用于量化Vibrio Fischeri分离物之间竞争交互的联合孵化测定

Immunology and Infection

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Summary

细菌编码各种机制,参与细菌间竞争。在这里,我们提出了一个基于培养的协议,用于描述细菌分离物之间的竞争相互作用,以及它们如何影响混合种群的空间结构。

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Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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Abstract

本手稿描述了一种基于培养的共生测定,用于检测和描述两种细菌群体之间的竞争相互作用。该方法采用稳定的质粒,使每个种群分别具有不同的抗生素抗性能力和荧光蛋白,用于选择和视觉鉴别。在这里,我们描述了竞争维布里奥菲舍尔菌株的制备和联合孵化、荧光显微镜成像和定量数据分析。这种方法很简单,产生快速的结果,并可用于确定一个种群是杀死还是抑制另一个种群的生长,以及竞争是通过可扩散的分子进行中介的,还是需要直接的细胞-细胞接触。由于每个细菌群体表达不同的荧光蛋白,因此测定允许在混合菌群中对相互竞争的人群进行空间歧视。虽然所述方法使用共生细菌V. 菲舍尔使用针对该物种优化的条件执行,但该协议可以适用于大多数可培养的细菌分离物。

Introduction

本手稿概述了一种基于培养的方法,用于确定两种细菌分离物是否具有竞争性相互作用。在研究混合种群时,评估细菌分离物相互作用的程度非常重要,特别是分离物是否通过干扰机制直接竞争。干扰竞争是指一个人口直接抑制增长或杀死竞争对手1的相互作用。这些相互作用是重要的识别,因为它们可以有深刻的影响微生物群落的结构和功能2,3。

微生物竞争机制已广泛发现来自不同环境的细菌基因组,包括宿主相关细菌和自由生存细菌4、5、6、7 8,9.已经描述了各种竞争策略10,11包括可扩散的机制,如杀菌化学品1,12和分泌抗菌肽13,以及需要细胞-细胞接触将抑制作用剂转移到目标细胞9、14、15、16、17的接触依赖机制,18.

虽然基于培养的共育物在微生物学5、8、19中常用,但本手稿概述了如何使用测定来描述竞争机制,以及适应与其他细菌物种一起使用的协议。此外,此方法还描述了分析和呈现数据的多种方法,以回答有关竞争交互性质的不同问题。虽然本文所述技术以前曾用于识别共生Vibrio Fischeri细菌19共生菌株之间特定竞争背后的细菌间杀灭机制,但它们适用于许多细菌物种,包括环境分离物和人类病原体,可用于评估接触依赖性和可扩散的竞争机制。协议中的步骤可能需要优化其他细菌种类。鉴于更多的模型系统正在扩大他们的研究,从同源生物的使用,包括不同的基因型10,16,20,21,这种方法将是一个宝贵的资源寻求了解竞争如何影响多菌株或多物种系统的研究人员。

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Protocol

1. 为联合孵化准备菌株

  1. 选择适当的参考菌株,作为联合孵育测定期间细菌竞争的目标。请参阅讨论,了解选择参考应变时的最佳做法以及参考应变将如何影响结果。在此协议中,V.菲舍尔应变 ES114 将作为参考应变。
  2. 确定将采用哪些选择和筛选方法来区分共育中的分离物
    1. 通常,使用含有不同抗生素耐药性基因(如卡那霉素或氯霉素)的稳定质粒来转化菌株,以为每个菌株选择,以及编码不同荧光蛋白(例如 GFP 或 RFP)的基因,以便直观地进行区分共栽中的菌株类型。
      注:需要使用稳定的质粒,因为如果菌株在没有选择的情况下失去质粒,那么当量化时,该菌株的数量将被低估,并且不能使用荧光显微镜在视觉上检测。
    2. 标记硬币孵化V. 菲舍尔利菌株差异,使一个菌株包含质粒 pVSV102,它表示绿色荧光蛋白 (GFP) 和抗生素卡那霉素 (KanR) 的耐药性,第二个菌株包含质粒pVSV208,它表示红色荧光蛋白(dsRed)和抗生素氯霉素(Cm R)22的耐药性。
      注:其他差分选择可用于区分凝结菌株。有关其他方法,请参阅讨论。
    3. 在联合孵育测定的初始优化过程中包括以下控制,以确保选择是可靠的。在含有抗生素的琼脂板上贴上差异标记的每个菌株板(即,在选为菌株2的介质上的板1,反之亦然)。
  3. 在共孵化分析前两天,条纹参考菌株pVSV102,参考应变pVSV208,以及每个竞争对手的pVSV208从-80°C库存到含有适当抗生素的LBS琼脂板上(例如,100μg/mL卡那霉素或2μg/mL)氯霉素),并在24°C孵育过夜。需要选择抗生素,以确保所有细胞在实验开始时都含有质粒。
  4. 在测定前一天,用适当的抗生素将每个菌株类型(生物复制)的四个单个菌落挑回至新鲜的LBS琼脂板上,并在24°C孵育过夜。
    注:此步骤可能需要优化其他细菌物种,因为可能需要更长或更短的孵育时间才能获得足够的细胞,具体取决于感兴趣的生物体的生长速率。

2. 金孵化菌菌株

  1. 培养每种细菌菌株(图1A)
    1. 使用无菌牙签,从琼脂板上刮取细胞(相当于一粒米的大小),并在含有 1 mL LBS 汤的 1.5 mL 微离心管中重新悬浮细胞。将细胞团压入管侧,用力上下移液,从而分解细胞团块。
    2. 盖住管子和涡流1-2s。如果细胞团群仍然可见,则继续上下旋转或移液器,直到样品在视觉上均匀。
    3. 对所有样品重复步骤 2.1.1-2.1.2。
  2. 测量并记录所有样品的光学密度为600nm(OD600)。使用 LBS 肉汤可能需要将样品稀释至 10 倍,以获得准确的 OD 测量。将每个样本规范化为所需的 OD600。菌株通常归化为OD600 ±1.0,这转化为+106细菌/mL的V.菲舍尔。
    注:此步骤可能需要优化不同的细菌种类,因为接种细胞密度会影响联合孵育结果,具体取决于竞争机制。请参阅讨论以进行优化。
  3. 凝结菌株(图1B,C)
    1. 将参考应变和竞争对手应变以 1:1 的比例 (v/v) 混合,将每个菌株的 100 mL(归化为 OD 1.0)添加到标记的 1.5 mL 离心管中。作为控制,将参考应变与自身微分标记版本(参考应变 pVSV102 + 参考应变 pVSV208)混合。以后的统计分析需要这种控制,以确定竞争对手应变的存在是否影响参考应变的生长。涡旋混合应变培养1-2s。
      注:此步骤可能需要优化,因为启动比可能会显著影响结果,并且可能需要进行调整。请参阅讨论以进行优化。
    2. 对每个生物复制重复步骤 2.3.1。完成此步骤后,应总共存在 8 个混合应变管:4 个带有微分标记参考菌株(控制)的生物复制,以及四个带有微分标记参考和竞争对手菌株的生物复制(实验)。
    3. 将每个对照和实验混合物的10 mL点到含有LBS琼脂的Petri板上;这些培养点将在孵育后用于荧光显微镜。
    4. 让斑点在长凳上完全干燥,直到所有液体被吸收到琼脂中,并在24°C下孵育Petri板24小时。使用pVSV102和pVSV208标记的V.fischeri菌株至少需要15小时,才能生长到足够高的细胞密度,分别在总体水平上使用荧光解剖显微镜可视化GFP和RFP。在这里,我们使用24小时孵育成像混合点。
      注:重要的是使用不太潮湿或太干燥的盘子。如果板太湿,共孵化点不会被吸收到琼脂板;避免使用当天浇注的盘子。如果板太干燥,琼脂表面可能会形成小波或裂缝,使共孵化点形状不规则。
    5. 使用步骤 2.3.3 中的相同细菌悬浮液,将每个对照和实验混合物的 10 mL 点入 24 孔板中,每孔含有 1 mL LBS 琼脂。与步骤 2.3.3 一样,确保 24 孔板中的琼脂具有适当的水分。让斑点完全干燥,并在24°C孵育5小时。这些培养点将用于在实验结束时量化每个菌株的菌群形成单位(CCFUs)。
      注:发现细菌悬浮液在单个井中生长,可在结束时间点更容易重新悬浮。此步骤可以使用方形无菌滤片完成,作为使用 24 孔板的更经济的方法。方形无菌滤片可以放置在琼脂板上,每个实验混合物的10 mL可以被发现在这些过滤器上,而不是24孔板上。联合孵育时间后,过滤器可转移到1.5 mL离心管中,共孵化点可以通过涡旋或上下移液重新悬浮。5小时的孵育时间足以检测V.Fischeri分离物19之间的细菌间杀灭,然而,对于其他物种或竞争机制,这种联合孵育时间可能需要更短或更长。有关详细信息,请参阅讨论。
  4. 用于起始接种的串行稀释
    1. 要对起始共育混合物进行连续稀释,请旋转 96 孔板 90°,以便有 8 列和 12 行。每行将包含第一列中未稀释的混合物样本,然后沿行剩余井中进行七次十倍连续稀释(图 2A)。
    2. 用应变 ID、复制编号和时间(开始接种 = T0)标记每行。标记 LBS 琼脂板,辅以适当的抗生素,在其中发现稀释系列。请务必确定每个抗生素板选择的菌株。
    3. 使用多通道移液器,向每口井中加入 180 mL 的 LBS 肉汤,使未稀释的共孵化混合物的第一列为空。
      注:研究人员可以选择使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)来重新悬浮联合孵化点,如果使用生长特别快的细菌物种或持续进行大型实验,其中可能进行连续稀释,则进行连续稀释。很长一段时间执行。在这些情况下使用PBS可以防止细菌在进行连续稀释过程中大量外泄。但是,在所有实验中使用哪种解决方案(例如 PBS 或 LBS)(无论其大小或持续时间如何)非常重要。
    4. 使用 200 mL 单通道移液器,将 100 mL 的共育混合物从管转移到第一柱井。丢弃尖端,对所有共育混合物重复。
    5. 使用多通道移液器,将 20 mL 从 1 列转移到 2 列,然后通过上下移液进行混合。放弃每列的提示并重复,以便到最后,每行包含初始共育混合物的十倍序列稀释。
      注:与稀释液上下移液的次数一致。例如,将移液器手柄压压五次,使每个稀释在整个稀释系列中保持一致。
    6. 使用装有8个吸头的多通道移液器,在稀释系列中从每口井(即一排8口井)中吸出5 mL,并将其点到为参考菌株(辅以卡那霉素)的LBS琼脂板上。重复此步骤,在选择竞争对手菌株(辅以氯霉素)的板上进行识别(图2B)。在放入培养箱之前,让斑点完全干燥。
      注:相同的尖端可用于在选择参考和竞争对手应变的板材上发现复制稀释系列,但必须在复制之间进行更改。避免将移液器尖端的末端接触 LBS 琼脂板,因为这可能产生类似于细菌菌落的凹陷,并在板计数期间产生倾斜结果。如果尖端确实接触了盘子,请记下并不要将凹陷包括在菌群计数中。
  5. 进行 T 最终测量
    1. 在24孔板中的共孵化点在24°C下孵育5小时后,向每口井中加入1mL的LBS肉汤,然后通过上下移液重新悬浮共育点,直到所有细胞重新悬浮。与细胞在所有复制中重新悬浮的活力保持一致。例如,按下移液器手柄八次以完全重新悬浮每个样品。
    2. 重新暂停每个共孵化点后,准备一个 96 孔板,用于连续稀释和 LBS 琼脂板,并配备适当的抗生素,以与步骤 2.4.1 相同的方式发现稀释。
    3. 执行步骤 2.4.2-2.4.6 以完成 T 最终测量的串行稀释。
      注:在联合孵育测定的初始优化过程中,应包括一个重要的控制。在共孵化期结束时,将混合菌株盘到包括两种抗生素的介质上。除非1)发生自发突变,或2)在菌株之间交换可选择的标记,否则两种菌株都不应能够生长。

3. 使用荧光显微镜可视化培养

  1. 使用配备用于绿色和红色荧光检测的立体显微镜,在 LBS Agar Petri 板上对每个共生点进行成像,该显微镜与稳定质粒上表达的荧光蛋白相对应。
  2. 首先拍摄控制共孵化点的图像(参考应变 pVSV102 + 参考应变 pVSV208)。
    1. 调整放大倍率,使点处于对焦中。
    2. 使用适当的激励光和滤光片观察GFP,调整曝光时间,以便只能检测到来自共孵化点的荧光,并且介质中的任何背景荧光都很低或不可见。
    3. 更改激励灯和滤镜以观察 RFP,调整曝光时间以最小化介质的背景。
  3. 对于实验处理中的每个共孵化点,使用 GFP 滤波器的参考应变图像和步骤 3.2.2 中确定的暴露时间。
  4. 使用 RFP 滤镜对竞争对手应变进行成像,调整暴露时间,以便仅从介质的孵育点和背景荧光中观察到荧光。保存两个图像并命名它们,以包括应变 D、复制编号、拍摄图像时的孵育时间(例如,24 小时)。对所有复制重复上述步骤。
    注:可能需要根据不同的质粒或细菌物种调整联合孵育时间。请参阅讨论以进行优化。

4. 数据分析

  1. 在每个时间点(T 开始和 T 最终)计算每个控制和实验处理的 CCF
    1. 一旦菌落在连续稀释板上可见(例如,24小时在24°C对V.菲舍尔),确定稀释因子,其中单个菌落可以计数,并且没有一起成长为大型的多群落簇(图2B)。对于每个复制,计数并记录给定稀释的单个菌落数。此数字表示该复制的 CCF。
    2. 使用以下公式将稀释的 CCF 转换为共育中每种菌株的总 CCF:
      • CCF = (稀释系数 x 稀释点的 vol)= 未稀释样品的 x vol = 总 CCF
      示例:T0:[(6 CCFUs) = (10*-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 实验开始时混合点中 1 号菌株的总 CCF
      T5: [(4 CCFUs) = (10°-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 8.0E5 在混合点中菌株 1 的总 CCFUs,在 5 h 共孵育后
      每个时间点的每个应变的 CFU 值是可用于多个不同分析和统计测试的原始数据(见下文第 4.2 节)。
  2. 执行以下数据转换,以确定竞争对手应变是否优于参考应变:(i) 确定参考应变的比例是否随着竞争对手应变的存在而减小,或 (ii) 计算日志相对竞争指数 (RCI)。这些分析将原始数据转换为比率,可用于确定交互的竞争结果,但不能确定竞争机制(即杀戮与增长抑制)。
    1. 计算联合孵育过程中每个时间点的每个应变的比例
      1. 将 CFU 数据转换为治疗中每个菌株的比例。对于 T0 处的参考应变 (RS),将 T0 处参考应变的总 CCF 除以参考应变和竞争对手 (CS) 在 T0 的总 CCF 之和:
        RST0 CCFUs = (RST0 CCFUs = CST0 CCFUs) = T0 处参考应变的比例。
        执行相同的计算以确定 T0 处竞争对手应变的比例:
        CST0 CCF= (RST0 CCFUs = CST0 CCF) = T0 处参考应变的比例
        对每个时间点重复此过程,并复制实验处理和控制处理(微分标记参考菌株共孵化)。
      2. 在堆叠条形图(图 3A) 中绘制 T0 和 T5 中每种应变类型的平均比例。
      3. 确保获得所需的菌株启动比。对于最初混合菌株为 1:1 的共育,每种菌株类型应包含 T0 时总体的 ±0.5,并且不应使用学生的 t 检验 (P > 0.05) 在统计上彼此不同。如果一个应变在 T0 处的比例明显大于另一个应变的比例,则重复实验,直到达到 1:1 启动比。
      4. 确定在5小时后,竞争对手菌株是否包含明显较大的人群比例。 执行学生T测试,比较T0和T5实验处理中每种菌株的比例。如果竞争对手应变的比例与 T5(P < 0.05) 的参考应变的比例显著不同,则此结果表明可能发生应变竞争。继续执行步骤 4.2.1.5。
      5. 要确定竞争对手应变的存在在 5 小时后是否降低了参考应变的比例,请执行学生 t 检验,将对照中参考应变的比例与参考应变在实验处理(参考应变v竞争对手菌株)。
        注:如果参考菌株在实验处理中相对于对照(P< 0.05)的比例在统计学上较低,则竞争对手菌株在5小时后显著降低参考菌株的比例,比参考应变。
    2. 计算每次处理(包括控制)的日志 RCI 值
      注:相对竞争指数(RCI)是一个值,用于比较应变类型的结束比与起始比有何不同。RCI 值经过日志转换,因此日志 RCI 值大于零表示竞争对手应变 (CS) 超过参考应变 (RS),日志 RCI 值小于零表示参考应变超过竞争对手应变,对数 RCI值为零表示两个应变均未被超越。
      1. 使用以下公式计算每个控制和实验处理的日志 RCI 值:
        日志 =(CST5 CFU = RST5 CCFUs) = (CST0 CFU = RST0 CFU)= = 日志 RCI
      2. 使用分隔框和胡须绘制的图形日志 RCI 值,其中数据以水平方向绘制(图 3B)。
      3. 通过执行学生 t 检验,将每个处理的 LOG RCI 值(包括控件)与数据集进行比较,将相同数量的复制都与零值进行比较,确定每种处理是否与零显著不同。如果实验处理的对数 RCI 值在统计上大于零(P < 0.05),则竞争对手应变超过参考应变。
        注:该对照值不应与零(P > 0.05)在统计上不同,因为差分标记的参考菌株是同源的。
      4. 执行学生的 t 检验,以确定实验处理的 log RCI 值是否明显大于对照(P < 0.05)。如果实验处理中的对数 RCI 值在统计上大于对照处理,则竞争对手应变超过参考应变。
  3. 执行以下统计分析以确定竞争对手应变优于参考应变的机制:(i) 分析原始总 CFU 数据,或 (ii) 检查参考应变的回收百分比。与步骤 4.2 中的分析相比,这些分析可能更麻烦,但将确定竞争对手应变是否通过超过参考应变、抑制参考应变增长或主动消除参考应变而超过参考应变。
    1. 分析原始总 CFU 数据
      1. 使用交错散点图绘制两个应变的原始原始总 CFU 数据,其中复制显示为单个数据点(图4A)。在日志比例上显示数据,并添加一条水平线,指示两个菌株的平均 T0 CCF。
      2. 要确定竞争对手应变的存在是否对参考应变产生负面影响,请执行学生 t 检验比较参考应变 CCFUs,用于 T5 的控制和实验处理。如果实验处理中的参考应变 CCF 在统计上低于对照(P< 0.05),则竞争对手应变的存在对参考应变有显著影响。
      3. 要确定竞争对手菌株的存在是否抑制了参考菌株的生长或消除参考菌株,请执行学生 t 检验,比较 T0 和 T5 的参考应变 CCFUs,以便进行控制和实验处理。
        注:在没有竞争对手的情况下,在比较控制处理的 T0 和 T5 时,参考应变应显示 CFU 显著增加。在分析实验处理时,如果 T5 中的参考应变 CCF 与 T0 (P> 0.05) 没有统计上的不同,则竞争对手应变会抑制参考应变的生长。如果参考应变 T5 CCFUs 明显低于 T0CCF(P< 0.05),则竞争对手应变杀死了参考应变。
    2. 计算参考应变的回收百分比
      1. 使用以下公式将参考应变 (RS) 的总 CFU 数据转换为百分比恢复数据:
      2. (RST5 CCFUs = RST0 CCFUs) x 100 = 参考应变恢复百分比
      3. 使用分离的条形图显示参考应变的百分比恢复百分比,其中每个条形表示控制或实验处理(图 4B)。在 y = 100 处添加虚线,以指示参考应变的 100% 恢复(参考应变 CCF 从 0 h 到 5 h 没有增加或减少)。
      4. 要确定竞争对手应变是否对参考应变产生负面影响,请执行学生 t 检验,将对照处理的参考应变百分比恢复与实验处理进行比较。如果回收百分比明显小于控制 (P< 0.05),则竞争对手应变对参考应变产生负面影响。
      5. 要确定竞争对手应变是否抑制了参考菌株的生长或消除参考菌株,请执行学生 t 检验比较实验治疗的参考应变百分比恢复,以及具有相同数量的复制次数的数据集。值为 100。
        注:如果实验处理与 100 (P> 0.05) 在统计上没有区别,则竞争对手菌株抑制参考菌株的生长。如果实验处理中的参考菌株百分比恢复显著低于 100 (P< 0.05),则竞争对手菌株杀死了参考菌株。
    3. 解释荧光显微镜图像
      1. 一旦拍摄荧光显微镜图像,确定每个菌株是否可明显检测在联合孵育点。对于控制共育育菌(参考应变 pVSV102 + 参考应变 pVSV208),GFP 和 RFP 应从一个共孵化点可见。如果不是这样,再次设置实验,确保菌株正确标记,并在无抗生素的板上孵化。
      2. 对于每个实验共孵化点,检查可能的结果。
        注:如果竞争对手应变是可见的,但未检测到参考应变,则表明竞争对手的应变终止或抑制了参考应变的生长。如果两种菌株都存在且均匀混合(GFP 和 RFP 存在于整个联合孵育点),则这些数据表明竞争对手菌株不与参考菌株竞争,并且两种菌株共存。如果两种菌株都存在,但空间分离(GFP 或 RFP 的微聚位点存在于整个联合孵育点),则表明参考菌株和竞争对手菌株可能正在进行竞争交互和修改,可能需要参考菌株或初始共育比。有关详细信息,请参阅讨论。

5. 确定交互是否与联系人相关

注:如果您发现一种菌株杀死或抑制参考菌株,则相互作用可能是可扩散的或接触相关的。要确定相互作用是否依赖于细胞-细胞接触,请执行与上述步骤 1-2 所述的共孵化测定,并进行以下修改。

  1. 执行步骤 1.1-2.2。
  2. 一旦菌株规范化,使用0.22毫米孔径的硝化纤维素过滤器进行物理分离菌株。这种孔径允许抗菌素和小分子扩散,但防止V.菲舍尔细胞之间的物理接触。
    注:如果相互作用取决于细胞-细胞接触,则参考菌株与过滤器的竞争对手菌株分离应废除杀灭或抑制表型,参考应变不应减少 CfUS。如果相互作用不依赖于细胞-细胞接触,并且是一种可扩散的机制,分离菌株不应防止竞争对手菌株杀死参考菌株。
    1. 将参考应变的 5 mL 点到过滤器的中心,将竞争对手应变的 5 mL 点到不同过滤器的中心。将含有参考应变的过滤器放在 LBS 琼脂板表面。将含有竞争对手应变的过滤器直接放在过滤器顶部,并带有参考应变。
      注:每个菌株都印在过滤器上,而不是直接在琼脂板上发现底部菌株,因此菌株可以更容易地直接放置在彼此的顶部。
    2. 如果担心菌株不能直接堆叠在彼此的顶部,则减少在过滤器上发现的参考菌株接种量。这将确保参考应变点的区域较小且完全高于或低于竞争对手应变。交替哪个菌株位于顶部和底部,以解释琼脂培养基中营养物质扩散的差异。
    3. 为了确保过滤器允许小分子扩散,包括控制治疗,其中参考菌株被发现到过滤器上,一种对它敏感的抗生素(氯霉素)被发现到另一个。将过滤器直接堆叠在彼此的顶部,并放置在 LBS 琼脂板上。抗生素应该能够通过过滤器扩散,并应杀死参考菌株。
  3. 在 24°C 下用过滤器孵育板 5 小时。孵育时不要反转琼脂板,以免移动滤清器。
  4. 根据步骤 2.4 对起始接种执行串行稀释。
  5. 进行 T 最终测量
    1. 使用无菌钳子,将每组过滤器转移到含有 5 mL LBS 汤的 50 mL 猎鹰管中。确保过滤器在管内物理分离,以便每种应变类型完全重新悬浮。
    2. 通过上下移液,从过滤器中重新悬浮菌株,直到过滤器清除所有细胞。使用钳子旋转过滤器,并从两侧清除细胞材料。在样品之间用乙醇消毒钳子。
    3. 根据步骤 2.5 对 T 最终执行串行稀释。在计算 T 终审样品的总量时,将"未稀释样品的总体积"从 1 mL 调整为 5 mL。

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Representative Results

为了评估细菌群之间的竞争相互作用,为V.fischeri开发并优化了联合孵育测定方案。该方法利用编码抗生素抗性基因和荧光蛋白的稳定质粒,允许每个菌株的微分选择和视觉鉴别。通过分析从共孵化测定中收集的数据,可以识别相互作用的竞争结果和相互作用的机制。例如,使用V.菲舍尔基分离物进行了以下实验。凝结菌株含有两个稳定的质粒之一:pVSV102表示卡那霉素抗性,GFP+,或pVSV208表示氯霉素抗性,DsRed®。在样本数据中,菌株以1:1的比例混合,在LBS琼脂板上孵育5小时。作为一种控制处理,参考菌株的差分标记版本相互结合。实验处理采用参考应变(带压pVSV102)和竞争对手应变1或竞争对手应变2(波林pVSV208)。进行。如上文所述,每个菌株的培养物都进行了制备和孵化,如图1和图2所示。

图 3中,分析的数据确定竞争对手应变 1 或 2 是否超过参考应变以两种方式呈现。在图3A中,根据步骤4.2.1计算了实验期间每个时间点每个应变类型的比例。在实验处理中,样本数据显示,实验开始时(0小时)和结束(5小时)的参考应变和竞争对手菌株1的比例为0.5,这与对照处理中观察到的一致。这些数据表明,在5小时共育后,菌株的比例没有变化,因此没有观察到任何竞争。相比之下,当参考应变与竞争对手应变2一起孵育时,参考应变在实验开始时(0小时)的比例为0.5,实验结束时为<0.01,明显低于对照治疗(学生的 t 测试: P < 0.001)。这些数据表明,在竞争对手应变2存在的情况下,参考应变的比例降低,因此表明竞争对手应变2和参考应变之间发生了竞争。在确定社区中菌株的比例如何随时间变化,但不能用于确定竞争互动的机制时,应应用这种类型的分析,因此应与其他分析相结合。例如,在竞争对手应变 2 存在的情况下,参考应变的比例下降可归因于几种类型的相互作用:(i) 应变 2 比参考应变增长更快,(ii) 应变 2 抑制了参考菌株的生长应变,或(iii)应变2通过杀灭消除参考应变。

图3B中,根据步骤4.2.2计算了每个处理的日志相对竞争指数(RCI)。当参考应变与竞争对手应变1一起孵育时,对数RCI值在统计学上与零或对照处理(P > 0.05)没有差异,这表明未观察到菌株之间的竞争。然而,当参考应变与竞争对手应变2一起孵育时,对数RCI值明显大于零和控制处理(学生的t-test:P<0.001)。 这些数据表明,应变2比参考菌株要大。分析日志 RCI 值提供了一种简单的方法,用于确定一个菌株在潜伏期是否比另一个菌株所具有。由于此分析包含实验结束时(5 小时)和开始(0 h)的菌株比率,因此启动比可以显著影响结果。因此,在从日志 RCI 数据得出结论时,应检查和考虑起始比率。此外,这种分析没有提供有关竞争机制的信息,只是报告在孵育期间菌株的比例如何变化。

图 4显示了两种数据分析方法,以确定给定交互的竞争机制。在图4A中,显示了实验每个时间点每个应变的总CCF。当参考菌株与竞争对手应变1一起孵育时,两个菌株的C请联系我们在5小时过程中增加,参考应变的CCF与菌株1或5小时控制(P > 0.05)没有显著差异。这些数据表明,参考菌株在存在1菌株的情况下增加,并表明没有发生竞争。然而,当参考菌株与竞争对手应变2孵育时,2号CCFUs在5小时后增加,但参考应变的CCFUs减小。参考应变 CCF 明显低于应变 2 CCF 和控制在 5 小时 (学生的 t 测试: P < 0.002)。这些数据表明,参考菌株CCFUs在存在2菌株时减少,并建议应变2杀死参考菌株。如果参考应变没有显示 CCF 值数下降,而是没有变化(在 0 h 和 5 h 时参考应变 CCF 之间没有统计差异),这些数据将表明应变 2 通过抑制参考应变的生长而超过参考应变。分析未转换的 CFU 总数据特别翔实,因为每个时间点的两个菌株的 CFU 都是独立显示的,可用于识别竞争机制。

图 4B显示了参考应变的恢复百分比,以确定竞争对手应变的存在如何影响参考应变。当参考菌株与竞争对手应变1一起孵育时,观察到±3,200%的恢复,这与对照分析没有统计学上的不同,表明应变1不影响参考应变的百分比恢复。当参考菌株与竞争对手应变2一起孵育时,观察到±4%的恢复,这明显低于对照(学生的t-test:P<0.002)。 恢复百分比也明显小于100(学生的t-test:P<0.002),表明应变2通过杀死参考菌株超过了参考菌株。 如果回收百分比与 100 在统计上没有区别,这些数据将表明应变 2 抑制了参考应变的生长。百分比恢复数据通过检查参考应变总体如何对竞争对手应变的存在做出反应,提供了一种简化的方法来描述竞争机制。但是,以这种方式显示数据会排除有关起始比率的信息,以及在整个孵育过程中竞争对手菌株的丰度如何变化。

Figure 1
图1:说明共孵化测定的流程图。(A) 含有 pVSV102(参考应变或 R.S.) 或 pVSV208(竞争对手应变指示 Comp. Strain 或 C.S.) 的细菌菌株在参考应变 (LBS Kan) 或竞争对手应变 (LBS 凸轮)。然后,菌株在 LBS 汤中重新悬浮,并归一化为 OD = 1.0。(B) 参考应变和竞争对手应变按体积之比混合 1:1。用这种混合物进行连续稀释,以确定两种菌株在0小时(C)的CCFUs,然后应变混合物被发现到含有LBS琼脂的24孔板中。每个复制都被发现到自己的井。斑点允许干燥,然后在24°C孵育5小时。5 小时后,执行串行稀释以量化每种菌株的 CCF。(D) B面板的应变混合物也被发现到LBS琼脂培养板,允许干燥,并在24°C孵育24小时。在 24 小时时,使用荧光解剖显微镜成像联合孵化点,该显微镜适用于检测绿色(参考应变)和红色(竞争对手应变)荧光。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:串行稀释所需的板的代表性图像。(A) 用于执行串行稀释的 96 孔板。板块旋转,有 12 行和 8 列。每种治疗的描述包括所使用的菌株及其携带的质粒(例如,带 pVSV102 的参考应变和带 pVSV208 的竞争对手应变)以及每行的复制数(R1、R2、R3 或 R4)。第一列是未稀释的样本,右侧的每一列表示上一列的 10 倍稀释(上面列出的稀释系数)。(B) LBS 琼脂板用于确定从实验处理中用于确定 LBS Kan 板(顶部)上的参考应变和 LBS 凸轮板(底部)上的竞争对手应变的 CCF。每行在一个处理中是一个复制(例如,R1),每个点的稀释系数列在板的顶部。每个复制计数的 CCF 数量列在右侧。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:用于评估竞争对手菌株是否比参考菌株竞争力的样本数据。(A) 携带 pVSV102(深灰色)或 pVSV208(浅灰色)的凝结菌株的比例。R.S. 指示参考应变,C.S. 指示竞争对手应变。虚线水平线表示比例为 0.5。星号表示在 5 h 时控制中,在统计上构成比竞争对手应变或参考应变小的参考应变(学生 t 检验:P < 0.001); ns 表示不显著(P > 0.05)。(B) 记录用于共孵化测定的相对竞争力指数 (RCI)。虚线垂直线表示日志 RCI = 零。星号表示对数 RCI 值在统计上大于零,并且控件(学生的 t 检验:P < 0.001)。错误栏表示 SEM.请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:确定竞争机制的样本数据。(A) 使用V. fischeri分离物进行的共孵化检测的总 CFU 计数,这些分离物用 pVSV102 或 pVSV208 进行差分标记。在实验开始时(0小时)和5小时孵育后收集CCF。R.S. 表示参考应变,C.S. 表示竞争对手应变。虚线水平线表示两个菌株的平均 0 h CCF;星号表示参考应变 CCF 在实验处理中相对于 5 小时的控制处理(学生 t 检验: P < 0.002)在统计上较低。(B) 参考应变的回收百分比。水平虚线表示 100% 恢复(CCF 值中无增加或减少);星号表示百分比恢复率在统计上低于 100%和控制处理(学生的 t 检验:P < 0.002)。错误栏表示 SEM.请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:孵育时间和成像优化的样本数据。(A) 在实验开始时(0 h),在5、12和24小时孵育后,收集CCF的共育测定总CCF。R.S. 表示参考应变,C.S.2 表示竞争对手应变 2。虚线水平线表示两个菌株的平均 0 h CCF;星号表示参考应变 CCF 在实验处理中相对于给定时间点的控制处理(学生的 t 检验: P < 0.002)在统计上较低。误差条表示SEM. (B) 荧光显微镜图像与面板 A. 比例尺 +1 mm 中的 CFU 数据对应。

Figure 6
图 6.用于共孵育比优化的样本数据。在携带pVSV102(绿色、顶行)和含有pVSV208(红色、底行)的参考应变(R.S.)和携带pVSV208(红色、底行)和荧光显微镜图像之间进行了共孵化实验。(A)菌株在24小时(A)应变之间进行了。以1:1的比例或(B)的比例混合,其中含有pVSV102的参考应变数超过含有pVSV208的竞争对手菌株。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

上述共育测定为发现细菌间竞争提供了一种强有力的方法。这种方法可以识别V.fischeri分离和描述竞争机制之间的特定竞争19。虽然所述方法针对海洋细菌V.菲舍尔进行了优化,但可以轻松修改,以适应其他细菌种类,包括临床和环境分离物。需要注意的是,竞争机制通常有条件地受到5、6、23、24、25、26、27的制约。,28,因此生长条件(如摇动与站立培养、温度等)和介质类型(如含盐量)的微小差异可以显著影响结果。因此,对于不同的细菌种类和不同的竞争机制,优化共育条件可能是必要的。最好选择能密切反映隔离物自然环境的文化条件。例如,在24°C下用LBS介质在V.菲舍尔菌株之间进行共育测定,以反映海洋环境的盐度和温度。然而,一些细菌在其环境中自然有能力27,28,因此可以吸收在对抗性相互作用29过程中由解细胞释放的遗传物质。为了防止这种DNA转移影响共孵化结果,重要的是使用不促进能力或菌株的条件,无论是自然或通过脱氧核糖核酸吸收机制的失活。此外,细胞生长阶段、培养密度、孵育时间或起始菌株比等实验参数可能还需要针对不同的细菌物种或竞争机制进行优化。例如,初始培养密度将决定菌株之间的细胞-细胞接触量,这可能会影响细菌部署依赖接触的竞争机制的能力。

图5A显示了使用V.菲舍尔基分离物优化共育测定的过程。在这里,评估了CFU采集和荧光显微镜成像的一系列孵育时间,以确定收集每个指标的最佳时间。在将参考菌株和竞争对手菌株2的混合物收集到LBS琼脂板(0小时)后,立即收集CFU,并在5、12和24小时后立即采集CFU测量和荧光显微镜图像。这些示例数据强调了在得出两种菌株之间的相互作用的任何结论之前进行彻底优化的重要性。例如,根据收集CCF时可以推断出关于相互作用机制的两种不同的结论:5或12 h的CCF表示应变2杀死了参考应变,而24小时收集的CCF表明应变2会抑制参考应变。

通过荧光显微镜可视化共孵化点的最佳时间可能与 CFU 采集的最佳时间不同。图 5B显示 0、5、12 和 24 小时的共孵化点荧光显微镜图像。在 0 和 5 小时,荧光显微镜看不到共孵化点。对于在 12 小时拍摄的图像,控制处理中的两个应变都可见,但 RFP(参考应变怀有 pVSV208)明显变暗。在12小时的实验处理中,竞争对手应变2可见(但暗淡),参考应变不可检测。细菌分离物之间的应变特异性差异会影响荧光蛋白的表达,从而影响混合点中细胞的亮度。由于 RFP 明显比控件中的 GFP 暗,因此联合孵育点应继续孵育,并在以后再次成像。在 24 小时拍摄的图像中,两种菌株在控制实验中均可明显检测到,亮度也相似。在实验处理中,2是可见的,而参考应变在共孵化点内不观察到。15- 24 h 的孵育时间足以分别使用稳定的质粒 pVSV102 和 pVSV208 来可视化V. fischeri的 GFP 和 RFP,但可能需要根据不同的质粒或细菌种类调整孵育时间。虽然可视化共孵化点和收集 CFU 数据的最佳时间不同,但 24 小时成像是快速筛选V. fischeri交互的好方法,因为在 24 小时时通过成像获得的结果(目标是否可见)反映了在 5 或 12 h 时从电镀 CCF 获得的更耗时的定量数据。

起始比可以显著影响结果,特别是在孵育两个抑制菌株时,可能需要进行调整,以考虑到在杀死效率或增长率方面的特定菌株差异。例如,图 6A显示了实验的荧光显微镜图像,其中参考应变与自身(控制)和另外三个V. 菲舍尔基分离物一起以 1:1 的比例开始。在这些样本数据中,在24小时后孵育自身、竞争对手菌株1和竞争对手应变3时,可明显检测到参考应变。然而,当起始比调整为1:5(即50 mL的参考应变与250 mL的竞争对手应变混合)时,参考应变只有在与自身和应变1结合时才能明显检测到,表明应变2和应变3都比对手有竞争力参考应变。这种调整可防止参考应变的更快增长率掩盖竞争对手应变表现出的任何干扰竞争机制的影响。根据图6A中的结果,应使用1:5(参考应变:竞争对手应变)的比例来筛选额外的V.菲舍尔菌株,以杀死参考应变。

该协议通过用含有卡那霉素或氯霉素抗基因的质粒进行差别标记菌株来区分凝血菌株。然而,不同的抗生素或其他选择方法可能更适合不同的细菌物种。其他微分选择方法可包括:1) 利用菌株/物种特异性辅助营养剂用于特定生长因子(如DAP或胸腺素),2)有条件的生长要求(例如,一种菌株在37°C生长,而另一种不生长),或3)当在适当条件下生长时,消除或抑制标记菌株的生长以表达"杀伤"基因(例如,ccdB或sacB)的计数器选择标记物。

选择适当的参考菌株对于获得和解释共孵化测定的可重复结果至关重要。参考菌株应经过深入研究(即,具有广泛的科学文献),没有明显的杀灭或抑制能力,理想情况下具有测序基因组。例如,某些大肠杆菌菌株是许多细菌联合孵育实验的常见参考菌株30,31。但是,大肠杆菌可能与特定竞争机制或竞争对手在生态上无关,这可能会影响结果。例如,一些细菌可能进化了专门针对密切相关的物种或竞争者的机制,以寻找相同的生态利基,其竞争机制对大肠杆菌参考菌株无效。

总之,本文描述的方法旨在提供一种易于修改和可靠的方法来评估细菌间相互作用和竞争。该方法可应用于与环境或临床研究相关的细菌分离物,并可用于探索以前未知或难以研究的微生物相互作用的各种机制。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢审阅者提供的有用反馈。A.N.S.由戈登和贝蒂·摩尔基金会通过授予GBMF 255.03向生命科学研究基金会提供支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

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References

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