げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

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Summary

このプロトコルは、げっ歯類の脳の異なる細胞区画におけるユビキチンプロテアソーム系(UPS)活性を効率的に定量するように設計されている。ユーザーは、同じ動物の核、細胞質およびシナプス画のUPS機能を調べることができ、これらの複雑な分析を行うために必要な時間と動物の数を減らすことができます。

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McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

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Abstract

ユビキチンプロテアソーム系は、真核生物におけるタンパク質分解および他の様々な細胞プロセスの主要な調節剤である。脳では、ユビキチンプロテアソーム活性の増加は、シナプス可塑性および記憶形成のために重要であり、このシステムの異常な変化は、様々な神経学的、神経変性および精神疾患に関連している。脳内でユビキチンプロテアソームが機能する研究における問題の1つは、タンパク質標的、機能的役割および調節機構が大きく異なる可能性があるすべての細胞コンパートメントに存在することです。その結果、同じ動物内の異なる細胞内の異なる細胞内の脳ユビキチンタンパク質ターゲティングおよびプロテアソーム触媒活性を直接比較する能力は、UPSがシナプス可塑性にどのように寄与するかを完全に理解するために重要であり、記憶と病気。ここで説明する方法は、同じげっ歯類(ラット)脳からの核、細胞質および粗シナプス画分の収集を可能にし、続いてプロテアソーム触媒活性の同時定量化(間接的に、プロテアソームコアの活性を提供する)のみ)およびリンケージ特異的ユビキチンタンパク質タグ付け。したがって、この方法は、シナプス可塑性、記憶形成および異なる疾患状態の間に同じ動物における異なる脳領域におけるユビキチン-プロテアソーム活性の細胞内変化を直接比較するために使用することができる。この方法は、同じ動物内の他のタンパク質の細胞内分布および機能を評価するためにも使用することができる。

Introduction

ユビキチンプロテアソーム系(UPS)は、細胞1のほとんどの短命タンパク質の分解を制御する相互接続されたタンパク質構造およびリチウムの複雑なネットワークである。このシステムでは、タンパク質は、小さな修飾子ユビキチンによって分解または他の細胞プロセス/運命のためにマークされます。標的タンパク質は、7つのリジン(K)部位(K6、K11、K27、K29、K33、K48およびK63)またはN末端メチオニン(M1;線形として知られている)のいずれかで一緒にリンクすることができる1-7ユビキチン修飾を獲得することができる。これらのポリウビキチンタグのいくつかは、分解特異的(K48)3であり、他のものはタンパク質分解プロセス(M1)4、5、6とは大きく独立している。したがって、タンパク質ユビキチン化プロセスは非常に複雑であり、特定のポリウビキチンタグの変化を定量化する能力は、細胞機能における与えられた修飾の役割を最終的に理解するために重要である。さらにこのシステムの研究を複雑にし、UPS7の触媒構造であるプロテアソームは、いずれもタンパク質を分解するが、他の非タンパク質分解プロセス8、9にも関与しうる。当然のことながら、その最初の発見以来、正常かつ異常なユビキチンプロテアソーム活性は、長期記憶形成および多くの神経学的、神経変性および精神医学的な疾患状態に関与している。障害10,11.その結果、脳内のUPS活性を効果的かつ効率的に定量化できる方法は、このシステムが疾患状態でどのように調節されるか、およびユビキチンおよび/またはを標的とする治療オプションの最終的な開発を最終的に理解するために重要である。プロテアソーム機能。

ラットやマウスから脳組織のユビキチン・プロテアソーム活性を定量化する上で多くの問題があり、これはUPS機能の研究に使用される最も一般的なモデルシステムであり、1)ユビキチン修飾の多様性、および2)分布および細胞外コンパートメント12、13、14を横切って機能するUPS差分規制。例えば、記憶形成中の脳におけるユビキチン・プロテアソーム機能の初期のデモンストレーションの多くは、全細胞のライサーションを使用し、タンパク質ユビキチン化およびプロテアソーム活性の両方における時間依存性の増加を示した15、16歳,17歳,18歳,19歳,しかし、最近、ユビキチン・プロテアソーム活性は、学習に応じて細胞内の区画全体で大きく変化し、一部の地域では同時に増加し、他の地域では減少し、大きく異なるパターンであることがわかった。以前に報告されたものから全細胞は21をlysates.これは、異なる細胞内区画間でのUPS活性の変化の寄与を解離できないため、細胞全体のアプローチの制限と一致しています。より最近の研究は、学習22、23、24に応答してシナプスで特にUPSを研究するためにシナプス画分プロトコルを採用しているが、使用される方法は、測定する能力を閉塞する同じ動物における核および細胞質のユビキチン・プロテアソーム変化。その結果、実験を何度も繰り返す必要が不要で、それぞれに異なる細胞分画が収集されます。これは動物の生命の損失を大きくするだけでなく、特定の事象に応答するか、特定の疾患状態の間に異なる細胞内区間でUPS活動を直接比較する能力を排除します。ユビキチンおよびプロテアソームのタンパク質標的が細胞全体で大きく異なっていることを考慮すると、ユビキチン-プロテアソームシグナル伝達が異なる細胞内接画においてどのように異なるかを理解することは、記憶形成と神経学的、神経変性および精神疾患の間の脳。

このニーズに対処するために、我々は最近、同じ動物21から所定の脳領域に対して核、細胞質およびシナプス画分を収集することができる手順を開発した。さらに、同じサンプルから複数の細胞分画を収集して得ることができるタンパク質の限られた量を考慮して、我々はインビトロプロテアソーム活性およびリンケージ特異的なアッセイに以前に確立されたプロトコルを最適化したげっ歯類の脳組織から採取した細胞のタンパク質ユビキチン化。このプロトコルを使用して、ラットの横扁桃体における核および細胞質におけるプロテアソーム活性、K48、K63、M1および全体的なタンパク質ポリユービキチン化レベルにおける学習依存的変化を収集し、直接比較することができた。ここでは、UPSが長期記憶形成や様々な疾患状態にどのように関与しているのかについての理解を大幅に改善する可能性のある手順(図1)を詳細に説明します。しかしながら、我々のプロトコルで議論されるインビトロプロテアソーム活性は、広く使用されている一方で、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定しないことに留意すべきである。むしろ、このアッセイは20Sコアの活性を測定し、26Sプロテアソーム複合体全体とは対照的に、コア自体の活動を理解するプロキシとしてのみ役立つことができる。

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Protocol

動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア工科大学と州立大学機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

げっ歯類脳組織の採取と解剖

注:このプロトコルは、様々な脳領域に適用することができ、様々な組織採取手順で使用することができます。以下は、ラットの脳組織の細胞細胞に対して研究室で使用される手順で、8~9週齢の雄スプラーグ・ドーリーラットを用いたものです。同じ動物のすべての細胞コンパートメントを処理するために、セクション1.3。使用される組織採取手順にかかわらず従わなければならない。

  1. ラットの脳を抽出し、ドライアイスで事前に冷やした低温カップに入れます。ドライアイスで脳をフラッシュフリーズするか、液体窒素を使用して-80°C冷凍庫に移します。脳は、同じ日または後の時間に解剖することができます。
  2. 凍結した脳を低温カップから取り出し、ドライアイスで冷やしたラットの脳マトリックスに入れます。マトリックス上の各スロットは 0.5 mm に対応しており、対象領域 (ROI) のおおよその位置を決定するために使用できます。
    1. ラットブレインアトラスを使用して、ROIの予測開始の直前(前方)のマトリックスにカミソリブレードを挿入します。次に、ROIの予測末(後部)に直ちにカミソリブレードを挿入します。
    2. メスを使用してかみそり刃の間のスライスを取り除き、ドライアイスで冷やした顕微鏡スライドの上に置きます。通常、セクションの厚さは 2 ~ 3 mmですが、これは ROI によって異なります。
  3. メスを使用して、一度に1つの半球のROIを解剖します。各半球をドライアイスであらかじめ冷やした1.5mLのマイクロ遠心管に入れます。凍結組織は、すぐに細胞下分画に使用したり、-80°Cで保存された場合は後で処理することができます。

2. 核と細胞質抽出

注:このプロトコルは、0.1 M HEPES、1 M MgCl 2、1Mジチオスレイトール(DTT)、0.5 Mエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)、5M NaCl、10%NP-40(IGEPAL)および50%グリセロールを含む一般的なラボ化学物質の事前製ストックソリューションを使用しています。エンドポイントがプロテアソーム活性アッセイに使用される場合、グリセロールおよびATPは、溶解中にプロテアソーム複合体の分解を防ぐために、すべてのバッファーに添加することができる。

  1. Lysis バッファーを準備します。無菌の15 mL円錐管に8.63 mLの超純物(脱イオン化および蒸留)水を加えます。
    1. 円錐管に、0.1 M HEPESの1,000 μL、1M MgClの15 μL、1M DTTの100 μL、10%NP-40の50 μLを加えます。
    2. プロテアーゼ阻害剤カクテルの100 μLとホスファターゼ阻害剤カクテルの100 μLを追加します。簡単に混ぜて、冷やすために湿った氷の上に置くために溶液を渦。なお、溶液はホスファターゼ阻害剤から黄色い色調を持ちてもよい。
      注:プロテアーゼ阻害剤の使用は、タンパク質を保存し、インビトロプロテアソーム活性アッセイの特異性を確保するために不可欠です。しかしながら、これらの阻害剤はまた、プロテアソーム活性のわずかな減少をもたらし得る、すなわちインビトロアッセイで測定された活性は、実際の活性レベルの過小評価であり得る。
  2. 抽出バッファーを準備します。無菌の15 mL円錐管に5.925 mLの超純物(脱イオン化および蒸留)水を加えます。
    1. 円錐管に、0.1 M HEPESの2,000 μL、50%グリセロールの1250 μL、1M MgCl2の15 μL、1M DTTの5μL、0.5 M EDTAの5μLおよび5M NaClの600 μLを加える。
    2. プロテアーゼ阻害剤カクテルの100 μLとホスファターゼ阻害剤カクテルの100 μLを追加します。簡単に混ぜて、冷やすために湿った氷の上に置くために溶液を渦。なお、溶液はホスファターゼ阻害剤から黄色い色調を持ちてもよい。
  3. -80 °C 冷凍庫からROIの半球を含む1.5mL遠心マイクロチューブを取り外します。使用する半球が、各実験群の抽出条件間で相殺されていることを確認します。たとえば、2 つのグループ実験では、各グループの最初の 2 つの動物に左半球を使用し、次の 2 つのサンプルには右半球を使用します。
  4. メスを使用して、凍結した脳組織を2mLガラステフロンホモジナイザーに移します。テフロンチューブに500μLのリシスバッファーを追加します。
    1. 害虫Bを使用して、固体材料の目に見える量が存在しないまで、15ストロークを使用して同じ組織を均質化する。各ストローク中に回転モーション(時計回りまたは反時計回り)を使用します。
  5. 1,000 μLピペットを使用して、均質化されたサンプルを新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。チューブを湿った氷の上に置き、30分間インキュベートします。
  6. チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、845 x gおよび4°Cで10分間スピンします。完了後、慎重にピペッティングによって上清を除去し、新しい1.5 mLマイクロ遠心管に配置します。これは、セクション2.9まで氷または4 °Cで保存することができる細胞質画分です。
  7. 得られたペレットに50 μLの抽出バッファーを追加し、ピペッティングによって再中断します。ペレットを渦に入れしないでください。再懸濁したペレットを含むチューブを氷の上に置き、30分間インキュベートします。
  8. チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、21,456 x g、4 °Cで20分間スピンします。完了後、慎重にピペッティングによって上清を除去し、新しい1.5 mLマイクロ遠心管に配置します。これが核分数です。ペレットを破棄できるようになりました。
  9. Dcタンパク質アッセイ(メーカーの指示に従って)、または非イオン性洗剤を使用して収集されたサンプルの同等のアッセイを使用して、細胞質抽出および核抽出のタンパク質濃度を測定します。プロテアソーム活性アッセイ(セクション4)またはウェスタンブロッティング(セクション5)に直ちに進みます。あるいは、サンプルは必要になるまで-80°Cで貯えることができる。

3. シナプス画集

注:このプロトコルは、1 Mトリス(pH 7.5)、0.5 M EDTA、5 M NaClおよび10%SDSを含む一般的なラボ化学物質の事前に作られたストックソリューションを使用します。エンドポイントがプロテアソーム活性アッセイに使用される場合、グリセロールおよびATPは、溶解中にプロテアソーム複合体の分解を防ぐために、すべてのバッファーに添加することができます

  1. 320 mM スクロースを使用して TEVP バッファを準備します。60 mLの超純物(脱イオン化・蒸留)水をクリーンな100mLビーカーに加えます。
    1. ビーカーには、1 Mトリスの1,300 μL(pH 7.5)、0.5M EDTAの260 μL、プロテアーゼ阻害剤カクテルの100μL、ホスファスターの100μL、スクロースの10.944gを加えます。ショ糖が完全に溶解するまで、攪拌バーと混ぜます。
    2. ピペットを使用して溶液に塩酸(HCl)を滴下してpHを~7.4にします。
    3. 溶液を100 mLの容積フラスコに移します。超純水を加えて100mLにボリュームを取り入れます。必要になるまで氷の上で最終的な溶液を冷やします。
  2. 均質化バッファーを準備します。60 mLの超純物(脱イオン化・蒸留)水をクリーンな100mLビーカーに加えます。
    1. ビーカーには、1 Mトリスの5,000 μL(pH 7.5)、5M NaClの3,000 μL、プロテアーゼ阻害剤カクテルの100μL、ホスファターゼ阻害剤カクテルの100μL、10%SDSの2,000μLを加えます。かき混ぜる。
      注:イオン性洗剤は、プロテアソーム複合体の脱線をもたらすことによってプロテアソーム活性アッセイを妨げる可能性がある。必要に応じてプロテアソーム機能を維持するために、SDSの体積を下げることができます。
    2. ピペットを使用して溶液にHClをドロップワイズで追加して、pHを~7.4にします。
    3. 溶液を100 mLの容積フラスコに移します。超純水を加えて100mLにボリュームを取り入れます。最終溶液を室温で保存します。SDSが溶液の外に沈殿するように冷やさらない。
  3. -80 °C 冷凍庫からROIの半球を含む1.5mL遠心分離機を取り外します。使用する半球が、各実験群の抽出条件間で相殺されていることを確認します。たとえば、2 つのグループ実験では、各グループの最初の 2 つの動物に左半球を使用し、次の 2 つのサンプルには右半球を使用します。
  4. メスを使用して、凍結した脳組織を2mLガラステフロンホモジナイザーに移します。テフロンチューブに500 μLのTEVPバッファを追加します。
    1. 害虫Bを使用して、固体材料の目に見える転移が存在しないまで、15ストロークを使用して同じ組織を均質化する。各ストローク中に回転モーション(時計回りまたは反時計回り)を使用します。
  5. 1,000 μLピペットを使用して、均質化されたサンプルを新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。10分間、4°Cで1,000 x gでサンプルを遠心分離します。
  6. 上清を収集し、1,000 μLピペットを使用して新しい1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。10分間、4°Cで10,000 x gでサンプルを遠心分離します。元のペレット(P1)は核および大きい破片を含み、捨てることができる。
  7. 上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。これは細胞細分画です。ペレット(P2)に50μLの均質化バッファーを追加し、固体材料が見えなくなるまでピペッティングで再中断します。
  8. 10分間、4°Cで20,000 x gでサンプルを遠心分離します。新しい1.5 mLマイクロ遠心管に上清を移す;これは粗シナプトソーム膜(シナプス)画分です。ペレットは廃棄することができる。
  9. Dcタンパク質アッセイ(メーカーの指示に従って)、またはイオン洗剤を使用して収集されたサンプルの同等のアッセイを使用して、シナプス画分のタンパク質濃度を測定します。プロテアソーム活性アッセイ(セクション4)またはウェスタンブロッティング(セクション5)に直ちに進みます。あるいは、サンプルは必要になるまで-80°Cで貯えることができる。

4. プロテアソーム活性アッセイ

注:プロテアソーム活性は、20Sプロテアソーム活性キットのわずかに改変されたバージョンを使用して均質化された脳組織で測定することができる。このアッセイは、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定するものではありません。むしろ、20Sコアの活性を測定し、26Sプロテアソーム複合体全体とは対照的に、コア自体の活動を理解するプロキシとしてのみ機能することを意味します。このアッセイの成功は、繰り返し凍結解凍サイクルおよび/または洗剤、特にイオンのレベルを増加させることで減少し、360/460(励起/発光)フィルタセットと37°Cまでの加熱能力を備えたプレートリーダーの使用を必要とします。

  1. プレートリーダーの設定:37°Cに事前に暖め、実行を通して保持します。
    1. 励起を 360 に設定し、放出を 460 に設定します。使用する96ウェルプレートが明確な場合は、光学系の位置をボトムに設定します。ダーク/ブラック 96 ウェルプレートを使用する場合は、光学系の位置を[トップへ" に設定します。
    2. 蛍光読み取りオプションの下で、古いプレートリーダーモデルを自動ゲインに設定します。新しいモデルはこのためにプリセットされています。2時間の時間でキネティックランをプログラムし、30分ごとにスキャン(読み取り)します。
  2. 13.5 mLの超純水でキットに設けられている10倍のアッセイバッファーを再構成します。100 mM ATP の 14 μL を現在の 1x バッファーに追加します。これはサンプルのプロテアソーム活動を有意に高め、アッセイの信頼性を向上させる。最終的な20Sアッセイバッファーは、必要になるまで氷上または4°Cで保存することができ、数ヶ月間安定しています。
  3. DMSOの100 μLのキットで提供されるAMC標準を再構成します。標準は光に敏感であるので、暗闇の中または低照度条件下でこのステップを実行します。
  4. 暗い状態または低照時間条件下で、再構成された標準を使用して AMC のスタンド カーブを作成します。
    1. 別々の0.5 mLマイクロ遠心分離管では、20、10、8、4、2、1、0μMの濃度に対応するAMC規格の1.6、0.8、0.4および0 μLを16、8、6.4、3.2を追加します。
    2. これらのチューブには、同じ順序で、20Sアッセイバッファーの84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6および100 μLを追加します。これは、均質化されたサンプルにおけるプロテアソーム活性のプレートリーダーの較正および分析に使用される一連の高から低AMC濃度を作成します。
    3. 必要になるまで、すべての希釈された基準を暗闇の中で氷の上に保管してください。
  5. DMSOの65 μLのキットで提供されるプロテアソーム基板(Suc-LLVY-AMC)を再構成します。基板は光に敏感なため、暗い環境や低照度条件下でこの手順を実行します。20Sアッセイバッファを使用して、新しい1.5 mLマイクロ遠心管でプロテアソーム基板の1:20希釈を作成します。希釈した基板を必要になるまで暗闇の氷の上に保管します。
    注:たとえば、プレートに 10 サンプルと 1 ブランクがある場合、ウェルあたり 10 μL で 22 ウェル (重複) に十分な希釈基板が必要になります。これは、ピペッティングエラーに対する220 μLの必要性+30 μLに相当し、基板の12.5 μLと20Sアッセイバッファの237.5 μLを必要とします。
  6. 所望のサンプルを解凍(凍結した場合)、96ウェルプレートに正規化された量を追加します。各サンプルを重複して実行します。必要なサンプルの量は、組織の調製に基づいて異なります。一般に、10~20 μgは、任意の細胞分画に対して十分です。
  7. サンプルウェル容積を超純水で80μLにします。追加される量は、追加されたサンプルの量によって異なります。例えば、サンプル1がタンパク質の4.5 μLで、サンプル2が8.7 μLの場合、必要な水量はそれぞれ75.5 μLと71.3 μLになります。2つの別々の井戸で、水の単独で80 μLを追加します。これらはアッセイブランクになります。
    注:ピペッティングエラーによるタンパク質体積の変化を制限するために、タンパク質濃度は最も濃縮されていないサンプルに正規化することができます。これにより、すべての条件で同じサンプルボリュームを使用できます。
  8. アッセイブランクを含む各ウェルに20Sアッセイバッファの10 μLを追加します。リピータ/自動ピペットは、ウェル間で一貫したアッセイボリュームを確保するために、ここでお勧めします。
  9. オプション:この段階では、必要に応じてインビトロ操作を導入します。これは、各サンプルが車両を含む治療ごとに追加の2ウェルを持っていることを必要とします。その場合は、対象の薬物/化合物の5-10 μLをサンプルウェルの2と同等の量の制御/車両を別の2ウェルに追加します。プレートを予め温めたプレートリーダーの上に置くか、37°Cのインキュベーターに30分間入れます。
  10. 明かりを消すか、暗い部屋に入ります。希釈されたAMC規格の100 μLをすべて新しいウェルに追加します。各標準は、単一の井戸を持つことになります。
  11. 暗闇では、希釈プロテアソーム基板の10 μLをサンプルおよびアッセイブランクを含むウェルに追加しますが、AMC規格には加えられません。リピータ/自動ピペットは、ウェル間で一貫したアッセイボリュームを確保するために、ここでお勧めします。
  12. プレートリーダーにプレートを入れ、運動走行を開始します。
    注:プレートは運動実行中に一定の撹拌を受ける必要はないが、ユーザーは必要に応じて選択できる
  13. 運動実行の最後に、生の 360/460 蛍光値を Microsoft Excel にエクスポートします。
    1. 各標準、各サンプル、アッセイブランクの5つのスキャンの重複井戸を平均します。生の蛍光値は、サンプルのスキャン全体で増加する必要がありますが、標準およびアッセイブランクでは安定した(またはわずかに減少)。
    2. 最高のAMC標準ウェル平均を取り、既知の濃度(20 μM)で除算します。この値をアッセイで使用するサンプル濃度で除算して、標準化されたAMC値を得ることができます。各サンプルとアッセイブランク平均について、標準化されたAMC値で除算します。
    3. この最終値をアッセイで除算し、各サンプルとアッセイブランクの正規化値を取得します。5 つのスキャンすべてに対してこれを行います。
    4. 5 つのスキャンすべてについて、正規化された各サンプル値から正規化されたアッセイブランク値を減算します。

5. リンケージ特異的タンパク質ユビキチン化の定量化

  1. げっ歯類の脳組織から収集された異なる細胞分画における多様なポリウビキチンタグの定量化は、ユニークなリンケージ特異的ポリウビキチン抗体と組み合わせて様々な標準的な西洋ブロッティングプロトコルを使用して行われるべきである。
    1. 脱電の場合は、正規化されたサンプルを、製造元の指示に従って、β-メルカプトエタノールを補充した同量のLaemmliサンプルバッファーと混合し、体積によって5%の割合にします。
    2. リンケージに関係なく、すべてのモノユビキチン化およびポリウビキチン化修飾の定量化のために、パンユビキチン抗体を使用する。
    3. すべてのポリユビキチン化タンパク質を認識するには、単一ユビキチン化と交差反応しないユビキチン抗体を使用します。
    4. リンケージ特異的ポリウビキチン化には、リジン-27、リジン-48、リジン-63および線形(M1)ポリユービキチン化を検出できる抗体を使用してください。
  2. 開発間のクロスコンタミネーションを防ぐために、偽陽性または異なるユビキチン修飾のイメージングを妨害する可能性があり、0.1 M NaOHを10分間使用して開発間の膜を剥切り取る。
    1. TBSで膜を0.1%の10分間2回洗浄し、再ブロックします(使用するウェスタンブロットプロトコルで好ましいブロッキング剤を使用)。
    2. 二次抗体で膜をインキュベートし、膜が一次および二次抗体を適切に取り除かれたことを確認するために再開発する。
    3. 推奨:汚染のない異なるユビキチン抗体の開発を成功させるには、蛍光または近赤外イメージングシステムを使用してください。これはしばしば抗体間の持ち越しを防ぐことができる。
  3. ユビキチンウエスタンブロット画像の中には、異なるバンド(M1など)の列を提供するものもあれば、明確な線がほとんどないか全く無いスミアのようなパターンを生成するものもあります(K48と共通)。画像化されたユビキチンウエスタンブロットの定量化のために、分子標準のはしご全体を拡張する柱の周りにボックスを描きます。
    1. ユビキチン染色がはしご全体に広がる場合は、ボックスを上下に調整します。これはLysine-48の修飾のために一般的であり、細胞外のコンパートメント間で広く変化する。
    2. すべての側面の柱を囲む背景の平均光学密度として計算される背景を減算します。

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Representative Results

ここで説明する手順を用いて、ラット脳の横扁桃体から核、細胞質およびシナプス画画を採取した(図1)。個々の分画の純度は、ウェスタンブロッティングを介して確認され、リサート中で濃縮または枯渇させるべきタンパク質に対する抗体を調べた。粗シナプス画分が収集された最初の半球では、シナプス密度タンパク質95(PSD95)はシナプス中に存在していたが、核、画分、細胞質の低いレベルで存在した(図2A)。これは、シナプス分画調製がシナプス前成分およびポストシナプス成分25の両方を分離することを実証する以前の研究と一致している。逆に、核タンパク質ヒストンH3は核中に存在していたが、細胞質のレベルが低いシナプス分率は存在しなかった(図2B)。細胞質におけるPSD95およびH3の存在は、細胞質翻訳と一致する。細胞質タンパク質β-チューブリンは、我々の細胞質画画に存在していたが、シナプス領域の低レベルで、核溶解物(図2C)から大部分は存在しなかった。これは、細胞質タンパク質がほとんど存在しない核画分を作り出すことができたことを示唆している。シナプス領域におけるチューブリンの存在は、以前の研究26と一致している。3つの画分はすべて、負荷制御として使用されたタンパク質β-アクチン(図2D)を保持するハウジングの同様のレベルを示した。これらの結果は、単一のラットの横扁桃体から採取された核、細胞質およびシナプス画の純度を確認する。

次に、全てのライサテをインビトロ20Sプロテアソーム活性アッセイの記載改変バージョンを用いて機能的プロテアソーム活性について確認した。すべてのリザートにおいて、アッセイの成功は、最初のスキャン(0分)から5番目/最終スキャン(120分)に検出された生蛍光ユニット(RFU)の増加として定義された。これらの解析のすべてで、10 μM AMC を生蛍光ユニット(RFU)の正規化のための最高基準として使用しました。粗シナプス画では、RFUはスキャン5(図3A)でピークに達し、その結果、正規化されたRFUは0.1以下(図3B)となった。細胞質画画では、RFUはスキャン全体で増加し(図3C)、最終的に正規化されたRFUは〜1.6(図3D)である。核分数はまた、RFU(図3E)の時間依存変化を示し、最終的に正規化されたRFUは0.3(図3F)である。コンパートメント間のプロテアソーム活性の違いは、一般的に細胞質および核27で最も豊富である分画におけるプロテアソームの利用可能性を反映している可能性が高い。準備。シナプス領域の活動の最も低いレベルは、イオン性洗剤を使用して収集された唯一の溶解液であることと一致しています, これは、より厳しい脱線状態によるプロテアソーム活性を減少させることができる.重要なことに、RFUはアッセイブランクまたは溶解物(シナプス)において、高特異的かつ強力なプロテアソーム阻害剤クラスト・ラクタシスチン-β-ラクトン(図3G、β-lac)でインキュベートされ、最終的な正規化されたRFUレベルを示さなかった。0.01 と 0.001 (図 3H)。これは、RFUの観察された変化が特にプロテアソームの活性に起因し、他のプロテアーゼではないことを示唆している。さらに、実験条件を越えて分析した場合、核の増加があったが、細胞質的ではなく、横扁桃体の後の遊歩道活性が増加し、シナプスプロテアソーム活性の低下と同時に起こった。対照動物との比較(図4)。これらの結果は、単一のラット横扁桃体から採取された3つの細胞下画すべてでプロテアソーム活性を正確に測定できることを確認した。

プロテアソーム活性アッセイの利点の1つは、プロテアソーム基板を添加する直前にインビトロ操作を試料に導入できることであり、プロテアソームを調節できる特定の分子の同定を可能にする。その特定の細胞外画分。その一例として、CaMKII(カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII)の役割をシナプス画画で評価し、最も過酷な変性溶解物を採取し、CaMKIIはシナプスでプロテアソーム機能を調節すると考えられている。CaMKII阻害剤myr-AIP(ミストレードオートカムチド-2関連阻害ペプチド)による30分のインキュベーションは、アッセイ上のプロテアソーム活性の有意な減少を引き起こし、これは未治療の約61%に達したレベルに達したコントロール (図 5A)を参照してください。逆に、細胞質に適用された同じ操作は、車両処理ウェルからのプロテアソーム活性の変化をもたらさなかった(図5B)。これらの結果は、プロテアソーム活性がインビトロでさらに操作され、この操作が収集された細胞下画分に応じて異なる効果を持つことができることを確認する。

プロテアソーム活性の定量化に加えて、記載されたプロトコルは、ウェスタンブロット手順を用いて多様なユビキチン修飾における細胞内差を測定するために使用することができる。検出可能なユビキチンタグは、現在ラットのK48、K63、M1を含むリンケージ特異的抗体の利用可能性によって制限されることに注意することが重要です(注:K27抗体は入手可能ですが、いずれの画像でも検出可能な画像は生成されませんでした)横扁桃体画または全細胞は、様々な条件下でlysats)。全体的なポリウビキチン化、分解非依存線形/M1およびK63ユビキチン化および分解特異的K48ユビキチン化は、全ての細胞下画分で検出された。重要なことに、異なる実験条件を越えて分析した場合、横扁桃体における全体的な(図6A)、線形(図6B)、K63(図6C)およびK48(図6D)のポリウビキチン化が増加した。対照動物と比較して学習後の核分数。同時に、細胞質領域では、全体的なポリウビキチン化が減少し、K48ユビキチン化は学習後に増加し、シナプスK63ユビキチン化は減少した。これらの結果は、リンケージ特異的タンパク質ユビキチン化における同じ動物細胞内の差異が正確に検出できることを示している。

Figure 1
図 1: ラット脳組織の細胞下分画の概略図。げっ歯類の脳は抽出され、脳領域は解剖され、半球は分裂する。一連のバッファーと遠心分離ステップを使用して、核分画と細胞質画分が一方の半球から収集され、もう一方から粗シナプス画分が収集されます。両方の画分は、プロテアソーム活性アッセイおよびウェスタンブロッティングに使用され、タンパク質ポリユービキチン化レベルをアッセイする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:原油シナプス、核および細胞質画分純度の確認。(A) シナプスタンパク質後のシナプス密度タンパク質95(PSD95;1:1,000)はシナプス中に存在したが、細胞質の低いレベルの核画分は存在しなかった。(B) ヒストンH3(1:500)は核中に存在したが、シナプスではなく、細胞質における発現が低い分数であった。(C)β-ツブリン(1:1,000)は細胞質に存在していたが、核から大部分は存在せず、シナプス溶解物では発現が低い画分であった。(D) ハウスキーピングタンパク質βアクチン(1:1,000)は、全ての細胞下コンパートメントに存在していた。領域は、標的タンパク質の予想サイズを示す。この図は、Orsi, S.A. et al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 同じ動物の横扁桃体から採取した核、細胞質およびシナプス画におけるプロテアソーム活性の定量化。インビトロプロテアソーム活性アッセイの間に、検出された相対蛍光単位(RFU)は、シナプス(A)、細胞質(C)および核(E)画分におけるアッセイの開始(スキャン1)から終端(スキャン5)まで増加した。ベースラインからのこの変化の定量化は、シナプス(B)で0.1、細胞質(D)で1.6、核(F)画分で0.3の正規化されたRFU値(10 μM AMCに対して10μM AMCに対して)を示した。プロテアソーム阻害剤βlacは、セッション全体でRRFが変化するのを防いだ(G-H)。この図は、Orsi, S.A. et al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 同じ動物の横扁桃体におけるプロテアソーム活性の細胞内差核プロテアソーム活性の増加は、シナプス画内の活性の減少に相当する対照に対する訓練された(恐怖条件付き)動物で検出された。細胞質プロテアソーム活性はベースラインに残った。* コントロールからP < 0.05.この図は、Orsi, S.A. et al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 採取されたシナプスおよび細胞質画分におけるプロテアソーム活性のインビトロ操作。阻害剤AIPを介したCaMKIIシグナル伝達のインビトロ操作は、シナプス(A)におけるプロテアソーム活性を減少したが、細胞質(B)ではなく、ラットの横扁桃体からの分数である。この数字は、Jarome, T.J. et al.23から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: 学習後の同じ動物の横扁桃体におけるリンケージ特異的タンパク質ユビキチン化における細胞内差(A) 学習後の核画分における全体的なユビキキ化の増加があり、これは細胞質画分の減少と相関した。(B) 核の線形ユビキチン化は増加したが、細胞質やシナプスではなく、学習後の分数であった。(C) 学習後の核分数におけるK63ユビキチン化の増加があり、これはシナプス画分の減少と相関した。(D) K48ユビキチン化は核および細胞質で増加したが、シナプスではなく、学習後の分数である。* コントロールからP < 0.05.得られたユビキチン光学密度は全てβ-アクチンレベル(Aの下位代表的なウェスタンブロット画像)に正規化され、これは負荷制御として用いた。この図は、Orsi, S.A. et al.21から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、同じ動物の異なる細胞内区画間のユビキチン-プロテアソーム活性の変化を定量化するための効率的な方法を示す。現在、ユビキチン・プロテアソーム系の活性における細胞内変化の測定のほとんどの試みは、サンプル当たり1つのコンパートメントに限定されており、実験を繰り返す必要がある。これは、多大なコストと動物の生命の損失につながります。私たちのプロトコルは、半球を分割することによって、この問題を緩和し、同じ動物の各半球から異なる細胞画分を収集できるようにします。このプロトコルを用いて、我々は、同じ動物のユビキチン-プロテアソーム活性において、学習21に応答して核、細胞質およびシナプス画の分画が差異的に変化することを初めて示すことができた。

ここで説明するプロトコルの主な制限は、得られる脳組織(サンプル)の量に依存している。例えば、上記で説明したように、このプロトコルは、所定の脳領域の半球を分割する必要があります。ただし、1 つの半球にのみ存在する特定の領域の場合など、これは常に可能であるとは限りません。これらの場合、このバッファーはすべての変性剤を含まないため、シナプス画分ステップ(セクション3.1)で使用されるTEVPバッファー内の脳領域全体を最初に均質化することによってプロトコルを変更することができる。その後、サンプルを体積別に 2 つの等しい部分に分割できます。最初の部分は、説明されているようにプロトコルに従って、シナプス画分に使用することができます。試料の後半では、非イオン性洗剤NP-40を0.05%の最終濃度に加え、セクション2.6に記載の遠心分離を加えることができる。これにより、細胞質タンパク質をペレットに上清タンパク質と核タンパク質に分離することができ、セクション2の残りのステップに続いてさらに単離することができます。組織量のもう一つの懸念は、いくつかの脳領域は、前肢皮質のようなサイズが非常に小さいということです。しかし、これらの場合には、上記のプロトコルは、使用されるバッファの体積を減らすことによって依然として使用することができ、これは収集された脳領域の大きさに基づいて経験的に決定されなければならないであろう。したがって、このプロトコルは、より少ない組織が利用可能であるより困難な脳領域に修正することができる。

ここで概説するプロトコルの主な利点の1つは、ほとんどの施設で見られる一般的な実験装置と試薬を使用し、この方法論が限られた予算や限られたリソースの中でも修正可能であることです。さらに、ユビキチン・プロテアソームシグナル伝達における細胞内変化を測定する方法としてこのプロトコルを概説する一方で、この方法論は、細胞の局在化および機能を理解する他のタンパク質または細胞プロセスにも適用することができる。が重要です。したがって、このプロトコルは、学習および記憶または異なる疾患状態の間に特定のタンパク質または複合体の細胞内機能を理解するための広範なアプリケーションを有することができる。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この研究は、農業生命科学部とバージニア工科大学の理学部のスタートアップファンドによって支援され、バージニア工科大学のジョージ・ワシントン・カーバー・プログラムによって支援されています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

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