Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Neuroscience

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Summary

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

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McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

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Abstract

Le système ubiquitine-protéasome est un régulateur clé de la dégradation des protéines et d'une variété d'autres processus cellulaires chez les eucaryotes. Dans le cerveau, les augmentations de l'activité ubiquitine-protéasome sont critiques pour la plasticité synaptique et la formation de mémoire et les changements aberrants dans ce système sont associés à une série de troubles neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques. L'un des problèmes dans l'étude du fonctionnement de l'ubiquitine-protéasome dans le cerveau est qu'il est présent dans tous les compartiments cellulaires, dans lesquels les cibles protéiques, le rôle fonctionnel et les mécanismes de régulation peuvent varier considérablement. En conséquence, la capacité de comparer directement le ciblage des protéines d'ubiquitine du cerveau et l'activité catalytique protéasome dans différents compartiments sous-cellulaires au sein d'un même animal est essentielle pour bien comprendre comment l'ONDu contribue à la plasticité synaptique, mémoire et la maladie. La méthode décrite ici permet la collecte de fractions synaptiques nucléaires, cytoplasmiques et brutes du même cerveau de rongeur (rat), suivie d'une quantification simultanée de l'activité catalytique protéasome (indirectement, fournissant l'activité du noyau protéasome seulement) et le marquage des protéines d'ubiquitine spécifique au lien. Ainsi, la méthode peut être utilisée pour comparer directement les changements subcellulaires dans l'activité ubiquitine-protéasome dans différentes régions du cerveau dans le même animal au cours de la plasticité synaptique, la formation de la mémoire et différents états de la maladie. Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer la distribution subcellulaire et la fonction d'autres protéines au sein d'un même animal.

Introduction

Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un réseau complexe de structures et de ligases de protéines interconnectées qui contrôle la dégradation de la plupart des protéines de courte durée dans les cellules1. Dans ce système, les protéines sont marquées pour la dégradation ou d'autres processus cellulaires / destins par le petit modificateur ubiquitine. Une protéine cible peut acquérir 1-7 modifications d'ubiquitine, qui peuvent relier ensemble à l'un des sept sites de lysine (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) ou la méthionine N-terminale (M1; aussi connu sous le nom linéaire) dans l'ubiquitine précédente2. Certaines de ces étiquettes de polyubiquitine sont spécifiques à la dégradation (K48)3, tandis que d'autres sont largement indépendantes du processus de dégradation des protéines (M1)4,5,6. Ainsi, le processus d'ubiquitination des protéines est incroyablement complexe et la capacité de quantifier les changements dans une étiquette spécifique de polyubiquitine est essentielle pour comprendre en fin de compte le rôle de cette modification donnée dans le fonctionnement cellulaire. Compliquant encore l'étude de ce système, le protéasome, qui est la structure catalytique de l'UPS7, les deux dégrade ntlifient les protéines, mais peut également être impliqué dans d'autres processus non protéolytiques8,9. Il n'est donc pas surprenant que, depuis sa découverte initiale, l'activité normale et aberrante ubiquitine-protéasome ait été impliquée dans la formation à long terme de mémoire et une série d'états de la maladie, y compris beaucoup neurologique, neurodégénérative et psychiatrique troubles10,11. En conséquence, les méthodes qui peuvent quantifier efficacement et efficacement l'activité UPS dans le cerveau sont essentielles pour comprendre en fin de compte comment ce système est dysrégulé dans les états de la maladie et le développement éventuel d'options de traitement ciblant l'ubiquitine et / ou protéasome fonctionnement.

Il y a un certain nombre de questions dans la quantification de l'activité ubiquitine-protéasome dans les tissus cérébraux des rats et des souris, qui sont les systèmes modèles les plus communs utilisés pour étudier la fonction d'UPS, y compris 1) la diversité des modifications d'ubiquitin, et 2) la distribution et régulation différentielle du fonctionnement d'UPS entre les compartiments subcellulaires12,13,14. Par exemple, bon nombre des premières démonstrations de la fonction ubiquitine-protéasome dans le cerveau pendant la formation de mémoire ont utilisé des lysates de cellules entières et ont indiqué des augmentations de temps-dépendantes dans l'ubiquitination de protéine et l'activité protéasome15, 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20. Cependant, nous avons récemment constaté que l'activité ubiquitine-protéasome variait considérablement d'un compartiment subcellulaire à l'autre en réponse à l'apprentissage, avec des augmentations simultanées dans certaines régions et des diminutions dans d'autres, un modèle qui diffère considérablement de ce qui a été précédemment rapporté dans les lysates de cellule entière21. Ceci est compatible avec la limitation d'une approche cellulaire entière, car elle ne peut dissocier la contribution des changements dans l'activité d'UPS dans différents compartiments subcellulaires. Bien que des études plus récentes ont utilisé des protocoles de fraction synaptique pour étudier l'UPS spécifiquement aux synapses en réponse à l'apprentissage22,23,24, les méthodes utilisées occlude la capacité de mesurer changements ubiquitine-protéasome nucléaires et cytoplasmiques chez le même animal. Il en résulte un besoin inutile de répéter des expériences plusieurs fois, la collecte d'une fraction subcellulaire différente dans chacun. Non seulement cela entraîne une plus grande perte de vies animales, mais il élimine la capacité de comparer directement l'activité UPS à travers différents compartiments subcellulaires en réponse à un événement donné ou au cours d'un état de maladie spécifique. Considérant que les cibles protéiques de l'ubiquitine et du protéasome varient considérablement dans l'ensemble de la cellule, il est essentiel de comprendre comment la signalisation ubiquitine-protéasome diffère dans les compartiments subcellulaires distincts pour identifier le rôle fonctionnel de l'UPS dans le cerveau pendant la formation de mémoire et les désordres neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques.

Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment mis au point une procédure dans laquelle des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques pourraient être recueillies pour une région du cerveau donnée à partir du même animal21. En outre, pour tenir compte de la quantité limitée de protéines qui peuvent être obtenues à partir de la collecte de plusieurs fractions subcellulaires à partir d'un même échantillon, nous avons optimisé les protocoles précédemment établis pour analyser l'activité protéasome in vitro et lien spécifique l'ubiquitination de protéine dans les cellules lysed s'est rassemblée du tissu de cerveau de rongeur. En utilisant ce protocole, nous avons pu recueillir et comparer directement les changements dépendants de l'apprentissage dans l'activité protéasome, K48, K63, M1 et les niveaux globaux de polyubiquitination de protéine dans le noyau et le cytoplasme et aux synapses dans l'amygdale latérale des rats. Ici, nous décrivons en détail notre procédure ( Figure1), qui pourrait améliorer considérablement notre compréhension de la façon dont l'UPS est impliqué dans la formation de la mémoire à long terme et divers états de la maladie. Cependant, il convient de noter que l'activité protéasome in vitro discutée dans notre protocole, bien que largement utilisée, ne mesure pas directement l'activité des complexes protéasomes complets de 26S. Au contraire, cet analyse mesure l'activité du noyau 20S, ce qui signifie qu'il ne peut servir de proxy que pour comprendre l'activité du noyau lui-même par opposition à l'ensemble du complexe protéasome 26S.

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Protocol

Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par le Virginia Polytechnic Institute et le State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Collection et dissection du tissu cérébral de rongeur

REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué à une variété de régions du cerveau et utilisé avec diverses procédures de collecte de tissus. Voici la procédure utilisée dans notre laboratoire pour la sous-cellulaire du tissu cérébral de rat, utilisant 8-9 semaines mâle s'il s'agit de rats Mâles Dawley. Afin de traiter tous les compartiments cellulaires du même animal, section 1.3. doit être suivie indépendamment de la procédure de collecte des tissus utilisée.

  1. Extraire le cerveau du rat et le placer dans une tasse cryogénique pré-réfrigérée sur de la glace sèche. Congelez le cerveau sur de la glace sèche, ou utilisez de l'azote liquide si disponible, et transférez-le dans un congélateur de -80 oC. Les cerveaux peuvent être disséqués le même jour ou à une date ultérieure.
  2. Retirez le cerveau gelé de la tasse cryogénique et placez-le dans une matrice de cerveau de rat refroidie avec de la glace sèche. Chaque fente sur la matrice correspond à 0,5 mm, qui peut être utilisé pour déterminer l'emplacement approximatif de la région d'intérêt (ROI).
    1. À l'aide d'un Atlas du cerveau des rats, insérez une lame de rasoir dans la matrice immédiatement devant (antérieure) du début prévu du retour sur investissement. Ensuite, insérez une lame de rasoir immédiatement à l'extrémité prévue (postérieure) du retour sur investissement.
    2. Retirer la tranche entre les lames de rasoir à l'aide d'un scalpel et la placer sur une lame de microscope refroidie sur de la glace sèche. Typiquement, les sections sont 2-3 mm d'épaisseur, mais cela varie en fonction du retour sur investissement.
  3. À l'aide d'un scalpel, disséquer le retour sur investissement un hémisphère à la fois. Placer chaque hémisphère dans des tubes microcentrifuges séparés de 1,5 ml préréfrigérés sur de la glace sèche. Les tissus congelés peuvent être immédiatement utilisés pour la fractionnement subcellulaire ou traités ultérieurement s'ils sont stockés à -80 oC.

2. Extraction nucléaire et cytoplasmique

REMARQUE: Ce protocole utilise des solutions de stock préfabriquées de produits chimiques de laboratoire courants, y compris 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,5 M d'acide éthylèneminetetraacetic (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) et 50% glycérol. Si le point final est utilisé dans les essais d'activité protéasome, le glycérol et l'ATP peuvent être ajoutés à tous les tampons pour aider à empêcher le démontage des complexes protéasome pendant la lyse.

  1. Préparer le tampon Lysis. Ajouter 8,63 ml d'eau ultrapure (désionisée et distillée) dans un tube conique stérile de 15 ml.
    1. Au tube conique, ajouter 1 000 l de 0,1 M HEPES, 15 oL de 1 M MgCl, 100 oL de 1 M DTT et 50 oL de 10 % De NP-40.
    2. Ajouter 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase et 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase. Vortex brièvement la solution pour mélanger et placer sur la glace humide pour refroidir. Notez que la solution peut avoir une teinte jaune de l'inhibiteur de la phosphatase.
      REMARQUE: L'utilisation d'inhibiteurs de la protéase est essentielle pour préserver les protéines et assurer la spécificité de l'évaluation de l'activité protéasome in vitro. Cependant, ces inhibiteurs peuvent également entraîner une légère réduction de l'activité protéasome, ce qui signifie que l'activité mesurée sur l'in vitro peut être une sous-estimation des niveaux d'activité réels.
  2. Préparer le tampon d'extraction. Ajouter 5,925 ml d'eau ultrapure (déionisée et distillée) dans un tube conique stérile de 15 ml.
    1. Au tube conique, ajouter 2 000 l de 0,1 M HEPES, 1250 oL de 50 % de glycérol, 15 l de 1 M MgCl2, 5 oL de 1 M DTT, 5 oL de 0,5 M EDTA et 600 oL de 5 M NaCl.
    2. Ajouter 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase et 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase. Vortex brièvement la solution pour mélanger et placer sur la glace humide pour refroidir. Notez que la solution peut avoir une teinte jaune de l'inhibiteur de la phosphatase.
  3. Retirez le microtube de centrifugeuse de 1,5 ml contenant un hémisphère du roi-roi du congélateur de -80 oC. Veiller à ce que l'hémisphère utilisé soit contrebalancé par les conditions d'extraction de chaque groupe expérimental. Par exemple, dans une expérience en deux groupes, utilisez l'hémisphère gauche pour les deux premiers animaux de chaque groupe et l'hémisphère droit pour les deux échantillons suivants, etc.
  4. À l'aide d'un scalpel, transférer le tissu cérébral congelé dans un homogénéisateur de téflon en verre de 2 ml. Ajouter 500 l de tampon lysis au tube de téflon.
    1. À l'aide du pilon B, homogénéiser le même tissu à l'aide de 15 coups jusqu'à ce qu'aucune quantité visible de matière solide ne soit présente. Utilisez un mouvement tournant (dans le sens des aiguilles d'une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d'une montre) pendant chaque course.
  5. À l'aide d'une pipette de 1 000 l, transférer l'échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml. Placer le tube sur de la glace humide et couver pendant 30 min.
  6. Placer le tube dans le microcentrifuge et faire tourner pendant 10 min à 845 x g et 4 oC. Après l'achèvement, retirer soigneusement le supernatant par pipetting et placer dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml; il s'agit de la Fraction Cytoplasmique, qui peut être stockée sur la glace ou à 4 oC jusqu'à la section 2.9.
  7. Ajouter 50 lde de tampon d'extraction à la pastille résultante et le suspendre à nouveau par tuyauterie. Ne pas vortexlant la pastille. Placer le tube contenant le granule rechargé sur la glace et couver pendant 30 min.
  8. Placer le tube dans le microcentrifuge et faire tourner pendant 20 min à 21 456 x g, 4 oC. Après l'achèvement, retirer soigneusement le supernatant par pipetting et placer dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml; c'est la Fraction Nucléaire. Le granule peut maintenant être jeté.
  9. Mesurer la concentration en protéines des extractions cytoplasmiques et nucléaires à l'aide de l'analyse des protéines Dc (selon les instructions du fabricant), ou de tout essai équivalent pour les échantillons prélevés à l'aide de détergents non ioniques. Procédez immédiatement à l'exemple d'activité protéasome (section 4) ou au ballonnement occidental (section 5). Alternativement, les échantillons peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à ce que nécessaire.

3. Collection Fraction Synaptic

REMARQUE: Ce protocole utilise des solutions de stock préfabriquées de produits chimiques de laboratoire courants, y compris 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl et 10% SDS. Si le point final est utilisé dans les tests d'activité protéasome, le glycérol et l'ATP peuvent être ajoutés à tous les tampons pour aider à empêcher le démontage des complexes protéasome pendant la lyse

  1. Préparer le tampon TEVP avec un saccharose de 320 mM. Ajouter 60 ml d'eau ultrapure (déionisée et distillée) à un bécher propre de 100 ml.
    1. Au bécher, ajouter 1 300 l de 1 M Tris (pH 7,5), 260 oL de 0,5 M EDTA, 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase, 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase et 10,944 g de saccharose. Mélanger avec une barre d'agitation jusqu'à ce que le saccharose soit complètement dissous.
    2. Amenez le pH à 7,4 euros en ajoutant de l'acide chlorhydrique (HCl) à la solution à l'aide d'une pipette.
    3. Transférer la solution dans un flacon volumétrique de 100 ml. Porter le volume à 100 ml en ajoutant de l'eau ultrapure. Refroidir la solution finale sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
  2. Préparer le tampon d'homogénéisation. Ajouter 60 ml d'eau ultrapure (déionisée et distillée) à un bécher propre de 100 ml.
    1. Au bécher, ajouter 5 000 l de 1 M Tris (pH 7,5), 3 000 l de 5 M NaCl, 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase, 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase et 2 000 l de 10 % de SDS. Mélanger avec une barre à remuer.
      REMARQUE: Les détergents ioniques peuvent interférer avec les essais d'activité protéasome en ayant pour résultat la dénaturation du complexe protéasome. Le volume de SDS pourrait être abaissé pour aider à préserver la fonction protéasome si désiré.
    2. Amenez le pH à 7,4 euros en ajoutant HCl dropwise à la solution à l'aide d'une pipette.
    3. Transférer la solution dans un flacon volumétrique de 100 ml. Porter le volume à 100 ml en ajoutant de l'eau ultrapure. Conserver la solution finale à température ambiante; ne pas refroidir que SDS va précipiter hors de la solution.
  3. Retirer la centrifugeuse de 1,5 ml contenant un hémisphère du retour sur investissement du congélateur de -80 oC. Veiller à ce que l'hémisphère utilisé soit contrebalancé par les conditions d'extraction de chaque groupe expérimental. Par exemple, dans une expérience en deux groupes, utilisez l'hémisphère gauche pour les deux premiers animaux de chaque groupe et l'hémisphère droit pour les deux échantillons suivants, etc.
  4. À l'aide d'un scalpel, transférer le tissu cérébral congelé dans un homogénéisateur de téflon en verre de 2 ml. Ajouter 500 l de tampon TEVP au tube de téflon.
    1. À l'aide du pilon B, homogénéiser le même tissu à l'aide de 15 coups jusqu'à ce qu'aucun transfert visible de matière solide ne soit présent. Utilisez un mouvement tournant (dans le sens des aiguilles d'une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d'une montre) pendant chaque course.
  5. À l'aide d'une pipette de 1 000 l, transférer l'échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifuger l'échantillon à 1 000 x g pendant 10 min, 4 oC.
  6. Recueillir le supernatant et transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml à l'aide d'une pipette de 1 000 l. Centrifuger l'échantillon à 10 000 x g pendant 10 min, 4 oC. La pastille d'origine (P1) contient des noyaux et les gros débris et peut être jetée.
  7. Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml. C'est une Fraction Cytosolique. Ajouter 50 l de tampon d'homogénéisation au granule (P2) et le suspendre à nouveau par tuyauterie jusqu'à ce qu'aucun matériau solide ne soit visible.
  8. Centrifuger l'échantillon à 20 000 x g pendant 10 min, 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml; il s'agit de la fraction de la membrane synaptosomique brute (synaptique). Le granule peut être jeté.
  9. Mesurer la concentration protéique de la fraction synaptique à l'aide de l'analyse de la protéine Dc (selon les instructions du fabricant), ou tout autre analyse équivalente pour les échantillons recueillis à l'aide de détergents ioniques. Procédez immédiatement à l'exemple d'activité protéasome (section 4) ou au ballonnement occidental (section 5). Alternativement, les échantillons peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à ce que nécessaire.

4. Test d'activité de protéasome

REMARQUE: L'activité protéasome peut être mesurée dans le tissu cérébral homogénéisé à l'aide d'une version légèrement modifiée de la trousse d'activité protéasome 20S. Cet exemple ne mesure pas directement l'activité des complexes protéasomes complets de 26S. Il mesure plutôt l'activité du noyau 20S, ce qui signifie qu'il ne peut servir que de substitut pour comprendre l'activité du noyau lui-même par opposition à l'ensemble du complexe protéasome 26S. Le succès de cet essai diminue avec des cycles de gel-dégel répétés et/ou des niveaux croissants de détergents, particulièrement ioniques, et nécessite l'utilisation d'un lecteur de plaque avec un ensemble de filtre s'énervois 360/460 (excitation/émission) et des capacités de chauffage jusqu'à 37 oC.

  1. Paramètres de lecteur de plaque : Pré-chaud à 37 oC et maintenez la course.
    1. Définir l'excitation à 360 et l'émission à 460. Si la plaque de puits 96 utilisée est claire, placez la position optique vers le bas. Si une plaque de puits 96 foncée/noire est utilisée, placez la position optique top.
    2. Définir les anciens modèles de lecteurs de plaques sur Auto-Gain sous les options de lecture fluorescente; de nouveaux modèles sont préréglés pour cela. Programmez une course cinétique avec un temps de 2 h, en scannant (lecture) toutes les 30 min.
  2. Reconstituer le tampon d'assay 10x fourni dans le kit avec 13,5 ml d'eau ultrapure. Ajouter 14 L de 100 mM ATP au tampon maintenant 1x; ceci améliore considérablement l'activité de protéasome dans les échantillons et améliore la fiabilité d'analyse. Le tampon d'analyse final 20S peut être stocké sur la glace ou à 4 oC jusqu'à ce que nécessaire et soit stable pendant plusieurs mois.
  3. Reconstituer la norme AMC fournie en kit avec 100 L de DMSO. Effectuez cette étape dans l'obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car la norme est sensible à la lumière.
  4. Créez une courbe de support d'AMC en utilisant la norme reconstituée, dans l'obscurité ou dans des conditions de faible luminosité.
    1. Dans les tubes de microcentrifuge distincts de 0,5 mL, ajouter 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 et 0 L de la norme AMC, ce qui correspond à 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 et 0 M de concentration AMC.
    2. À ces tubes, dans le même ordre, ajoutez 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 et 100 l de tampon d'essai 20S. Cela crée une série de concentrations élevées à faibles AMC, qui seront utilisés pour l'étalonnage des lecteurs de plaques et l'analyse de l'activité protéasome dans les échantillons homogénéisés.
    3. Conservez toutes les normes diluées sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que nécessaire.
  5. Reconstituer le substrat protéasome (Suc-LLVY-AMC) fourni en kit avec 65 l de DMSO. Effectuez cette étape dans l'obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car le substrat est sensible à la lumière. Créer une dilution de 1:20 du substrat protéasome dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml à l'aide d'un tampon d'analyse 20S. Conserver le substrat dilué sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que nécessaire.
    REMARQUE: Par exemple, si la plaque aura 10 échantillons et 1 blanc, vous aurez besoin d'un substrat dilué suffisant pour 22 puits (avec des doublons) à 10 l par puits. Cela équivaut à 220 'L besoin de '30 'L pour les erreurs de pipetting, nécessitant 12,5 'L de substrat et 237,5 'L de 20S Assay tampon.
  6. Décongeler les échantillons désirés (s'ils sont congelés) et ajouter une quantité normalisée à une assiette de 96 puits. Exécutez chaque échantillon en doublons. La quantité d'échantillon nécessaire varie en fonction de la préparation des tissus. En général, 10-20 g est suffisant pour n'importe quelle fraction subcellulaire.
  7. Porter le volume du puits d'échantillon à 80 L avec de l'eau ultrapure. La quantité ajoutée dépend du volume d'échantillon ajouté. Par exemple, si l'échantillon 1 était de 4,5 l de protéines et l'échantillon 2 était de 8,7 l, la quantité d'eau nécessaire sera de 75,5 l et de 71,3 l, respectivement. Dans deux puits distincts, ajouter 80 l'eau seule; ce seront les Assay Blanks.
    REMARQUE: Afin de limiter les changements dans le volume de protéines en raison d'erreurs de pipetage, les concentrations de protéines peuvent être normalisées à l'échantillon le moins concentré. Cela permettra l'utilisation du même volume d'échantillon dans toutes les conditions.
  8. Ajouter 10 l de tampon d'assay 20S à chaque puits, y compris les blancs d'assay. Un répéteur/pipette automatisée est recommandé ici pour assurer un volume d'analyse uniforme dans les puits.
  9. En option: À ce stade, introduire des manipulations in vitro si désiré; cela exigera que chaque échantillon dispose de 2 puits supplémentaires par traitement, y compris le véhicule. Si c'est le cas, ajouter de 5 à 10 L de médicaments/composés d'intérêt à 2 des puits de l'échantillon et un volume équivalent de contrôle/véhicule à 2 autres puits. Placer la plaque sur le lecteur de plaque préréchauffé ou dans un incubateur de 37 oC pendant 30 min.
  10. Éteignez les lumières ou entrez dans une pièce sombre. Ajouter les 100 l de normes AMC diluées à un nouveau puits; chaque norme aura un seul puits.
  11. Dans l'obscurité, ajouter 10 l de substrat protéasome dilué aux puits contenant des échantillons et des extraits, mais pas à la norme AMC. Un répéteur/pipette automatisée est recommandé ici pour assurer un volume d'analyse uniforme dans les puits.
  12. Placez la plaque dans le lecteur de plaque et commencez la course cinétique.
    REMARQUE: La plaque n'a pas besoin d'être sous agitation constante pendant la course cinétique, cependant, l'utilisateur peut choisir de si désiré
  13. À la fin de la course cinétique, exportez des valeurs fluorescentes brutes 360/460 à Microsoft Excel.
    1. Moyenne ensemble des puits en double pour chaque norme, chaque échantillon et le blanc d'analyse pour les 5 scans. Les valeurs fluorescentes brutes devraient augmenter d'un balayage à l'autre des échantillons, mais rester stables (ou diminuer légèrement) pour les normes et les extraits.
    2. Prenez la moyenne de puits la plus haute norme AMC et divisez-la par la concentration connue (20 M). Divisez cette valeur par la concentration d'échantillon utilisée dans l'analyse pour obtenir une valeur AMC normalisée. Pour chaque échantillon et la moyenne d'analyse, divisez par la valeur AMC standardisée.
    3. Prenez cette valeur finale et divisez par la concentration d'échantillon utilisée dans l'analyse pour obtenir la valeur normalisée pour chaque échantillon et le vide d'analyse. Faites ceci pour tous les 5 balayages.
    4. Soustrayez la valeur normalisée de l'Analyse Blank de chaque valeur d'échantillon normalisée pour les 5 scans.

5. Quantification de l'ubiquitination des protéines spécifique à Linkage

  1. La quantification de diverses étiquettes de polyubiquitine dans différentes fractions subcellulaires rassemblées du tissu de cerveau de rongeur devrait être faite utilisant une série de protocoles occidentaux standard de blotting en combination avec les anticorps polyubiquitin uniques, linkage-spécifiques.
    1. Pour dénaturation, mélanger les échantillons normalisés avec un volume égal de tampon d'échantillon Deemmli complété par du mercaptoéthanol à un pourcentage de 5 % en volume, selon l'instruction du fabricant.
    2. Pour quantifier toutes les modifications de monoubiquitination et de polyubiquitination indépendamment du lien, utilisez un anticorps pan-ubiquitine.
    3. Pour reconnaître toutes les protéines polyubiquitinated, utilisez un anticorps ubiquitine qui ne réagit pas avec la monoubiquitination.
    4. Pour la polyubiquitination spécifique au lien, utilisez des anticorps qui peuvent détecter lysine-27, Lysine-48, Lysine-63 et la polyubiquitination linéaire (M1).
  2. Pour prévenir la contamination croisée entre les développements, ce qui pourrait entraîner un faux positif ou interférer avec l'imagerie d'une modification différente de l'ubiquitine, les membranes de bande entre les développements en utilisant 0,1 M NaOH pendant 10 min.
    1. Laver les membranes dans le SCT avec 0,1% d'entre-deux pendant 10 min et rebloquer (en utilisant tout agent de blocage est préféré dans le protocole western blot utilisé).
    2. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire et le réaménager afin de confirmer que la membrane a été dépouillée des anticorps primaires et secondaires correctement.
    3. Recommandé: Pour le développement réussi de différents anticorps d'ubiquitine sans contamination, utilisez des systèmes d'imagerie fluorescents ou proches infrarouges. Cela peut souvent empêcher le report entre les anticorps.
  3. Certaines images de taches de l'ouest ubiquitine fourniront des colonnes de bandes distinctes (comme M1) tandis que d'autres produisent un motif de frottis avec peu ou pas de lignes claires (commune avec K48). Pour la quantification des taches occidentales d'ubiquitine d'image, dessinez une boîte autour de la colonne qui étend l'échelle entière de normes moléculaires.
    1. Ajuster la boîte vers le haut (ou vers le bas) si la coloration de l'ubiquitine s'étend à travers toute l'échelle; ceci est commun pour des modifications de Lysine-48 et varie considérablement entre les compartiments subcellulaires.
    2. Soustrayez l'arrière-plan, qui est calculé comme la densité optique moyenne de l'arrière-plan entourant immédiatement la colonne de tous les côtés.

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Representative Results

En utilisant la procédure décrite ici, des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques ont été recueillies à partir de l'amygdale latérale du cerveau du rat (Figure 1). La pureté des fractions individuelles a été confirmée par le ballonnement occidental, sondant avec des anticorps contre des protéines qui devraient être enrichies ou épuisées dans le lysate. Dans le premier hémisphère où une fraction synaptique brute a été recueillie, la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD95) était présente dans la fraction synaptique, mais pas nucléaire, avec des niveaux plus bas dans le cytoplasme (figure 2A). Ceci est compatible avec les travaux précédents démontrant que la préparation de fraction synaptique isole les composants presynaptiques et postsynaptiques25. Inversement, la protéine nucléaire histone H3 était présente dans le nucléaire, mais pas la fraction synaptique, avec des niveaux plus faibles dans le cytoplasme (Figure 2B). La présence de PSD95 et H3 dans le cytoplasme est compatible avec leur traduction cytoplasmique. La protéine cytoplasmique -tubulin était présente dans notre fraction cytoplasmique, mais était en grande partie absente du lysate nucléaire (figure 2C), avec des niveaux plus bas dans la région synaptique. Ceci suggère que nous avons pu produire une fraction nucléaire qui était en grande partie absente des protéines cytoplasmiques. La présence de tubuline dans la région synaptique est compatible avec les études précédentes26. Les trois fractions présentaient des niveaux similaires de la protéine de conservation du logement , l'actine (figure2D),qui était utilisée comme contrôle de chargement. Collectivement, ces résultats confirment que la pureté des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques recueillies à partir d'un seul rat amygdale latérale.

Ensuite, tous les lysates ont été confirmés pour l'activité protéasome fonctionnelle utilisant la version modifiée décrite de l'analyse in vitro 20S d'activité de protéasome. Dans tous les lysates, le succès de l'analyse a été défini comme une augmentation des unités fluorescentes brutes (RFU) détectées à partir de la première analyse (0 min) à la cinquième / dernière analyse (120 min). Pour toutes ces analyses, 10 'M AMC a été utilisé comme norme la plus élevée pour la normalisation des unités fluorescentes brutes (RFU). Dans la fraction synaptique brute, la RFU a atteint un sommet de 5 etos (figure3A),ce qui a entraîné une RFU normalisée d'un peu moins de 0,1 (figure 3B). Dans la fraction cytoplasmique, la RFU a augmenté à travers les balayages (figure 3C) avec une RFU normalisée finale de 1,6 (figure 3D). La fraction nucléaire a également affiché des changements dépendants du temps dans la RFU (Figure 3E), avec une RFU normalisée finale de 0,3 (figure 3F). Les différences dans l'activité protéasome entre les compartiments reflète probablement la disponibilité des protéasomes dans la fraction, qui sont généralement les plus abondantes dans le cytoplasme et le noyau27, compartiments qui ont le plus haut niveau d'activité dans notre préparation. Le niveau d'activité le plus bas dans la région synaptique est compatible avec le fait qu'il soit le seul lysate qui a été recueilli à l'aide de détergents ioniques, ce qui peut réduire l'activité protéasome en raison de l'état de dénaturation plus sévère. Fait important, la RFU n'a pas augmenté au fil du temps dans les assay Blanks ou chez les lysates (synaptiques) incubés avec l'inhibiteur protéasome très spécifique et puissant clasto-lactacystin-lactone (Figure 3G, 'lac), affichant les niveaux finaux normalisés de RFU de 0,01 et 0,001, respectivement (figure 3H). Ceci suggère que le changement observé dans RFU était dû spécifiquement à l'activité des protéasomes et pas d'autres protéases. En outre, lorsqu'il a été analysé dans des conditions expérimentales, il y a eu une augmentation de l'activité protéasome nucléaire, mais non cytoplasmique, dans l'amygdale latérale après l'apprentissage, qui s'est produite simultanément avec une diminution de l'activité protéasome synaptique dans comparaison avec les animaux témoins (Figure 4). Collectivement, ces résultats confirment que l'activité protéasome pourrait être mesurée avec précision dans chacun des trois fractions subcellulaires rassemblées à partir d'un amygdale latéral de rat simple.

L'un des avantages de l'analyse de l'activité protéasome est que des manipulations in vitro peuvent être introduites dans les échantillons immédiatement avant l'ajout du substrat protéasome, ce qui permet l'identification de molécules spécifiques qui peuvent réguler le protéasome dans cette fraction sous-cellulaire particulière. À titre d'exemple, le rôle de CaMKII (protéine dépendante du calcium/calmodulin kinase II) a été évalué dans la fraction synaptique, le lysate dénaturé le plus dur recueilli, puisque CaMKII est pensé pour réguler la fonction protéasome aux synapses. Une incubation de 30 minutes avec l'inhibiteur de CaMKII myr-AIP (peptide inhibiteur d'autocamtide-2 myristolayted d'autocamtide-2) a eu comme conséquence une augmentation sensiblement diminuée de l'activité de protéasome sur l'assay, qui a seulement atteint des niveaux qui étaient '61% du non traité (figure5A). Inversement, la même manipulation appliquée au cytoplasmique n'a pas entraîné de changement dans l'activité protéasome des puits traités par véhicule (figure 5B). Ces résultats confirment que l'activité protéasome peut être manipulée davantage in vitro et que cette manipulation peut avoir des effets différents selon la fraction subcellulaire recueillie.

En plus de quantifier l'activité protéasome, le protocole décrit peut être employé pour mesurer des différences subcellulaires dans diverses modifications d'ubiquitine utilisant des procédures occidentales de tache. Il est important de noter que les étiquettes d'ubiquitine qui peuvent être détectées sont limitées par la disponibilité d'anticorps spécifiques au lien, qui comprennent actuellement K48, K63 et M1 pour les rats (note: un anticorps K27 est disponible, mais n'a pas produit une image détectable dans tout la fraction latérale d'amygdale ou les lysates de cellules entières dans une série de conditions). L'ubiquitination globale, l'ubiquitination linéaire/M1 de dégradation-indépendante et l'ubiquitination de K48 spécifiques de dégradation ont été détectées dans toutes les fractions subcellulaires. Fait important, lorsqu'on les a analysés dans différentes conditions expérimentales, il y a eu une augmentation de la polyubiquitination globale (figure 6A),linéaire (figure 6B), K63 (figure 6C) et K48 (figure 6D) dans l'amygdale latérale fraction nucléaire après l'apprentissage par rapport à contrôler les animaux. Dans le même temps, dans la région cytoplasmique, la polyubiquitination globale a diminué et l'ubiquitination de K48 a augmenté après l'apprentissage, alors que l'ubiquitination synaptique de K63 a été réduite. Collectivement, ces résultats indiquent que dans le même animal les différences subcellulaires dans l'ubiquitination de protéine linkage-spécifique peuvent être exactement détectées.

Figure 1
Figure 1 : Schématique pour la fractionnement subcellulaire du tissu cérébral rat. Le cerveau des rongeurs est extrait, la région du cerveau disséquée et les hémisphères se divisent. À l'aide d'une série de tampons et d'étapes centrifugeuses, des fractions nucléaires et cytoplasmiques sont prélevées dans un hémisphère tandis qu'une fraction synaptique brute est prélevée sur l'autre. Les deux fractions sont ensuite utilisées pour les essais d'activité protéasome et le ballonnement occidental, pour évaluer les niveaux de polyubiquitination des protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Confirmation de la pureté des fractions synaptiques, nucléaires et cytoplasmiques brutes. (A) La protéine synaptique de la protéine postsynaptique protéine 95 (PSD95; 1:1,000) était présente dans la fraction synaptique, mais pas nucléaire avec des niveaux plus bas dans le cytoplasme. (B) Histone H3 (1:500) était présent dans la fraction nucléaire, mais pas synaptique, avec une expression inférieure dans le cytoplasme. (C) - Tubulin (1:1,000) était présent dans le cytoplasmique, mais largement absent du nucléaire, fraction avec une expression inférieure dans le lysate synaptique. (D) La protéine d'entretien ménager -actine (1:1,000) était présente dans tous les compartiments subcellulaires. Les zones indiquent la taille prévue de la protéine cible. Ce chiffre a été modifié à partir d'Orsi, S.A. et coll.21. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Quantification de l'activité protéasome dans les fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques recueillies à partir de l'amygdale latérale du même animal. Pendant l'essai d'activité protéasome in vitro, les unités fluorescentes relatives (RFU) détectées ont augmenté du début (Scan 1) à la fin (Scan 5) de l'essai dans le synaptique (A), Cytoplasmique (C) et nucléaire (E) fractions. La quantification de ce changement par rapport à la ligne de base a indiqué une valeur rFU normalisée (par rapport à 10 M AMC) de 0,1 dans les fractions synaptiques (B), 1,6 dans le cytoplasmique (D) et 0,3 dans les fractions nucléaires (F) . L'inhibiteur du protéasome 'lac a empêché les URF de changer tout au long de la session (G-H). Ce chiffre a été modifié à partir d'Orsi, S.A. et coll.21. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Différences subcellulaires dans l'activité protéasome dans l'amygdale latérale du même animal. Une augmentation de l'activité protéasome nucléaire a été détectée chez les animaux entraînés (conditionnés par la peur) par rapport aux témoins, ce qui correspondait à une diminution de l'activité au sein de la fraction synaptique. L'activité protéasome cytoplasmique est restée à la ligne de base. P lt; 0,05 de Contrôle. Ce chiffre a été modifié à partir d'Orsi, S.A. et coll.21. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Manipulation in vitro de l'activité protéasome dans les fractions synaptiques et cytoplasmiques collectées. La manipulation in vitro de la signalisation de CaMKII par l'intermédiaire de l'inhibiteur AIP a réduit l'activité protéasome dans le synaptique (A),mais pas le cytoplasmique (B),fraction de l'amygdale latérale de rat. Ce chiffre a été modifié à partir de Jarome, T.J. et coll.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Différences subcellulaires dans l'ubiquitination de protéine linkage-spécifique dans l'amygdale latérale du même animal après l'apprentissage. (A) Il y a eu une augmentation de l'ubiquitination globale dans la fraction nucléaire après l'apprentissage, qui s'est corrélée avec une diminution de la fraction cytoplasmique. (B) Il y a eu une augmentation de l'ubiquitination linéaire dans le nucléaire, mais pas cytoplasmique ou synaptique, fraction après l'apprentissage. (C) Il y a eu une augmentation de l'ubiquitination k63 dans la fraction nucléaire après l'apprentissage, qui s'est corrélée avec une diminution de la fraction synaptique. (D) K48 ubiquitination a augmenté dans le nucléaire et cytoplasmique, mais pas synaptique, fraction après l'apprentissage. P lt; 0,05 de Contrôle. Toutes les densités optiques d'ubiquitine obtenues ont été normalisées aux niveaux d'actine de ''(images occidentales inférieures représentatives de tache en A), qui ont été employées comme commande de chargement. Ce chiffre a été modifié à partir d'Orsi, S.A. et coll.21. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ici, nous démontrons une méthode efficace pour quantifier des changements dans l'activité ubiquitine-protéasome à travers différents compartiments subcellulaires dans le même animal. À l'heure actuelle, la plupart des tentatives de mesure des changements subcellulaires dans l'activité du système ubiquitine-protéasome ont été limitées à un seul compartiment par échantillon, ce qui a entraîné la nécessité de répéter des expériences. Cela entraîne des coûts importants et des pertes de vies animales. Notre protocole atténue ce problème en divisant les hémisphères, permettant à différentes fractions cellulaires d'être recueillies dans chaque hémisphère d'un même animal. En utilisant ce protocole, nous avons pu montrer pour la première fois que dans la même activité animale ubiquitine-protéasome change différentiellement dans les fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques en réponse à l'apprentissage21.

La principale limitation du protocole décrit ici est qu'il dépend de la quantité de tissu cérébral (échantillon) obtenue. Par exemple, comme indiqué ci-dessus, ce protocole exige la division des hémisphères d'une région cérébrale donnée. Cependant, cela n'est pas toujours possible, comme dans le cas de certaines zones qui ne sont présentes que dans un hémisphère. Dans ces cas, le protocole pourrait être modifié en homogénéisant d'abord toute la région du cerveau dans le tampon TEVP utilisé dans l'étape de fraction synaptique (section 3.1), puisque ce tampon est exempt de tous les agents dénaturants. L'échantillon peut ensuite être divisé en deux parties égales par volume. La première partie peut être utilisée pour la fraction synaptique, suivant le protocole tel que décrit. Pour la deuxième moitié de l'échantillon, le détergent non ionique NP-40 peut être ajouté à une concentration finale de 0,05 %, suivi du centrifage tel que décrit à la section 2.6. Cela permettra la séparation des protéines cytoplasmiques dans le supernatant et les protéines nucléaires dans la pastille, qui peuvent être encore isolés après les étapes restantes de la section 2. Une autre préoccupation dans la quantité de tissu est que certaines régions de cerveau sont très petites dans la taille, telle que le cortex prélimbique. Cependant, dans ces cas, le protocole ci-dessus peut encore être utilisé en réduisant les volumes des tampons utilisés, qui devraient être déterminés empiriquement en fonction de la taille de la région du cerveau recueillies. Ainsi, ce protocole peut être modifié pour même les régions du cerveau les plus difficiles dans lesquelles moins de tissu est disponible.

L'un des principaux avantages du protocole que nous exposons ici est qu'il utilise des équipements de laboratoire et des réactifs communs que l'on peut trouver dans la plupart des installations, ce qui permet à cette méthodologie d'être modifiable à ceux même avec un budget restreint ou avec des ressources limitées. En outre, tandis que nous définissons ce protocole comme un moyen de mesurer les changements subcellulaires dans la signalisation ubiquitine-protéasome, cette méthodologie peut également être appliquée à toute autre protéine ou processus cellulaire dans lequel la compréhension de la localisation cellulaire et la fonction est important. Ainsi, ce protocole pourrait avoir de larges applications pour comprendre les fonctions subcellulaires de protéines ou de complexes spécifiques pendant l'apprentissage et la mémoire ou différents états de la maladie.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du College of Agricultural and Life Sciences et le College of Science de Virginia Tech. T.M. est soutenu par le programme George Washington Carver de Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

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References

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