הבעת עכברים עבור תא צורב תרבות דורש שינו פרוטוקולים.

צעד קריטי הוא משך הזמן הלבלב קצוצים מוציא ב- collagenase. Collagenase אידיאלי העיכול הזמן יכול לנוע בין העכבר העכבר ובין המון collagenase של אותה חברה. הפעם צוין בפרוטוקול מתאים pancreata שקילה על 0.250 g. יותר מדי זמן רב עלולה לגרום נזק, להרוג תאים, בעוד מועד קטן מדי יגרום לעיכול לא שלם, ולכן פחות תאים זה תצליח לעבור תהליך הסינון על גבי צלחת הסופי. לבדוק את הדיסוציאציה מבחינה חזותית על-ידי מחפש פירוט החלקים קצוץ-up הלבלב; הפתרון צריך לפנות מעונן. בנוסף, לפני הפסקת התגובה collagenase עם HBSS קר, הפתרון שאפשר לקחת עם pipet 5 מ"ל, איפה הקלות שבה הפתרון שאפשר לקחת יציין אם היא מתאימה לעצור את התגובה. שיקול נוסף המספר של pancreata שנקטפו. אם יותר מ לבלב אחד הוא מבודד בו זמנית, העבודות ההליך הטוב ביותר כאשר pancreata נשמרים נפרד.

נקודה חשובה נוספת כדי להבטיח בריא התרבות של תאים acinar העיקרי הוא טיפול יש לנקוט כאשר pipetting הפתרון תא acinar. Pipetting נמרצת עשויה לגרום נזק לתאים, לגרום חוסר אוורור היווצרות, אפילו עם תוספת של ידועים inducers ADM, כגון TGF-α. עוד, אם קיימות בעיות הקיום, צנטריפוגה בשלבים 2.4, 2.6 2.7 ניתן לקחת עד x 300 גרם לייצר גלולה רך יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 (CA200572) מ- NIH כדי PS. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של המכון הלאומי לסרטן או מוסדות לאומיים של Health.The והנושא היה אין תפקיד ללמוד עיצוב, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה פרסום, או הכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C shaking incubator Thermo Scientific SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator NUAIRE NU-5500
50 mL tubes Falcon 352070
Absorbent pad, 20" x 24" Fisherbrand 1420662
Adenovirus, Ad-GFP Vector Biolabs  1060
Aluminum foil Fisherbrand 01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 Fisher Scientific  305167 Use as pins for dissection 
Beaker, 600 mL Fisherbrand FB-101-600
Bleach, 8.25% Clorox 31009
Cell Recovery Solution Corning 354253 Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge  Beckman Coulter Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone Sigma D1756 Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. 
Ethanol, 200 proof Decon Laboratories  2701
Fetal Bovine Serum  Sigma F0926-100mL
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Forceps  Fine Science Tools 91127-12
Glass slide, 8-well Lab-Tek 177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red Fisher Scientific SH3048801   
Ice bucket, rectangular Fisher Scientific  07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisherbrand 01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)  Minigrip SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower Invitrogen 44-2050
Matrigel Corning 356234 Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm Bemis PM992 Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS Fisher Scientific SH30028.02
Penicillin-Streptomycin  ThermoFisher Scientific 15140122
Pipet tips, 10 µL USA Scientific 1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL  Olympus Plastics 24-165RL
Pipet tips, 200 µL  USA Scientific 1111-1700
Pipet-Aid Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL Gilson F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL Gilson F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL Gilson F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL Gilson F123601
Pipettes, 10 mL  Falcon 357551
Pipettes, 25 mL Falcon 357525
Pipettes, 5 mL  Falcon 357543
Plate, 12-well Corning Costar 3513
Plate, 24-well plate Corning Costar 3524
Plate, 35 mm Falcon 353001
Plate, 6-well Falcon 353046
Polybrene EMD Millipore TR-1003-G Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. 
Polypropylene Mesh, 105 µm Spectrum Labs 146436
Polypropylene Mesh, 500 µm  Spectrum Labs 146418
Scissors  Fine Science Tools 14568-12
Scissors  Fine Science Tools 91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Scientific BP328-500
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8 Gibco 17075029
Spatula Fisherbrand 21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters  Millipore SCGP00525
TGF-α R&D Systems 239-A-100
Type I Rat Tail Collagen Corning 354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder) Sigma W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium  Fisherbrand 02-202-101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61, (3), 449-458 (2012).
  2. Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144, (6), 1170-1179 (2013).
  3. Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18, (1), 1-6 (1995).
  4. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22, (6), 737-750 (2012).
  5. Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120, (2), 508-520 (2010).
  6. Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63, (9), 2016-2019 (2003).
  7. Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (49), 19327-19332 (2007).
  8. Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202, (3), 563-577 (2013).
  9. De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18907-18912 (2008).
  10. Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18913-18918 (2008).
  11. Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14, (10), 2325-2336 (2016).
  12. Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43, (5), 577-578 (2007).
  13. Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90, (12), 1052-1060 (2011).
  14. Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  15. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
  16. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics