Analys av Spliceosomal snRNA lokalisering i mänskliga hela celler med mikroinjektion

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biogenesis av Spliceosomal snRNAs är en komplicerad process som involverar olika cellulära fack. Här använde vi mikroinjektion av fluorescerande märkta snRNAs för att övervaka deras transport inuti cellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biogenesis av Spliceosomal snRNAs är en komplicerad process som involverar både nukleära och cytoplasmiska faser och det sista steget sker i ett kärnkrafts fack kallas Cajal kroppen. Men sekvenser som direkt snRNA lokalisering i denna subnukleära struktur har inte varit känd förrän nyligen. För att bestämma sekvenser som är viktiga för ackumulering av snrnas i Cajal organ, vi anställda görs av överföras märkta snrnas följt av deras lokalisering inuti celler. Först, vi förberedde snRNA radering mutanter, syntetiserade DNA-mallar för in vitro-transkription och transkriberas snRNAs i närvaro av UTP i kombination med Alexa488. Märkta snRNAs blandades med 70 kDa-dextran konjugerat med TRITC, och microinjected till kärnan eller Cytoplasman hos mänskliga HeLa celler. Cellerna inkuberades för 1 h och fixeras och Cajal Body marker Mats visualiserades genom indirekt immunofluorescens, medan snrnas och dextran, som fungerar som en markör för nukleär eller Cytoplasmatisk injektion, observerades direkt med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Denna metod möjliggör effektiv och snabb testning av hur olika sekvenser påverkar RNA lokalisering inuti celler. Här visar vi vikten av den SM-bindande sekvensen för effektiv lokalisering av snRNAs i Cajal kroppen.

Introduction

RNA skarvning är en av de avgörande stegen i genuttryck, som katalyseras av en stor ribonukleoprotein komplex som kallas spliceosome. Sammanlagt är mer än 150 proteiner och 5 små nukleära RNAs (snRNAs) integrerade i skarvar i olika stadier av skarvning vägen. SnRNAs (U1, U2, U4, U5 och U6) deltar i splitsar av stora GU-AG Introns. Dessa snrnas gå med spliceosome som pre-bildade små nukleära ribonukleoprotein partiklar (snrnps) som innehåller snRNA, sju SM proteiner i samband med snRNA (eller liknande-SM proteiner, som associerar med U6 snRNA) och 1-12 proteiner specifika för varje snRNP.

Montering av snRNPs innebär cytoplasmiska och nukleära stadier. Nyligen transkriberade snRNA exporteras till cytoplasman där den förvärvar en ring sammansatt av sju SM-proteiner. SM-ringen fungerar därefter som en signal för snRNA åter importera tillbaka till kärnan. Defekta snRNAs som inte associeras med SM-proteiner behålls i cytoplasman1. Nyligen importerade snrnps visas först i Cajal kroppen där de uppfyller snRNP-specifika proteiner och avsluta sin mognad (ses över i referens2,3). Vi visade nyligen att hämning av den slutliga mogningen steg resulterar i kvarstad på omogen snrnps i Cajal organ4,5. Vi föreslog en modell där den slutliga snRNP mogningen är under kvalitetskontroll som övervakar tillägg av snRNP-specifika proteiner och bildandet av aktiva snRNPs. Men molekylära detaljer om hur celler skilja mellan korrekt monterade mogna och avvikande omogen partiklar förblir svårfångade.

För att bestämma snRNA sekvenser som är viktiga för inriktning och ackumulering av snrnas i nukleära Cajal organ, vi bestämde oss för att anställa mikroinjektion av överföras märkta snrnas. Microinjection var en metod för val eftersom: 1) det kräver inte en ytterligare sekvens tagg för att skilja syntetiska snRNAs bilda sina endogena motsvarigheter som är särskilt viktigt för korta RNAs med liten plats för införande av extra tagg sekvens; 2) det möjliggör analys av sekvenser som är viktiga för biogenes. Till exempel är SM-sekvensen avgörande för SM-ringmontering och återimport till Nucleus6. När snRNAs uttrycks i cellen, är snRNAs saknar SM sekvens bryts ned i cytoplasman och inte når kärnan och Cajal organ7. Men snRNAs utan SM-sekvensen kan direkt mikroinjiceras i kärnan och därmed en potentiell roll i SM-sekvensen i Cajal Body lokalisering analyseras.

Här beskriver vi i detalj en görs metod som vi tillämpade för att bestämma snRNA sekvenser som krävs för att rikta snrnas in i Cajal kroppen5. Vi visade att SM och SMN bindnings platser är tillsammans nödvändiga och tillräckliga för att lokalisera inte bara snRNAs men olika korta icke-kodning RNAs i Cajal kroppen. Baserat på mikroinjektion samt andra bevis, föreslog vi att SM ringen monteras på SM bindningsstället är Cajal kroppen lokalisering signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av snRNAs för mikroinjektion

  1. Förbered en DNA-mall som innehåller full längd eller stympad/muterad version av snRNA genom PCR med en följande PCR-inställning: 98 ° c för 60 s, 98 ° c för 15 s, 68 ° c för 30 s, 72 ° c i 1 min, 98 ° c för 15 s för 35x och 72 ° c i 5 min.
  2. Den främre primer måste innehålla en promotor sekvens för in vitro-transkription strax uppströms den första transkriberade nukleotid. Amplifiera U2 snRNA sekvens med hjälp av framåt primer som innehåller T7 promotorn och omvänd primer, som slutar med den sista transkriberade nukleotid (se tabell över material för detaljer).
  3. Syntetisera snRNA med hjälp av ett kit för kort RNA-syntes (se tabell över material för detaljer) som innehåller T7 RNA-polymeras. Lägg till 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine Cap analog (m32, 2, 7g (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml av en RNA-hämmare och 500-700 ng av DNA-mallen till reaktionsblandningen och inkubera vid 37 ° c över
  4. Tillsätt 1 μL (2U) DNase i reaktionen och inkubera i ytterligare 15 min vid 37 ° c.
  5. Isolera snRNA genom sura fenol/kloroformextraktion. Ta bort den övre vattenfasen och tillsätt 1/10 av den ursprungliga volymen av 3 M natriumacetat (pH = 5,2), 3 μL glykogen för bättre pellets visualisering och 2,5 volymer på 100% etanol. Inkubera i 1 h vid-80 ° c, Centrifugera i 10 min vid 14 000 x g och 4 ° c.
  6. Tvätta pelleten med 70% etanol och lös i 12 μL nukleasfritt vatten. Den vanliga RNA-avkastningen var cirka 600 ng/mL. Förvaras vid-80 ° c.
  7. Övervaka integriteten hos in vitro transkriberade snRNAs av aguppstod gel elektroforeses.
  8. Före mikroinjektion, späd RNA till den slutliga koncentrationen 200 ng/mL i Vatteninnehållande 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.

2. celler

  1. Före användning, behandla täckglas med 1 M HCl för 1 h, Tvätta grundligt i destillerat vatten och förvara i 100% etanol. Sura behandling främjar cellernas vidhäftning för att förhindra cellpeeling under eller efter injektion. För enklare identifiering av injicerade celler, Använd en täckslip med ett rutnät.
  2. Utsäde hela eller andra anhängare celler 1 dag före görs på 12 mm täckglas (nr 1 eller nr 1,5) för att nå 50% confluency vid tidpunkten för mikroinjektion.

3. injektion

Anmärkning: HeLa celler var microinjected i Dulbecco modifierade Eagle medium (D-MEM, 4,5 g/L D-glukosinnehållande fenolrött och antibiotika). Injektion utfördes med hjälp av en injektor och en micromanipulator utrustad med den sterila nålen (se tabell över material för detaljer). Hela mikroskopiska/micromanipulator systemet förvärmd till 37 ° c i minst 4 h för att förhindra fluktuationer i enskilda delar av mikroskopet och mikroinjektorn.

  1. Sätt petriskål (30 mm) som innehåller 2 mL odlingsmedier med täckglas i mitten in i hållaren av mikroskopet. Fyll på 3 μL snRNA-blandning i nålen med en microloader. Installera nålen i hållaren av mikroinjektorn i 45 ° med avseende på ytan av petriskål.
  2. För att hitta nålen, Använd en 10X långdistansmål. Ställ först in hastigheten grovt på injektorn och sänk nålen tills den vidrör odlingsmediet. Med hjälp av Mikroskop kikare, hitta den ljusa fläcken, som är den plats där nålen berör kultur mediet.
  3. Ändra hastigheten till fin och ytterligare sänka nålen medan du tittar in i mikroskopet tills spetsen på nålen observeras. Flytta nålen i mitten av synfält och växla till en 40x långdistansmål.
  4. När du har ändrat målet, Markera cellen och flytta nålen över den här cellen. Ställ in tryck och tid för cell kontakt (se tips och felsökning i diskussion).
  5. Flytta nålen nedåt i cellen och ställ sedan in den undre gränsen för mikromanipulatorn. Var noga med att inte flytta nålen under cellen.
  6. Efter inställning av den undre gränsen, flytta nålen tillbaka över cellen och tryck på injektionsknappen på injektorn joystick. Nålen rör sig automatiskt inuti cellen till den plats där gränsen är inställd och injicerar RNA-blandningen.
  7. För att avsluta, tryck på knapp menyn på injektorn och ta bort nålen från hållaren. Koppla sedan ur röret från injektorn innan du stänger av injektorn och mikromanipulatorn.

4. cellfixering och-färgning

  1. Efter mikroinjektion, returnera cellerna i en CO2 inkubator och inkubera vid 37 ° c för 1 h.
  2. Efter inkubering, skölj cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur, Fix för 20 min med 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M rör pH 6,9, och tvätta tre gånger med rumstemperatur PBS. Om endast snRNA lokalisering analyseras, skölj snabbt cellerna i vatten och montera i ett monteringsmedium med DAPI.
  3. Vid ytterligare protein lokalisering, permeabilisera cellerna med 0,5% Triton-X100 i PBS för 5 min vid rumstemperatur. Efter tre sköljningar med PBS, inkubera cellerna med primära och sekundära antikroppar och efter sista tvättar i PBS och kort skölj i vatten, montera i ett monteringsmedium med DAPI.

5. mikroskopi

  1. Om den inte avbildas omedelbart efter monteringen, förvara bilderna vid 4 ° c tills bildtagning.
  2. Hämta bilder med ett mikroskopiskt fluorescenssystem som är försett med ett fördjupnings mål (60X eller 100x/1.4 NA).
  3. När mikroinjicerade celler identifieras, samla en bunt med 20 z-sektioner med 200 nm z steg per prov och föremål för matematisk deconvolution. Maximala projektioner eller individuella z-stackar presenterades.
  4. För att kvantifiera fluorescerande signalen, rita regionen av intresse (ROI) runt en Cajal kropp identifierats av Mats immunofärgning. Mät intensiteten hos snRNA-signalen i Coilin-definierad ROI. Nästa bestämma intensiteten av snRNA fluorescens i ROI slumpmässigt placeras i nukleoplasm och beräkna förhållandet mellan RNA-signalen i Cajal kroppen och nukleoplasm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att övervaka snRNA lokalisering och den roll som SM bindnings plats i Cajal Body inriktning, vi förberedde en DNA-mall som innehåller T7 promotorn och antingen full längd U2 snRNA eller U2 snRNA saknar de sju nukleotider (AUUUUUG) bildar SM bindningsstället. snRNAs var in vitro transkriberad, isolerad och blandad med TRITC-kopplade dextran-70kDa. Vi microinjected blandningen innehåller in vitro transkriberade snRNA i kärnan eller Cytoplasman i HeLa celler.

Det har tidigare visats att SM-bindningsstället är nödvändigt för kärnkrafts import6. För att testa om SM platsen är också viktigt för Cajal Body ackumulering, vi microinjected snRNA saknar SM plats direkt i kärnan (figur 1a). Injektion i cytoplasman fungerade som en kontroll (figur 1b). Som en positiv kontroll, vi microinjected fullängds snRNA (figur 1c,D). Efter 60 min av inkubering i en co2 -inkubator, var mikroinjicerade celler fasta och Cajal Body marker Mats visualiserades genom indirekt immunofluorescens. Den fullängds snRNA ackumulerade i Cajal organ efter både nukleära och cytoplasmiska injektioner. Däremot, snRNA saknar SM plats kvar i cytoplasman efter görs i detta fack, vilket är förenligt med tidigare fynd6. Den nukleära görs av snRNA utan SM plats avslöjade att SM-bindning sekvens är viktigt för Cajal Body lokalisering. U2 snRNA saknar SM plats kvar i kärnan men inte ackumuleras i Cajal organ (figur 1a).

Ibland, mikroinjektion i endast ett cell fack misslyckades och TRICT-dextran-70kDa hittades i både kärnan och cytoplasman (figur 2A). Dessa celler förkastades från ytterligare analys. Trots att den fluorescerande märkta snRNAs lagras vid-80 ° c före injektionen, kan RNA-nedbrytning förekomma. Försämrad snRNA injiceras i cytoplasman transporteras inte in i kärnan och förblir lokaliserade i cytoplasman (figur 2b). Sådana snRNA bör kasseras, och nya snRNA bör syntetiseras.

Figure 1
Bild 1: lokalisering av microinjected snRNAs. Alexa488-märkt U2 snRNA antingen saknar SM plats (A,B) eller full längd (C,D) var microinjected in i cytoplasman eller kärnan i hela celler. Cajal organ (pilar) är markerade med Mats immunolabeling (röd); snRNAs avbildas i grönt. Dextran-TRITC-70kDa (gul) användes för att övervaka nukleära eller cytoplasmiska injektion; DNA färgas av DAPI (blått). Arrowheads markerar cytoplasmiska lokalisering av snRNA. Skalstapel = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: ett potentiellt fall av mikroinjektionsmetoden. (A) mikroinjektion i ett fack misslyckades och WT U2 snRNA var microinjected i både cytoplasman och kärnan. Observera att dextran-TRITC-70kDa (gul) finns i båda cell facken. (B) WT U2 snRNA var microinjected in i cytoplasman av hela celler (grön) men betydande mängd snRNA kvar i cytoplasman (pilspetsar), som indikerar partiell nedbrytning av injicerat snRNA och en förlust av SM bindningsstället. Cajal organ (pilar) är markerade med Mats immunolabeling (röd). DNA färgas av DAPI (blått). Skalstapel = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi använde mikroinjektion av fluorescerande märkta snRNAs för att bestämma sekvenser viktiga för snRNA lokalisering till nukleära Cajal organ. På grund av snabb och ganska enkel beredning av märkta RNAs (beredning av DNA-mall av PCR följt av in vitro-transkription) metoden erbjuder effektiv analys av hur olika sekvenser bidrar till RNA lokalisering. På relativt kort tid, kunde vi analysera tio olika borttagningar eller substitutioner av U2 snRNA (referens5 och data som inte visas). För rnas med en komplex biogenes väg, detta tillvägagångssätt kan också testa sekvenser som är nödvändiga för mognad. När det gäller snRNAs är borttagandet av SM-bindningssekvenser, som krävs för SM ring-montering, en bindning och nedbrytning av muterade snRNAs i cytoplasman7. Andra fördelaktiga inkluderar att två olika märkta RNAs kan injiceras samtidigt och deras lokalisering direkt jämfört i en cell. Eftersom olika fluorokromer kan förändra RNA-beteendet måste dock varje fluorokrom testas individuellt före dubbel märknings experiment. RNAs av flera hundra nukleotider i längd har framgångsrikt injicerats och deras lokalisering analyseras i olika modellsystem (ses över i referens8). Det begränsande steget i händelse av längre RNAs är vanligtvis in vitro-syntes av fullängdsrna. Dessutom kan injektion av RNAs med förmonterade proteiner appliceras för att testa effekten av enskilda proteiner på RNP lokalisering. I våra projekt injicerade vi snRNA i samband med SM-proteiner för att bekräfta den roll som SM-ringen har i Cajal Body localization5. Slutligen tillåter mikroinjektion av fluorescerande märkta RNAs direkt kvantifiering utan några ytterligare steg, vilket tidigare har tillämpats för snRNAs9.

Det finns också flera nackdelar med de metoder som bör övervägas innan du startar ett mikroinjektionsprojekt. Först, trots vissa automatisering av mikroinjektion processen, metoden kräver fortfarande manuella färdigheter och erfarenhet, och forskare bör överväga tid som krävs för utbildning. De kritiska delarna av protokollet är beredningen av intakt RNAs, mikroinjektion och sedan hitta injicerade celler i mikroskopet (se tips och felsökning nedan). För det andra, görs representerar en betydande stress och många celler inte överlever under en längre tid. Även om det finns några lyckade försök att följa microinjected rnas inuti celler av Live-cell Imaging10, observerade vi signifikant ökning av celldöd när vi kombinerade görs med levande cell avbildning med fluorescens mikroskopi. För det tredje är mängden injicerat RNA i humana celler mycket låg vilket förhindrar biokemisk analys av injicerad RNAs. Detta innebär också att det är svårt att övervaka hur införlivandet av fluorescerande märkta nukleotider påverkar RNA-funktioner. Därför, olika förhållanden av märkt-NTP: NTP bör införlivas med Wild-typ RNA och dess lokalisering analyseras för att få det ideala förhållandet mellan fluorescenssignalen och funktionaliteten hos märkt RNA. Dessutom kan arten av fluorkrom påverka RNA lokalisering. I våra händer, Alexa488-UTP arbetat mycket bättre än Alexa546-UTP. Vi har inte undersökt dessa skillnader ytterligare, men en anledning kan vara en större storlek och olika form av Alexa546 i jämförelse med Alexa488.

Att ta tillsammans, RNA görs är en kraftfull metod för RNA lokalisering men bör alltid kombineras med alternativa metoder. I vårt fall införde vi framgångsrikt MS2-bindande plats i U2 snRNA, övervakade dess lokalisering med MS2-YFP och bekräftade några viktiga resultat som erhållits genom snRNA mikroinjektion med MS2 system5.

Tips och felsökning
Insprutningstryck, kompensations tryck och insprutningstid måste bestämmas experimentellt för varje cellinje. Vi tillämpade insprutningstryck (PI) 170 hPa och kompensations tryck (PC) 50 hPa när det gäller cytoplasmisk mikroinjektion och PI = 200 hPa och PC = 80 hPa vid nukleär mikroinjektion. Injektionstiden var i båda fallen satt till 0,2 s. Du kan ibland observera en lätt förflyttning av material inuti cellen, vilket är en indikation på en lyckad injektion. Om cellen skurar, måste du minska insprutningstrycket. Du bör också kontrollera kompensations trycket via TRITC fluorescens-kanalen. När du ser den starka strömmen kommer ut från spetsen av nålen, sedan minska kompensations trycket.

Mellan injektionerna, Kontrollera alltid om cellerna har injicerats. Identifiera de mikroinjicerade cellerna via injicerad dextran-TRITC med hjälp av TRITC fluorescens Channel. Om du inte ser några mikroinjicerade celler, först öka insprutningstryck och injektion tid. För det andra, kontrollera om nålen inte är inkopplad via fluorescens Channel (TRITC). Om du ser dextran-TRITC svagt strömmande från spetsen av nålen, då nålen är funktionell, och problemet är sannolikt i inställningen av den nedre gränsen för injektion. Fastställandet av gränsen är ett mycket knepigt och viktigt steg. Varje cell har olika form och du kommer att ändra gränsen mycket ofta för att säkerställa korrekt mikroinjektion.

I idealfallet bör man kunna microinjicera ~ 50 celler innan spetsen på nålen är ansluten med ett cell skräp. Kontrollera om fluorescens kommer ut ur spetsen regelbundet, och om du inte ser någon dextran-TRITC streaming från spetsen, då nålen är blockerad. För att rengöra den, håll Clean -knappen på injektorn för 3 s, vilket ökar trycket och bör ta bort blocket. Om det inte hjälper, då kan du försöka att bryta av spetsen på nålen genom att trycka på botten av petriskål. Detta är dock ett mycket knepigt förfarande, som kräver en stor mängd erfarenhet och det finns ingen garanti för framgång. Därför, för nybörjare, är nålen utbyte tillrådligt.

Tryck på meny knappen på injektorn innan du utbyter nålen. Ta nålen lite upp och tryck hem på micromanipulator. Nålen kommer att gå hela vägen upp från mediet, men micromanipulator minns den ursprungliga positionen av nålen och du behöver inte hitta nålen igen. När nålen byts ut, tryck på hem knappen och nålen kommer att gå till den ursprungliga positionen och du bör kunna se spetsen på nålen i mikroskopet. När du har bytt nål, måste du justera gränsen. Tryck sedan på meny knappen på injektorn igen och nålen är förberedd för mikroinjektion.

Under Imaging är den svåraste delen att hitta mikroinjicerade celler. För att lokalisera dem, använda TRITC kanal, där TRITC-konjugerat dextran-70kDa är mycket bättre synlig än en svag Alexa488 signal av microinjected snRNAs. Täckglas med ett rutnät är bra här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av tjeckiska vetenskapsstiftelsen (18-10035S), det nationella hållbarhetsprogrammet I (LO1419), institutionellt stöd (RVO68378050), Europeiska regionala utvecklingsfonden (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) och bidrags myndigheten för Karlsuniversitetet (GAUK 134516). Vi erkänner vidare den lätta mikroskopi Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjeckien (med stöd av bidrag (Czech-bioimaging-LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics