माइक्रोइंजेक्शनिंग का उपयोग करके मानव हेला कोशिकाओं में स्प्लेकोसोमल स्एनआरएन स्थानीयकरण का विश्लेषण

Neuroscience

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Summary

स्प्लेयोसोमल एसएनआरए के जीवजनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें विभिन्न सेलुलर डिब्बे शामिल होते हैं। यहाँ, हम सेल के अंदर उनके परिवहन की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट लेबल srnAs के माइक्रोइंजेक्शन कार्यरत हैं।

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Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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Abstract

स्प्लेयोसोमल एसएनआरए का जीवजनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें परमाणु और कोशिकाद्रव्यदोनों दोनों चरण शामिल होते हैं और अंतिम चरण काजल शरीर नामक परमाणु डिब्बे में होता है। हालांकि, इस subnuclear संरचना में प्रत्यक्ष snRNA स्थानीयकरण अनुक्रम हाल तक ज्ञात नहीं किया गया है. काजल निकायों में srnAs के संचय के लिए महत्वपूर्ण दृश्यों का निर्धारण करने के लिए, हम fluorcently लेबल snRNAs के माइक्रोइंजेक्शन कार्यरत कोशिकाओं के अंदर उनके स्थानीयकरण के बाद. सबसे पहले, हम snRNA विलोपन म्यूटेंट तैयार, इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए संश्लेषित डीएनए टेम्पलेट्स और ALEXA488 के साथ युग्मित यूटीपी की उपस्थिति में snRNAs टाइप. लेबलित srnAs के साथ मिश्रित किया गया 70 kDa-Dextran TRITC के साथ संयुग्मी, और नाभिक या मानव Hela कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के लिए microined. कोशिकाओं के लिए incubated थे 1 ज और तय है और काजल शरीर मार्कर coilin अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की गई थी, जबकि srnAs और डेक्सट्रान, जो परमाणु या कोशिका द्रव्य ीय इंजेक्शन के एक मार्कर के रूप में कार्य करता है, सीधे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया गया. इस विधि कैसे विभिन्न दृश्यों कोशिकाओं के अंदर आरएनए स्थानीयकरण को प्रभावित के कुशल और तेजी से परीक्षण के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम काजल शरीर में snRNAs के कुशल स्थानीयकरण के लिए Sm बाध्यकारी अनुक्रम के महत्व को दिखाने के.

Introduction

आरएनए splicing जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, जो एक बड़े ribonucleoप्रोटीन परिसर द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है spliceosome कहा जाता है. कुल में, 150 से अधिक प्रोटीन और 5 छोटे परमाणु आरएनए (srnAs) splicing मार्ग के विभिन्न चरणों में spliceosome में एकीकृत कर रहे हैं. U1, U2, U4, U5 और U6 snRNAs प्रमुख GU-AG introns के splicing में भाग ले रहे हैं. इन snRNAs पूर्व गठन छोटे परमाणु ribonucleoप्रोटीन कणों (srnPs) कि snRNA होते हैं के रूप में spliceosome में शामिल होने, सात Sm प्रोटीन snRNA के साथ जुड़े (या की तरह एस एम प्रोटीन, जो U6 snRNA के साथ संबद्ध) और 1-12 प्रोटीन प्रत्येक snRNP के लिए विशिष्ट.

snRNPs की विधानसभा कोशिकाद्रव्यी और परमाणु चरणों शामिल है. नव लिखित SnRNA कोशिका द्रव्य जहां यह सात एस एम प्रोटीन से इकट्ठे एक अंगूठी प्राप्त करने के लिए निर्यात किया जाता है। Sm अंगूठी बाद में snRNA फिर से आयात के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करता है नाभिक के लिए वापस. दोषपूर्ण srnAs कि Sm प्रोटीन के साथ संबद्ध करने में विफल कोशिका द्रव्य1में बनाए रखा जाता है. नव आयातित srnPs पहले काजल शरीर में दिखाई देते हैं, जहां वे snRNP विशेष प्रोटीन से मिलने और उनकी परिपक्वता खत्म (संदर्भ में समीक्षाकी 2,3). हमने हाल ही में यह दिखाया है कि अंतिम परिपक्वता के कदमों के अवरोध के परिणामस्वरूप काजल निकायों4,5में अपरिपक्व एसएनआरपी को अलग कर दिया गया है . हम एक मॉडल जहां अंतिम srnP परिपक्वता गुणवत्ता नियंत्रण है कि snRNP विशेष प्रोटीन और सक्रिय srnPs के गठन के अलावा पर नज़र रखता है के तहत है का प्रस्ताव रखा. हालांकि, कैसे कोशिकाओं को सही ढंग से इकट्ठा परिपक्व और aberant अपरिपक्व कणों के बीच भेद के आणविक विवरण मायावी रहते हैं.

परमाणु काजल निकायों में snRNAs के लक्ष्य और संचय के लिए आवश्यक हैं कि snRNA दृश्यों का निर्धारण करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट लेबल srnAs के microinctions को रोजगार का फैसला किया. माइक्रोइंजेक्शन पसंद की एक विधि थी क्योंकि: 1) यह सिंथेटिक srnRNAs उनके अंतर्जात समकक्षों जो विशेष रूप से अतिरिक्त टैग अनुक्रम की प्रविष्टि के लिए कम स्थान के साथ कम RNAs के लिए महत्वपूर्ण है फार्म भेद करने के लिए एक अतिरिक्त अनुक्रम टैग की आवश्यकता नहीं है; 2) यह दृश्यों कि biogenesis के लिए महत्वपूर्ण हैं के विश्लेषण की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, Sm अनुक्रम Sm अंगूठी विधानसभा के लिए आवश्यक है और नाभिक6में फिर से आयात. जब srnAs सेल में व्यक्त कर रहे हैं, srnAs Sm अनुक्रम की कमी कोशिका द्रव्य में निम्नीकृत कर रहे हैं और नाभिक और काजल निकायों7तक नहीं पहुँच. हालांकि, SnRNAs Sm अनुक्रम के बिना सीधे नाभिक में microinsed किया जा सकता है और इस प्रकार काजल शरीर स्थानीयकरण परख में Sm अनुक्रम की एक संभावित भूमिका.

यहाँ, हम विस्तार से एक माइक्रोइंजेक्शन विधि है कि हम काजल शरीर5में snRNAs लक्ष्य के लिए आवश्यक snRNA दृश्यों का निर्धारण करने के लिए आवेदन का वर्णन. हमने दिखाया कि Sm और SMN बाध्यकारी साइटों को एक साथ आवश्यक हैं और न केवल srnAs लेकिन विभिन्न छोटे गैर-कोडिंग आरएनए काजल शरीर में स्थानीयकरण करने के लिए पर्याप्त हैं। माइक्रोइंजेक्शनिंग के साथ-साथ अन्य साक्ष्यके आधार पर, हमने प्रस्ताव किया कि Sm बाइंडिंग साइट पर इकट्ठे हुए Sm अंगूठी काजल शरीर स्थानीयकरण संकेत है।

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Protocol

1. माइक्रोइंजेक्शन के लिए srnNAs की तैयारी

  1. पीसीआर द्वारा एक निम्नलिखित पीसीआर सेटअप का उपयोग करके एसआर आरएनए के पूर्ण लंबाई या छोटा/परिवर्तित संस्करण युक्त एक डीएनए टेम्पलेट तैयार करें: 60 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 68 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 35x के लिए 15 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस , और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस.
  2. फॉरवर्ड प्राइमर में विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए एक प्रमोटर अनुक्रम होना चाहिए जो पहले लिखित न्यूक्लिओटाइड के ऊपर होता है। T7 प्रमोटर और रिवर्स प्राइमर, जो पिछले लिखित न्यूक्लिओटाइड के साथ समाप्त होता है युक्त आगे प्राइमर का उपयोग कर U2 snRNA अनुक्रम बढ़ाना (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें).
  3. संक्षेप SnRNA कम आरएनए संश्लेषण के लिए एक किट का उपयोग कर (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) T7 आरएनए पॉलिमरेज युक्त. 1 m एटीपी जोड़ें, 1 एमएम सीटीपी, 1 एमएम जीटीपी, 0.8 एम एम यूटीपी, 0.2 एम एम यूटीपी-एलेक्सा488, 1.8 एम एम ट्राइमेथिलगुआनोसाइन कैप एनालॉग (एम3 2,2,7जी (5') पीपीपी (5')जी), एक आरएनए अवरोधक के 1 एमएल और 500-700 एनजी प्लेट डीएनए को रात भर में प्रतिक्रिया के साथ-साथ सी-सीक्यूमेंट्री और रात भर में प्रतिक्रिया के लिए।
  4. DNase के 1 $L (2U) प्रतिक्रिया में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  5. अम्लीय फीनॉल/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा srna को अलग करें। शीर्ष जल चरण निकालें और 3 एम सोडियम ऐसीटेट (पीएच ़ 5.2), बेहतर गोली दृश्य के लिए ग्लाइकोजन के 3 डिग्री सेल्सियस और 100% इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम की मूल मात्रा के 1/10 जोड़ें। -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट, 14,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. 70% इथेनॉल के साथ गोली धो लें और nuclease मुक्त पानी के 12 डिग्री एल में भंग. सामान्य आरएनए उपज लगभग 600 एनजी/एमएल थी। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. इन विट्रो लिखित srnAs की अखंडता की निगरानी agarose जेल इलेक्ट्रोफोरीज़ द्वारा.
  8. माइक्रोइंजेक्शन से पहले, अंतिम सांद्रता 200 एनजी/एमएल पानी में आरएनए को पतला किया जाता है जिसमें 10 ग्राम/एल डीएक्सट्रान-TRITC 70 केडीए होता है।

2. सेल

  1. उपयोग से पहले, 1 एच एच सी के लिए 1 एम एचसीएल के साथ कवरलिप्स का इलाज करें, आसुत पानी में अच्छी तरह से धोएं और 100% इथेनॉल में स्टोर करें। अम्लीय उपचार के दौरान या इंजेक्शन के बाद सेल छीलने को रोकने के लिए कोशिकाओं आसंजन को बढ़ावा देता है। इंजेक्शन कोशिकाओं की आसान पहचान के लिए, एक ग्रिड के साथ एक कवरस्लिप का उपयोग करें।
  2. बीज HeLa या अन्य अनुलग्न कोशिकाओं 1 दिन पहले माइक्रोइंजेक्शनिंग पर 12 मिमी coverslips (नं. 1 या नहीं. 1.5) माइक्रोइंजेक्शन के समय 50% संगम तक पहुँचने के लिए।

3. इंजेक्शन

नोट: हेला कोशिकाओं को Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (डी-एमईएम, 4.5 ग्राम/एल डी-ग्लूकोज जिसमें फिनोल लाल और एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त माइक्रोइंजेक्ट किया गया था)। इंजेक्शन एक इंजेक्टर और बाँझ सुई से लैस एक micromanipulator का उपयोग कर बाहर किया गया था (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें). माइक्रोस्कोप और माइक्रोइंजेक्टर के अलग-अलग हिस्सों में उतार-चढ़ाव को रोकने के लिए पूरे सूक्ष्म/माइक्रोमैनिप्युलेटर सिस्टम को कम से कम 4 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से पहले गर्म किया गया था।

  1. पेट्री डिश (30 मिमी) माइक्रोस्कोप के धारक में बीच में कवरस्लिप के साथ संस्कृति मीडिया के 2 एमएल युक्त रखो। माइक्रोलोडर का उपयोग करके सुई में एनआरएनए मिश्रण का 3 डिग्री सेल्सियस लोड करें। पेट्री डिश की सतह के संबंध में 45 डिग्री में माइक्रोइंजेक्टर के धारक में सुई स्थापित करें।
  2. सुई खोजने के लिए, एक 10x लंबी दूरी के उद्देश्य का उपयोग करें. सबसे पहले, इंजेक्टर पर गति COARSE सेट और सुई कम जब तक यह संस्कृति माध्यम छू लेती है. माइक्रोस्कोप दूरबीन का उपयोग करना, उज्ज्वल स्थान है, जो जगह है जहाँ सुई संस्कृति माध्यम को छू लेती है लगता है.
  3. सुई की नोक मनाया जाता है जब तक माइक्रोस्कोप में देख रहा है, जबकि FINE करने के लिए गति बदलें और आगे सुई कम है। दृश्य क्षेत्र के बीच में सुई ले जाएँ और एक 40x लंबी दूरी के उद्देश्य के लिए स्विच.
  4. उद्देश्य को बदलने के बाद, सेल का चयन करें और इस सेल के ऊपर सुई ले जाएँ. कक्ष संपर्क के लिए दबाव और समय सेट करें (चर्चा में युक्तियाँ और समस्या निवारण देखें).
  5. सुई को कोशिका में नीचे ले जाएँ और फिर माइक्रोमैनिप्युलेटर पर निम्न सीमा निर्धारित करें। सेल के नीचे सुई को स्थानांतरित न करने के लिए सावधान रहें।
  6. कम सीमा निर्धारित करने के बाद, सुई को सेल के ऊपर वापस ले जाएं और इंजेक्टर की जॉयस्टिक पर इंजेक्शन बटन दबाएं। सुई कोशिका के अंदर स्वचालित रूप से उस स्थान पर जाती है जहां सीमा निर्धारित की जाती है और आरएनए मिश्रण को इंजेक्ट करती है।
  7. समाप्त करने के लिए, इंजेक्टर पर बटन MENU धक्का और धारक से सुई को हटा दें. फिर इंजेक्टर और micromanipulator बंद करने से पहले इंजेक्टर से ट्यूब डिस्कनेक्ट.

4. सेल फिक्सेशन और दाग

  1. माइक्रोइंजेक्शनके बाद, कोशिकाओं को सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस करें और 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. ऊष्मायन के बाद, कमरे के तापमान पर फॉस्फेट बफर नमकीन समाधान (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को तीन बार कुल्ला, 0.1 एम PIPES पीएच 6.9 में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ 20 मिनट के लिए ठीक करें, और कमरे के तापमान पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। यदि केवल snRNA स्थानीयकरण का विश्लेषण किया है, संक्षेप में पानी में कोशिकाओं कुल्ला और DAPI के साथ एक बढ़ते माध्यम में माउंट.
  3. अतिरिक्त प्रोटीन स्थानीयकरण के मामले में, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% Triton-X100 के साथ कोशिकाओं permebilize. पीबीएस के साथ तीन कुल्ला के बाद, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और पीबीएस में अंतिम washes के बाद और पानी में संक्षिप्त कुल्ला, डीएपीआई के साथ बढ़ते माध्यम में माउंट करें।

5. माइक्रोस्कोपी

  1. यदि बढ़ते के तुरंत बाद छवि नहीं बनाई गई है, तो इमेजिंग तक स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एक विसर्जन उद्देश्य (60X या 100x/1.4NA) के साथ सुसज्जित एक उच्च अंत फ्लोरोसेंट सूक्ष्म प्रणाली का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण।
  3. एक बार microinedsed कोशिकाओं की पहचान कर रहे हैं, नमूना प्रति 200 एनएम z कदम के साथ 20 z वर्गों के एक ढेर इकट्ठा और गणितीय deconvolution के अधीन. अधिकतम अनुमानों या व्यक्तिगत z ढेर तो प्रस्तुत किए गए.
  4. फ्लोरोसेंट संकेत की मात्रा निर्धारित करने के लिए, coilin इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा पहचाने गए एक काजल शरीर के चारों ओर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को आकर्षित करें। coilin-निर्धारित ROI में SnRNA संकेत की तीव्रता को मापने. अगला संप्रग फ्लोरोसेंट की तीव्रता का निर्धारण करें जो संप्रग-संह ता नाभिकद्रव्य में बेतरतीब ढंग से रखे गए हैं तथा काजल निकाय तथा न्यूक्लिओप्लाज्म में आरएनए संकेत के अनुपात की गणना कीजिए।

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Representative Results

SnRNA स्थानीयकरण और काजल शरीर लक्ष्यीकरण में Sm बाध्यकारी साइट की भूमिका की निगरानी करने के लिए, हम एक डीएनए टेम्पलेट T7 प्रमोटर युक्त तैयार किया है और या तो पूर्ण लंबाई U2 snRNA या U2 snRNA सात nucleotides की कमी (AUUUUUG) Sm बाध्यकारी साइट बनाने. srnAs में इन विट्रो प्रतिलेखन, अलग और TRITC-युग्मित dextran-70kDa के साथ मिश्रित किया गया. हमने इन विट्रो में युक्त मिश्रण को नाभिक या हेला कोशिकाओं के कोशिकाद्रव्य में एस.एन.आर.एन.ए.

यह पहले से पता चला है कि परमाणु आयात6के लिए स्म बाइंडिंग साइट आवश्यक है . यह परीक्षण करने के लिए कि क्या स्म साइट काजल शरीर संचय के लिए भी महत्वपूर्ण है, हमने स्म साइट की कमी को सीधे नाभिक में माइक्रोइंजेक्शन किया है (चित्र 1क)। कोशिकाद्रव्य में इंजेक्शन एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है (चित्र 1ख) । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम सूक्ष्म रूप से पूर्ण लंबाई snRNA इंजेक्शन (चित्र 1C,डी) . एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 60 मिनट के ऊष्मायन के बाद, माइक्रोइंजेक्शन कोशिकाओं को ठीक किया गया और काजल बॉडी मार्कर कोलिन को अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की गई थी। परमाणु और कोशिकाद्रव्यी इंजेक्शन दोनों के बाद काजल निकायों में जमा पूर्ण लंबाई snRNA. इसके विपरीत, SnRNA Sm साइट की कमी इस डिब्बे में माइक्रोइंजेक्शन के बाद कोशिका द्रव्य में बने रहे, जो पिछले निष्कर्षोंकेअनुरूप है 6. Sm साइट के बिना snRNA के परमाणु microinctions से पता चला कि Sm बाध्यकारी अनुक्रम काजल शरीर स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण है. उ2 स्नरणन की कमी स्म साइट नाभिक में बनी रही लेकिन काजल निकायों में संचित नहीं हुई (चित्र 1क)

कभी-कभी केवल एक सेल्यूलर कम्पार्टमेंट में माइक्रोइंजेक्शन फेल हो जाता है और TRICT-dextran-70kDa नाभिक और कोशिकाद्रव्य दोनों में पाया गया (चित्र 2A)। इन कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण से छोड़ दिया गया. इस तथ्य के बावजूद कि फ्लोरोसेंट लेबल srnAs इंजेक्शन से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, आरएनए गिरावट हो सकती है। कोशिकाद्रव्य में इंजेक्ट किए गए अवक्रमित स्नरान को नाभिक में नहीं ले जाया जाता है और कोशिकाद्रव्य में स्थानीयकृत रहता है (चित्र 2ख) । इस तरह के snRNA खारिज कर दिया जाना चाहिए, और नए snRNA संश्लेषित किया जाना चाहिए.

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोइंजेक्शन snRNAs का स्थानीयकरण. Alexa488-लेबल U2 snRNA या तो Sm साइट की कमी (,बी) या पूर्ण लंबाई (सी,डी) कोशिका द्रव्य या Hela कोशिकाओं के नाभिक में microinsected थे. काजल निकायों (तीर) कोइलिन इम्यूनोलेबलिंग (लाल) द्वारा चिह्नित किया गया है; nRNAs हरे रंग में चित्रित कर रहे हैं. Dextran-TRITC-70kDa (पीला) परमाणु या साइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; डीएनए DAPI (नीले) द्वारा दागा गया था. एरोहेड्स एन.एन.एन.ए. के कोशिकाद्रव्यी स्थानीयकरण को चिह्नित करता है। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: माइक्रोइंजेक्शन दृष्टिकोण का एक संभावित नुकसान। (ए) एक डिब्बे में माइक्रोइंजेक्शन असफल हो गया और डब्ल्यूटी यू 2 एनआरएनए को कोशिकाद्रव्य और नाभिक दोनों में सूक्ष्म रूप से इंजेक्ट किया गया। ध्यान दें कि Dextran-TRITC-70kDa (पीला) दोनों सेलुलर डिब्बों में मौजूद है. (B) WT U2 SnRNA को हेला कोशिकाओं (हरा) के कोशिकाद्रव्य में सूक्ष्म रूप दिया गया था लेकिन एन.आर.एन.ए. की महत्वपूर्ण मात्रा कोशिकाद्रव्य (एरोहेड्स) में बनी रही, जो इंजेक्शन के आंशिक अवक्रमण और स्म बाइंडिंग साइट के नुकसान को इंगित करती है. काजल निकायों (तीर) कोइलिन इम्यूनोलेबलिंग (लाल) द्वारा चिह्नित किया गया है। डीएनए DAPI (नीले) द्वारा दागा गया था. स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने परमाणु काजल निकायों में एनआरएनए स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण दृश्यों का निर्धारण करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबल वाले snRNAs का माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग किया। लेबल आरएनए की तेजी से और बल्कि सरल तैयारी के कारण (पीसीआर द्वारा डीएनए टेम्पलेट की तैयारी, इन विट्रो प्रतिलेखन के बाद) विधि कैसे विभिन्न दृश्यों आरएनए स्थानीयकरण में योगदान के प्रभावी विश्लेषण प्रदान करता है। अपेक्षाकृत कम समय में, हम दस अलग विलोपन या U2 snRNA के प्रतिस्थापन का विश्लेषण करने में सक्षम थे (संदर्भ5 और डेटा नहीं दिखाया). एक जटिल जीवजनन मार्ग के साथ RNAs के लिए, इस दृष्टिकोण भी परीक्षण दृश्यों कि परिपक्वता के लिए आवश्यक हैं की अनुमति देता है. SRNAs के मामले में, Sm बाध्यकारी दृश्यों, जो Sm अंगूठी विधानसभा के लिए आवश्यक हैं के विलोपन और cytoplasm7में उत्परिवर्तित srnAs के गिरावट में परिणाम. अन्य लाभप्रद शामिल है कि दो अलग लेबल आरएनए एक साथ इंजेक्शन किया जा सकता है और उनके स्थानीयकरण सीधे एक सेल के भीतर तुलना में. हालांकि, के रूप में विभिन्न fluorochromes आरएनए व्यवहार को संशोधित हो सकता है, प्रत्येक fluorochrome डबल लेबलिंग प्रयोगों से पहले व्यक्तिगत परीक्षण किया जाना चाहिए. लंबाई में कई सौ न्यूक्लिओटाइड के आरएनए सफलतापूर्वक इंजेक्ट किए गए हैं और विभिन्न मॉडल प्रणालियों में उनके स्थानीयकरण पर परख लगाया गया है(संदर्भ8 में समीक्षा की गई)। अब आरएनए के मामले में सीमित कदम आमतौर पर पूर्ण लंबाई आरएनए के इन विट्रो संश्लेषण में होता है। इसके अलावा, पूर्व इकट्ठे प्रोटीन के साथ आरएनए का इंजेक्शन आरएनपी स्थानीयकरण पर व्यक्तिगत प्रोटीन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। हमारी परियोजनाओं में, हम काजल शरीर स्थानीयकरण5में एस एम अंगूठी की भूमिका की पुष्टि करने के लिए Sm प्रोटीन के साथ जुड़े snRNA इंजेक्शन. अंत में, फ्लोरोसेंट लेबल आरएनए का माइक्रोइंजेक्शन किसी भी अतिरिक्त कदम के बिना प्रत्यक्ष परिमाणीकरण की अनुमति देता है, जैसा कि पहले srnAs9के लिए लागू किया गया है।

वहाँ भी तरीकों है कि एक microinctions परियोजना शुरू करने से पहले विचार किया जाना चाहिए के कई नुकसान कर रहे हैं. सबसे पहले, microinsection प्रक्रिया के कुछ automatization के बावजूद, विधि अभी भी मैनुअल कौशल और अनुभव की आवश्यकता है, और शोधकर्ताओं को प्रशिक्षण के लिए आवश्यक समय पर विचार करना चाहिए. प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण भागों बरकरार RNAs की तैयारी कर रहे हैं, microinsइंजेक्शन और फिर माइक्रोस्कोप में इंजेक्शन कोशिकाओं को खोजने (नीचे युक्तियाँ और समस्या निवारण देखें). दूसरा, माइक्रोइंजेक्शन एक महत्वपूर्ण तनाव का प्रतिनिधित्व करता है और कई कोशिकाओं को समय की एक लंबी अवधि के लिए जीवित नहीं है। जबकि लाइव-सेल इमेजिंग द्वारा कोशिकाओं के अंदर माइक्रोइंजेक्शन आरएनए का पालन करने के लिए कुछ सफल प्रयास कर रहे हैं10,हम सेल मौत की महत्वपूर्ण वृद्धि देखी जब हम फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लाइव सेल इमेजिंग के साथ माइक्रोइंजेक्शन संयुक्त. तीसरा, मानव कोशिकाओं में इंजेक्शन आरएनए की मात्रा बहुत कम है जो इंजेक्शन आरएनए के जैव रासायनिक विश्लेषण को रोकता है। इसका यह भी मतलब है कि यह निगरानी करने के लिए कैसे फ्लोरोसेंट लेबल न्यूक्लियोटाइड्स का समावेश आरएनए कार्यों को प्रभावित करता है मुश्किल है. इसलिए, लेबल-एनटीपी के विभिन्न अनुपातों को जंगली-प्रकार आरएनए में शामिल किया जाना चाहिए और इसके स्थानीयकरण को फ्लोरोसेंट सिग्नल और लेबल आरएनए की कार्यक्षमता के बीच आदर्श अनुपात प्राप्त करने के लिए परख दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, फ्लोरोक्रोम की प्रकृति आरएनए स्थानीयकरण को प्रभावित कर सकती है। हमारे हाथों में, Alexa488-UTP Alexa546-UTP की तुलना में बेहतर काम किया. हम इन मतभेदों को किसी भी आगे का पता लगाया नहीं है, लेकिन एक कारण Alexa488 की तुलना में एक बड़ा आकार और Alexa546 के विभिन्न आकार हो सकता है.

एक साथ ले जा रहा है, आरएनए माइक्रोइंजेक्शन आरएनए स्थानीयकरण के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, लेकिन हमेशा वैकल्पिक दृष्टिकोण के साथ संयुक्त किया जाना चाहिए। हमारे मामले में, हम सफलतापूर्वक U2 snRNA में MS2 बाध्यकारी साइट शुरू की, MS2-YFP का उपयोग कर अपने स्थानीयकरण की निगरानी और कुछ महत्वपूर्ण MS2 प्रणाली5के साथ snRNA microinctions द्वारा प्राप्त परिणामों की पुष्टि की.

युक्तियाँ और समस्या निवारण
इंजेक्शन दबाव, मुआवजा दबाव और इंजेक्शन समय प्रत्येक सेल लाइन के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित करने की आवश्यकता है। हमने न्यूक्लियर माइक्रोइंजेक्शनिंग के मामले में इंजेक्शन दबाव (पीआई) 170 एचपीए और मुआवजा दबाव (पीसी) 50 एचपीए लागू किया। इंजेक्शन समय दोनों मामलों में 0.2 s करने के लिए सेट किया गया था. आप कभी-कभी सेल के अंदर सामग्री की एक मामूली आंदोलन का निरीक्षण कर सकते हैं, जो एक सफल इंजेक्शन का संकेत है। यदि सेल फट, आप इंजेक्शन दबाव को कम करने के लिए है. तुम भी TRITC फ्लोरोसेंट चैनल के माध्यम से मुआवजा दबाव की जाँच करनी चाहिए. जब आप देखते हैं मजबूत धारा सुई की नोक से बाहर आ रहा है, तो मुआवजा दबाव कम.

इंजेक्शन के बीच, हमेशा कोशिकाओं को सफलतापूर्वक इंजेक्शन रहे हैं कि क्या जाँच करें. TRITC फ्लोरोसेंट चैनल का उपयोग कर इंजेक्शन Dextran-TRITC के माध्यम से microinsed कोशिकाओं की पहचान. यदि आप किसी भी microinedकोशिका कोशिकाओं को नहीं देखते हैं, पहले इंजेक्शन दबाव और इंजेक्शन समय में वृद्धि. दूसरा, सुई फ्लोरोसेंट चैनल (TRITC) के माध्यम से खामियों को दूर नहीं किया है, तो जाँच करें। यदि आप देखते हैं Dextran-TRITC कमजोर सुई की नोक से स्ट्रीमिंग, उसके बाद सुई कार्यात्मक है, और समस्या इंजेक्शन के लिए कम सीमा की सेटिंग में होने की संभावना है. सीमा की स्थापना एक बहुत ही मुश्किल और महत्वपूर्ण कदम है. प्रत्येक सेल अलग आकार है और आप उचित microinsinctions सुनिश्चित करने के लिए बहुत बार सीमा बदलने के लिए होगा.

आदर्श मामले में, सुई की नोक से पहले एक सेल मलबे के साथ खामियों को दूर किया जाता है एक microinect करने में सक्षम होना चाहिए. यदि फ्लोरोसेंट नियमित रूप से टिप से बाहर आता है, और यदि आप टिप से स्ट्रीमिंग किसी भी Dextran-TRITC नहीं देखते हैं, तो सुई अवरुद्ध है की जाँच करें। इसे साफ करने के लिए, इंजेक्टर पर क्लीन बटन को 3 s के लिए रखें, जो दबाव बढ़ाता है और ब्लॉक को हटाना चाहिए। यदि यह मदद नहीं करता है, तो आप पेट्री डिश के नीचे से टकराने से सुई की नोक को तोड़ने की कोशिश कर सकते हैं। हालांकि, यह एक बहुत ही मुश्किल प्रक्रिया है, जो अनुभव की एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता है और वहाँ सफलता की कोई गारंटी नहीं है. इसलिए, शुरुआती के लिए, सुई विनिमय सलाह दी जाती है.

इससे पहले कि आप सुई का आदान-प्रदान करें, इंजेक्टर पर MENU बटन दबाएँ. सुई थोड़ा ऊपर ले लो और micromanipulator पर घर दबाएँ. सुई माध्यम से सभी तरह से ऊपर जाना होगा, लेकिन micromanipulator सुई की मूल स्थिति याद है और आप सुई फिर से खोजने की जरूरत नहीं है. जब सुई की जगह है, घर बटन दबाएँ और सुई मूल स्थिति में जाना होगा और आप माइक्रोस्कोप में सुई की नोक देखने में सक्षम होना चाहिए. सुई बदलने के बाद, आप सीमा को समायोजित करने के लिए है। फिर, इंजेक्टर पर MENU बटन को फिर से पुश करें और सुई माइक्रोइंजेक्शनिंग के लिए तैयार है।

इमेजिंग के दौरान, trickiest हिस्सा microइंजेक्ट कोशिकाओं को खोजने के लिए है. उन्हें खोजने के लिए, TRITC चैनल का उपयोग करें, जहां TRITC-संयुग्मी Dextran-70kDa microinsed snRNAs के एक कमजोर Alexa488 संकेत की तुलना में बेहतर दिखाई देता है. एक ग्रिड के साथ coversps यहाँ उपयोगी हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम चेक साइंस फाउंडेशन (18-10035S), राष्ट्रीय स्थिरता कार्यक्रम मैं (LO1419), संस्थागत सहायता (RVO68378050), यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (C$.02.1.01/0.0/0.0/16]013/001775) और अनुदान एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया था चार्ल्स विश्वविद्यालय (GAUK 134516). हम आगे लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, IMG कैस, प्राग, चेक गणराज्य (अनुदान द्वारा समर्थित (चेक-बायोइमेजिंग - LM2015062) स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

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References

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