マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析

Neuroscience

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Summary

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、様々な細胞コンパートメントを含む複雑なプロセスである。ここでは、細胞内での輸送を監視するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用しました。

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Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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Abstract

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、核相と細胞質相の両方を含む複雑なプロセスであり、最後のステップはCajal体と呼ばれる核コンパートメントで起こる。しかし、この亜核構造にsnRNA局在化を指示する配列は、最近まで知られていなかった。カジャール体内のsnRNAの蓄積に重要な配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用し、その後細胞内での局在化を行った。まず、SnRNA欠失変異体、インビトロ転写用の合成DNAテンプレート、およびAlexa488と組み合わせたUTPの存在下で転写されたsnRNAを調製した。標識されたsnRNAをTRITCと共役した70kDa-Dextranと混合し、ヒトHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。細胞を1時間固定して固定し、カジャルボディマーカーコイルリンを間接免疫蛍光で可視化し、核または細胞質注射のマーカーとなるsnRNAとデキストランを蛍光顕微鏡で直接観察した。この方法は、様々な配列が細胞内のRNA局在化にどのように影響するかを効率的かつ迅速にテストすることを可能にします。ここでは、Cajal体内へのSnRNAの効率的なローカリゼーションのためのSm結合配列の重要性を示す。

Introduction

RNAスプライシングは、遺伝子発現における重要なステップの1つであり、スプライセオソームと呼ばれる大きなリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。合計で、150以上のタンパク質と5つの小さな核RNA(snRNA)がスプライシング経路の異なる段階でスプライセオソームに統合されています。U1、U2、U4、U5、U6 snRNAは、主要なGU-AGイントロンのスプライシングに参加しています。これらのsnRNAは、snRNAを含む予め形成された小さな核リボヌクレオタンパク質粒子(snRNA)としてスプリセオソームに結合し、snRNAに関連する7つのSmタンパク質(またはU6 snRNAに関連するライクSmタンパク質)および各snRNPに特異的な1-12タンパク質を含む。

snNRPsの組み立てには、細胞質および核段階が含まれる。新たに転写されたsnRNAは細胞質にエクスポートされ、7つのSmタンパク質から組み立てられたリングを獲得する。Smリングは、その後、snRNAを核に再インポートするためのシグナルとして機能します。Smタンパク質と関連付けることができない欠陥のあるsnRNAは、細胞質1に保持される。新しくインポートされたsnRAPは、まずSnRNP特異的タンパク質を満たし、その成熟を終えるCajal体内に現れ(参照2、3で確認)。我々は最近、最終的な成熟ステップの阻害がCajal体内の未熟なsnNRRpの隔離をもたらすことを示した4,5.我々は、snRNP特異的タンパク質の添加と活性snRNPの形成を監視する品質管理下にある最終snRNP成熟モデルを提案した。しかし、細胞が正しく組み立てられた成熟粒子と異常な未熟粒子を区別する方法の分子詳細は、依然として不明瞭なままである。

核カジャール体内のsnRNAの標的化と蓄積に不可欠なsnRNA配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用することにしました。マイクロインジェクションは、1)合成snRNAを区別するために追加のシーケンスタグを必要としないため、余分なタグ配列を挿入するためのスペースが少ない短いRNAにとって特に重要です。2)それは生体発生のために重要な配列の分析を可能にする。たとえば、Sm シーケンスは Sm リング アセンブリに不可欠であり、核6に再インポートします。snRNAが細胞内で発現されると、Sm配列を欠くsnRNAは細胞質中で分解され、核およびCajal体7に到達しない。しかしながら、Sm配列を持たないSnRNAは、核に直接マイクロ注入することができ、したがって、Cajal体局在化におけるSm配列の潜在的な役割をアッセイする。

ここでは、Cajal本体5にsnRNAを標的にするために必要なsnRNA配列を決定するために適用したマイクロインジェクション法について詳しく説明する。我々は、SmおよびSMN結合部位が一緒に必要であり、SnRNAだけでなく、Cajal本体に様々な短い非コーディングRNAをローカライズするのに十分であることを示した。マイクロインジェクションおよび他の証拠に基づいて、Sm結合部位に組み立てられたSMリングがCajal本体ローカリゼーション信号であることを提案した。

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Protocol

1. マイクロインジェクション用snRNAの調製

  1. 次の PCR セットアップを使用して PCR による snRNA の全長または切り捨て/変異バージョンを含む DNA テンプレートを準備する: 60 s の場合は 98 °C、15 s の場合は 98 °C、30 s は 68 °C、1 分間は 72 °C、98 °C は 1 分間、98 °C は 35 倍の場合、および5分間72 °C。
  2. 前方プライマーは、最初に転写されたヌクレオチドのちょうど上流のインビトロ転写のためのプロモーター配列を含んでいなければならない。T7プロモーターとリバースプライマーを含むフォワードプライマーを用いてU2 snRNA配列を増幅し、最後に転写されたヌクレオチドで終わる(詳細は材料表を参照)。
  3. T7 RNA ポリメラーゼを含む短い RNA 合成キットを使用して snRNA を合成します(詳細については材料表を参照)。1 mM ATP を追加します。 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM トリメチルグアノシンキャップ類似体 (m32,2,7G(5')ppp(5'G), 1 mLのRNA阻害剤と500-700 ngのDNAテンプレートの一晩の反応で°7.
  4. 反応にDNaseの1 μL(2U)を加え、37°Cでさらに15分間インキュベートします。
  5. 酸性フェノール/クロロホルム抽出によりsnRNAを単離する。トップ水位相を取り除き、3M酢酸ナトリウム(pH= 5.2)の元の体積の1/10、より良いペレット可視化のためのグリコーゲンの3 μL、および100%エタノールの2.5ボリュームを追加します。-80 °Cで1時間、遠心分離機を14,000 x gおよび4°Cで10分間インキュベートする。
  6. 70%エタノールでペレットを洗浄し、ヌクレルスフリー水の12 μLに溶解します。通常のRNA収率は約600ng/mLであった。-80 °C.で保存します。
  7. アガロースゲル電気泳動によるインビトロ転写snRNAの完全性を監視します。
  8. マイクロインジェクションの前に、10 μg/μLデキストラン-TRITC 70 kDaを含む水中の最終濃度200 ng/mLにRNAを希釈する。

2. セル

  1. 使用前に、1M HClで1M HClでカバースリップを処理し、蒸留水で十分に洗浄し、100%エタノールで保存します。酸性治療は、注射中または注射後の細胞剥離を防ぐために細胞の接着を促進します。注入された細胞の識別を容易にするために、グリッド付きのカバースリップを使用します。
  2. 種子HeLaまたは他の付着細胞は、マイクロインジェクション時に50%の合流性に達する12mmカバースリップ(No.1またはNo.1.5)上のマイクロインジェクションの1日前に。

3. インジェクション

注:HeLa細胞は、ダルベッコの修飾イーグル培地(D-MEM、フェノール赤および抗生物質を含む4.5g/L D-グルコース)にマイクロ注入された。注射は、無菌針を装備したインジェクターとマイクロマニピュレータを用いて行った(詳細は材料表参照)。顕微鏡/マイクロマニピュレータシステム全体を、顕微鏡とマイクロインジェクターの個々の部分の変動を防ぐために、少なくとも4時間37°Cに予熱しました。

  1. 2mLの培養培地を含むペトリ皿(30mm)を中央にカバースリップして顕微鏡のホルダーに入れます。マイクロローダーを使用して、3 μLのsnRNA混合物を針にロードします。ペトリ皿の表面に対して45°のマイクロインジェクターのホルダーに針を取り付けます。
  2. 針を見つけるには、10倍の長距離目的を使用します。まず、インジェクタの速度をCOARSEに設定し、培養剤に触れるまで針を下げます。顕微鏡双眼鏡を使用して、針が培養培地に触れる場所である明るいスポットを見つけます。
  3. 針の先端が観察されるまで顕微鏡を見ながら、針の速度をFINEに変更し、さらに針を下げます。視野の中央に針を移動し、40倍の長距離目標に切り替えます。
  4. 目的を変更した後、セルを選択し、このセルの上に針を移動します。セル接触の圧力と時間を設定します (説明のヒントとトラブルシューティングを参照)。
  5. 針をセルに下ろし、マイクロマニピュレータの下限を設定します。細胞の下に針を動かさないで下さい。
  6. 下限を設定した後、針をセルの上に戻し、インジェクタのジョイスティックのインジェクションボタンを押します。針は、限界が設定された場所に細胞内で自動的に移動し、RNA混合物を注入します。
  7. 仕上げるには、インジェクタのボタンMENUを押し、ホルダーから針を取り外します。次に、インジェクタとマイクロマニピュレータをオフにする前に、インジェクタからチューブを取り外します。

4. 細胞の固定と染色

  1. マイクロインジェクション後、細胞をCO2インキュベーターに戻し、37°Cで1時間インキュベートする。
  2. インキュベーション後、リン酸緩衝生理食液(PBS)で細胞を室温で3回すすいで、0.1 M PIPES pH 6.9で4%のパラホルムアルデヒドで20分間固定し、室温PBSで3回洗浄する。snRNA局在度のみを解析する場合は、細胞を水中で簡単にすすいで、DAPIを使用して取り付け媒体に取り付けます。
  3. 追加のタンパク質局在化の場合は、室温で5分間PBSで0.5%トリトン-X100で細胞を透過化します。PBSで3回のリンスの後、一次および二次抗体で細胞をインキュベートし、PBSで最終洗い、水中で短いリンスをした後、DAPIを用いた取り付け媒体に取り付けます。

5. 顕微鏡検査

  1. 取り付け直後に画像を撮影しない場合は、画像化するまでスライドを4°Cに保管してください。
  2. 没入目的(60Xまたは100x/1.4NA)を備えたハイエンド蛍光顕微鏡システムを使用して画像を取得します。
  3. マイクロ注入された細胞が同定されたら、サンプルあたり200 nm zステップで20zセクションのスタックを収集し、数学的な破壊の対象となる。その後、最大投影または個々のzスタックが提示された。
  4. 蛍光シグナルを定量化するには、コイル免疫染色によって同定されたカジャル体の周りに関心領域(ROI)を描画します。コイル定義ROIにおけるsnRNA信号の強度を測定します。次に、核内にランダムに配置されたROIにおけるsnRNA蛍光の強度を決定し、Cajal体内および核内のRNAシグナルの比率を計算する。

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Representative Results

SnRNA局在化とカジャール体内標的におけるSm結合部位の役割を監視するために、T7プロモーターと全長U2 snRNAまたはU2 snRNAを含むDNAテンプレートを調製し、Sm結合部位を形成する7つのヌクレオチド(AUUUUUG)を欠いている。snRNAは、TRITC結合デキストラン-70kDaとインビトロ転写し、単離され、混合された。インビトロ転写snRNAを含む混合物をHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。

核輸入6にはSm結合部位が必要であることが以前に示されている。Sm部位がCajal体蓄積にとっても重要であるかどうかをテストするために、Sm部位を欠くsnRNAを直接核に注入した(図1A)。細胞質への注入は、コントロールとして役立った(図1B)。陽性対照として、全長snRNA(図1C、D)をマイクロ注入した。CO2インキュベーターでのインキュベーションの60分後、マイクロ注入細胞を固定し、カジャルボディマーカーコイルを間接免疫蛍光により可視化した。核注射と細胞質注射の両方の後にカハル体内に蓄積された全長snRNA.対照的に、Sm部位を欠くsnRNAは、このコンパートメントにマイクロインジェクションした後に細胞質に残り、これは以前の所見6と一致する。Sm部位を持たないsnRNAの核マイクロインジェクションは、Sm結合配列がCajal体の局在化にとって重要であることを明らかにした。Sm部位を欠くU2 snRNAは核内に残ったが、カジャール体には蓄積しなかった(図1A)。

時には、1つの細胞コンパートメントへのマイクロインジェクションのみが失敗し、TRICT-dextran-70kDaは核と細胞質の両方で発見されました(図2A)。これらの細胞は、さらなる分析から廃棄された。蛍光標識されたsnRNAは注射前に-80°Cで保存されているにもかかわらず、RNA分解が起こりうる。細胞質に注入された分解されたsnRNAは核に輸送されず、細胞質に局在したままである(図2B)。このようなsnRNAは廃棄し、新しいsnRNAを合成する必要があります。

Figure 1
図1:マイクロ注入snRNAの局在化。Alexa488標識U2 snRNAは、Sm部位(A、B)または全長(C、D)を欠いているか、細胞質またはHeLa細胞の核にマイクロ注入された。カジャール体(矢印)は、コイルイン免疫標識(赤)によってマークされています。snRNA は緑色で表示されます。デキストラン-TRITC-70kDa(黄色)は、核または細胞質注射を監視するために使用されました。DNAはDAPI(青色)によって染色された。矢印はsnRNAの細胞質局在化を示す。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: マイクロインジェクションアプローチの潜在的な落とし穴。(A)1つのコンパートメントへのマイクロインジェクションが失敗し、WT U2 snRNAを細胞質と核の両方にマイクロ注入した。なお、Dextran-TRITC-70kDa(黄色)は両方のセルラーコンパートメントに存在する。(B)WT U2 snRNAをHeLa細胞の細胞質(緑色)に微小注入したが、大量のsnRNAが細胞質(矢印)に残り、注入されたsnRNAの部分的な分解およびSm結合部位の喪失を示した。カジャール体(矢印)は、コイルイン免疫標識(赤色)によってマークされる。DNAはDAPI(青色)によって染色された。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを用い、核カジャール体へのsnRNA局在化に重要な配列を決定した。標識されたRNAの迅速かつかなり単純な調製(PCRによるDNAテンプレートの調製、インビトロ転写)により、この方法は、様々な配列がRNA局在化にどのように寄与するかの効果的な分析を提供します。比較的短時間で、U2 snRNAの10種類の欠損または置換を分析することができました(参照5とデータは示されていません)。複雑な生体発生経路を持つRNAの場合、このアプローチは成熟に不可欠な配列の試験も可能にします。snRNAの場合、Smリングアセンブリに必要なSm結合配列の欠失は、細胞質7における変異SnRNAの隔離および劣化をもたらす。その他の利点としては、異なるラベル付きの2つのRNAを同時に注入し、その局在化を1つのセル内で直接比較できることが挙まれる。しかし、様々なフルオロクロムがRNAの挙動を変える可能性があるため、各フルオロクロムは二重標識実験の前に個々にテストする必要があります。長さ数百のヌクレオチドのRNAが正常に注入され、その局在化は様々なモデルシステムでアッセイされた(参照8でレビュー)。より長いRNAの場合の制限工程は、通常、全長RNAのインビトロ合成である。また、組み立て済みタンパク質を用いてRNAを注入し、RNP局在化に対する個々のタンパク質の効果を試験することができます。我々のプロジェクトでは、Smタンパク質に関連するsnRNAを注入し、Cajal体局在におけるSmリングの役割を確認した5.最後に、蛍光標識RNAのマイクロインジェクションは、snRNA9に以前に適用されているように、追加のステップなしで直接定量を可能にする。

マイクロインジェクションプロジェクトを起動する前に考慮する必要がある方法のいくつかの欠点もあります。第一に、マイクロインジェクションプロセスのいくつかの自動化にもかかわらず、この方法はまだ手作業のスキルと経験を必要とし、研究者はトレーニングに必要な時間を考慮する必要があります。プロトコルの重要な部分は、無傷のRNAの調製、マイクロインジェクション、そして顕微鏡で注入された細胞を見つけることです(以下のヒントとトラブルシューティングを参照)。第二に、マイクロインジェクションは有意な応力を表し、多くの細胞は長期間生き残らない。生細胞イメージング10によって細胞内の微小注入RNAを追いかける試みはいくつか成功していますが、蛍光顕微鏡を用いてマイクロインジェクションとライブ細胞イメージングを組み合わせると、細胞死の有意な増加が見られました。第3に、ヒト細胞に注入されるRNAの量は非常に少なく、注入されたRNAの生化学的分析を妨げる。これはまた、蛍光標識ヌクレオチドの組み込みがRNA機能にどのように影響するかを監視することが困難であることを意味する。したがって、標識-NTP:NTPの様々な比率は、蛍光シグナルと標識RNAの機能との理想的な比率を得るために、野生型RNAとその局在化アッセイに組み込まれるべきである。また、フルオロクロムの性質はRNA局在化に影響を与える可能性があります。私たちの手の中では、Alexa488-UTPはAlexa546-UTPよりもはるかに優れています。これらの違いについてはこれ以上詳しく調べていませんが、Alexa488と比較してAlexa546の大きさと形状が異なる理由の1つです。

一緒に、RNAマイクロインジェクションはRNA局在化のための強力な方法ですが、常に代替アプローチと組み合わせる必要があります。我々のケースでは、U2 snRNAにMS2結合部位を導入することに成功し、MS2-YFPを用いてその局在化を監視し、MS2システム5を用いたsnRNAマイクロインジェクションによって得られたいくつかの主要な結果を確認した。

ヒントとトラブルシューティング
注入圧力、補償圧力および注入時間は、各細胞株について実験的に決定される必要がある。核マイクロインジェクションの場合は、射出圧力(Pi)170hPaと補償圧力(Pc)50hPaを適用し、核マイクロインジェクションの場合はPi=200hPaとPc=80 hPaを適用した。注射時間はどちらの場合も0.2sに設定した。細胞内の物質のわずかな動きを観察することは、注入が成功した兆候である場合があります。細胞が破裂した場合は、注入圧力を下げる必要があります。また、TRITC蛍光チャネルを介して補償圧力を確認する必要があります。針の先端から強い流れが出てくるのを見たら、補償圧力を下げてください。

注射の間、細胞が正常に注入されているかどうかを常に確認してください。TRITC蛍光チャネルを用いて注入されたDextran-TRITCを介してマイクロ注入された細胞を同定する。マイクロ注入された細胞が見えない場合は、まず注入圧力と注入時間を増やします。次に、針が蛍光チャネル(TRITC)を介して差し込んでいないかどうかを確認します。Dextran-TRITCが針の先端から弱く流れ出るのを見ると、針は機能しており、注射の下限の設定に問題がある可能性が高い。制限の設定は非常にトリッキーで重要なステップです。各セルは異なる形状を持っており、適切なマイクロインジェクションを確保するために非常に頻繁に制限を変更します。

理想的なケースでは、針の先端が細胞の破片で差し込まれる前に、約50セルをマイクロ注入することができるはずです。蛍光が定期的に先端から出てくるかどうかを確認し、先端から流れるDextran-TRITCが見えない場合は、針がブロックされます。それをきれいにするには、インジェクタのCLEANボタンを3sに押し続けます。それが役に立たない場合は、ペトリ皿の底を打つことによって針の先端を壊そうとすることができます。ただし、これは非常に複雑な手順であり、かなりの経験が必要であり、成功の保証はありません。したがって、初心者のために、針交換をお勧めします。

針を交換する前に、インジェクタのMENUボタンを押します。針を少し上げて、マイクロマニピュレータのHOMEを押します。針は媒体からすべての方法を行くが、マイクロマニピュレータは針の元の位置を覚えており、あなたは再び針を見つける必要はありません。針を交換すると、HOMEボタンを押すと、針は元の位置に移動し、顕微鏡で針の先端を見ることができるはずです。針を変更した後、あなたは限界を調整する必要があります。その後、インジェクタのMENUボタンをもう一度押すと、針はマイクロインジェクション用に準備されます。

イメージング中に、最もトリッキーな部分は、マイクロ注入された細胞を見つけることです。それらを見つけるには、TRITC結合Dextran-70kDaがマイクロ注入されたsnRNAの弱いAlexa488信号よりもはるかに良く見えるTRITCチャネルを使用します。グリッド付きのカバースリップは、ここで役立ちます。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この研究は、チェコ科学財団(18-10035S)、国家サステナビリティプログラムI(LO1419)、制度支援(RVO68378050)、欧州地域開発基金(CZ.02.1.01/0.0.0.0.0/0.0/16_013/0001775)、および助成金によって支援されました。チャールズ大学 (GAUK 134516).我々はさらに、光顕微鏡コア施設、IMG CAS、プラハ、チェコ共和国(助成金によってサポートされている-チェコバイオイメージング - LM2015062)を認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACT
CACTATAGGGATCGCTTCT
CGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTG
CACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

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References

  1. Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42, (4), 2708-2724 (2014).
  2. Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits. RNA Biology. 14, (6), 671-679 (2017).
  3. Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
  4. Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
  5. Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46, (7), 3774-3790 (2018).
  6. Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12, (2), 573-583 (1993).
  7. Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111, (32), E3277-E3286 (2014).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20, (7), 380-390 (2010).
  9. Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17, (12), 4972-4981 (2006).
  10. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33, (6), 1902-1912 (2005).

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