Kvantifiera subcellulär ubiquitin-Proteasome-aktivitet i gnagare hjärnan

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll är utformat för att effektivt kvantifiera ubiquitin-Proteasome system (UPS) aktivitet i olika cellulära fack i gnagare hjärnan. Användare kan undersöka UPS fungerar i nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner i samma djur, minska mängden tid och antal djur som behövs för att utföra dessa komplexa analyser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den ubiquitin-Proteasome systemet är en viktig regulator av proteinnedbrytning och en mängd andra cellulära processer i eukaryotes. I hjärnan, ökningar av ubiquitin-Proteasome aktivitet är kritiska för synaptisk plasticitet och minnesbildning och avvikande förändringar i detta system är förknippade med en mängd olika neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar. En av de frågor som studerar ubiquitin-Proteasome funktion i hjärnan är att det är närvarande i alla cellulära fack, där protein mål, funktionell roll och mekanismer för reglering kan variera kraftigt. Som ett resultat, förmågan att direkt jämföra hjärnan ubiquitin protein inriktning och proteasom katalytisk aktivitet i olika subcellulära fack inom samma djur är avgörande för att fullt förstå hur UPS bidrar till synaptisk plasticitet, minne och sjukdom. Den metod som beskrivs här tillåter insamling av nukleära, cytoplasmiska och råa synaptiska fraktioner från samma gnagare (råtta) hjärna, följt av samtidig kvantifiering av proteasom katalytisk aktivitet (indirekt, som ger aktivitet av proteasom kärna endast) och länkningsspecifika ubiquitin protein märkning. Sålunda, metoden kan användas för att direkt jämföra subcellulära förändringar i ubiquitin-Proteasome aktivitet i olika hjärnregioner i samma djur under synaptisk plasticitet, minnesbildning och olika sjukdomstillstånd. Denna metod kan också användas för att bedöma den subcellulära distributionen och funktionen av andra proteiner inom samma djur.

Introduction

Ubiquitin-Proteasome-systemet (UPS) är ett komplext nätverk av sammankopplade proteinstrukturer och Ligaser som kontrollerar nedbrytningen av de flesta kortlivade proteiner i celler1. I detta system är proteiner märkta för nedbrytning eller andra cellulära processer/öden av den lilla modifieraren ubiquitin. Ett målprotein kan förvärva 1-7 ubiquitin modifieringar, som kan länka samman på en av sju lysin (K) platser (K6, K11, K27, K29, K33, K48 och K63) eller N-Terminal metionin (M1, så kallad linjär) i föregående ubiquitin2. Några av dessa polyubiquitin taggar är nedbrytnings-specifika (K48)3, medan andra är till stor del oberoende av proteinnedbrytning processen (M1)4,5,6. Sålunda, proteinet ubiquitination förlopp är oerhört komplex och förmågan till kvantifiera förändringen i en bestämd polyubiquitin tag är kritisk för i slutändan förstå den roll av så pass givit modifiera i Cellular funktion. Ytterligare komplierar studiet av detta system, Proteasome, som är den katalytiska strukturen av UPS7, både försämrar proteiner men kan också vara inblandade i andra icke-proteolytiska processer8,9. Inte överraskande då, sedan dess första upptäckten, normal och avvikande ubiquitin-Proteasome aktivitet har varit inblandad i långtids minnesbildning och en mängd olika sjukdomstillstånd, inklusive många neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar10,11. Som ett resultat av detta är metoder som effektivt och effektivt kan kvantifiera UPS aktivitet i hjärnan avgörande för att i slutändan förstå hur detta system är dysreglerat i sjukdomstillstånd och eventuell utveckling av behandlingsalternativ riktade mot ubiquitin och/eller proteasom fungerar.

Det finns ett antal frågor att kvantifiera ubiquitin-Proteasome aktivitet i hjärnvävnad från råttor och möss, som är de vanligaste modellsystem som används för att studera UPS-funktion, inklusive 1) mångfalden av ubiquitin modifieringar, och 2) distribution och differentiell reglering av UPS fungerar över subcellulära fack12,13,14. Till exempel, många av de tidiga demonstrationerna av ubiquitin-proteasom funktion i hjärnan under minnesbildning används hela cellen celllysat och indikerade tidsberoende ökningar i både protein ubiquitination och proteasom aktivitet15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Vi fann dock nyligen att ubiquitin-Proteasome aktivitet varierade kraftigt över subcellulära fack som svar på inlärning, med samtidiga ökningar i vissa regioner och minskningar i andra, ett mönster som skiljer sig avsevärt från vad som tidigare rapporterades i hela cellen celllysat21. Detta är förenligt med begränsningen av en hel cells strategi, eftersom den inte kan separera bidraget från förändringar i UPS-aktivitet i olika subcellulära fack. Även nyare studier har använt synaptiska fraktions protokoll för att studera UPS specifikt på synapser som svar på lärande22,23,24, de metoder som används ockludera förmågan att mäta nukleära och cytoplasmiska ubiquitin-Proteasome förändringar i samma djur. Detta resulterar i ett onödigt behov av att upprepa experiment flera gånger, samla in en annan subcellulär fraktion i varje. Detta resulterar inte bara i en större förlust av djurliv, men det eliminerar möjligheten att direkt jämföra UPS aktivitet mellan olika subcellulära fack som svar på en viss händelse eller under en viss sjukdomstillstånd. Med tanke på att protein målen för ubiquitin och proteasom varierar kraftigt i hela cellen, förstå hur ubiquitin-proteasom signalering skiljer sig i olika subcellulära fack är avgörande för att identifiera den funktionella roll UPS i hjärnan under minnesbildning och neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar.

För att ta itu med detta behov utvecklade vi nyligen ett förfarande där nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner kunde samlas in för en given hjärnregion från samma djur21. Dessutom, för att ta hänsyn till den begränsade mängden protein som kan erhållas från insamling av flera subcellulära fraktioner från samma prov, vi optimerat tidigare etablerade protokoll till assay in vitro proteasom aktivitet och länkspecifika protein ubiquitination i lyserade celler som samlats in från gnagare hjärnvävnad. Med hjälp av detta protokoll, kunde vi samla in och direkt jämföra lärande-beroende förändringar i proteasom aktivitet, K48, K63, M1 och övergripande protein polvubiquitinering nivåer i kärnan och cytoplasman och vid synapser i sidled amygdala av råttor. Här beskriver vi i detalj vårt förfarande (figur 1), som avsevärt skulle kunna förbättra vår förståelse för hur UPS är involverad i långtids minnesbildning och olika sjukdomstillstånd. Det bör dock noteras att in vitro proteasom verksamhet diskuteras i vårt protokoll, medan allmänt används, inte direkt mäta aktiviteten av kompletta 26S proteasom komplex. Snarare, denna analys mäter aktiviteten av 20-talet kärnan, vilket innebär att det bara kan fungera som en proxy för att förstå verksamheten i själva kärnan i motsats till hela 26S proteasom Complex.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden inklusive djur försökspersoner har godkänts av Virginia Polytechnic Institute och State University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).

1. insamling och dissektion av gnagare hjärnvävnad

Anmärkning: Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika hjärnregioner och används med olika vävnads insamlings förfaranden. Nedan är det förfarande som används i vårt labb för subcellulära av råtta hjärnvävnad, med hjälp av 8-9 vecka gamla manliga Sprague Dawley råttor. För att bearbeta alla cellulära fack i samma djur, avsnitt 1,3. måste följas oavsett vilken vävnads insamlingsprocedur som används.

  1. Extrahera råtta hjärnan och placera i en kryogen kopp pre-kyld på torris. Flash-frysa hjärnan på torris, eller använda flytande kväve om det finns, och överföra till en-80 ° c frys. Hjärnor kan dissekeras samma dag eller vid ett senare tillfälle.
  2. Ta bort den frusna hjärnan från kryogen kopp och placera i en råtta hjärna matris kyld med torris. Varje plats på matrisen motsvarar 0,5 mm, som kan användas för att bestämma den ungefärliga placeringen av intresseregionen (ROI).
    1. Med hjälp av en råtta hjärna Atlas, sätt ett rakblad i matrisen omedelbart framför (Anterior) av den förväntade starten av ROI. Därefter sätter du in ett rakblad omedelbart vid det förväntade slutet (posteriort) ROI.
    2. Ta bort segmentet mellan rakbladen med en skalpell och placera på ett Mikroskop glida kyld på torris. Typiskt, avsnitten är 2-3 mm tjock utom den här variera baserat på den ROI.
  3. Använda en skalpell, dissekera ut ROI en halvklotet i taget. Placera varje hjärnhalva i separata 1,5 mL mikrocentrifugrör förkyld på torris. Fryst vävnad kan omedelbart användas för subcellulär fraktionering eller bearbetas vid ett senare tillfälle om den förvaras vid-80 ° c.

2. nukleär och Cytoplasmatisk extraktion

Anmärkning: Detta protokoll använder färdiga stamlösningar av vanliga Lab kemikalier, inklusive 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m Ditiothreitol (dTT), 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 5 m NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) och 50% glycerol. Om Endpoint används i proteasom aktivitet analyser, glycerol och ATP kan läggas till alla buffertar för att förhindra demontering av proteasom komplex under Lys.

  1. Förbered Lyseringsbufferten. Tillsätt 8,63 ml ultrarent (avjoniserat och destillerat) vatten till ett sterilt 15 ml koniskt rör.
    1. Till det koniska röret, tillsätt 1 000 μL av 0,1 M HEPES, 15 μL 1 M MgCl, 100 μL av 1 M DTT och 50 μL 10% NP-40.
    2. Tillsätt 100 μl proteashämmare cocktail och 100 μl av fosfatas hämmare cocktail. Kortfattat Vortex lösningen att blanda och placera på våt is för att kyla. Observera att lösningen kan ha en gul nyans från fosfatas hämmare.
      Anmärkning: Användning av proteashämmare är nödvändig för att bevara protein och säkerställa specificiteten hos in vitro-proteasom-aktivitetstest. Dessa hämmare kan dock också resultera i en liten minskning av proteasomaktiviteten, vilket innebär att den aktivitet som mäts på in vitro-analysen kan vara en underskattning av de faktiska aktivitetsnivåerna.
  2. Förbered Extraktionsbufferten. Tillsätt 5,925 ml ultrarent (avjoniserat och destillerat) vatten till ett sterilt 15 ml koniskt rör.
    1. Till det koniska röret, tillsätt 2 000 μL av 0,1 M HEPES, 1250 μL av 50% glycerol, 15 μL 1 M MgCl2,5μl 1 m DTT, 5 μl 0,5 m EDTA och 600 μl med 5 m NaCl.
    2. Tillsätt 100 μl proteashämmare cocktail och 100 μl av fosfatas hämmare cocktail. Kortfattat Vortex lösningen att blanda och placera på våt is för att kyla. Observera att lösningen kan ha en gul nyans från fosfatas hämmare.
  3. Ta bort 1,5 ml centrifug mikrorör som innehåller en halvklot av ROI från-80 ° c frys. Se till att halvklotet som används är motviktat över extraktionsförhållanden för varje experimentell grupp. Till exempel, i ett två-grupps experiment, Använd vänster hjärnhalva för de två första djuren i varje grupp och höger hjärnhalva för de kommande två proven, etc.
  4. Med hjälp av en skalpell, överföra den frysta hjärnvävnaden till en 2 mL glas Teflon Homogenisatorer. Tillsätt 500 μL lyseringsbuffert till teflonröret.
    1. Med hjälp av mortelstöt B, homogenisera samma vävnad med 15 slag tills ingen synlig mängd fast material är närvarande. Använd en roterande rörelse (medurs eller motsols) under varje slaglängd.
  5. Överför det homogeniserade provet med en 1 000 μL pipett till ett nytt microcentrifugerör med 1,5 mL. Placera röret på våt is och inkubera i 30 min.
  6. Placera röret i mikrocentrifug och snurra i 10 min vid 845 x g och 4 ° c. Efter avslutad, försiktigt bort supernatanten genom Pipettera och placera i en ny 1,5 mL microcentrifug röret; Detta är cytoplasmiska fraktionen, som kan lagras på is eller vid 4 ° c till avsnitt 2,9.
  7. Tillsätt 50 μL extraktion buffert till den resulterande pelleten och Omsuspendera genom pipettering. Vortexblanda inte pelleten. Placera röret som innehåller den återsuspenderade pelleten på isen och inkubera i 30 min.
  8. Placera röret i microcentrifug och snurra i 20 min vid 21 456 x g, 4 ° c. Efter avslutad, försiktigt bort supernatanten genom Pipettera och placera i en ny 1,5 mL microcentrifug röret; Detta är den nukleära fraktionen. Pelleten kan nu kasseras.
  9. Mät protein koncentrationen av cytoplasmiska och nukleära extraktioner med hjälp av DC-proteinanalysen (enligt tillverkarens anvisningar), eller motsvarande test för prover som samlats med icke-joniska rengöringsmedel. Fortsätt omedelbart till proteasomaktivitetstest (avsnitt 4) eller Western blotting (avsnitt 5). Alternativt kan prover förvaras vid-80 ° c tills det behövs.

3. insamling av synaptiska fraktioner

Anmärkning: Detta protokoll använder premade stamlösningar av vanliga laboratoriekemikalier, inklusive 1 M tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl och 10% SDS. Om Endpoint används i proteasom aktivitet analyser, glycerol och ATP kan läggas till alla buffertar för att förhindra demontering av proteasom komplex under Lys

  1. Förbered TEVP-bufferten med 320 mM sackaros. Tillsätt 60 ml ultrarent (avjoniserat och destillerat) vatten till en ren 100 ml-bägare.
    1. Till bägaren, tillsätt 1 300 μL av 1 M tris (pH 7,5), 260 μL av 0,5 M EDTA, 100 μL av proteashämmare cocktail, 100 μL fosfatashämmare cocktail och 10,944 g sackaros. Blanda med en röra bar tills sackaros är helt upplöst.
    2. Ta pH till ~ 7,4 genom att tillsätta saltsyra (HCl) droppvis till lösningen med hjälp av en pipett.
    3. Överför lösningen till en 100 mL mätkolv. Ta med volym till 100 ml genom att tillsätta ultrarent vatten. Chill den slutliga lösningen på is tills det behövs.
  2. Förbered Homogeniseringsbufferten. Tillsätt 60 ml ultrarent (avjoniserat och destillerat) vatten till en ren 100 ml-bägare.
    1. Tillsätt 5 000 μL på bägaren 1 M tris (pH 7,5), 3 000 μL 5 M NaCl, 100 μL av proteashämmare, 100 μL av cocktail av fosfatashämmare och 2 000 μL 10% SDS. Blanda med en Stir bar.
      Anmärkning: Joniska rengöringsmedel kan störa proteasom aktivitets analyser genom att resultera i denaturering av proteasom-komplexet. Volymen av SDS kan sänkas för att hjälpa till att bevara proteasom funktion om så önskas.
    2. Ta pH till ~ 7,4 genom att tillsätta HCL droppvis till lösningen med hjälp av en pipett.
    3. Överför lösningen till en 100 mL mätkolv. Flytta volymen till 100 ml genom att tillsätta ultrarent vatten. Förvara den slutliga lösningen i rumstemperatur; inte kyla eftersom SDS kommer att fällas ut ur lösningen.
  3. Ta bort 1,5 mL centrifug som innehåller en halvklot av avkastningen från-80 ° c frysen. Se till att halvklotet som används är motviktat över extraktionsförhållanden för varje experimentell grupp. Till exempel, i ett två-grupps experiment, Använd vänster hjärnhalva för de två första djuren i varje grupp och höger hjärnhalva för de kommande två proven, etc.
  4. Med hjälp av en skalpell, överföra den frysta hjärnvävnaden till en 2 mL glas Teflon Homogenisatorer. Tillsätt 500 μL TEVP-buffert till teflonröret.
    1. Med hjälp av mortelstöt B, homogenisera samma vävnad med 15 slag tills inga synliga överföringar av fast material är närvarande. Använd en roterande rörelse (medurs eller motsols) under varje slaglängd.
  5. Överför det homogeniserade provet med en 1 000 μL pipett till ett nytt microcentrifugerör med 1,5 mL. Centrifugera provet vid 1 000 x g i 10 min, 4 ° c.
  6. Samla supernatanten och överför till ett nytt 1,5 mL microcentrifugerör med en 1 000 μL pipett. Centrifugera provet vid 10 000 x g i 10 min, 4 ° c. Den ursprungliga pelleten (P1) innehåller kärnor och det stora skräpet och kan kasseras.
  7. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL microcentrifugerör. Detta är en Cytosolisk fraktion. Tillsätt 50 μL Homogeniseringsbuffert till pelleten (P2) och Omsuspendera genom pipettering tills inget fast material syns.
  8. Centrifugera provet vid 20 000 x g i 10 min, 4 ° c. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL microcentrifugerör; Detta är den råa Synaptosomal membran (Synaptic) fraktion. Pelleten kan kasseras.
  9. Mät protein koncentrationen i den synaptiska fraktionen med hjälp av DC-proteinanalysen (enligt tillverkarens anvisningar), eller motsvarande test för prover som samlats med hjälp av Joniska rengöringsmedel. Fortsätt omedelbart till proteasomaktivitetstest (avsnitt 4) eller Western blotting (avsnitt 5). Alternativt kan prover förvaras vid-80 ° c tills det behövs.

4. Proteasome aktivitet analys

Anmärkning: Proteasome aktivitet kan mätas i homogeniserad hjärnvävnad med hjälp av en något modifierad version av 20S Proteasome Activity kit. Denna analys mäter inte direkt aktiviteten hos kompletta 26S proteasom-komplex. Snarare mäter den aktiviteten av 20-talet kärnan, vilket innebär att det bara kan fungera som en proxy för att förstå verksamheten i själva kärnan i motsats till hela 26S proteasom Complex. Framgången för denna analys avtar med upprepade frys-Tina cykler och/eller ökande nivåer av rengöringsmedel, särskilt jonisk, och kräver användning av en Plattläsare med en 360/460 (excitation/emission) filteruppsättning och värmekapacitet upp till 37 ° c.

  1. Inställningar för Plattläsare: Förvärm till 37 ° c och håll genom körningen.
    1. Ställ excitation till 360 och utsläpp till 460. Om 96 väl plattan som används är klar, Ställ in optikpositionen till botten. Om en mörk/svart 96 väl plattan används, ställa optik position överst.
    2. Ställ äldre plattan läsare modeller till Auto-Gain under fluorescerande Läsalternativ; nyare modeller är förinställda för detta. Program mera en kinetisk springa med en tid av 2 h, skanning (läsning) var 30 min.
  2. Bered den 10X analysbufferten som finns i satsen med 13,5 ml ultrarent vatten. Tillsätt 14 μL 100 mM ATP till den nu 1x bufferten. Detta förbättrar signifikant proteasom aktivitet i proverna och förbättrar assay tillförlitlighet. Den slutliga 20S analysbufferten kan lagras på is eller vid 4 ° c tills det behövs och är stabil i flera månader.
  3. Rekonstituera AMC-standarden som tillhandahålls i sats med 100 μL DMSO. Utför detta steg i mörker eller under svagt ljus, eftersom standarden är ljuskänslig.
  4. Skapa en stativ kurva av AMC med den rekonstituerade standarden, i mörker eller under svagt ljus.
    1. I separata 0,5 mL microcentrifug rör, tillsätt 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 och 0 μL av AMC-standarden, vilket motsvarar 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 och 0 μM AMC koncentration.
    2. Till dessa rör, i samma ordning, tillsätt 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 och 100 μL av 20S analysbuffert. Detta skapar en serie av höga till låga AMC koncentrationer, som kommer att användas för Plattläsare kalibrering och analys av proteasom aktivitet i homogeniserade prover.
    3. Förvara alla utspädda standarder på is i mörker tills de behövs.
  5. Bered proteasomsubstratet (SUC-LLVY-AMC) som tillhandahålls i sats med 65 μL DMSO. Utför detta steg i mörker eller under svagt ljus, eftersom underlaget är ljuskänsligt. Skapa en 1:20 utspädning av proteasom substrat i en ny 1,5 ml microcentrifug röret med 20s analysbuffert. Förvara det utspädda underlaget på is i mörker tills det behövs.
    Anmärkning: Till exempel, om plattan kommer att ha 10 prover och 1 blank, du kommer att behöva tillräckligt utspädda substrat för 22 brunnar (med dubbletter) vid 10 μL per brunn. Detta motsvarar 220 μL behöver + 30 μL för pipettering fel, som kräver 12,5 μL substrat och 237,5 μL av 20S analysbuffert.
  6. Tina önskade prover (om frysta) och tillsätt ett normaliserat belopp till en 96 väl tallrik. Kör varje prov i dubbletter. Mängden prov som behövs varierar beroende på vävnads beredning. I allmänhet räcker 10-20 μg för varje subcellulär fraktion.
  7. Ta provet väl volym till 80 μl med ultrarent vatten. Beloppet som läggs till beror på mängden prov som lagts till. Till exempel, om prov 1 var 4,5 μL protein och prov 2 var 8,7 μL, kommer mängden vatten som behövs vara 75,5 μL respektive 71,3 μL. I två separata brunnar, tillsätt 80 μL vatten ensamt; dessa kommer att vara analysen ämnen.
    Anmärkning: För att begränsa förändringar i protein volym på grund av pipettering av fel, kan proteinkoncentrationer normaliseras till det minst koncentrerade provet. Detta gör det möjligt att använda samma provvolym under alla förhållanden.
  8. Tillsätt 10 μL av 20S analysbuffert till varje brunn, inklusive analys ämnen. En repeater/automatiserad pipett rekommenderas här för att säkerställa konsekvent analys volym över brunnar.
  9. Valfritt: I detta skede, införa in vitro manipulationer om så önskas; Detta kommer att kräva att varje prov har ytterligare 2 brunnar per behandling, inklusive fordonet. Om så är det, tillsätt 5-10 μL av drogen/föreningen av intresse för 2 av provet brunnar och en likvärdig volym av kontroll/fordon till en annan 2 brunnar. Placera plattan på den förvärmda plattläsaren eller i en inkubator på 37 ° c i 30 min.
  10. Stäng av lamporna eller gå in i ett mörkt rum. Tillsätt alla 100 μL utspädda AMC-standarder till en ny brunn; varje standard kommer att ha en enda brunn.
  11. I mörkret, tillsätt 10 μl av utspädd proteasom substrat till brunnar som innehåller prov och assay ämnen, men inte till AMC standard. En repeater/automatiserad pipett rekommenderas här för att säkerställa konsekvent analys volym över brunnar.
  12. Placera plattan i plattläsaren och starta den kinetiska körningen.
    Anmärkning: Plattan behöver inte vara under ständig agitation under den kinetiska körningen, men användaren kan välja att om så önskas
  13. Vid slutet av den kinetiska körningen, exportera rå 360/460 fluorescerande värden till Microsoft Excel.
    1. Genomsnittlig tillsammans dubbla brunnar för varje standard, varje prov och analysen tom för alla 5 skanningar. Råa fluorescerande värden bör öka mellan skanningar för proverna men förbli stabila (eller minska något) för standarder och assay ämnen.
    2. Ta högsta AMC standard väl genomsnittet och dividera med den kända koncentrationen (20 μM). Dividera detta värde med provet koncentration som används i analysen för att få standardiserade AMC värde. För varje prov och analys blank genomsnitt, dividera med standardiserade AMC värde.
    3. Ta detta slutliga värdet och dividera med provet koncentration som används i analysen för att få det normaliserade värdet för varje prov och analysen tom. Gör detta för alla 5 skanningar.
    4. Subtrahera det normaliserade analys tom värdet från varje normaliserat exempelvärde för alla 5 skanningar.

5. kvantifiering av det sammanlänknings specifika proteinet Ubiquitination

  1. Kvantifiering av olika polyubiquitin-Taggar i olika subcellulära fraktioner som samlats in från gnagare hjärnvävnad bör göras med hjälp av en mängd olika standard Western blotting protokoll i kombination med unika, länkspecifika polyubiquitin antikroppar.
    1. För denaturering, blanda de normaliserade proverna med en lika mängd Laemmli prov buffert kompletterad med β-merkaptoetanol till en procentsats av 5 volymprocent, enligt tillverkarens instruktion.
    2. För kvantifiering av alla monoubiquitination och polvubiquitinering ändringar oavsett länkning, använda en pan-ubiquitin antikropp.
    3. För att känna igen alla polyubiquitinerade proteiner, Använd en ubiquitin antikropp som inte korsreagerar med monoubiquitination.
    4. För länkspecifika polyubiquitination, Använd antikroppar som kan detektera lysin-27, lysin-48, lysin-63 och linjär (M1) polyubiquitination.
  2. För att förhindra korskontaminering mellan utvecklingen, vilket kan resultera i en falsk positiv eller störa avbildning av en annan ubiquitin modifiering, remsor membran mellan utvecklingen med 0,1 M NaOH i 10 min.
    1. Tvätta membranen i TBS med 0,1% Tween två gånger för 10 min och reblock (med vad blockerande medel är att föredra i Western blot-protokollet används).
    2. Inkubera membranet med den sekundära antikroppen och återutveckla för att bekräfta att membranet var fråntagen primär och sekundär antikroppar på rätt sätt.
    3. Rekommenderas: För framgångsrik utveckling av olika ubiquitin antikroppar utan kontaminering, Använd fluorescerande eller nära infraröda avbildningssystem. Detta ofta gånger kan förhindra överföring mellan antikroppar.
  3. Vissa ubiquitin Western blot-bilder kommer att ge kolumner av distinkta band (som M1) medan andra producerar ett smear-liknande mönster med få eller inga tydliga linjer (vanligt med K48). För kvantifiering av avbildade ubiquitin Western blots, rita en låda runt kolonnen som utökar hela molekylära standarder stege.
    1. Justera rutan upp (eller ner) om ubiquitin färgning sträcker sig genom hela stegen; Detta är vanligt för lysin-48 ändringar och varierar kraftigt över subcellulära fack.
    2. Subtrahera ut bakgrunden, som beräknas som den genomsnittliga optiska tätheten av bakgrunden omedelbart omger kolonnen på alla sidor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av det förfarande som beskrivs här, nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner samlades in från den laterala amygdala av råtta hjärnan (figur 1). Renhet av de enskilda fraktioner bekräftades via västerländska blotting, sondering med antikroppar mot proteiner som bör berikas eller utarmat i lysat. I den första halvklotet där en rå synaptisk fraktion samlades, postsynaptiska densitet protein 95 (PSD95) var närvarande i synaptic, men inte kärnkraft, fraktion, med lägre nivåer i cytoplasman (figur 2A). Detta är förenligt med tidigare arbete som visar att den synaptiska fraktions preparatet isolerar både presynaptiska och postsynaptiska komponenter25. Omvänt, kärn proteinet Histon H3 var närvarande i kärnkraft, men inte den synaptiska, fraktion, med lägre nivåer i cytoplasman (figur 2b). Närvaron av PSD95 och H3 i cytoplasman är förenligt med deras cytoplasmiska översättning. Cytoplasmiska proteinet β-tubulin var närvarande i vår cytoplasmiska fraktion, men var i stort sett frånvarande från den nukleära lysat (figur 2C), med lägre nivåer i den synaptiska regionen. Detta tyder på att vi kunde producera en nukleär fraktion som var i stort sett frånvarande av cytoplasmiska proteiner. Närvaron av tubulin i den synaptiska regionen är förenlig med tidigare studier26. Alla tre fraktioner visade liknande halter av det inhysa proteinet β-Actin (figur 2D), som användes som lastkontroll. Kollektivt, dessa resultat bekräftar att renheten av den nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner som samlats in från en enda råtta lateral amygdala.

Nästa, alla celllysat bekräftades för funktionell proteasom aktivitet med hjälp av den beskrivna modifierade versionen av in vitro 20s proteasom Activity assay. I alla Lysates definierades framgången med analysen som en ökning av de råa fluorescerande enheterna (RFU) som upptäcktes från den första genomsökningen (0 min) till den femte/sista genomsökningen (120 min). För alla dessa analyser användes 10 μM AMC som högsta standard för normalisering av de råa fluorescerande enheterna (RFU). I den råa synaptiska fraktionen nådde RFU en topp på Scan 5 (figur 3a), vilket resulterade i en NORMALISERAD RFU på strax under 0,1 (figur 3b). I cytoplasmatiska fraktionen ökade RFU mellan skanningar (figur 3c) med en slutlig NORMALISERAD RFU av ~ 1,6 (figur 3D). Den nukleära fraktionen visade också tidsberoende förändringar i RFU (figur 3E), med en slutlig NORMALISERAD RFU på 0,3 (figur 3F). Skillnaderna i proteasom aktivitet mellan avdelningar sannolikt återspeglar tillgängligheten av proteasomerna i fraktionen, som i allmänhet är vanligast i cytoplasman och Nucleus27, fack som har den högsta nivån av aktivitet i vår förberedelse. Den lägsta aktivitetsnivån i den synaptiska regionen är förenlig med det är den enda lysate som samlades med hjälp av Joniska rengöringsmedel, vilket kan minska proteasom aktivitet på grund av hårdare denaturering skick. Viktigare, RFU inte öka över tiden i analysen ämnen eller i celllysat (Synaptic) inkuberas med den mycket specifika och potenta proteasom hämmare clasto-lactacystin-β-lactone (figur 3G, β-Lac), visar slutliga normaliserade RFU nivåer av 0,01 respektive 0,001 (diagram 3H). Detta tyder på att den observerade förändringen i RFU berodde särskilt på aktiviteten av proteasom och inte andra proteaser. Dessutom, när analyseras över experimentella förhållanden, det fanns en ökning av nukleära, men inte cytoplasmiska, proteasom aktivitet i sidled amygdala efter inlärning, som inträffade samtidigt med en minskning av synaptisk proteasom aktivitet i jämförelse med kontrolldjur (figur 4). Kollektivt, dessa resultat bekräftar att proteasom aktivitet kan mätas exakt i alla tre subcellulära fraktioner som samlats in från en enda råtta lateral amygdala.

En av fördelarna med proteasom Activity assay är att in vitro-manipulationer kan införas i proverna omedelbart före tillsats av proteasom-substratet, vilket möjliggör identifiering av specifika molekyler som kan reglera proteasomen i den specifika subcellulära fraktionen. Som ett exempel på detta, var den roll som camkii (kalcium/calmodulin beroende proteinkinas II) bedömdes i den synaptiska fraktionen, den hårdaste denaturerade lysat samlas in, eftersom camkii tros reglera proteasom funktion vid synapser. En 30 min inkubation med CaMKII-hämmaren MYR-AIP (myristolayted autocamtide-2-relaterad inhibitorisk peptid) resulterade i en signifikant minskad ökning av proteasomaktiviteten på analysen, som endast nådde nivåer som var ~ 61% av den obehandlade kontroller (figur 5a). Omvänt skulle samma manipulation som tillämpades på cytoplasman inte resultera i en förändring av proteasomaktiviteten från fordonsbehandlade brunnar (Figur 5b). Dessa resultat bekräftar att proteasom aktivitet kan ytterligare manipuleras in vitro och att denna manipulation kan ha olika effekter beroende på subcellulära fraktionen samlas.

Förutom att kvantifiera proteasom aktivitet, kan det beskrivna protokollet användas för att mäta subcellulära skillnader i olika ubiquitin ändringar med hjälp av Western blot-procedurer. Det är viktigt att notera att ubiquitin taggar som kan upptäckas begränsas av tillgängligheten av länkningsspecifika antikroppar, som för närvarande omfattar K48, K63 och M1 för råttor (Obs: en K27 antikropp är tillgänglig, men inte ger en detekterbar bild i någon i sidled amygdala fraktion eller hela cellen celllysat under en mängd olika förhållanden). Övergripande polyubiquitination, nedbrytning-oberoende linjär/M1 och K63 ubiquitination och nedbrytning-specifika K48 ubiquitination upptäcktes i alla subcellulära fraktioner. Viktigt, när det analyseras över olika Försöksförhållanden, det fanns en ökning av totalt (figur 6a), linjär (figur 6b), K63 (figur 6c) och K48 (figur 6d) polvubiquitinering i den laterala amygdala kärn fraktion efter inlärning i jämförelse med kontrolldjuren. Samtidigt, i cytoplasmiska regionen, totala polvubiquitinering minskade och K48 ubiquitination ökade efter inlärning, medan Synaptic K63 ubiquitination reducerades. Kollektivt, dessa resultat tyder på att inom samma djur subcellulära skillnader i länkningsspecifika protein ubiquitination kan upptäckas korrekt.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk för subcellulär fraktionering av rått hjärnvävnad. Gnagare hjärnan utvinns, hjärnregion dissekeras och halvklot Split. Med hjälp av en serie av buffertar och centrifugering steg, nukleära och cytoplasmiska fraktioner samlas in från en halvklotet medan en rå synaptisk fraktion samlas in från den andra. Båda fraktioner används sedan för proteasom aktivitet analyser och västerländska blotting, till assay protein polvubiquitinering nivåer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Bekräftelse av rå synaptic, nukleära och cytoplasmiska fraktions renhet. (A) det synaptiska proteinet postsynaptiska täthets proteinet 95 (PSD95; 1:1000) var närvarande i den synaptiska, men inte nukleära fraktionen med lägre nivåer i cytoplasman. B) Histone H3 (1:500) var närvarande i den nukleära, men inte synaptiska, fraktionen med lägre uttryck i cytoplasman. (C) β-tubulin (1:1000) var närvarande i cytoplasmiska, men till stor del frånvarande från den nukleära, fraktion med lägre uttryck i den synaptiska lysate. D) städ protein β-Actin (1:1000) var närvarande i alla subcellulära fack. Områden indikerar den förväntade storleken på målproteinet. Denna siffra har modifierats från Orsi, S.A. et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Kvantifiering av proteasom aktivitet i nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner som samlats in från den laterala amygdala av samma djur. Under den in vitro proteasom Activity assay, relativa fluorescerande enheter (RFU) upptäcks ökat från början (Scan 1) till slutet (Scan 5) av analysen i Synaptic (A), cytoplasmiska (C) och nukleära (E) fraktioner. Kvantifiering av denna förändring från baseline indikerade ett normaliserat RFU-värde (i förhållande till 10 μM AMC) på 0,1 i Synaptic (B), 1,6 i cytoplasman (D) och 0,3 i de nukleära (F) fraktionerna. Den proteasom hämmare βlac förhindrade rfus från att förändras över sessionen (G-H). Denna siffra har modifierats från Orsi, S.A. et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Subcellulära skillnader i proteasom aktivitet i den laterala amygdala av samma djur. En ökning av nukleär proteasom aktivitet upptäcktes i utbildade (rädsla konditioneras) djur i förhållande till kontroller, som motsvarade en minskning av aktiviteten inom den synaptiska fraktionen. Cytoplasmiska proteasom aktivitet förblev vid baseline. *P < 0,05 från kontroll. Denna siffra har modifierats från Orsi, S.A. et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : In vitro-manipulation av proteasom aktivitet i insamlade synaptiska och cytoplasmiska fraktioner. In vitro-manipulation av camkii signalering via inhibitor AIP reducerad proteasom aktivitet i Synaptic (A), men inte cytoplasmiska (B), fraktion från råtta laterala amygdala. Denna siffra har modifierats från Jarome, tj et al.23. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Subcellulära skillnader i länkningsspecifikt protein ubiquitination i laterala amygdala av samma djur efter inlärning. (A) det fanns en ökning av den totala ubiquitination i den nukleära fraktionen efter inlärning, som korrelerade med en minskning av cytoplasmatiska fraktionen. (B) det fanns en ökning av linjär ubiquitination i den nukleära, men inte cytoplasmiska eller synaptiska, fraktion efter inlärning. (C) det fanns en ökning av K63 ubiquitination i den nukleära fraktionen efter inlärning, som korrelerade med en minskning av den synaptiska fraktionen. (D) K48 ubiquitination ökade i den nukleära och cytoplasmiska, men inte synaptic, fraktion efter inlärning. *P < 0,05 från kontroll. Alla erhållna ubiquitin optiska densiteter normaliserades till β-Actin nivåer (lägre representativa Western blot bilder i A), som användes som en lastning kontroll. Denna siffra har modifierats från Orsi, S.A. et al.21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här visar vi en effektiv metod för att kvantifiera förändringar i ubiquitin-Proteasome-aktivitet mellan olika subcellulära fack i samma djur. För närvarande, de flesta försök att mäta subcellulära förändringar i aktiviteten av ubiquitin-Proteasome systemet har begränsats till ett enda fack per prov, vilket resulterar i behovet av att upprepa experiment. Detta leder till betydande kostnader och förlust av djurlivet. Vårt protokoll lindrar detta problem genom att dela upp halvklot, vilket gör att olika cellulära fraktioner samlas från varje halvklot av samma djur. Med hjälp av detta protokoll, kunde vi Visa för första gången att i samma djur ubiquitin-Proteasome verksamhet differentially förändringar i nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner som svar på lärande21.

Den viktigaste begränsningen av protokollet som beskrivs här är det beroende på mängden av hjärnvävnad (prov) erhålls. Till exempel, som beskrivs ovan, detta protokoll kräver att dela upp halvklot av en given hjärnregion. Detta kan dock inte alltid vara möjligt, till exempel när det gäller vissa områden som bara finns i ett halvklot. I dessa fall kan protokollet ändras genom att först homogenisera hela hjärnregionen i TEVP-bufferten som används i det synaptiska fraktions steget (avsnitt 3,1), eftersom denna buffert är fri från alla denatureringsmedel. Provet kan sedan delas upp i två lika stora delar i volym. Den första delen kan användas för den synaptiska fraktionen, enligt protokollet som beskrivs. För den andra halvan av provet kan det icke-joniska tvätt-och rengöringsmedlet NP-40 tillsättas till en slutlig koncentration på 0,05%, följt av centrifugering enligt beskrivningen i avsnitt 2,6. Detta kommer att möjliggöra separation av cytoplasmiska proteiner i supernatanten och kärn proteiner i pelleten, som kan ytterligare isoleras efter de återstående stegen i avsnitt 2. En annan oro i vävnad kvantitet är att vissa regioner i hjärnan är mycket små i storlek, såsom prelimbic cortex. I dessa fall kan dock ovanstående protokoll fortfarande användas genom att minska volymerna av de buffertar som används, vilket skulle behöva bestämmas empiriskt baserat på storleken på det insamlade hjärn området. Detta protokoll kan därför ändras till och med de svårare hjärnregioner där det finns mindre vävnad.

En av de stora fördelarna med det protokoll som vi skisserar här är att den använder gemensam laboratorieutrustning och reagens som finns i de flesta anläggningar, vilket gör att denna metod kan ändras till dem även på en begränsad budget eller med begränsade resurser. Dessutom, medan vi skisserar detta protokoll som ett sätt att mäta subcellulära förändringar i ubiquitin-Proteasome signalering, denna metod kan också tillämpas på alla andra protein eller cellulära process där förstå cellulära lokalisering och funktion är viktigt. Därför kan detta protokoll ha breda tillämpningar för att förstå de subcellulära funktioner av specifika proteiner eller komplex under inlärning och minne eller olika sjukdomstillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av startup medel från College of Agricultural och Life Sciences och College of Science vid Virginia Tech. T.M. stöds av George Washington Carver program på Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129, (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3, (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15, (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38, (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169, (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45, (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13, (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30, (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54, (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48, (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17, (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6, (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14, (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24, (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319, (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21, (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79, (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16, (20), 6331-6341 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics