Количественная подклеточная убиквитин-протеасомная активность в мозге грызунов

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол предназначен для эффективной количественной оценки активности убиквитино-протеасомного системы (UPS) в различных клеточных отсеках мозга грызунов. Пользователи могут изучить иСП функционирования в ядерных, цитоплазмических и синаптических фракций в одном животном, уменьшая количество времени и количество животных, необходимых для выполнения этих сложных анализов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Система убиквитин-протеасома является ключевым регулятором деградации белка и различных других клеточных процессов в эукариотах. В головном мозге, увеличение активности убиквитина-протеамы имеют решающее значение для синаптической пластичности и формирования памяти и аномальные изменения в этой системе связаны с различными неврологическими, нейродегенеративными и психическими расстройствами. Одна из проблем при изучении убиквитина-протеасомы функционирования в головном мозге является то, что он присутствует во всех клеточных отсеках, в которых белковые цели, функциональная роль и механизмы регулирования могут сильно различаться. В результате, способность непосредственно сравнивать мозг убиквитин белка ориентации и протеасомы каталитической активности в различных субклеточных отсеков в одном животном имеет решающее значение для полного понимания того, как ИБП способствует синаптической пластичности, памяти и болезней. Описанный здесь метод позволяет сбор ядерных, цитоплазмических и сырых синаптических фракций из одного и того же мозга грызунов (крысы), а затем одновременной количественной оценки протеасомного каталитической активности (косвенно, обеспечивая активность протеасомного ядра только) и связи конкретных убиквитин белка пометки. Таким образом, метод может быть использован для непосредственного сравнения субклеточных изменений в убиквитин-протеасомактивности в различных областях мозга в одном животном во время синаптической пластичности, формирования памяти и различных состояний заболеваний. Этот метод также может быть использован для оценки субклеточного распределения и функции других белков в пределах того же животного.

Introduction

Система убиквитин-протеасомы (UPS) представляет собой сложную сеть взаимосвязанных белковых структур илигазов, которая контролирует деградацию большинства недолговечных белков в клетках 1. В этой системе, белки помечены для деградации или других клеточных процессов / судьбы небольшой модификатор убиквитин. Целевой белок может приобрести 1-7 модификаций убиквитина, которые могут соединяться на одном из семи лизиновых (K) участков (K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63) или N-терминалметионина (M1; как известно, линейный) в предыдущем ubiquitin2. Некоторые из этих полиубиквитина теги деградации конкретных (K48)3, в то время как другие в значительной степени независимы от процесса деградации белка (M1)4,5,6. Таким образом, процесс убликвитирования белка невероятно сложен, и способность к количественной оценке изменений в определенном теге полиубиквитин имеет решающее значение для понимания роли данной модификации в клеточной работе. Дальнейшее осложняет изучение этой системы, протеасома, который является каталитической структурой UPS7, как ухудшает белки, но также может быть вовлечен в другие непротеолитические процессы8,9. Не удивительно, что с момента своего первого открытия, нормальная и аномачная убиквитин-протеасомная активность была вовлечена в долгосрочное формирование памяти и различные состояния заболеваний, в том числе многие неврологические, нейродегенеративные и психиатрические расстройства10,11. В результате, методы, которые могут эффективно и эффективно количественно UPS деятельности в головном мозге имеют решающее значение для в конечном итоге понимание того, как эта система дисрегулируется в состоянии болезни и в конечном итоге разработка вариантов лечения ориентации убиквитин и / или протеасомы функционирования.

Существует ряд проблем в количественной оценке убиквитина-протеасомы активности в тканях мозга от крыс и мышей, которые являются наиболее распространенными модельными системами, используемыми для изучения функции ИБП, в ключая 1) разнообразие модификаций убиквитина, и 2) распределение и 2) дифференциальная регуляция ИПС, функционирующих между субклеточными отсеками12,13,14. Например, многие из ранних демонстраций убиквитина-протеасомы функции в головном мозге во время формирования памяти использовали целые клеточные лисаты и указали на временное увеличение как убиквитинации белка, так и протеасомной активности15, 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20. Однако, однако, мы недавно обнаружили, что убликвитин-протеасом активность сильно различается по субклеточным отсекам в ответ на обучение, с одновременным увеличением в некоторых регионах и уменьшается в других, картина, которая значительно отличается от того, что ранее сообщалось в целых клеточных лисатов21. Это согласуется с ограничением целого клеточного подхода, поскольку он не может разъединять вклад изменений в активность ИПС в различных субклеточных отсеках. Хотя более поздние исследования использовали синаптические протоколы фракции для изучения ИПС специально в синапсах в ответ на обучение22,23,24, методы, используемые окклюзии способность измерять ядерные и цитоплазмические убиквитин-протеаомы изменения в том же животном. Это приводит к ненужной необходимости повторять эксперименты несколько раз, собирая различные субклеточные фракции в каждом. Это не только приводит к большей гибели животных, но и устраняет возможность непосредственно сравнивать активность ИБП в различных субклеточных отсеках в ответ на данное событие или во время определенного состояния заболевания. Учитывая, что белковые мишени убиквитина и протеамы сильно различаются по всей клетке, понимание того, как дибиквитин-протеасомы сигнализации отличается в различных субклеточных отсеков имеет решающее значение для определения функциональной роли ИБП в мозга при формировании памяти и неврологических, нейродегенеративных и психических расстройств.

Для решения этой потребности, мы недавно разработали процедуру, в которой ядерные, цитоплазмические и синаптические фракции могут быть собраны для данной области мозга от того же животного21. Кроме того, для учета ограниченного количества белка, который может быть получен от сбора нескольких субклеточных фракций из одного и того же образца, мы оптимизировали ранее установленные протоколы, чтобы прозаизировать активность протеасомы in vitro и специфическую связь убиквитинация белка в лисизированных клетках, собранных из ткани мозга грызунов. Используя этот протокол, мы смогли собрать и напрямую сравнить обучающие-зависимые изменения в протеасомой активности, K48, K63, M1 и общих уровнях полиубиквитина в ядре и цитоплазме и на синапсах в боковой миндалине крыс. Здесь мы подробно описываем нашу процедуру (Рисунок1),которая может значительно улучшить наше понимание того, как ИБП участвует в формировании долгосрочной памяти и различных состояниях заболеваний. Тем не менее, следует отметить, что протеасомная активность in vitro, обсуждаемая в нашем протоколе, хотя и широко используется, не измеряет непосредственно активность полных 26S протеасомы комплексов. Скорее, этот ассс измеряет активность ядра 20S, то есть он может служить только в качестве прокси, чтобы понять деятельность самого ядра, в отличие от всего 26S протеасомы комплекса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, включая животных субъектов были одобрены Политехнический институт Вирджинии и Государственного университета институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

1. Сбор и вскрытие тканей грызунов мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к различным областям мозга и использоваться с различными процедурами сбора тканей. Ниже приведена процедура, используемая в нашей лаборатории для субклеточной ткани мозга крысы, используя 8-9 недельный самец Sprague Dawley крыс. Для того, чтобы обработать все сотовые отсеки в одном животном, раздел 1.3. должны соблюдаться независимо от процедуры сбора тканей.

  1. Извлеките мозг крысы и поместите в криогенную чашку предварительно охлажденной на сухом льду. Вспышка заморозить мозг на сухом льду, или использовать жидкий азот, если это возможно, и передать в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию. Мозги могут быть вскрыты в тот же день или в более позднее время.
  2. Удалить замороженный мозг из криогенной чашки и поместить в матрицу мозга крысы охлажденной сухим льдом. Каждый слот на матрице соответствует 0,5 мм, которые могут быть использованы для определения приблизительного расположения региона интереса (ROI).
    1. Используя атлас rat Brain, вставьте лезвие бритвы в матрицу непосредственно перед (передним) прогнозируемого начала рентабельности инвестиций. Затем вставьте лезвие бритвы сразу же в предсказанном конце (задней) рентабельности инвестиций.
    2. Удалите ломтик между лезвиями бритвы с помощью скальпеля и поместите на микроскоп слайд охлажденной на сухом льду. Как правило, секции толщиной 2-3 мм, но это зависит от рентабельности инвестиций.
  3. С помощью скальпеля, вскрыть рентабельность инвестиций в одном полушарии за один раз. Поместите каждое полушарие в отдельные микроцентрифугные трубки мощностью 1,5 мл, предварительно охлажденные на сухом льду. Замороженная ткань может быть немедленно использована для субклеточной фракционации или обработана на более позднем времени, если хранится при -80 градусов по Цельсию.

2. Ядерная и цитоплазматическая добыча

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются предизготовленные запаса растворы общих лабораторных химических веществ, в том числе 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Дитиотрейтол (DTT), 0,5 М этиленденедиаминэтинететраацетическая кислота (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) и 50% глицерол. Если конечная точка используется в протеасомо-активности анализы, глицерол и АТФ могут быть добавлены во все буферы, чтобы помочь предотвратить разборку протеасомного комплекса во время лиза.

  1. Подготовьте лисийный буфер. Добавьте 8,63 мл ультрачистой (деионированной и дистиллированной) воды в стерильную коническую трубку 15 мл.
    1. К конической трубке добавьте 1000 л 0,1 М HEPES, 15 л из 1 M MgCl, 100 л из 1 М ДТТ и 50 л 10% NP-40.
    2. Добавьте 100 л ингибитора протеазы и 100 л ингибитора фосфатазы. Кратко вихрь раствор смешать и поместить на мокрый лед, чтобы охладить. Обратите внимание, что раствор может иметь желтый цвет от ингибитора фосфатазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ингибиторов протеазы имеет важное значение для сохранения белка и обеспечения специфичности протеасомы in vitro анализа активности. Тем не менее, эти ингибиторы могут также привести к незначительному снижению активности протеасомы, а это означает, что активность измеряется на анализе in vitro может быть занижена фактических уровней активности.
  2. Подготовьте буфер извлечения. Добавьте 5,925 мл ультрачистой (деионированной и дистиллированной) воды в стерильную коническую трубку 15 мл.
    1. К конической трубке добавьте 2000 л 0,1 М HEPES, 1250 л 50% глицерола, 15 л 1 M MgCl2, 5 Л 1 М ДТТ, 5 л 0,5 М ЭДТА и 600 л 5 М NaCl.
    2. Добавьте 100 л ингибитора протеазы и 100 л ингибитора фосфатазы. Кратко вихрь раствор смешать и поместить на мокрый лед, чтобы охладить. Обратите внимание, что раствор может иметь желтый цвет от ингибитора фосфатазы.
  3. Удалите микротрубку центрифуги мощностью 1,5 мл, содержащую одно полушарие рентабельности инвестиций, из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию. Убедитесь, что используемое полушарие уравновешивается в условиях экстракции для каждой экспериментальной группы. Например, в двухгрупповом эксперименте используйте левое полушарие для первых двух животных в каждой группе и правого полушария в течение следующих двух образцов и т.д.
  4. С помощью скальпеля, передача замороженных тканей мозга в 2 мл стекла тефлоновые гомогенизатор. Добавьте 500 л люсис буфера в тефлоновые трубки.
    1. Используя пестик B, гомогенизировать ту же ткань с помощью 15 ударов, пока не будет видимого количества твердого материала. Используйте поворотное движение (по часовой стрелке или против часовой стрелки) во время каждого хода.
  5. Используя пипетку мощностью 1000 л, перенесите гомогенизированный образец в новую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Поместите трубку на мокрый лед и инкубировать в течение 30 минут.
  6. Поместите трубку в микроцентрифуге и вращайтесь в течение 10 мин при 845 х г и 4 градусах Цельсия. После завершения, тщательно удалить супернатант путем pipetting и место в новый 1,5 мл микроцентрифуговой трубки; это цитоплазмическая фракция, которая может храниться на льду или при 4 градусах По Цельсию до раздела 2.9.
  7. Добавьте 50 зл буфера извлечения в результирующую гранулу и приостановите путем пайпетирования. Не вихрь гранулы. Поместите трубку, содержащую повторно еле и инкубировать в течение 30 минут.
  8. Поместите трубку в микроцентрифуге и вращайтесь в течение 20 мин при 21 456 х г, 4 кв. C. После завершения, тщательно удалить супернатант путем pipetting и место в новый 1,5 мл микроцентрифуговой трубки; это ядерная фракция. Гранулы теперь могут быть отброшены.
  9. Измерьте концентрацию белка цитоплазмических и ядерных извлечений с использованием протеинового анализа Dc (в соответствии с инструкциями производителя) или любого эквивалентного исследования для образцов, собранных с использованием неионических моющих средств. Немедленно приступайке к протеасомного асссе активности (раздел 4) или западному промокну (раздел 5). Кроме того, образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо.

3. Коллекция синаптической фракции

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются предизготовленные биржевые решения общих лабораторных химических веществ, в том числе 1 M Tris (pH 7.5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl и 10% SDS. Если конечная точка используется в протеасомо-активности анализы, глицерол и АТФ могут быть добавлены во все буферы, чтобы помочь предотвратить разборку протеасомного комплексов во время lysis

  1. Подготовьте буфер TEVP с сахарозой 320 мМ. Добавьте 60 мл ультрачистой (деионированной и дистиллированной) воды в чистый стакан 100 мл.
    1. К стакану добавьте 1300 л из 1 М Трис (рН 7,5), 260 л 0,5 М ЭДТА, 100 л ингибитора протеазы, 100 л ингибиторного коктейля фосфатазы и 10,944 г сахарозы. Смешайте с перемешивания бар до сахарозы полностью растворяется.
    2. Доведите рН до 7,4 евро, добавив соляную кислоту (HCl) в раствор с помощью пипетки.
    3. Перенесите раствор в объемную колбу объемом 100 мл. Довести объем до 100 мл, добавив ультрачистую воду. Охладите окончательное решение на льду до тех пор, пока это необходимо.
  2. Подготовьте буфер гомогенизации. Добавьте 60 мл ультрачистой (деионированной и дистиллированной) воды в чистый стакан 100 мл.
    1. К стакану добавьте 5000 л из 1 М Три (рН 7,5), 3000 л 5 М NaCl, 100 Л коктейля ингибитора протеазы, 100 Л ингибиторного коктейля фосфатазы и 2000 Л 10% SDS. Смешайте с перемешать бар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ионные моющие средства могут вмешиваться в протеасомную активность анализов, приводя к денатурированию протеасомного комплекса. Объем SDS может быть снижен, чтобы помочь сохранить протеасомную функцию при желании.
    2. Доведите рН до 7,4 евро, добавив HCl dropwise в решение с помощью пипетки.
    3. Перенесите раствор в объемную колбу объемом 100 мл. Доведите объем до 100 мл, добавив ультрачистую воду. Храните окончательное решение при комнатной температуре; не охлаждайте, как SDS будет осаждать из раствора.
  3. Удалите центрифугу 1,5 мл, содержащую одно полушарие рентабельности инвестиций, из морозильной камеры -80 градусов. Убедитесь, что используемое полушарие уравновешивается в условиях экстракции для каждой экспериментальной группы. Например, в двухгрупповом эксперименте используйте левое полушарие для первых двух животных в каждой группе и правого полушария в течение следующих двух образцов и т.д.
  4. С помощью скальпеля, передача замороженных тканей мозга в 2 мл стекла тефлоновые гомогенизатор. Добавьте 500 кЛ буфера TEVP в тефлоновые трубки.
    1. Используя пестик B, гомогенизировать ту же ткань с помощью 15 ударов, пока не присутствуют видимые передачи твердого материала. Используйте поворотное движение (по часовой стрелке или против часовой стрелки) во время каждого хода.
  5. Используя пипетку мощностью 1000 л, перенесите гомогенизированный образец в новую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Центрифуги образца на 1000 х г в течение 10 мин, 4 КС.
  6. Соберите супернатант и перенесите на новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл с помощью 1000-ти-пипетки. Центрифуги образца на 10000 х г в течение 10 мин, 4 КС. Оригинальный гранулы (P1) содержат ядра и крупные обломки и могут быть отброшены.
  7. Перенесите супернатант в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл. Это цитосоликическая фракция. Добавьте 50 зл буфера гомогенизации в пеллеты (P2) и приостановите путем трубации до тех пор, пока не будет виден твердый материал.
  8. Центрифуги образца на 20000 х г в течение 10 мин, 4 КС. Перенос супернатанта на новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл; это сырая синаптосомальная Мембрана (Синаптическая) Фракция. Гранулы могут быть отброшены.
  9. Измерьте концентрацию белка синаптической фракции с помощью протеинового анализа Dc (согласно инструкциям производителя) или любого эквивалентного анализа образцов, собранных с использованием ионных моющих средств. Немедленно приступайке к протеасомного асссе активности (раздел 4) или западному промокну (раздел 5). Кроме того, образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо.

4. Протеасомы деятельности Ассай

ПРИМЕЧАНИЕ: Протеасомная активность может быть измерена в гомогенизированной ткани мозга с помощью слегка измененной версии 20S Proteasome Activity Kit. Этот асссенена напрямую не измеряет активность полных 26S протеасомы комплексов. Скорее, он измеряет активность ядра 20S, то есть он может служить только в качестве прокси, чтобы понять деятельность самого ядра, в отличие от всего 26S протеасомы комплекса. Успех этого анализснижается с повторными циклами замораживания-оттепели и/или повышением уровня моющих средств, особенно ионных, и требует использования считывателя пластин с набором фильтра 360/460 (возбуждение/выброс) и возможностями нагревания до 37 градусов по Цельсию.

  1. Настройки плиты читателя: Предварительно разогреть до 37 градусов по Цельсию и удерживать через бег.
    1. Установите возбуждение до 360 и выброс до 460. Если 96 хорошо пластины используется ясно, установите положение оптики на дно. Если используется темная/черная пластина 96 скважин, установите положение оптики к верхнейчасти.
    2. Установите старые модели чтения пластин для автоматического получения под флуоресцентными опциями чтения; новые модели предустановить для этого. Программа кинетического запуска со временем 2 ч, сканирование (чтение) каждые 30 минут.
  2. Восстановите 10-x буфер асссея, представленный в комплекте с 13,5 мл ультрачистой воды. Добавьте 14 qL из 100 мМ АТС в буфер 1x; это значительно повышает протеасомную активность в образцах и повышает надежность ассс. Окончательный буфер 20S Assay может храниться на льду или при 4 градусах По Цельсию до тех пор, пока это необходимо, и является стабильным в течение нескольких месяцев.
  3. Восстановите стандарт AMC, представленный в комплекте с 100 зл ИТ ДМСО. Выполните этот шаг в темноте или при условиях низкой освещенности, так как стандарт светочувствительный.
  4. Создайте кривую стенда AMC, используя восстановленный стандарт, в темноте или в условиях низкой освещенности.
    1. В отдельных микроцентрифуговых трубках 0,5 мл добавьте 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 и 0 л стандарта AMC, что соответствует концентрации 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0 км АМ.
    2. К этим трубам, в том же порядке, добавить 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 и 100 Л 20S Assay буфера. Это создает ряд высоких и низких концентраций AMC, которые будут использоваться для калибровки читательных пластин и анализа протеасомой активности в гомогенизированных образцах.
    3. Храните все разбавленные стандарты на льду в темноте до необходимости.
  5. Восстановите протеасомы субстрат (Suc-LLVY-AMC), представленный в комплекте с 65 Зл ДМСО. Выполните этот шаг в темноте или при условиях низкой освещенности, так как субстрат светочувствительный. Создайте 1:20 разбавления протеасомы субстрата в новой 1,5 мл микроцентрифуговой трубки с использованием буфера 20S Assay. Храните разбавленный субстрат на льду в темноте до необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если пластина будет иметь 10 образцов и 1 пустой, вам понадобится достаточно разбавленного субстрата для 22 скважин (с дубликатами) по 10 Лл на скважину. Это приравнивается к 220 мл нужно 30 qL для трубации ошибки, требующие 12,5 зл и 237,5 л 20S Ассай буфера.
  6. Оттепель желаемых образцов (если замороженные) и добавить нормализованное количество в 96 хорошо пластины. Выполнить каждый образец в дубликатах. Количество необходимых образцов зависит от подготовки тканей. Как правило, 10-20 мкг достаточно для любой субклеточной фракции.
  7. Доведите объем пробной скважины до 80 л с ультрачистой водой. Добавленное количество зависит от объема добавленной выборки. Например, если в пробе 1 было 4,5 л белка, а в пробе 2 - 8,7 л, то необходимое количество воды составит 75,5 л и 71,3 л соответственно. В двух отдельных скважинах добавьте 80 кЛ воды в одиночку; это будут пробелы в Ассе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы ограничить изменения в объеме белка из-за ошибок трубаций, концентрации белка могут быть нормализованы до наименее концентрированного образца. Это позволит использовать один и тот же объем выборки во всех условиях.
  8. Добавьте 10 l из 20S Asay буфера для каждой скважины, в том числе Assay Бланки. Ретранслятор / автоматизированный пипетка рекомендуется здесь, чтобы обеспечить последовательный объем ассеа через скважины.
  9. Необязательно: На этом этапе, ввести в пробирке манипуляции при желании; это потребует, чтобы каждый образец имеет дополнительные 2 скважины на обработку, в том числе транспортного средства. Если это так, добавьте 5-10 л наркотиков/соединения, представляющих интерес, к 2 из образцовых скважин и эквивалентный объем контроля/транспортного средства к еще 2 скважинам. Поместите тарелку на предварительно разогретый считыватель пластины или в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  10. Выключите свет или введите темную комнату. Добавьте все 100 юаней разбавленных стандартов AMC в новый колодец; каждый стандарт будет иметь одну скважину.
  11. В темноте добавьте 10 кЛ разбавленного протеасомного субстрата к скважинам, содержащим образец и пробелы в анализе, но не к стандарту AMC. Ретранслятор / автоматизированный пипетка рекомендуется здесь, чтобы обеспечить последовательный объем ассеа через скважины.
  12. Поместите пластину в считыватель пластины и начать кинетического запуска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина не должна находиться под постоянным волнением во время кинетической пробежки, однако, пользователь может выбрать при желании
  13. В конце кинетического запуска экспортирует в Microsoft Excel необработанные значения 360/460.
    1. Среднее вместе дубликаты скважин для каждого стандарта, каждый образец и Анализ Бланк для всех 5 сканирований. Сырые флуоресцентные значения должны увеличиваться по всем сканам для образцов, но остаются стабильными (или немного уменьшаться) для стандартов и пробелов assay.
    2. Возьмите самый высокий стандарт AMC и среднее и разделить на известные концентрации (20 мкм). Разделите это значение на концентрацию образца, используемую в анализе, чтобы получить стандартизированное значение AMC. Для каждого образца и среднего показателя Assay Blank делитесь на стандартизированное значение AMC.
    3. Возьмите это окончательное значение и разделите на концентрацию образца, используемую в анализе, чтобы получить нормализованное значение для каждого образца и пробела. Сделайте это для всех 5 сканирований.
    4. Вычесть нормализованное значение Assay Blank из каждого нормализованного значения выборки для всех 5 сканирований.

5. Количественная оценка убивления белка, специфичный для связей

  1. Количественная оценка различных меток полиубиквитина в различных субклеточных фракциях, собранных из ткани мозга грызунов, должна проводиться с использованием различных стандартных протоколов западных прометы в сочетании с уникальными, специфическими поливиквитином антителами.
    1. Для денатурирования смешайте нормализованные образцы с равным объемом буфера образца Laemmli, дополненного q-mercaptoethanol до 5% по объему, согласно инструкции производителя.
    2. Для количественной оценки всех модификаций моноубиквитинации и поликубиквиции независимо от связи используйте антитела панкиквитина.
    3. Чтобы распознать все полиубиквитинатированные белки, используйте убиквитин антитело, которое не перекрестно реагирует с моноубиквицинированием.
    4. Для связи-специфической полиубиквитина, используйте антитела, которые могут обнаружить лизин-27, лизин-48, Лизин-63 и линейной (M1) поликубиквитина.
  2. Для предотвращения перекрестного загрязнения между разработками, которые могут привести к ложному срабатыванию или помешать визуализации другой модификации убиквитина, полосы мембран между разработками, используя 0,1 М НаОХ в течение 10 мин.
    1. Вымойте мембраны в TBS с 0,1% tween дважды в течение 10 минут и блокировать (с помощью любого блокирующего агента предпочтительнее в западном протоколе пятно используется).
    2. Инкубировать мембрану вторичными антителами и перестроиться, чтобы подтвердить, что мембрана была лишена первичных и вторичных антител должным образом.
    3. Рекомендуемые: Для успешного развития различных антител убиквитин без загрязнения, используйте флуоресцентные или ближнего инфракрасного воображения систем. Это часто раз может предотвратить перенос между антителами.
  3. Некоторые убиквитин западные помарки изображения будут предоставлять столбцы различных полос (таких как M1), в то время как другие производят мазок, как шаблон с несколькими или нет четких линий (общие с K48). Для количественной оценки изображенных убиквитин западных помарки, нарисуйте коробку вокруг колонны, которая расширяет всю лестницу молекулярных стандартов.
    1. Отрегулируйте коробку вверх (или вниз), если окрашивание убиквитина распространяется через всю лестницу; это является общим для модификаций Lysine-48 и широко варьируется в зависимости от субклеточных отсеков.
    2. Вычтите фон, который рассчитывается как средняя оптическая плотность фона, непосредственно окружающего столбец со всех сторон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя описанную здесь процедуру, ядерные, цитоплазмические и синаптические фракции были собраны из боковой миндалины мозга крысы(рисунок 1). Чистота отдельных фракций была подтверждена с помощью западного blotting, зондирование с антителами против белков, которые должны быть обогащены или истощены в lysate. В первом полушарии, где была собрана сырая синаптическая фракция, белки нюсинаптическая плотность белка 95 (PSD95) присутствовала в синаптической, но не ядерной фракции, с более низкими уровнями цитоплазмы(рисунок 2A). Это согласуется с предыдущей работой, демонстрирующей, что препарат синаптической фракции изолирует как пресинаптические, так и постсинаптические компоненты25. И наоборот, ядерный белок гистон H3 присутствовал в ядерной, но не синаптической, фракции, с более низким уровнем цитоплазмы(рисунок 2B). Присутствие PSD95 и H3 в цитоплазме согласуется с их цитоплазмическим переводом. Цитоплазмический белок -тубулин присутствовал в нашей цитоплазмической фракции, но в значительной степени отсутствовал в ядерном лисате(рисунок 2С),с более низкимуровнем в синаптическом регионе. Это говорит о том, что мы смогли произвести ядерную фракцию, которая в значительной степени отсутствовала цитоплазматических белков. Наличие тубулина в синаптическом регионе согласуется с предыдущими исследованиями26. Все три фракции показали одинаковые уровни жилья, сохраняя белок q-actin (Рисунок 2D), который был использован в качестве контроля нагрузки. В совокупности эти результаты подтверждают, что чистота ядерных, цитоплазмических и синаптических фракций, собранных из одной боковой миндалины крысы.

Далее, все lysates были подтверждены для функциональной активности протеасомы с помощью описанной модифицированной версии in vitro 20S протеасомы деятельности анализа. Во всех лисатах успех ассая определялся как увеличение количества необработанных флуоресцентных установок (РФС), обнаруженных с первого сканирования (0 мин) до пятого/финального сканирования (120 мин). Для всех этих анализов, 10 КМ AMC был использован в качестве высочайшего стандарта для нормализации сырых флуоресцентных установок (RFU). В сырой синаптической фракции, РФС достиг пика на сканирование 5(рисунок 3A), в результате чего нормализованный РФС чуть менее 0,1 (рисунок3B). В цитоплазмической фракции, РФС увеличился через сканирование(рисунок 3C) с окончательным нормализованным РФС в размере 1,6 евро (рисунок3D). Ядерная фракция также отображала зависящие от времени изменения в РФС(рисунок 3E),с окончательным нормализованным РФС 0,3 (рисунок3F). Различия в протеасомной активности в разных отсеках, вероятно, отражает наличие протеасомы в фракции, которые, как правило, наиболее распространены в цитоплазме и ядре27, отсеки, которые имеют самый высокий уровень активности в нашей Подготовка. Самый низкий уровень активности в синаптическом регионе согласуется с тем, что он является единственным лизатом, который был собран с помощью ионных моющих средств, которые могут снизить протеасомную активность из-за более сурового состояния денатурации. Важно отметить, что РФС не увеличивался во времени в Assay Blanks или в лизатах (синаптическом) инкубированных с высокоспецифическим и мощным ингибитором протеасомы clasto-lactacystin-й-лактоном(рисунок 3G,q-lac), показывая окончательные нормализованные уровни РФС 0,01 и 0,001, соответственно(рисунок 3H). Это говорит о том, что наблюдаемые изменения в РФС были вызваны именно активностью протеасомы, а не другими протеазами. Кроме того, при анализе в экспериментальных условиях наблюдалось увеличение ядерной, но не цитоплазмической, протеасомой активности в боковой миндалине после обучения, которое произошло одновременно со снижением активности синаптической протеасомы в сравнение с контрольных животных(рисунок 4). В совокупности эти результаты подтверждают, что протеасомная активность может быть точно измерена во всех трех субклеточных фракциях, собранных из одной боковой миндалины крысы.

Одним из преимуществ протеасомного анализа активности является то, что манипуляции in vitro могут быть введены в образцы непосредственно перед добавлением протеасомного субстрата, который позволяет идентифицировать конкретные молекулы, которые могут регулировать протеасому в этой конкретной субклеточной фракции. В качестве примера этого, роль CaMKII (кальций / calmodulin зависимых белка киназы II) была оценена в синаптической фракции, суровых денатурированных лизат собраны, так как CaMKII считается регулировать протеасомную функцию в синапсах. Инкубация 30 мин с ингибитором CaMKII myr-AIP (myristolayted autocamtide-2 связанных ингибиторпептид пептид) привело к значительному увеличению протеасомной активности на анализ, который только достиг уровней, которые были 61% от необработанных элементы управления(рисунок 5A). И наоборот, те же манипуляции, применяемые к цитоплазмическому не привело к изменению протеасомной активности от обработанных автомобильными скважинами(рисунок 5B). Эти результаты подтверждают, что протеасомной активностью можно продолжать манипулировать in vitro и что эта манипуляция может иметь различные эффекты в зависимости от собранной субклеточной фракции.

В дополнение к количественной протеасомного активности, описанный протокол может быть использован для измерения субклеточных различий в различных модификациях убиквитина с использованием западных процедур помок. Важно отметить, что метки убиквитина, которые могут быть обнаружены, ограничены наличием специфических антител связи, которые в настоящее время включают K48, K63 и M1 для крыс (обратите внимание: антитела K27 доступны, хотя и не производят обнаруживаемое изображение в любом боковой миндалины фракции или целые клетки lysates при различных условиях). Во всех субклеточных фракциях были обнаружены полиубиквитинация, деградация-независимая линейная/М1 и K63, убиквицинация и деградация конкретных K48. Важно отметить, что при анализе в различных экспериментальных условиях, было увеличение общего(Рисунок 6A), линейный (рисунок6B), K63 (Рисунок 6C) и K48 (Рисунок 6D) полиубичивание в боковой миндалины ядерной фракции после обучения по сравнению с контролем животных. В то же время, в цитоплазменской области, общее полиубиквитинация уменьшилась и K48 убиквитинация увеличилась после обучения, в то время как синаптический K63 убиквитинации было сокращено. В совокупности эти результаты показывают, что в рамках одного и того же животного субклеточного различия в убиквитине белок, специфичных для уликвитина, могут быть точно обнаружены.

Figure 1
Рисунок 1 : Схема для субклеточной фракционирования ткани мозга крысы. Мозг грызунов извлекается, область мозга расчленяется и полушария раскололись. Используя ряд буферов и центрифуги, ядерные и цитоплазмические фракции собираются из одного полушария, в то время как сырая синаптическая фракция собирается из другого. Обе фракции затем используются для протеасомного активности анализов и западной промокания, чтобы рассказать уровни белка полиубичинина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Подтверждение сырой синаптической, ядерной и цитоплазмической чистоты фракций. ()Синаптический белок postsynaptic плотность белка 95 (PSD95; 1:1,000) присутствовал в синаптических, но не ядерной фракции с более низкимуровнем в цитоплазме. (B) Histone H3 (1:500) присутствовал в ядерной, но не синаптической, фракции с более низкой экспрессией в цитоплазме. (C) К-Тубулин (1:1,000) присутствовал в цитоплазмическом, но в значительной степени отсутствует в ядерной, фракции с более низкой экспрессией в синаптической лицизм. (D) Домашний белок З-актин (1:1,000) присутствовал во всех субклеточных отсеках. Области указывают на ожидаемый размер целевого белка. Эта цифра была изменена из Орси, S.A. и др.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Количественная протеасомная активность в ядерных, цитоплазмических и синаптических фракциях, собранных из боковой миндалины одного и того же животного. Во время анализа активности протеамы in vitro обнаружены относительные флуоресцентные единицы (RFU), увеличиваемые с начала(Сканирование 1) до конца (Сканирование 5) анализа в синаптике (A), Цитоплазмическом (C)и ядерных (E) фракциях. Количественная оценка этого изменения от базового значения показала нормализованное значение РФС (относительно 10 ММ AMC) 0,1 в синаптическом (B), 1,6 в цитоплазме (D) и 0,3 в ядерных (F) фракциях. Ингибитор протеасомы «Лак» помешал РФУ изменяться на протяжении всей сессии(G-H). Эта цифра была изменена из Орси, S.A. и др.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Субклеточные различия в протеасомой активности в боковой миндалины того же животного. Увеличение активности ядерной протеасомы было обнаружено у обученных (страх условных) животных по отношению к контролю, что соответствовало снижению активности в пределах синаптической фракции. Цитоплазмическая протеасома активность оставалась на исходном уровне. -П Злт; 0,05 от управления. Эта цифра была изменена из Орси, S.A. и др.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : В продкое манипуляции протеасомы деятельности в собранных синаптических и цитоплазмических фракций. В пробирке манипуляции CaMKII сигнализации через ингибитор AIP снижение протеасомы активность в синаптических (A), но не цитоплазматический (B), фракция от крысы боковой миндалины. Эта цифра была изменена из Jarome, TJ и др.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : Субклеточные различия в убиквитии белка связи специфического в боковой миндалине того же животного после обучения. (A) После обучения произошло увеличение общего убиквитирования в ядерной фракции, что коррелировало с уменьшением цитоплазмической фракции. (B) Было увеличение линейного убиквитирования в ядерной, но не цитоплазматический или синаптический, фракция после обучения. (C) Было увеличение убиквитина K63 в ядерной фракции после обучения, которое коррелирует с уменьшением синаптической фракции. (D) K48 вездесущность увеличилась в ядерной и цитоплазмической, но не синаптический, фракция после обучения. -П Злт; 0,05 от управления. Все полученные убиквитин оптические плотности были нормализованы до уровня к-актина (ниже представительзападных западных пометных изображений в А), который использовался в качестве контроля нагрузки. Эта цифра была изменена из Орси, S.A. и др.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы демонстрируем эффективный метод количественной оценки изменений в активности убиквитин-протеасомы в различных субклеточных отсеках одного и того же животного. В настоящее время большинство попыток измерения субклеточных изменений в активности системы убиквитин-протеасомы были ограничены одним отсеком на образец, что привело к необходимости повторения экспериментов. Это приводит к значительным издержкам и гибели животных. Наш протокол облегчает эту проблему, разделяя полушария, позволяя собирать различные клеточные фракции из каждого полушария одного и того же животного. Используя этот протокол, мы смогли показать в первый раз, что в том же животном убиквитин-протеасомы деятельности дифферепретно изменения в ядерных, цитоплазмических и синаптических фракций в ответ на обучение21.

Основное ограничение описанного здесь протокола заключается в том, что он зависит от количества полученной ткани мозга (образца). Например, как указано выше, этот протокол требует расщепления полушарий данной области мозга. Однако это не всегда возможно, как, например, в некоторых областях, которые присутствуют только в одном полушарии. В этих случаях протокол может быть изменен путем первого гомогенизации всей области мозга в буфере TEVP, используемом в шаге синаптической фракции (раздел 3.1), так как этот буфер свободен от всех денатурирующих агентов. Образец может быть разделен на две равные части по объему. Первая часть может быть использована для синаптической фракции, следуя описанному протоколу. Во второй половине выборки неионическое моющее средство NP-40 может быть добавлено к конечной концентрации 0,05%, а затем центрифугируется, как описано в разделе 2.6. Это позволит разделить цитоплазмические белки в супернатант и ядерные белки в гранулы, которые могут быть дополнительно изолированы после оставшихся шагов в разделе 2. Еще одна проблема в количестве тканей является то, что некоторые области мозга очень малы по размеру, такие как прелимбическая кора. Однако в этих случаях вышеупомянутый протокол все еще может быть использован за счет уменьшения объемов используемых буферов, которые должны быть определены эмпирически на основе размера собранной области мозга. Таким образом, этот протокол может быть изменен даже в более сложных областях мозга, в которых меньше ткани доступна.

Одним из основных преимуществ протокола, который мы излагаем здесь, является то, что он использует общее лабораторное оборудование и реагенты, которые можно найти в большинстве объектов, что позволяет изменить эту методологию даже при ограниченном бюджете или с ограниченными ресурсами. Кроме того, в то время как мы излагаем этот протокол как способ измерения субклеточных изменений в убиквитин-протеасомы сигнализации, эта методология также может быть применена к любому другому белку или клеточному процессу, в котором понимание клеточной локализации и функции важно. Таким образом, этот протокол может иметь широкое применение для понимания субклеточных функций конкретных белков или комплексов во время обучения и памяти или различных состояний болезни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана стартап средств из колледжа сельскохозяйственных и наук о жизни и колледж науки в Вирджинии Tech. T.M. поддерживается Джордж Вашингтон Карвер программы в Вирджинии Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129, (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3, (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15, (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38, (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169, (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45, (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13, (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30, (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54, (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48, (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17, (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6, (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14, (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24, (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319, (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21, (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79, (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16, (20), 6331-6341 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics