Cancer Research
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![Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)](https://cloudfront.jove.com/files/thumbs/60445_t.png)
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Summary May 20th, 2019
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환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.
Transcript
PDX는 암 실험 전 임상 연구에 혁명을 일으켰습니다. 우리는 지금 실험실에서, 환자에서 무슨 일이 일어나고 있는지 모방할 수 있습니다. 그리고 지금 우리는 저항을 극복하는 방법과 장기적으로, 우리는 환자의 생존을 증가시킬 수있는 방법에 대해 작업 할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 민샤오입니다. 시작하려면 이전에 수집된 흑색종 조직을 멸균 페트리 접시로 옮긴다. 외과 가위, 메스 블레이드 및 집게와 함께 작업, 먼저 가능한 한 정상적인 조직에서 정상적인 조직을 제거합니다.
그리고 종양 내중앙에 위치한 창백한 백색 이같은 조직에 의해 확인된 괴사 조직을 제거합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 초기 종양 덩어리를 수술 마우스 이식을 위해 거의 동일한 조각으로 세분화하십시오. 종양 조직이 기계적 해리에 너무 어려운 경우 메스를 사용하여 종양 덩어리를 가능한 한 미세하게 다진하여 슬러리를 형성하십시오.
칼슘과 마그네슘 이온없이 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액으로 슬러리를 50 밀리리터 튜브로 옮춥니까. 섭씨 4도에서 4분간 220배 g의 원심분리기. 상체를 제거 한 후, 종양 조직의 1 그램 당 따뜻하고 신선한 소화 매체의 10 밀리리터에서 슬러리를 다시 중단합니다.
튜브를 섭씨 37도의 수조에 20분간 놓고 5분마다 일회용 파이펫과 힘차게 섞습니다. 최대 50밀리리터의 HBSS를 사용하여 슬러리를 씻고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 4분간 220배 g로 씻어낸 다음 상무제를 제거합니다. 종양 조직의 1 그램 당 사전 따뜻하게 TEG 버퍼의 다섯 밀리리터를 추가 부드럽게 다시 중단 흔들어, 혼합하지 않고 2 분 동안 37섭씨에 튜브를 배치합니다.
트립신을 담금질하려면 섭씨 4도에서 4분간 220배의 차가운 염색 매체와 원심분리기의 동일한 볼륨을 최소 한 권 이상 추가합니다. 상체를 제거한 후 종양 조직 1그램당 10밀리리터의 염색 매체를 추가하고, 위아래로 배관하여 펠릿을 다시 중단한다. 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 필터링하여 마우스 주입을 위한 단일 셀 서스펜션을 얻습니다.
외과 적 절제 또는 외과 생검 조직을 이식하기 위해 NSG 6 ~ 8 주 된 마취 마우스의 허리에서 모발을 먼저 면도하여 약 1.5 센티미터에서 3 센티미터 부위를 머리카락없이 남깁니다. 종양 덩어리를 준비하고 페트리의 종양 슬러리를 외과 이식을 위해 개별 고분으로 나눕니다. 메스 블레이드를 사용하여 마우스 뒤쪽중앙에 약 5밀리미터 길이의 절개를 합니다.
한 쌍의 집게로 작업자 맞은편에 있는 절개 쪽의 피부에 생명을 불어넣습니다. 반면에 가위를 사용하면 작은 가위 절단으로 근막을 부드럽게 절단하여 근육을 분리하여 종양 조직을 위한 포켓을 만듭니다. 메스 블레이드를 사용하여 종양 척 1척과 종양 슬러리 조직의 개별 마운드를 집어 들고 조직을 만든 주머니에 부드럽게 넣습니다.
그런 다음 주머니에 종양 조직 마운드에 인공 세포 외 매트릭스 100 마이크로 리터를 추가합니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 양 끝에 절개를 당겨 상처 가장자리가 가까이 다가옵니다. 그런 다음 상처 클립을 하나 또는 두 개 바르게 발라 상처를 닫습니다.
피하 진통제의 킬로그램 당 1 ~ 5 밀리 그램을 주입. 치유가 완전히 되면 약 7 일 후에 상처 클립을 제거하십시오. 만져볼 수 있는 종양을 확인하기 위해 매주 한 번 마우스를 모니터링합니다.
종양이 원하는 볼륨에 도달하면 외과 용 집게를 사용하여 안락사 마우스의 종양에 인접한 피부를 들어 올리고 곡선 가위를 사용하여 수평 절단을하십시오. 무딘 분리 기술을 사용하여 종양의 양면과 종양 위에 피부를 동원하여 종양을 노출시합니다. 가위와 메스 블레이드를 사용하여 종양을 근막에서 분리합니다.
종양을 잘라 멸균 페트리 접시로 옮기. 종양을 작은 조각으로 자르고 종양에서 괴사 조직을 제거하십시오. 향후 이식을 위해 종양 조직을 뱅크하기 위해 2~3개의 작은 종양 조각을 가지고 1밀리미터보다 작은 조각으로 잘라냅니다.
모든 다진 조직을 2밀리리터 극저온 사악한 것으로 옮기. 냉동 용지 1 밀리리터를 넣고 잘 섞습니다. 유리병을 미리 냉각된 isopropanol 기반 세포 동결 용기에 넣고 밤새 영하 80도의 냉동고에 용기를 보관한 다음 바이알을 액체 질소 저장장치로 옮춥니다.
하류 분해를 위한 동결 조직을 스냅하려면 종양 조직 조각을 극저온 유리병에 넣고 극저온 사악을 액체 질소에 즉시 넣고 바이알을 영하 80도 냉동고에 보관하십시오. 종양 조직을 성장시키는 세 가지 다른 방법을 비교했을 때, 효소 소화의 사용과 종양 세포의 단일 세포 현탁액이 가장 성공적이었다. 더 빠른 종양 성장을 허용하는 것 외에도, 종양 척 및 슬러리 방법은 5 에서 10 마우스로 만 확장 될 수있는 반면, 1개의 초기 종양이 10 에서 20 마우스로 확장되기에 충분했습니다.
흑색종 환자 유래 xenograft 모형은 수시로 치료에 있을 때 환자가 표시한 약 감도를 반영합니다. 처음 BRAF 억제제에 반응하지만 궁극적으로 재발한 흑색종 환자로부터 유래된 이노크이식은 BRAF 단백질 억제제에 대한 초기 민감도, MEK 키나아제 억제제에 대한 초기 감도를 보였지만 종양은 궁극적으로 재발했다. 그것은 은행PDX 조직을 준비 할 때주의하는 것이 중요합니다, 이것은 미래의 PDX 확장에서 성공을 보장 할 것입니다, 치료 시험, 뿐만 아니라 특성화.
PDX 물질, 단세포 RNA 염기서열 분석, 전체 외음질 염기서열 분석 및 프로테오믹 특성화를 통해 실험실이 치료 저항을 해부하기 위해 활용하는 많은 방법 중 하나입니다. PDX 기술은 연구원이 플라스틱에서 자란 전통적인 암 모형에 대하여 인간 적인 환자에 있는 종양 생물학을 더 잘 재구성하는 종양 세포를 사용하여 치료 저항을 조사할 수 있습니다. 이러한 이점을 통해 보다 예측적인 통찰력을 얻을 수 있습니다.
연구원은 인간 적인 환자에서 파생 된 종양 조직을 취급할 때 항상 주의하고 생물 안전 수준 2개의 예방 조치를 이용해야 합니다.
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