Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna's gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biogenese van spliceosomale Snrna's is een complex proces waarbij zowel nucleaire als cytoplasmatische fasen en de laatste stap optreedt in een nucleair compartiment genaamd de Cajal lichaam. Echter, sequenties die direct snRNA lokalisatie in deze subnucleaire structuur zijn niet bekend tot voor kort. Om de sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor accumulatie van Snrna's in Cajal-lichamen, werkten we met micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's, gevolgd door hun lokalisatie in cellen. Eerst bereidden we snRNA deletie mutanten voor, synthetiseerde DNA templates voor in vitro transcriptie en transcribeerde Snrna's in aanwezigheid van UTP in combinatie met Alexa488. Gelabelde Snrna's werden gemengd met 70 kDa-dextran geconjugeerd met TRITC, en microgeïnjecteerde naar de Nucleus of het cytoplasma van menselijke HeLa cellen. Cellen werden gedurende 1 uur geïnincubeerd en de Cajal-Body marker coilin werd gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie, terwijl Snrna's en dextran, die dient als een marker van nucleaire of cytoplasmatische injectie, direct werden waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Deze methode maakt het mogelijk om efficiënt en snel te testen hoe verschillende sequenties de RNA lokalisatie in cellen beïnvloeden. Hier tonen we het belang van de SM-bindende sequentie voor efficiënte lokalisatie van Snrna's in de Cajal-body.

Introduction

RNA splicing is een van de cruciale stappen in genexpressie, die wordt gekatalyseerd door een groot RiboNucleoProteïne complex genaamd de spliceosome. In totaal zijn meer dan 150 eiwitten en 5 kleine nucleaire rna's (snrna's) geïntegreerd in de spliceosoom in verschillende stadia van het splicing traject. De Snrna's U1, U2, U4, U5 en U6 nemen deel aan de splitsing van de grote GU-AG introns. Deze snrna's voegen zich bij de spliceosoom als voorgevormde kleine nucleaire RiboNucleoProteïne deeltjes (snrnps) die snrna bevatten, zeven SM-eiwitten geassocieerd met snrna (of like-SM-eiwitten, die associëren met de U6 snrna) en 1-12 eiwitten die specifiek zijn voor elke snRNP.

Assemblage van snRNPs omvat cytoplasmatische en nucleaire stadia. Nieuw getranscribeerd snRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma waar het verwerft een ring geassembleerd uit zeven SM-eiwitten. De SM-ring dient vervolgens als een signaal voor het opnieuw importeren van snRNA terug naar de Nucleus. Defecte Snrna's die niet associëren met SM eiwitten worden bewaard in het cytoplasma1. Nieuw geïmporteerde snrnps verschijnen eerst in het lichaam van Cajal waar ze snRNP-specifieke eiwitten ontmoeten en hun rijping voltooien (beoordeeld in referentie2,3). We hebben onlangs aangetoond dat remming van de uiteindelijke rijpings stappen resulteert in vastlegging van onrijpe snrnps in Cajal-lichamen4,5. We stelden een model voor waarbij de uiteindelijke rijping van snRNP onder kwaliteitscontrole is die de toevoeging van snRNP-specifieke eiwitten en de vorming van actieve snRNPs bewaakt. Echter, moleculaire Details van hoe cellen onderscheid maken tussen correct geassembleerde volwassen en afwijkende onvolgroeide deeltjes blijven ongrijpbaar.

Om snRNA-sequenties te bepalen die essentieel zijn voor de targeting en accumulatie van Snrna's in nucleaire Cajal-lichamen, hebben we besloten om micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's in gebruik te nemen. Micro Injection was een methode van keuze omdat: 1) het vereist geen extra sequentie tag om synthetische Snrna's te onderscheiden van hun endogene tegenhangers, wat vooral belangrijk is voor korte Rna's met weinig ruimte voor het inbrengen van extra tagvolgorde; 2) het maakt analyse van sequenties die belangrijk zijn voor biogenese. De SM-reeks is bijvoorbeeld essentieel voor SM-ring assemblage en opnieuw importeren in de Nucleus6. Wanneer Snrna's worden uitgedrukt in de cel, Snrna's ontbreekt de SM sequentie zijn afgebroken in het cytoplasma en niet bereiken de Nucleus en Cajal lichamen7. Echter, Snrna's zonder de SM sequentie kunnen direct microgeïnjecteerd in de Nucleus en dus een mogelijke rol van de SM sequentie in Cajal lichaam lokalisatie geassageerd.

Hier beschrijven we in detail een micro injectie methode die we hebben toegepast om snRNA-sequenties te bepalen die nodig zijn om Snrna's in de Cajal-Body5te targeten. We toonden aan dat SM en SMN binding sites samen noodzakelijk en voldoende zijn om niet alleen Snrna's te lokaliseren, maar verschillende korte niet-Codeer Rna's in het Cajal lichaam. Op basis van Microinjection en ander bewijs, stelden we voor dat de SM-ring die op de SM-bindingsplaats is geassembleerd, het Cajal-lichaam lokalisatie signaal is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van Snrna's voor micro Injection

  1. Bereid een DNA-template met de volledige of afgeknotte/gemuleerde versie van snRNA door PCR met behulp van een volgende PCR-instelling: 98 °C voor 60 s, 98 °C voor 15 s, 68 °C voor 30 s, 72 °C gedurende 1 minuut, 98 °C gedurende 15 sec. voor 35x en 72 °C gedurende 5 min.
  2. De voorwaartse primer moet een volgorde van de organisator voor in vitro transcriptie bevatten, net stroomopwaarts van het eerste getranscribeerde nucleotide. Amplificatie U2 snRNA-sequentie met behulp van de voorwaartse primer met de T7 promoter en de reverse primer, die eindigt met het laatst getranscribeerd nucleotide (Zie tabel met materialen voor details).
  3. Synthetiseren snRNA met behulp van een Kit voor korte RNA-synthese (Zie tabel met materialen voor details) met T7 RNA polymerase. Voeg 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine Cap analoog (M32, 2, 7G (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml van een RNA-remmer en 500-700 ng van de DNA-sjabloon aan het reactiemengsel en inbroed bij 37 °c 's nachts
  4. Voeg 1 μL (2U) DNase toe aan de reactie en bebroed 15 minuten extra bij 37 °C.
  5. Isoleren van snRNA door zure fenol/chloroform extractie. Verwijder de bovenste waterfase en voeg 1/10 van het oorspronkelijke volume van 3 M Natriumacetaat toe (pH = 5,2), 3 μL glycogeen voor betere korrel visualisatie en 2,5 volumes van 100% ethanol. Inincuberen gedurende 1 uur bij-80 °C, centrifugeer 10 min bij 14.000 x g en 4 °c.
  6. Was de pellet met 70% ethanol en los op in 12 μL Nuclease-vrij water. De gebruikelijke RNA-opbrengst was rond 600 ng/mL. Bewaren bij-80 °C.
  7. Bewaak de integriteit van in vitro getranscribeerd Snrna's door agarose gel elektroforeses.
  8. Verdun vóór micro injectie RNA tot de uiteindelijke concentratie 200 ng/mL in water dat 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa bevat.

2. cellen

  1. Behandel vóór het gebruik de dekstroken met 1 M HCl voor 1 uur, grondig wassen in gedistilleerd water en bewaren in 100% ethanol. Zure behandeling bevordert de hechting van cellen om celpeeling tijdens of na de injectie te voorkomen. Gebruik voor een gemakkelijkere identificatie van geïnjecteerde cellen een dekslip met een rooster.
  2. Zaad Hela of andere aanhandige cellen 1 dag voor micro injectie op 12 mm dekstroken (nr. 1 of nr. 1,5) om 50% confluentie te bereiken op het moment van micro injectie.

3. injectie

Opmerking: HeLa-cellen werden microgeïnjecteerd in het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glucose met fenolrood en antibiotica). Injectie werd uitgevoerd met behulp van een injector en een micro manipulator uitgerust met de steriele naald (Zie tabel met materialen voor details). Het gehele microscopisch/micromanipulator systeem werd voorverwarmd tot 37 °C gedurende ten minste 4 uur om fluctuatie van afzonderlijke delen van de Microscoop en de micro injector te voorkomen.

  1. Plaats de Petri schaal (30 mm) met 2 mL kweekmedia met de Afdeklijst in het midden in de houder van de Microscoop. Laad 3 μL snRNA-mengsel in de naald met behulp van een micro lader. Installeer de naald in de houder van de micro injector in 45 ° met betrekking tot het oppervlak van de Petri schaal.
  2. Om de naald te vinden, gebruik een 10x lange afstand doel. Stel eerst de snelheid grof in op de injector en verlaag de naald totdat deze het kweekmedium raakt. Met behulp van de Microscoop verrekijker, vinden de lichte plek, dat is de plaats waar de naald raakt het cultuurmedium.
  3. Verander de snelheid in fijn en verder verlagen van de naald terwijl het kijken naar de Microscoop totdat de punt van de naald wordt waargenomen. Beweeg de naald in het midden van het gezichtsveld en schakel over op een 40x lange afstand doel.
  4. Nadat u de doelstelling hebt gewijzigd, selecteert u de cel en verplaatst u de naald boven deze cel. Stel de druk en tijd voor het celcontact in (Zie Tips en probleemoplossing in discussie).
  5. Beweeg de naald naar beneden in de cel en stel vervolgens de ondergrens op de micro manipulator in. Let op dat u de naald niet onder de cel beweegt.
  6. Nadat u de ondergrens hebt ingesteld, beweegt u de naald terug boven de cel en drukt u op de injectieknop op de joystick van de injector. De naald beweegt automatisch in de cel naar de plaats waar de limiet is ingesteld en injecteert het RNA-mengsel.
  7. Om te eindigen, druk op het knop menu op de injector en verwijder de naald uit de houder. Koppel vervolgens de buis los van de injector alvorens de injector en de micro manipulator uit te schakelen.

4. fixatie en kleuring van cellen

  1. Na de micro injectie, retourneer de cellen in een CO2 -incubator en incuberen bij 37 °c gedurende 1 uur.
  2. Na de incubatie, spoel de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur, Fix voor 20 min met 4% Paraformaldehyde in 0,1 M buizen pH 6,9, en was drie keer met kamertemperatuur PBS. Als alleen snRNA-lokalisatie wordt geanalyseerd, spoel de cellen dan kort in water en Monteer deze in een afdekmedium met DAPI.
  3. In geval van extra eiwit lokalisatie, permeabiliseer de cellen met 0,5% Triton-X100 in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na drie spoelen met PBS, inbroed de cellen met primaire en secundaire antilichamen en na de laatste wasbeurten in PBS en korte spoeling in water, Monteer in een afdekmedium met DAPI.

5. microscopie

  1. Als deze niet direct na de montage wordt afgebeeld, slaat u de glaasjes op 4 °C op tot beeldvorming.
  2. Verkrijg beelden met behulp van een hoogwaardig fluorescentie microscopisch systeem uitgerust met een immersie doelstelling (60X of 100x/1.4 NA).
  3. Zodra microgeïnjecteerde cellen zijn geïdentificeerd, verzamel een stapel van 20 z-secties met 200 nm z stappen per monster en onderworpen aan wiskundige deconvolutie. De maximale projecties of individuele z-stapels werden vervolgens gepresenteerd.
  4. Om het fluorescerende signaal te kwantificeren, trekt u regio van belang (ROI) rond een Cajal-lichaam dat wordt geïdentificeerd door coilin-immunokleuring. Meet de intensiteit van het snRNA-signaal in de door coilin gedefinieerde ROI. Bepaal vervolgens de intensiteit van de snRNA-fluorescentie in ROI die willekeurig in het nucleoplasma wordt geplaatst en bereken de verhouding van het RNA-signaal in het lichaam van Cajal en het nucleoplasma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor het monitoren van snRNA lokalisatie en de rol van de SM binding site in Cajal Body targeting, bereidden we een DNA-template voor met de T7 promoter en ofwel de full-length U2 snRNA of U2 snRNA zonder de zeven nucleotiden (AUUUUUG) die de SM binding site vormen. Snrna's werden in vitro getranscribeerd, geïsoleerd en vermengd met TRITC-gekoppelde dextran-70kDa. We microgeïnjecteerde het mengsel dat in vitro getranscribeerd snRNA in de Nucleus of het cytoplasma van HeLa cellen.

Er is al eerder aangetoond dat de SM binding site noodzakelijk is voor nucleaire import6. Om te testen of de SM-site ook belangrijk is voor Cajal lichaam accumulatie, we microgeïnjecteerde snRNA ontbreekt de SM-site rechtstreeks in de Nucleus (Figuur 1a). Injectie in het cytoplasma diende als een controle (Figuur 1b). Als een positieve controle, we microgeïnjecteerde volledige lengte snRNA (figuur 1c,D). Na 60 minuten incubatie in een CO2 -incubator werden microgeïnjecteerde cellen vastgesteld en werd de Cajal-Body marker coilin gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie. De volledige lengte snRNA verzameld in Cajal lichamen na zowel nucleaire en cytoplasmische injecties. Daarentegen, snRNA ontbreekt de SM-site bleef in het cytoplasma na micro injectie in dit compartiment, die consistent is met eerdere bevindingen6. De nucleaire micro injectie van snRNA zonder de SM-site onthulde dat de SM-bindingsvolgorde belangrijk is voor de lokalisatie van Cajal-lichaam. U2 snRNA ontbreekt de SM-site bleef in de Nucleus, maar zich niet ophopen in Cajal lichamen (Figuur 1a).

Soms is de micro injectie in slechts één mobiel compartiment mislukt en werd TRICT-dextran-70kDa aangetroffen in zowel de Nucleus als het cytoplasma (Figuur 2a). Deze cellen zijn verwijderd uit verdere analyse. Ondanks het feit dat de fluorescently gelabelde Snrna's bij-80 °C worden bewaard vóór de injectie, kan de afbraak van RNA optreden. Gedegradeerd snRNA geïnjecteerd in het cytoplasma wordt niet vervoerd in de Nucleus en blijft gelokaliseerd in het cytoplasma (Figuur 2b). Dergelijke snRNA moet worden weggegooid, en nieuwe snRNA moet worden gesynthetiseerd.

Figure 1
Figuur 1: lokalisatie van microgeïnjecteerde Snrna's. Alexa488-gelabeld U2 snrna ofwel ontbreekt de SM-site (A,B) of volledige lengte (C,D) werden microgeïnjecteerd in het cytoplasma of de kern van HeLa cellen. Cajal-lichamen (pijlen) worden gekenmerkt door coilin immunolabeling (rood); Snrna's worden in het groen afgebeeld. Dextran-TRITC-70kDa (geel) werd gebruikt voor het monitoren van nucleaire of cytoplasmische injectie; DNA werd gekleurd door DAPI (blauw). Pijlpunten merken cytoplasmische lokalisatie van snRNA. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: een mogelijke valkuil van de microinjectiebenadering. (A) micro injectie in één compartiment is mislukt en WT U2 snrna werd microgeïnjecteerd in zowel het cytoplasma als de Nucleus. Merk op dat dextran-TRITC-70kDa (geel) aanwezig is in beide cellulaire compartimenten. B) WT U2 snrna microgeïnjecteerd in het cytoplasma van HeLa cellen (groen) maar aanzienlijke hoeveelheid snrna bleef in het cytoplasma (pijlpunten), wat duidt op gedeeltelijke afbraak van geïnjecteerde snrna en een verlies van de SM binding site. Cajal-lichamen (pijlen) worden gekenmerkt door coilin immunolabeling (rood). DNA werd gekleurd door DAPI (blauw). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We werkten met Microinjection van fluorescently gelabelde Snrna's om sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor snRNA-lokalisatie in nucleaire Cajal-lichamen. Door een snelle en vrij eenvoudige bereiding van gelabelde Rna's (voorbereiding van DNA-Template door PCR gevolgd door in vitro transcriptie) biedt de methode een effectieve analyse van hoe verschillende sequenties bijdragen aan RNA lokalisatie. In relatief korte tijd konden we tien verschillende verwijderingen of vervangingen van het snRNA van U2 (referentie5 en niet-getoonde gegevens) analyseren. Voor Rna's met een complexe biogenese pathway, deze aanpak ook testen sequenties die essentieel zijn voor rijping. In het geval van snrnas, de verwijdering van SM binding sequenties, die nodig zijn voor de SM ring assemblage resulteert in vastlegging en afbraak van gemuleerde snrna's in het cytoplasma7. Andere voordelige omvatten dat twee verschillend gelabelde Rna's gelijktijdig kunnen worden geïnjecteerd en hun lokalisatie direct vergeleken binnen één cel. Aangezien verschillende fluorochromes echter het RNA-gedrag kunnen wijzigen, moet elk fluorochrome individueel worden getest voordat er dubbele etiketterings experimenten zijn. Rna's van enkele honderden nucleotiden in lengte zijn met succes geïnjecteerd en hun lokalisatie in verschillende modelsystemen getest (beoordeeld in referentie8). De beperkende stap in het geval van langere Rna's is meestal in vitro synthese van volledige-lengte RNA. Ook kan de injectie van Rna's met voorgemonteerde eiwitten worden toegepast om het effect van individuele eiwitten op de lokalisatie van RNP te testen. In onze projecten, we geïnjecteerd snRNA geassocieerd met SM eiwitten om de rol van de SM ring in Cajal lichaam lokalisatie5te bevestigen. Tot slot maakt micro injectie van fluorescently gelabelde Rna's een directe kwantificering zonder extra stappen mogelijk, zoals eerder is toegepast voor snRNAs9.

Er zijn ook verschillende nadelen van de methoden die moeten worden overwogen voordat de lancering van een micro-injectie project. Ten eerste, ondanks sommige automatisatie van het Microinjection proces, de methode vereist nog steeds handmatige vaardigheden en ervaring, en onderzoekers moeten nadenken over de tijd die nodig is voor de opleiding. De kritische delen van het protocol zijn de bereiding van intacte Rna's, micro Injection en vervolgens het vinden van geïnjecteerde cellen in de Microscoop (Zie Tips en probleemoplossing hieronder). Ten tweede, micro injectie vertegenwoordigt een aanzienlijke stress en veel cellen overleven niet voor een langere periode van tijd. Hoewel er enkele succesvolle pogingen zijn om microgeïnjecteerde Rna's in cellen te volgen door Live-cel Imaging10, hebben we een significante toename van de celdood waargenomen toen we Microinjection combineerden met Live-celbeeldvorming met behulp van fluorescentiemicroscopie. Ten derde is de hoeveelheid geïnjecteerd RNA in menselijke cellen zeer laag, waardoor biochemische analyse van geïnjecteerde Rna's wordt voorkomen. Dit betekent ook dat het moeilijk is om te controleren hoe de opname van fluorescently gelabelde nucleotiden de RNA-functies beïnvloedt. Daarom moeten verschillende ratio's van gelabeld-NTP: NTP worden opgenomen in wild-type RNA en de lokalisatie ervan om de ideale verhouding te krijgen tussen het fluorescentie signaal en de functionaliteit van gelabeld RNA. Ook kan de aard van fluorochrome invloed hebben op de RNA lokalisatie. In onze handen werkte Alexa488-UTP veel beter dan Alexa546-UTP. We hebben deze verschillen niet verder verkend, maar een van de redenen zou een grotere omvang en een andere vorm van Alexa546 kunnen zijn in vergelijking met Alexa488.

Samen nemen, RNA micro Injection is een krachtige methode voor RNA lokalisatie, maar moet altijd worden gecombineerd met alternatieve benaderingen. In ons geval hebben we met succes de MS2-bindende site geïntroduceerd in U2 snRNA, de lokalisatie bewaakt met MS2-YFP en enkele belangrijke resultaten bevestigd door snRNA micro Injection met het MS2-systeem5.

Tips en probleemoplossing
Injectiedruk, compensatie druk en injectie tijd moeten experimenteel worden bepaald voor elke cellijn. We hebben injectiedruk (PI) 170 hPa en compensatie druk (PC) 50 hPa toegepast in het geval van cytoplasmische micro injectie en Pi = 200 hPa en PC = 80 hPa in het geval van nucleaire micro injectie. De injectie tijd was in beide gevallen ingesteld op 0,2 s. Soms u een lichte beweging van het materiaal in de cel observeren, wat een indicatie is van een geslaagde injectie. Als de cel barst, moet u de injectiedruk verlagen. Controleer ook de compensatie druk via het TRITC fluorescentie kanaal. Als je de sterke stroom uit de punt van de naald ziet komen, verlaag dan de compensatie druk.

Tussen injecties, Controleer altijd of de cellen met succes worden geïnjecteerd. Identificeer de microgeïnjecteerde cellen via injecteerde dextran-TRITC met behulp van het TRITC fluorescentie kanaal. Als u geen microgeïnjecteerde cellen ziet, verhoog dan eerst de injectiedruk en de injectie tijd. Ten tweede, Controleer of de naald niet is aangesloten via het fluorescentie kanaal (TRITC). Als u ziet dat dextran-TRITC zwak streamt vanaf de punt van de naald, dan is de naald functioneel en is het probleem waarschijnlijk in de instelling van de ondergrens voor injectie. Het instellen van de grens is een zeer lastige en belangrijke stap. Elke cel heeft een andere vorm en u zult de limiet heel vaak veranderen om een goede micro injectie te garanderen.

In het ideale geval moet men in staat zijn om te microinjecteren ~ 50 cellen voordat de punt van de naald is aangesloten met een celpuin. Controleer of fluorescentie regelmatig uit de tip komt en als u geen dextran-TRITC-streaming vanaf de punt ziet, dan wordt de naald geblokkeerd. Om het schoon te maken, houdt u de clean -knop op de injector voor 3 s, die de druk verhoogt en het blok moet verwijderen. Als het niet helpt, dan zou je kunnen proberen om de punt van de naald af te breken door de bodem van de Petri schaal te raken. Dit is echter een zeer lastige procedure, die een aanzienlijke hoeveelheid ervaring vergt en er is geen garantie voor succes. Daarom is voor beginners, de naald uitwisseling is aan te raden.

Druk, voordat u de naald uitwisselt, op de menu knop op de injector. Neem de naald een beetje omhoog en druk op Home op de micro manipulator. De naald zal helemaal omhoog gaan vanaf het medium, maar de micromanipulator onthoudt de oorspronkelijke positie van de naald en u hoeft de naald niet opnieuw te vinden. Wanneer de naald wordt vervangen, druk op de Home -knop en de naald gaat naar de oorspronkelijke positie en je moet in staat zijn om de punt van de naald in de Microscoop te zien. Nadat u de naald hebt vervangen, moet u de limiet aanpassen. Druk vervolgens nogmaals op de menu knop op de injector en de naald is voorbereid op micro injectie.

Tijdens de beeldvorming is het moeilijkste deel om de microgeïnjecteerde cellen te vinden. Om ze te lokaliseren, gebruik TRITC kanaal, waar de TRITC-geconjugeerde dextran-70kDa is veel beter zichtbaar dan een zwak Alexa488 signaal van microgeïnjecteerde Snrna's. De dekstroken met een rooster zijn hier nuttig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Tsjechische wetenschaps Stichting (18-10035S), het nationaal duurzaamheidsprogramma I (LO1419), institutionele ondersteuning (RVO68378050), het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) en het subsidie Bureau van Universiteit van Charles (GAUK 134516). Verder erkennen we de Lichtmicroscopie kern faciliteit, IMG CAS, Praag, Tsjechië (ondersteund door subsidies (Tsjechisch-Bioimaging-LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics