Análise da localização de snRNA Spliceosomal em células HeLa humanas usando microinjeção

Neuroscience

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Summary

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo vários compartimentos celulares. Aqui, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado a fim monitorar seu transporte dentro da pilha.

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Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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Abstract

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo ambas as fases nuclear e citoplasmática e o último passo ocorre em um compartimento nuclear chamado corpo de Cajal. No entanto, as sequências que direcionam a localização de snRNA para esta estrutura subnuclear não foram conhecidas até recentemente. Para determinar seqüências importantes para a acumulação de snrnas em corpos de Cajal, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado seguido por sua localização dentro das pilhas. Primeiramente, nós preparamos mutantes do apagamento de snRNA, moldes sintetizados do ADN para in vitro a transcrição e transcrito snRNAs na presença de UTP acoplado com Alexa488. Os snRNAs rotulados foram misturados com 70 kDa-Dextran conjugados com TRITC, e microinjetado no núcleo ou no citoplasma de células HeLa humanas. As células foram incubadas por 1 h e fixadas e a coilina do marcador do corpo de Cajal foi visualizada por imunofluorescência indireta, enquanto snRNAs e Dextran, que serve como marcador de injeção nuclear ou citoplasmática, foram observados diretamente com um microscópio de fluorescência. Este método permite o teste eficiente e rápido de como as várias seqüências influenciam a localização do RNA dentro das pilhas. Aqui, mostramos a importância da sequência de ligação SM para uma localização eficiente de snRNAs no corpo de Cajal.

Introduction

A emenda do RNA é uma das etapas cruciais na expressão de Gene, que é catalisada por um grande complexo do ribonucleoprotein chamado o spliceosome. No total, mais de 150 proteínas e 5 RNAs nucleares pequenas (snrnas) são integrados no spliceossoma em estágios diferentes da via de emenda. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNAs estão participando na emenda dos principais introns GU-AG. Estes snrnas juntam-se ao spliceossoma como partículas nucleares pequenas pré-formadas do ribonucleoprotein (snRNPs) que contêm snRNA, sete proteínas do SM associadas com o snRNA (ou proteínas de like-SM, que associam com o snRNA U6) e 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.

A montagem de snRNPs envolve estágios citoplasmáticos e nucleares. O snRNA recentemente transcrito é exportado para o citoplasma onde adquire um anel montado a partir de sete proteínas SM. O anel SM, subsequentemente, serve como um sinal para snRNA re-importação de volta para o núcleo. SnRNAs defeituosos que não conseguem associar com proteínas SM são retidos no citoplasma1. Os snRNPs recém-importados aparecem pela primeira vez no corpo de Cajal, onde eles atendem às proteínas específicas de snRNP e terminam sua maturação (revisada na referência2,3). Nós mostramos recentemente que a inibição de etapas finais da maturação conduz ao sequestro de snRNPs imaturos em corpos de Cajal4,5. Nós propusemos um modelo onde a maturação final de snRNP esteja o controle de qualidade que monitora a adição de proteínas snRNP-específicas e a formação de snRNPs ativo. Entretanto, os detalhes moleculars de como as pilhas distinguem entre as partículas imaturas maduras e aberrantes corretamente montadas permanecem indescritível.

Para determinar as sequências de snRNA que são essenciais para o direcionamento e acúmulo de snrnas em corpos nucleares de Cajal, decidimos empregar microinjeção de snrnas rotulados com cDNAs. A microinjeção foi um método de escolha porque: 1) não requer uma tag de seqüência adicional para distinguir snRNAs sintéticos formam suas contrapartes endógenas que é especialmente importante para RNAs curtas com pouco espaço para inserção de seqüência de Tags extra; 2) permite a análise de sequências que são importantes para a biogênese. Por exemplo, a sequência SM é essencial para o conjunto do anel SM e re-importar para o núcleo6. Quando snRNAs são expressos na célula, snRNAs faltando a seqüência SM são degradadas no citoplasma e não atingem o núcleo e corpos Cajal7. Entretanto, snrnas sem a seqüência do SM pode diretamente ser injetado no núcleo e assim um papel potencial da seqüência do SM na localização do corpo de Cajal assayed.

Aqui, nós descrevemos em detalhe um método do microinjection que nós aplicamos para determinar as seqüências de snRNA necessárias para alvejar snRNAs no corpo5de Cajal. Nós mostramos que os locais obrigatórios do SM e do SMN são junto necessário e suficiente localizar não somente snRNAs mas vários RNAs não-codificando curtos no corpo de Cajal. Com base na microinjeção, bem como outras evidências, propusemos que o anel SM montado no local de ligação SM é o sinal de localização do corpo Cajal.

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Protocol

1. preparação de snRNAs para microinjection

  1. Prepare um molde do ADN que contem a versão full-length ou truncada/Mutated de snRNA pelo PCR usando uma seguinte configuração do PCR: 98 ° c para 60 s, 98 ° c para 15 s, 68 ° c para 30 s, 72 ° c para 1 minuto, 98 ° c para 15 s para 35x e 72 ° c por 5 min.
  2. O primer dianteiro deve conter uma sequência de promotor para a transcrição in vitro apenas a montante do primeiro nucleotídeo transcrito. Amplify a seqüência de snRNA U2 usando o primer dianteiro que contem o promotor T7 e o primer reverso, que termina com o último nucleotide transcrito (veja a tabela de materiais para detalhes).
  3. Sintetizar snRNA usando um kit para síntese de RNA curto (ver tabela de materiais para detalhes) contendo T7 RNA polimerase. Adicionar 1 mm ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimetilguanosina Cap analógico (m32, 2, 7g (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml de um inibidor de RNA e 500-700 ng do modelo de DNA para a mistura de reação e incubar a 37 ° c durante
  4. Adicionar 1 μL (2U) de DNase na reacção e incubar por 15 min adicionais a 37 ° c.
  5. Isole o snRNA pela extração ácida do fenol/clorofórmio. Retire a fase superior da água e adicione 1/10 do volume original de 3 M de acetato de sódio (pH = 5,2), 3 μL de glicogênio para melhor visualização da pelota e 2,5 volumes de 100% de etanol. Incubar durante 1 h a-80 ° c, centrifugador por 10 min a 14.000 x g e 4 ° c.
  6. Lave a pelota com 70% de etanol e dissolva em 12 μL de água sem nuclease. O rendimento usual do RNA era ao redor 600 ng/mL. Conservar a-80 ° c.
  7. Monitore a integridade de snRNAs transcritas in vitro por electrophoreses do gel do agarose.
  8. Antes da microinjecção, diluir o RNA para a concentração final 200 ng/mL em água contendo 10 μg/μL de Dextran-TRITC 70 kDa.

2. células

  1. Antes do uso, trate os COVERSLIP com 1 M HCl para 1 h, lave-o completamente na água destilada e armazene-o em 100% etanol. O tratamento ácido promove a adesão das pilhas para impedir a casca da pilha durante ou após a injeção. Para facilitar a identificação de células injetadas, use uma lamínula com uma grade.
  2. Semente HeLa ou outras células aderentes 1 dia antes da microinjecção em 12 mm COVERSLIP (n º 1 ou n º 1,5) para atingir 50% confluência no momento da microinjecção.

3. injeção

Nota: As células de HeLa foram microinjetadas no meio de águia modificada de Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glicose contendo fenol vermelho e antibióticos). A injeção foi feita usando um injector e um micromanipulador equipado com a agulha estéril (veja a tabela de materiais para detalhes). Todo o sistema microscópico/micromanipulador foi pré-aquecido a 37 ° c por pelo menos 4 h para evitar a flutuação de partes individuais do microscópio e do microinjetor.

  1. Coloque o prato de Petri (30 mm) contendo 2 mL de meios de cultura com a lamínula no meio no suporte do microscópio. Carregar 3 μL de mistura de snRNA na agulha utilizando um microloader. Instale a agulha no suporte do microinjector em 45 ° com respeito à superfície do prato de Petri.
  2. Para encontrar a agulha, use um objetivo de longa distância de 10x. Primeiramente, ajuste a velocidade grosseira no injector e abaixe a agulha até que toque o meio de cultura. Usando os binóculos microscópio, encontrar o ponto luminoso, que é o lugar onde a agulha toca o meio de cultura.
  3. Mude a velocidade para multa e abaixe mais a agulha ao olhar no microscópio até que a ponta da agulha esteja observada. Mova a agulha no meio do campo visual e mude para um objetivo de longa distância de 40x.
  4. Depois de alterar o objetivo, selecione a célula e mova a agulha acima desta célula. Defina as pressões e o tempo para o contato da célula (consulte Dicas e solução de problemas em discussão).
  5. Mova a agulha para baixo na célula e, em seguida, defina o limite inferior no micromanipulador. Tenha cuidado para não mover a agulha abaixo da célula.
  6. Depois de definir o limite inferior, mova a agulha para trás acima da célula e pressione o botão de injeção no joystick do injector. A agulha se move automaticamente dentro da célula para o local onde o limite é definido e injeta a mistura de RNA.
  7. Para terminar, empurre o menu do botão no injector e retire a agulha do suporte. Em seguida, desconecte o tubo do injector antes de desligar o injector e o micromanipulador.

4. fixação e coloração de células

  1. Após a microinjecção, devolva as células a uma incubadora de CO2 e incubar a 37 ° c durante 1 h.
  2. Após a incubação, enxágüe as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente, correção por 20 min com paraformaldeído a 4% em tubos de 0,1 M pH 6,9 e lave três vezes com a temperatura ambiente PBS. Se apenas a localização de snRNA for analisada, enxague brevemente as células em água e monte em um meio de montagem com DAPI.
  3. Em caso de localização de proteínas adicionais, permeabilize as células com 0,5% Triton-X100 em PBS por 5 min à temperatura ambiente. Após três enxaguatórios com PBS, incubar as células com anticorpos primários e secundários e após lavagens finais em PBS e breve enxágüe em água, montagem em um meio de montagem com DAPI.

5. microscopia

  1. Se não imaged imediatamente após a montagem, armazene as corrediças em 4 ° c até a imagem latente.
  2. Adquira imagens usando um sistema microscópico high-end da fluorescência equipado com um objetivo da imersão (60X ou 100x/1.4 NA).
  3. Uma vez que as células microinjetadas são identificadas, coletar uma pilha de 20 seções z com 200 nm z passos por amostra e sujeitos a desvolução matemática. Projeções máximas ou pilhas z individuais foram então apresentadas.
  4. Para quantificar o sinal fluorescente, desenhe região de interesse (ROI) em torno de um corpo de Cajal identificado por imunomarcação de coilina. Meça a intensidade do sinal snRNA no ROI definido pela coilina. Em seguida determine a intensidade da fluorescência de snRNA no ROI coloc aleatòria no Nucleoplasm e calcule a relação do sinal do RNA no corpo e no Nucleoplasm de Cajal.

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Representative Results

Para monitorar a localização de snRNA e o papel do local obrigatório do SM na segmentação do corpo de Cajal, nós preparamos um molde do ADN que contem o promotor T7 e o snRNA U2 completo ou o snRNA U2 que faltam os sete nucleotídeos (auuuuug) que formam o local obrigatório do SM. os snRNAs foram transcritos in vitro, isolados e misturados com Dextran-70kDa acoplado ao TRITC. Nós injetado a mistura que contem in vitro o snRNA transcrito no núcleo ou no citoplasma de pilhas de Hela.

Foi mostrado previamente que o local obrigatório do SM é necessário para a importação nuclear6. Para testar se o site SM também é importante para o acúmulo de corpo de Cajal, nós microinjetado snRNA faltando o site SM diretamente no núcleo (Figura 1a). A injeção no citoplasma serviu como controle (Figura 1b). Como um controle positivo, nós microinjetado snRNA de comprimento total (Figura 1C,D). Após 60 min de incubação em uma incubadora de CO2 , as células microinjetadas foram fixadas e a coilina do marcador do corpo de Cajal foi visualizada por imunofluorescência indireta. O snRNA full-length acumulou em corpos de Cajal após injeções nucleares e cytoplasmic. Ao contrário, snRNA que falta o local do SM remanesceu no citoplasma após o microinjection neste compartimento, que é consistente com os resultados precedentes6. O microinjection nuclear de snRNA sem o local do SM revelou que a seqüência obrigatória do SM é importante para a localização do corpo de Cajal. O snRNA de U2 que falta o local do SM permaneceu no núcleo mas não se acumulou em corpos de Cajal (Figura 1a).

Às vezes, a microinjeção em apenas um compartimento celular falhou e o TRICT-Dextran-70kDa foi encontrado tanto no núcleo quanto no citoplasma (Figura 2a). Estas pilhas foram descartadas de uma análise mais adicional. Apesar do fato de que os snrnas cDNAs etiquetados estão armazenados em-80 ° c antes da injeção, a degradação do RNA pode ocorrer. O snRNA degradado injetado no citoplasma não é transportado para o núcleo e permanece localizado no citoplasma (Figura 2b). Tal snRNA deve ser descartado, e o snRNA novo deve ser sintetizado.

Figure 1
Figura 1: localização de snRNAs microinjetado. Alexa488-rotulado U2 snRNA ou faltando o site SM (a,B) ou full-length (C,D) foram microinjetado no citoplasma ou o núcleo de células HeLa. Corpos Cajal (setas) são marcados por coilin Immunolabeling (vermelho); snRNAs são representados em verde. Dextran-TRITC-70kDa (amarelo) foi utilizado para monitorar a injeção nuclear ou citoplasmática; O DNA foi manchado por DAPI (azul). As pontas de seta marcam a localização cytoplasmic de snRNA. Barra de escala = 10 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: uma possível armadilha da abordagem de microinjeção. (A) a microinjeção em um compartimento falhou e o WT U2 snRNA foi microinjetado no citoplasma e no núcleo. Note-se que Dextran-TRITC-70kDa (amarelo) está presente em ambos os compartimentos celulares. (B) o peso U2 snRNA foi microinjetado no citoplasma de pilhas de Hela (verde) mas a quantidade significativa de snRNA permaneceu no citoplasma (pontas de seta), que indica a degradação parcial do snRNA injetado e uma perda do local obrigatório do SM. Os corpos de Cajal (setas) são marcados por coilin Immunolabeling (vermelho). O DNA foi manchado por DAPI (azul). Barra de escala = 10 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado para determinar as seqüências importantes para a localização de snRNA em corpos nucleares de Cajal. Devido à preparação rápida e rather simples de RNAs etiquetado (preparação do molde do ADN pelo PCR seguido pela transcrição in vitro) o método oferece a análise eficaz de como as várias seqüências contribuem à localização do RNA. Em tempo relativamente curto, pudemos analisar dez diferentes exclusões ou substituições do snRNA U2 (referência5 e dados não mostrados). Para RNAs com uma via de biogênese complexa, essa abordagem também permite testar sequências que são essenciais para a maturação. No caso de snrnas, o apagamento de seqüências de ligação SM, que são necessários para o conjunto de anel SM resulta em sequestro e degradação de snrnas mutado no citoplasma7. Outras vantagens incluem que duas RNAs rotuladas diferentemente podem ser injetadas simultaneamente e sua localização diretamente comparada dentro de uma célula. No entanto, como vários fluorochromes podem modificar o comportamento do RNA, cada fluorocromo deve ser testado individualmente antes de duplas experiências de rotulagem. RNAs de várias centenas de nucleotídeos de comprimento foram injetados com sucesso e sua localização analisada em vários sistemas de modelo (revisado na referência8). A etapa limitante em caso de RNAs mais longos é geralmente síntese in vitro do RNA completo. Além disso, a injeção de RNAs com proteínas pré-montadas pode ser aplicada para testar o efeito de proteínas individuais na localização de RNP. Em nossos projetos, injetamos snRNA associado a proteínas SM para confirmar o papel do anel SM na localização do corpo Cajal5. Por fim, a microinjeção de RNAs com rótulo cDNAs permite a quantificação direta sem quaisquer etapas adicionais, como já foi aplicado anteriormente para snrnas9.

Há também várias desvantagens dos métodos que devem ser considerados antes do lançamento de um projeto de microinjeção. Primeiro, apesar de alguma automatização do processo de microinjeção, o método ainda requer habilidades e experiência manuais, e os pesquisadores devem considerar o tempo necessário para o treinamento. As partes críticas do protocolo são a preparação de RNAs intactas, microinjeção e, em seguida, encontrar células injetadas no microscópio (consulte Dicas e solução de problemas abaixo). Em segundo lugar, a microinjeção representa um stress significativo e muitas células não sobrevivem por um longo período de tempo. Quando houver algumas tentativas bem sucedidas de seguir RNAs injetado dentro das pilhas pela imagem latente viva-pilha10, nós observamos o aumento significativo da morte de pilha quando nós combinamos o microinjection com a imagem latente da vivo-pilha usando a microscopia de fluorescência. Em terceiro lugar, a quantidade de RNA injetado em células humanas é muito baixa, o que impede a análise bioquímica de RNAs injetadas. Isto igualmente significa que é difícil monitorar como a incorporação de nucleotídeos cDNAs etiquetados afeta funções do RNA. Conseqüentemente, as várias relações de etiquetado-NTP: o NTP deve ser incorporado no selvagem-tipo RNA e em sua localização ensaiada para começ a relação ideal entre o sinal da fluorescência e a funcionalidade do RNA etiquetado. Além disso, a natureza do fluorocromo pode afetar a localização do RNA. Em nossas mãos, Alexa488-UTP funcionou muito melhor do que Alexa546-UTP. Nós não exploramos essas diferenças ainda mais, mas uma razão poderia ser um tamanho maior e forma diferente de Alexa546 em comparação com Alexa488.

Tomar junto, microinjection do RNA é um método poderoso para a localização do RNA mas deve sempre ser combinado com as aproximações alternativas. No nosso caso, introduzimos com sucesso o site de ligação de MS2 no snRNA U2, monitoramos sua localização usando o MS2-YFP e confirmámos alguns dos principais resultados obtidos pela microinjeção de snRNA com o sistema MS25.

Dicas e solução de problemas
A pressão da injeção, a pressão da compensação e o tempo da injeção precisam de ser determinados experimentalmente para cada linha celular. Aplicou-se pressão de injeção (PI) 170 hPa e pressão de compensação (PC) 50 hPa no caso de microinjecção citoplasmática e PI = 200 hPa e PC = 80 hPa no caso de microinjecção nuclear. O tempo da injeção estava em ambos os casos ajustados a 0,2 s. Às vezes, você pode observar um ligeiro movimento de material dentro da célula, que é uma indicação de uma injeção bem-sucedida. Se a célula estourar, você tem que diminuir a pressão de injeção. Você também deve verificar a pressão de compensação através do canal de fluorescência TRITC. Quando você vê o córrego forte que sai da ponta da agulha, a seguir diminui a pressão da compensação.

Entre as injeções, verifique sempre se as células são injetadas com sucesso. Identifique as células microinjetadas via Dextran-TRITC injetada usando o canal de fluorescência TRITC. Se você não vir nenhuma célula microinjetada, primeiro aumente a pressão de injeção e o tempo de injeção. Em segundo lugar, verifique se a agulha não está obstruída através do canal de fluorescência (TRITC). Se você ver Dextran-TRITC fracamente streaming a partir da ponta da agulha, em seguida, a agulha é funcional, eo problema é provável na configuração do limite inferior para a injeção. A definição do limite é um passo muito complicado e importante. Cada célula tem uma forma diferente e você vai mudar o limite muitas vezes para garantir a microinjeção adequada.

No caso ideal, deve-se ser capaz de microinjetar ~ 50 células antes da ponta da agulha é plugada com um escombros de células. Verifique se a fluorescência sai da ponta regularmente, e se você não vê qualquer Dextran-TRITC streaming da ponta, então a agulha está bloqueada. Para limpá-lo, segure o botão Clean no injector por 3 s, o que aumenta a pressão e deve remover o bloco. Se não ajudar, então você pode tentar quebrar a ponta da agulha batendo o fundo da placa de Petri. No entanto, este é um procedimento muito complicado, que requer uma quantidade significativa de experiência e não há garantia de sucesso. Portanto, para iniciantes, a troca de agulhas é aconselhável.

Antes de trocar a agulha, empurre o botão de menu no injector. Leve a agulha um pouco para cima e pressione para casa no micromanipulador. A agulha vai todo o caminho para cima a partir do meio, mas o micromanipulador lembra a posição original da agulha e você não precisa encontrar a agulha novamente. Quando a agulha é substituída, pressione o botão Home e a agulha vai para a posição original e você deve ser capaz de ver a ponta da agulha no microscópio. Depois de mudar a agulha, você tem que ajustar o limite. Em seguida, empurre o botão de menu no injector novamente e a agulha está preparada para a microinjecção.

Durante a imagem, a parte mais complicada é encontrar as células microinjetadas. Para localizá-los, use TRITC canal, onde o TRITC-conjugated Dextran-70kDa é muito melhor visível do que um sinal Alexa488 fraco de snRNAs microinjetado. Os COVERSLIP com uma grade são úteis aqui.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Czech Science Foundation (18-10035S), o programa nacional de sustentabilidade I (LO1419), apoio institucional (RVO68378050), o Fundo Europeu de desenvolvimento regional (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) e a agência de subvenção da Universidade de Charles (GAUK 134516). Nós reconhecemos mais a facilidade do núcleo da microscopia de luz, IMG CAS, Praga, República Checa (apoiado por concessões (Czech-BioImaging-LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

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References

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