Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

İntronları snrnas Biogenesis çeşitli hücresel bölmeler içeren karmaşık bir süreçtir. Burada, hücrenin içindeki taşımalarını izlemek için floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu çalışılmış.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

İntronları snrnas Biogenesis hem nükleer ve sitoplazmik aşamaları içeren karmaşık bir süreçtir ve son adım Cajal vücut denilen bir nükleer bölme oluşur. Ancak, snRNA lokalizasyonu bu subnuclear yapısına doğrudan dizileri yakın zamana kadar bilinmemektedir. Cajal vücutlarında snRNAs birikimi için önemli dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu ve ardından hücrelerin içindeki lokalizasyonu ile çalışmaktadır. İlk olarak, snRNA silme mutantlar hazırladık, in vitro transkripsiyon için sentezlenmiş DNA şablonları ve Alexa488 ile birleştiğinde UTP varlığı ile snRNAs transkripsiyonu. Etiketli snRNAs TRITC ile konjuli 70 kDa-dextran ile karıştırıldı ve Kernel veya insan HeLa hücrelerinin sitoplazması mikroenjekte edildi. Hücreler 1 h ve sabit ve Cajal vücut Marker aytac dolaylı immünofluorescence tarafından görselleştirilmiş iken, snrnas ve dextran, hangi nükleer veya sitoplazmik enjeksiyon bir marker olarak hizmet veren, doğrudan bir floresan mikroskop kullanılarak gözlenmiştir. Bu yöntem, çeşitli sıraları hücrelerin içinde RNA lokalizasyonu nasıl etkilediğini verimli ve hızlı test etmek için izin verir. Burada, snRNAs 'ın Cajal gövdesine verimli bir şekilde lokalizasyonu için SM-bağlayıcı dizisinin önemini gösteriyoruz.

Introduction

RNA birleştirme, spliceosome denilen büyük bir Ribonükleoprotein kompleksi tarafından katalizlenmiş gen ifadesinde önemli adımlardan biridir. Toplam olarak, 150 ' den fazla protein ve 5 küçük nükleer RNAs (snRNAs) spliceosome içine birleştirme yolu farklı aşamalarında entegre edilmiştir. U1, U2, U4, U5 ve U6 snRNAs, büyük GU-AG intron 'larının takılmasını yapmaya katılıyor. Bu snRNAs, snRNA içeren önceden biçimlendirilmiş küçük nükleer Ribonükleoprotein parçacıkları (snRNPs), snRNA ile ilişkili yedi SM proteinleri (U6 snRNA ile ilişkilendirmek gibi-SM proteinleri) ve her snRNP için spesifik 1-12 proteinleri olan spliceosome 'a katılır.

SnRNPs montajı sitoplazmik ve nükleer aşamaları içerir. Yeni yazılmış snRNA, yedi SM proteininden toplanan bir yüzüğü satın aldığı sitoplazmada ihraç edilir. SM halkası daha sonra snRNA 'nın çekirdeğe yeniden ithalatı için bir sinyal olarak hizmet vermektedir. SM proteinleri ile ilişkilendirmek için başarısız arızalı snRNAs sitoplazmada korunur1. Yeni ithal snrnps ilk Cajal vücutta nerede onlar snrnp özgü proteinler karşılamak ve olgunlaşma bitirmek görünür (referans2,3' te gözden). Son olgunlaşma adımlarını inhibisyonu Cajal organları4,5olgunlaşmamış snrnps sekestrasyon sonuçları gösterdi. Biz son snRNP olgunlaşma snRNP özgü Protein ilavesi ve aktif snRNPs oluşumu izler kalite kontrol altında bir model önerdi. Ancak, hücrelerin doğru birleştirilen olgun ve anormal olgunlaşmamış parçacıklar arasında ayırt nasıl moleküler detayları zor kalır.

Nükleer Cajal vücutlarının hedefleme ve snRNAs birikimi için gerekli olan snRNA dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam etmeye karar verdik. Mikroenjeksiyon bir seçim yöntemidir, çünkü: 1) sentetik snRNAs 'ların, ekstra etiket dizisinin yerleştirilmesi için az alan olan kısa RNAs 'lar için özellikle önemli olan endojen meslektaşlarını ayırt etmek için ek bir sıralı etiket gerektirmediği; 2) biyogenesis için önemli olan dizileri analiz sağlar. Örneğin, SM dizisi SM Ring montajı için gereklidir ve çekirdek6' ya yeniden içe aktarabilir. SnRNAs hücrede ifade edildiğinde, SM dizisi bulunmayan snRNAs sitoplazmada bozulur ve çekirdeğin ve Cajal organları7' ye ulaşmaz. Ancak, SM dizisi olmadan snRNAs doğrudan çekirdeğin içine mikro enjekte edilebilir ve böylece Cajal vücut lokalizasyonu içinde SM dizisinin potansiyel bir rolü assayed.

Burada, snRNA dizilerini Cajal gövdesine5' e hedef almak için gerekli olan bir mikroenjeksiyon yöntemi hakkında ayrıntılı olarak tarif ediyoruz. Biz SM ve SMN bağlayıcı siteleri birlikte gerekli ve sadece snRNAs ama Cajal vücuda çeşitli kısa olmayan kodlama RNAs yerelleştirmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Mikroenjeksiyon yanı sıra diğer kanıtlar dayalı, biz SM halka SM bağlayıcı site monte Cajal vücut yerelleştirme sinyali olduğunu önerdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mikroenjeksiyon için snRNAs hazırlanması

  1. Aşağıdaki PCR kurulumunu kullanarak snRNA 'nın tam uzunluklu veya kesilmiş/mutasyona uğramış sürümünü içeren bir DNA şablonunu hazırlayın: 98 °C 60 s, 98 °C için 15 s, 68 °C 30 s, 72 °C için 1 dakika, 98 °C için 15 s 35x ve 72 °C 5 dk.
  2. İleriye dönük astar, ilk transkripsiyon nükperotid 'in sadece upstream olarak in vitro dökümü için bir organizatör dizisi içermelidir. U2 snRNA dizisini, T7 promotör ve ters astar içeren ileri astar kullanarak arttırın (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın).
  3. Kısa RNA sentezi için bir kit kullanarak snRNA sentezini (bkz: Ayrıntılar için malzeme tablosu ) T7 RNA polimeraz içeren. 1 mM ATP Ekle, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine Cap analog (m32, 2, 7g (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml RNA inhibitörü ve NG reaksiyon500-700 una karşı karışımı ve 37 °c ' de bir gecede inkük.
  4. Reaksiyonda 1 μL (2U) DNase ekleyin ve 37 °C ' de 15 dk ek için Inküye yapın.
  5. Asitli fenol/kloroform ekstraksiyon ile snRNA izole. Üst su fazını çıkarın ve 3 M sodyum asetat (pH = 5,2), 3 μL glikojen daha iyi Pelet görselleştirme ve 2,5 hacimleri% 100 etanol orijinal hacminin 1/10 ekleyin. 1 saat-80 °C ' ye kadar inkük, 14.000 x g ve 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.
  6. 70% etanol ile Pelet yıkayın ve 12 μL nükleücretsiz su içinde çözülür. Her zamanki RNA verimi yaklaşık 600 ng/mL 'Dir. -80 °C ' de saklayın.
  7. Agaroz jel elektrophoreses ile in vitro transkripsiyonu snrnas bütünlüğünü izleyin.
  8. Mikroenjeksiyonu yapmadan önce, 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa içeren suda son konsantrasyon 200 ng/mL 'ye seyreltin.

2. hücreler

  1. Kullanmadan önce, 1 M HCl ile coverfları tedavi 1 h, damıtılmış su iyice yıkayın ve 100% etanol içinde saklayın. Asidik tedavi sırasında veya enjeksiyon sonrası hücre peeling önlemek için hücreleri yapışma teşvik eder. Enjekte hücrelerin daha kolay tanımlanması için, bir ızgara ile bir lamel magazini kullanın.
  2. Tohum HeLa veya diğer yapışan hücreler 1 gün önce mikroenjeksiyon üzerinde 12 mm kapak (No. 1 veya No. 1,5) ulaşmak için 50% mikroenjeksiyon sırasında konfluency.

3. enjeksiyon

Not: HeLa hücreleri Dulbecco modifiye kartal orta mikroenjekte edildi (D-MEM, 4,5 g/L D-glikoz fenol kırmızı ve antibiyotikler içeren). Enjeksiyon bir enjektör ve steril iğne ile donatılmış bir Mikromanipülatör kullanılarak yapılmıştır (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın). Mikroskobik/Mikromanipülatör sistemi, mikroskop ve microinjector bireysel parçalarının dalgalanması önlemek için en az 4 h için 37 °C ' ye önceden ısıtıldı.

  1. 2 ml kültür ortamını içeren Petri tabağı (30 mm), ortadaki lamel magazini ile mikroskop sahibi haline koyun. Bir mikroyükleyici kullanarak iğne içine 3 μL snRNA karışımı yükleyin. Petri tabağı yüzeyine göre 45 ° ' de mikroenjektör tutucusuna iğne takın.
  2. İğne bulmak için, 10X uzun mesafe hedefi kullanın. İlk olarak, enjektör üzerinde hızı kaba ayarlayın ve kültür ortamına dokunur kadar iğne aşağı. Mikroskop dürbünlerini kullanarak, iğne kültür ortamına dokunan yer olan parlak noktayı bulun.
  3. İnce ve iğne ucu görülene kadar mikroskop bakarak iğne daha düşük hızını değiştirin. Görsel alan ortasında iğne hareket ve 40X uzun mesafe hedefe geçiş.
  4. Hedefi değiştirdikten sonra, hücreyi seçin ve iğne bu hücrenin üzerine taşıyın. Hücre teması için basınçları ve zamanı ayarlayın (bkz. Ipuçları ve tartışma sorunlarını giderme).
  5. İğneyi hücreye taşıyın ve ardından mikromanipülatörün alt sınırını ayarlayın. Hücre altında iğne taşımak için dikkatli olun.
  6. Alt sınırı ayarladıktan sonra, iğne hücrenin üzerine geri taşıyın ve enjektör joystick üzerinde enjeksiyon düğmesine basın. İğne, hücrenin içinde otomatik olarak sınırın ayarlanmış olduğu yere taşınır ve RNA karışımı enjekte eder.
  7. Bitirmek için, enjektör üzerinde düğme menüsünü itin ve tutucunun iğne çıkarın. Enjektörü ve mikromanipülatörü kapatmadan önce tüpü enjektörden çıkarın.

4. hücre Fikreme ve boyama

  1. Mikroenjeksiyonu yaptıktan sonra, hücreleri CO2 kuluçk içine dönün ve 37 °c ' de 1 saat boyunca Inküye yapın.
  2. İnkübasyon sonra, hücreleri üç kez fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile durulayın (PBS) Oda sıcaklığında, düzeltmek 20 dakika ile 4% civarında formaldehite 0,1 M borular pH 6,9, ve yıkama üç kez oda sıcaklığı PBS ile. Yalnızca snRNA lokalizasyonu analiz edildiğinde, hücreleri su içinde kısaca durulayın ve DAPı ile bir montaj ortamına monte edin.
  3. Ek protein lokalizasyonu durumunda, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS 'de% 0,5 Triton-X100 ile hücreleri geçirgen. PBS ile üç durulama sonra, primer ve ikincil antikorlar ve PBS son yıkanır ve su kısa durulama sonra, DAPı ile bir montaj ortamı monte hücreleri inküstir.

5. mikroskobik

  1. Montajdan hemen sonra görüntülenmiş değilse, slaytları görüntüleme kadar 4 °C ' de saklayın.
  2. Bir daldırma objektif (60X veya 100x/1.4 NA) ile donatılmış bir High-End floresan mikroskobik sistemi kullanarak görüntüleri elde.
  3. Mikroenjeksiyonlu hücreler belirlendikten sonra, numune başına 200 Nm z basamakları ve matematiksel deconvolution ile 20 z-Bölüm yığını toplayın. Daha sonra maksimal projeksiyonlar veya bireysel z yığınları sunuldu.
  4. Floresan sinyalini ölçmek için, aytac immünostakresi ile tanımlanan bir Cajal vücudun etrafında ilgi alanı (YG) çizin. Coilin tanımlı YG 'de snRNA sinyalinin yoğunluğunu ölçün. Sonraki ROı içinde snRNA floresans yoğunluğu nükploplazm rasgele yerleştirilir ve Cajal vücutta RNA sinyalinin oranını hesaplamak ve nükostoplazm belirleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SnRNA lokalizasyonunu ve Cajal vücut hedeflemede SM bağlama sitesinin rolünü izlemek için, T7 Organizatör içeren bir DNA şablonu ve SM bağlayıcı sitesini oluşturan yedi nükleotid (auuuuug) bulunmayan tam uzunlukta U2 snRNA veya U2 snRNA 'yı hazırladık. snRNAs in vitro transkripsiyonu, izole ve TRITC-bağlı dextran-70kDa ile karışık. İçinde vitro olarak transkripsiyonu snRNA içeren karışımı mikroenjekte ettik.

Daha önce SM bağlayıcı sitenin nükleer ithalat6için gerekli olduğunu göstermiştir. SM site de Cajal vücut birikimi için önemli olup olmadığını test etmek için, biz mikroenjeksiyon snRNA doğrudan çekirdeğe SM site eksik (Şekil 1a). Sitoplazmanın içine enjeksiyon bir kontrol olarak görev yapmıştır (Şekil 1B). Olumlu bir kontrol olarak, tam uzunluklu snRNA (Şekil 1C,D) Mikroenjeksiyonu. Bir Co2 inkükleme 60 min sonra, mikroenjekte hücreleri sabit ve Cajal vücut Marker aytac dolaylı immünofluorescence tarafından görselleştirildi. Tam uzunluklu snRNA, hem nükleer hem de sitoplazmik enjeksiyonlardan sonra Cajal organları içinde birikmiş. Buna karşılık, SM sitesi bulunmayan snRNA, önceki bulgularla tutarlı olan bu bölme içine mikroenjeksiyon sonrası sitoplazmada kalmıştır6. SM sitesi olmadan snRNA 'nın nükleer Mikroenjeksiyonu, SM bağlayıcı dizisinin Cajal vücut lokalizasyonu için önemli olduğunu ortaya koydu. U2 snRNA SM site eksikliği çekirdeğinde kaldı ama Cajal organları (Şekil 1a) birikmez.

Bazen, tek bir hücresel bölme içine mikroenjeksiyon başarısız oldu ve TRICT-dextran-70kDa çekirdek ve sitoplazmada bulundu (Şekil 2a). Bu hücreler daha fazla analizden atıldı. Floresan etiketli snRNAs 'ların enjeksiyon öncesinde-80 °C ' ye depolanmasına rağmen RNA bozulması ortaya çıkabilir. Sitoplazmanın içine enjekte edilen bozulmuş snRNA çekirdeğin içine taşınmaz ve sitoplazmada lokalize kalır (Şekil 2B). Bu tür snRNA atılmalıdır ve yeni snRNA sentezlenmiş olmalıdır.

Figure 1
Şekil 1: mikroskobik snRNAs 'ın lokalizasyonu. Alexa488-etiketlenmiş U2 snRNA veya SM site (A,B) veya tam uzunluklu (C,D) eksik sitoplazması veya hela hücrelerinin çekirdeğine mikroenjekte edildi. Cajal organları (oklar) aytac immunolabeling (kırmızı) ile işaretlenir; snRNAs yeşil olarak tasvir edilir. Dextran-TRITC-70kDa (sarı) nükleer veya sitoplazmik enjeksiyonu izlemek için kullanıldı; DNA, DAPı (mavi) tarafından lekelenmiş. Ok uçları snRNA 'nın sitoplazmik lokalizasyonunu işaretler. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: mikroenjeksiyon yaklaşımıyla ilgili olası bir tuzaklık. (A) bir bölmede mikroenjeksiyon başarısız oldu ve WT U2 snRNA hem sitoplazmada hem de çekirdeğin içine mikroenjekte edildi. Dextran-TRITC-70kDa (sarı) her iki hücresel bölmeler de mevcut olduğunu unutmayın. (B) WT U2 snRNA, Hela hücrelerinin sitoplazmasına (yeşil) mikroenjekte edildi, ancak enjekte edilen snRNA 'nın kısmen bozulmasını ve SM bağlayıcı sitesinin kaybını gösteren sitoplazmada (ok uçları) önemli miktarda snRNA kalmıştır. Cajal organları (oklar) aytac immunolabeling (kırmızı) ile işaretlenir. DNA, DAPı (mavi) tarafından lekelenmiş. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SnRNA lokalizasyonu için nükleer Cajal organları için önemli dizileri belirlemek için floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam. Etiketli RNAs 'ların hızlı ve oldukça basit hazırlanması nedeniyle (PCR ile DNA şablonunun hazırlanması ve ardından in vitro transkripsiyon) yöntem, çeşitli dizilerin RNA lokalizasyonu için nasıl katkıda bulunduğunu etkili bir analiz sunar. Nispeten kısa sürede, U2 snRNA 'nın on farklı silme veya değiştirme işlemlerini analiz edebildik (referans5 ve veri gösterilmez). Kompleks biyogenesis yolu ile RNAs için, bu yaklaşım da olgunlaşma için gerekli olan test dizileri sağlar. SnRNAs durumunda, SM Ring montajı için gerekli olan SM bağlama sıralarının silinmesi, sitoplazmada mutasyona uğramış snRNAs 'ların sequestrasyon ve bozulması ile sonuçlanır7. Diğer avantajlı iki farklı etiketli RNAs aynı anda enjekte edilebilir ve yerelleştirme doğrudan bir hücre içinde karşılaştırıldığında dahil. Ancak, çeşitli florokromlarla RNA davranışını değiştirebilir gibi, her fluorokrom çift etiketleme deneyleri önce bireysel test edilmelidir. Birkaç yüz nükleotid uzunluğundaki RNAs 'lar başarıyla enjekte edilmiştir ve lokalizasyonu çeşitli model sistemlerde incelenir (referans8' de değerlendirildi). Daha uzun RNAs durumunda sınırlayıcı adım, genellikle tam uzunlukta RNA 'nın in vitro sentezidir. Ayrıca, bireysel proteinlerin RNP lokalizasyonu üzerinde etkisini test etmek için önceden montajlı proteinlere sahip RNAs enjeksiyonu uygulanabilir. Projelerimizde, biz Cajal vücut yerelleştirme5SM yüzük rolünü onaylamak için SM proteinleri Ile Ilişkili snRNA enjekte. Son olarak, floresan etiketli RNAs 'ların Mikroenjeksiyonu, daha önce snRNAs9için uygulandığı gibi, herhangi bir ek adım olmadan doğrudan ölçmek sağlar.

Ayrıca bir mikroenjeksiyon projesi başlatmadan önce dikkate alınmalıdır yöntemlerin çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, mikroenjeksiyon sürecinin bazı otomatikleştirme rağmen, yöntem hala manuel beceri ve deneyim gerektirir, ve araştırmacılar eğitim için gerekli zamanı dikkate almalısınız. Protokolün kritik kısımları bozulmamış RNAs 'ların hazırlanması, mikroenjeksiyon ve daha sonra mikroskopla enjekte edilen hücreleri bulma (Ipuçları ve sorun giderme konusuna bakın). Ikinci, mikroenjeksiyon önemli bir stres temsil eder ve birçok hücre uzun bir süre için hayatta değildir. Canlı hücre görüntüleme10ile hücreler içinde mikroenjekte Rnas takip etmek için bazı başarılı girişimler olsa da, biz floresan mikroskopisi kullanarak canlı hücre görüntüleme ile mikroenjeksiyon kombine zaman hücre ölümü önemli bir artış gözlenen. Üçüncü olarak, enjekte edilen RNAs 'ın biyokimyasal analizini engelleyen, insan hücrelerine enjeksiyonlu RNA miktarı çok düşüktür. Bu da, floresan etiketli nükleotiklerin birleştirilme fonksiyonlarının RNA fonksiyonlarını nasıl etkilediğini izlemek zor olduğu anlamına gelir. Bu nedenle, çeşitli oranlarda etiketli-NTP: NTP, vahşi tip RNA 'ya dahil edilmelidir ve lokalizasyonu, floresan sinyali ile etiketli RNA 'nın işlevselliği arasında ideal bir oran elde etmek için nitelendirmiştir. Ayrıca, flororokrom doğası RNA lokalizasyonu etkileyebilir. Bizim elimizde, Alexa488-UTP çok Alexa546-UTP daha iyi çalıştı. Biz bu farklılıkları daha fazla araştırılmamış, ancak bir nedeni Alexa488 karşılaştırıldığında Alexa546 daha büyük bir boyutu ve farklı bir şekil olabilir.

RNA Mikroenjeksiyonu, RNA lokalizasyonu için güçlü bir yöntemdir, ancak her zaman alternatif yaklaşımlar ile birlikte olmalıdır. Bizim durumumuzda, MS2-bağlayıcı siteyi U2 snRNA 'ya başarıyla tanıttık, MS2-YFP kullanarak lokalizasyonu izleniyor ve MS2 sistemi5Ile snRNA Mikroenjeksiyonu ile elde edilen bazı önemli sonuçları doğruladı.

İpuçları ve sorun giderme
Enjeksiyon basıncı, tazminat basıncı ve enjeksiyon süresi her hücre hattı için deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Atom Mikroenjeksiyonu durumunda sitoplazmik mikroenjeksiyon ve Pi = 200 hPa ve PC = 80 hPa halinde, enjeksiyon basıncı (Pi) 170 hPa ve tazminat basıncı (PC) 50 hPa uygulanmıştır. Enjeksiyon süresi her iki durumda da 0,2 s olarak ayarlandı. Bazen hücrenin içindeki malzemenin hafif bir hareketini gözlemleyebilirsiniz, bu da başarılı bir enjeksiyonu gösteren bir göstergesidir. Eğer hücre patlamaları, enjeksiyon basıncı azaltmak zorunda. Ayrıca TRITC floresans kanalı üzerinden tazminat basıncını kontrol etmelisiniz. İğne ucundan çıkan güçlü akımı görürseniz, tazminat basıncını azaltın.

Enjeksiyonlar arasında, her zaman hücrelerin başarıyla enjekte olup olmadığını kontrol edin. TRıSC floresans kanalını kullanarak enjekte edilen dextran-TRITC ile mikroenjit hücreleri tanımlayın. Eğer herhangi bir mikroenjekte hücreleri görmüyorum, ilk enjeksiyon basıncı ve enjeksiyon süresini artırın. İkincisi, iğne floresan kanal (TRıSC) üzerinden takılı değil olup olmadığını kontrol edin. Eğer dextran-TRITC zayıf iğne ucunda akış görürseniz, sonra iğne işlevsel ve sorun enjeksiyon için alt limit ayarı muhtemeldir. Sınırın ayarı çok zor ve önemli bir adımdır. Her hücre farklı şekli vardır ve uygun mikroenjeksiyon sağlamak için çok sık sınırı değiştirmek olacaktır.

İdeal durumda, bir mikroenjeksiyon muktedir ~ 50 iğne ucu bir hücre enkaz ile takılı önce hücreler. Flüoresan ucun düzenli olarak çıkıp gelmediğini kontrol edin ve iplikten herhangi bir dextran-TRITC akışını görmeyin, iğne engellenir. Temizlemek için, enjektör üzerinde temiz düğmesini tutun 3 s, hangi basıncı artırır ve bloğu kaldırmanız gerekir. Eğer yardımcı olmazsa, o zaman Petri tabak alt isabet iğne ucunu kırmak için deneyebilirsiniz. Ancak, bu deneyim önemli miktarda gerektirir ve başarı garantisi yoktur çok zor bir işlemdir. Bu nedenle, yeni başlayanlar için, iğne değişimi tavsiye edilir.

İğne değişimi yapmadan önce, enjektör üzerindeki menü düğmesine basın. İğne biraz yukarı alın ve Mikromanipülatör on Home basın. İğne orta tüm yol kadar gidecek, ama Mikromanipülatör iğne orijinal konumunu hatırlar ve tekrar iğne bulmak gerekmez. İğne yerine, ana düğmeye basın ve iğne orijinal konumuna gidecek ve mikroskop iğne ucunu görmek mümkün olmalıdır zaman. İğne değiştirdikten sonra, sınırı ayarlamak zorunda. Sonra, enjektör üzerinde menü düğmesini tekrar itin ve iğne mikroenjeksiyon için hazırlanır.

Görüntüleme sırasında, trickiest parçası mikroenjekte hücreleri bulmak için. Onları bulmak için, tritc-Conjugated dextran-70kDa mikroskobik snRNAs zayıf Alexa488 sinyal daha görünür olduğu TRITC kanalı kullanın. Izgaraya sahip coverları burada yararlı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Çek Bilim Vakfı (18-10035S), Ulusal sürdürülebilirlik programı ı (LO1419), kurumsal destek (RVO68378050), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ve hibe ajansı tarafından destekleniyordu. Charles Üniversitesi (GAUK 134516). Biz daha fazla ışık mikroskobu çekirdek tesisi kabul, ıMG CAS, Prag, Çek Cumhuriyeti (hibe tarafından desteklenen (Czech-Bioımaging-LM2015062).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics